از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت ارائه می کنیم.
نیاز به یک سیستم آزمایشگاهی قابل اعتماد وجود دارد که بتواند محیط فیزیولوژیکی قلب را برای آزمایش دارو به طور دقیق بازتولید کند.در دسترس بودن محدود سیستم های کشت بافت قلب انسان منجر به تفسیرهای نادرست از اثرات داروهای قلبی شده است.در اینجا، ما یک مدل کشت بافت قلبی (CTCM) ایجاد کرده‌ایم که به‌طور الکترومکانیکی برش‌های قلب را تحریک می‌کند و در طول مراحل سیستولیک و دیاستولیک چرخه قلبی تحت کشش فیزیولوژیکی قرار می‌گیرد.پس از 12 روز کشت، این رویکرد تا حدی زنده ماندن بخش های قلب را بهبود بخشید، اما یکپارچگی ساختاری آنها را به طور کامل حفظ نکرد.بنابراین، پس از غربالگری مولکول های کوچک، متوجه شدیم که افزودن 100 نانومولار تری یدوتیرونین (T3) و 1 میکرومولار دگزامتازون (Dex) به محیط ما ریزساختار مقاطع را به مدت 12 روز حفظ کرد.در ترکیب با درمان T3/Dex، سیستم CTCM پروفایل های رونویسی، زنده ماندن، فعالیت متابولیکی و یکپارچگی ساختاری را در همان سطح بافت تازه قلب به مدت 12 روز حفظ کرد.علاوه بر این، کشش بیش از حد بافت قلب در کشت، سیگنال‌های هیپرتروفیک قلبی را القا می‌کند و شواهدی را برای توانایی CTCM در تقلید شرایط هیپرتروفیک ناشی از کشش قلبی فراهم می‌کند.در نتیجه، CTCM می‌تواند فیزیولوژی و پاتوفیزیولوژی قلب را در دوره‌های زمانی طولانی مدل‌سازی کند و غربالگری دارویی قابل اعتماد را ممکن می‌سازد.
قبل از تحقیقات بالینی، سیستم‌های آزمایشگاهی قابل اعتمادی مورد نیاز است که بتواند محیط فیزیولوژیکی قلب انسان را با دقت بازتولید کند.چنین سیستم هایی باید کشش مکانیکی تغییر یافته، ضربان قلب و خواص الکتروفیزیولوژیکی را تقلید کنند.مدل های حیوانی معمولاً به عنوان یک پلت فرم غربالگری برای فیزیولوژی قلب با قابلیت اطمینان محدود در انعکاس اثرات داروها در قلب انسان استفاده می شود.در نهایت، مدل آزمایشی کشت بافت قلب ایده آل (CTCM) مدلی است که برای مداخلات درمانی و دارویی مختلف بسیار حساس و اختصاصی است و فیزیولوژی و پاتوفیزیولوژی قلب انسان را به دقت بازتولید می کند.فقدان چنین سیستمی کشف درمان‌های جدید برای نارسایی قلبی را محدود می‌کند.
در دهه گذشته، هشت داروی غیر قلبی عروقی از مصرف بالینی کنار گذاشته شده اند، زیرا باعث طولانی شدن فاصله QT می شوند که منجر به آریتمی بطنی و مرگ ناگهانی می شود.بنابراین، نیاز فزاینده ای به استراتژی های غربالگری پیش بالینی قابل اعتماد برای ارزیابی اثربخشی و سمیت قلبی عروقی وجود دارد.استفاده اخیر از کاردیومیوسیت های مشتق شده از سلول های بنیادی پرتوان القایی انسان (hiPS-CM) در غربالگری دارو و آزمایش سمیت راه حلی جزئی برای این مشکل ارائه می دهد.با این حال، ماهیت نابالغ hiPS-CMs و عدم پیچیدگی چند سلولی بافت قلب از محدودیت‌های اصلی این روش است.مطالعات اخیر نشان داده‌اند که می‌توان با استفاده از hiPS-CM اولیه برای تشکیل هیدروژل‌های بافت قلب بلافاصله پس از شروع انقباضات خود به خود و افزایش تدریجی تحریک الکتریکی در طول زمان، بر این محدودیت تا حدی غلبه کرد.بعلاوه، بافت قلب انسان ساختار پیچیده تری دارد که از مخلوطی ناهمگن از انواع مختلف سلول، از جمله سلول های اندوتلیال، نورون ها و فیبروبلاست های استرومایی تشکیل شده است که توسط مجموعه های خاصی از پروتئین های ماتریکس خارج سلولی به هم متصل شده اند.این ناهمگونی جمعیت های غیر قلبی 11، 12، 13 در قلب پستانداران بالغ مانع اصلی برای مدل سازی بافت قلبی با استفاده از انواع سلول های فردی است.این محدودیت‌های عمده بر اهمیت توسعه روش‌هایی برای کشت بافت سالم میوکارد تحت شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیک تأکید می‌کند.
ثابت شده است که بخش های نازک (300 میکرومتر) کشت شده قلب انسان مدل امیدوارکننده ای از میوکارد دست نخورده انسان است.این روش دسترسی به یک سیستم سه بعدی چند سلولی کامل مشابه بافت قلب انسان را فراهم می کند.با این حال، تا سال 2019، استفاده از بخش‌های قلب کشت‌شده با بقای کشت کوتاه (24 ساعت) محدود بود.این به دلیل تعدادی از عوامل از جمله عدم کشش فیزیکی-مکانیکی، رابط هوا-مایع، و استفاده از رسانه های ساده است که نیازهای بافت قلب را پشتیبانی نمی کند.در سال 2019، چندین گروه تحقیقاتی نشان دادند که ترکیب عوامل مکانیکی در سیستم‌های کشت بافت قلب می‌تواند عمر کشت را افزایش دهد، بیان قلب را بهبود بخشد و آسیب‌شناسی قلبی را تقلید کند.دو مطالعه ظریف 17 و 18 نشان می دهد که بارگذاری مکانیکی تک محوری تأثیر مثبتی بر فنوتیپ قلب در طول کشت دارد.با این حال، این مطالعات از بارگذاری فیزیکی و مکانیکی سه بعدی دینامیک چرخه قلبی استفاده نکردند، زیرا مقاطع قلب با نیروهای کششی ایزومتریک 17 یا بارگذاری آکستونیک خطی 18 بارگذاری شده بودند.این روش‌های کشش بافت منجر به سرکوب بسیاری از ژن‌های قلبی یا بیان بیش از حد ژن‌های مرتبط با پاسخ‌های کششی غیرطبیعی می‌شود.قابل توجه، پیتولیس و همکاران.19 یک حمام کشت برش قلب پویا برای بازسازی چرخه قلبی با استفاده از بازخورد مبدل نیرو و درایوهای کششی ایجاد کرد.اگرچه این سیستم امکان مدل‌سازی دقیق‌تر چرخه قلبی در شرایط آزمایشگاهی را فراهم می‌کند، پیچیدگی و توان عملیاتی کم روش، کاربرد این سیستم را محدود می‌کند.آزمایشگاه ما اخیراً یک سیستم کشت ساده را با استفاده از تحریک الکتریکی و یک محیط بهینه برای حفظ زنده ماندن بخش‌های بافت قلب خوک و انسان تا 6 روز توسعه داده است20،21.
در نسخه خطی کنونی، ما یک مدل کشت بافت قلبی (CTCM) را با استفاده از بخش‌هایی از قلب خوک توصیف می‌کنیم که نشانه‌های هومورال را برای جمع‌بندی فیزیولوژی سه بعدی قلب و اتساع پاتوفیزیولوژیک در طول چرخه قلبی در خود دارد.این CTCM می‌تواند دقت پیش‌بینی داروی قبل از بالینی را با ارائه یک سیستم قلبی مقرون‌به‌صرفه و متوسط ​​که از فیزیولوژی/پاتوفیزیولوژی قلب پستانداران برای آزمایش‌های دارویی پیش بالینی تقلید می‌کند، به سطحی که قبلاً هرگز به آن دست نیافته بود، افزایش دهد.
سیگنال های مکانیکی همودینامیک نقش مهمی در حفظ عملکرد کاردیومیوسیت در شرایط آزمایشگاهی 22،23،24 ایفا می کنند.در نسخه خطی فعلی، ما یک CTCM (شکل 1a) ایجاد کرده‌ایم که می‌تواند محیط قلبی بزرگسالان را با القای تحریک الکتریکی و مکانیکی در فرکانس‌های فیزیولوژیکی (1.2 هرتز، 72 ضربه در دقیقه) تقلید کند.برای جلوگیری از کشش بیش از حد بافت در طول دیاستول، یک دستگاه چاپ سه بعدی برای افزایش اندازه بافت تا 25٪ استفاده شد (شکل 1b).ضربان‌سازی الکتریکی ناشی از سیستم C-PACE با استفاده از یک سیستم جمع‌آوری داده‌ها برای بازتولید کامل چرخه قلبی، زمان‌بندی شده بود تا 100 میلی‌ثانیه قبل از سیستول شروع شود.سیستم کشت بافت از یک محرک پنوماتیک قابل برنامه‌ریزی (LB Engineering، آلمان) استفاده می‌کند تا غشای سیلیکونی انعطاف‌پذیر را به صورت دوره‌ای منبسط کند تا باعث انبساط برش‌های قلب در محفظه بالایی شود.این سیستم از طریق یک مبدل فشار به یک خط هوای خارجی متصل شد، که امکان تنظیم دقیق فشار (1± میلی‌متر جیوه) و زمان (1± میلی‌ثانیه) را فراهم کرد (شکل 1c).
a بخش بافت را به حلقه نگهدارنده 7 میلی متری که به رنگ آبی نشان داده شده است، در داخل محفظه کشت دستگاه وصل کنید.محفظه کشت توسط یک غشای سیلیکونی انعطاف پذیر نازک از محفظه هوا جدا می شود.برای جلوگیری از نشتی، یک واشر بین هر اتاق قرار دهید.درب دستگاه حاوی الکترودهای گرافیتی است که باعث تحریک الکتریکی می شوند.b نمایش شماتیک دستگاه بافت بزرگ، حلقه راهنما و حلقه نگهدارنده.مقاطع بافتی (قهوه ای) با حلقه راهنما در شیار لبه بیرونی دستگاه روی دستگاه بزرگ قرار می گیرند.با استفاده از راهنما، حلقه نگهدارنده پوشیده شده با چسب اکریلیک بافتی را روی قسمت بافت قلب قرار دهید.c نموداری که زمان تحریک الکتریکی را به عنوان تابعی از فشار محفظه هوا که توسط یک محرک پنوماتیکی قابل برنامه ریزی (PPD) کنترل می شود را نشان می دهد.برای همگام سازی تحریک الکتریکی با استفاده از سنسورهای فشار از یک دستگاه جمع آوری داده استفاده شد.هنگامی که فشار در محفظه کشت به آستانه تنظیم شده رسید، یک سیگنال پالسی به C-PACE-EM ارسال می شود تا تحریک الکتریکی را تحریک کند.d تصویر چهار CTCM قرار داده شده در قفسه انکوباتور.هر دستگاه شامل شش بخش بافت است.
با استفاده از یک محرک پنوماتیکی، ما توانستیم 4 دستگاه CTCM را کنترل کنیم که هر کدام می توانند 6 بخش بافت را در خود جای دهند (شکل 1d).در CTCM، فشار هوا در محفظه هوا به فشار سنکرون در محفظه مایع تبدیل می‌شود و باعث انبساط فیزیولوژیکی برش قلب می‌شود (شکل 2a و فیلم تکمیلی 1).ارزیابی کشش بافت در 80 میلی متر جیوه.هنرکشش مقاطع بافتی را 25 درصد نشان داد (شکل 2b).نشان داده شده است که این درصد کشش با طول سارکومر فیزیولوژیکی 2.2 تا 2.3 میکرومتر برای انقباض طبیعی بخش قلب مطابقت دارد. 17،19،25.حرکت بافت با استفاده از تنظیمات دوربین سفارشی ارزیابی شد (شکل تکمیلی 1).دامنه و سرعت حرکت بافت (شکل 2c, d) با کشش در طول چرخه قلبی و زمان در طول سیستول و دیاستول مطابقت دارد (شکل 2b).کشش و سرعت بافت قلب در طول انقباض و آرامش به مدت 12 روز در کشت ثابت باقی ماند (شکل 2f).برای ارزیابی اثر تحریک الکتریکی بر روی انقباض در طی کشت، ما روشی را برای تعیین تغییر شکل فعال با استفاده از یک الگوریتم سایه‌زنی توسعه دادیم (شکل تکمیلی 2a,b) و توانستیم بین تغییر شکل‌ها با و بدون تحریک الکتریکی تمایز قائل شویم.همان بخش قلب (شکل 2f).در ناحیه متحرک برش (R6-9)، ولتاژ در حین تحریک الکتریکی 20 درصد بیشتر از عدم وجود تحریک الکتریکی بود که نشان دهنده سهم تحریک الکتریکی در عملکرد انقباضی است.
نشان‌دهنده فشار محفظه هوا، فشار محفظه سیال و اندازه‌گیری‌های حرکت بافت تأیید می‌کند که فشار محفظه فشار محفظه مایع را تغییر می‌دهد و باعث حرکت متناظر برش بافت می‌شود.ب نشان دهنده درصد کشش (آبی) مقاطع بافتی مربوط به درصد کشش (نارنجی).ج حرکت اندازه گیری شده برش قلب با سرعت اندازه گیری شده حرکت مطابقت دارد.(د) مسیر حرکت چرخه ای (خط آبی) و سرعت (خط نقطه چین نارنجی) در یک برش از قلب.e تعیین کمیت زمان چرخه (19 برش در هر گروه، از خوک‌های مختلف)، زمان انقباض (19 برش در هر گروه)، زمان استراحت (19 برش در هر گروه، از خوک‌های مختلف)، حرکت بافت (n = 25).برش ها)/گروه از خوک های مختلف)، اوج سرعت سیستولیک (n = 24 (D0)، 25 (D12) برش/گروه از خوک های مختلف) و اوج میزان آرامش (n=24 (D0)، 25 (D12) برش/گروه از خوک های مختلف).تجزیه و تحلیل کرنش نشان‌دهنده آثاری از بخش‌های بافت با (قرمز) و بدون (آبی) تحریک الکتریکی، ده ناحیه منطقه‌ای از بخش‌های بافت از همان بخش.پانل های پایینی، کمیت تفاوت درصد کرنش را در بخش های بافت با و بدون تحریک الکتریکی در ده ناحیه از بخش های مختلف نشان می دهد. (n = 8 برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون t دانشجوی دو دنباله انجام می‌شود؛ ****p <0.0001، **p <0.01، *p <0.05). (n = 8 برش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمون t دانشجوی دو دنباله انجام می‌شود؛ ****p <0.0001، **p <0.01، *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 بخش/گروه از خوک های مختلف، آزمون t دانشجوی دو طرفه؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 بخش/گروه، از خوک های مختلف، آزمون t دانشجوی دو طرفه؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05).نوارهای خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف استاندارد است.
در سیستم کشت برش قلب بیومیمتیک استاتیک قبلی خود [20، 21]، ما زنده بودن، عملکرد و یکپارچگی ساختاری برش های قلب را به مدت 6 روز با اعمال تحریک الکتریکی و بهینه سازی ترکیب محیط حفظ کردیم.اما پس از 10 روز این ارقام به شدت کاهش یافت.ما به بخش های کشت شده در سیستم کشت بیومیمتیک استاتیک قبلی خود 20، 21 شرایط کنترل (Ctrl) اشاره خواهیم کرد و از محیط بهینه سازی شده قبلی خود به عنوان شرایط MC و کشت تحت تحریک مکانیکی و الکتریکی همزمان (CTCM) استفاده خواهیم کرد.نامیده شد .ابتدا، تعیین کردیم که تحریک مکانیکی بدون تحریک الکتریکی برای حفظ زنده ماندن بافت به مدت 6 روز کافی نیست (شکل تکمیلی 3a,b).جالب توجه است که با معرفی تحریک فیزیکی و مکانیکی و الکتریکی با استفاده از STCM، زنده ماندن بخش‌های قلب 12 روزه مانند بخش‌های قلب تازه تحت شرایط MS باقی ماند، اما در شرایط Ctrl، همانطور که توسط تجزیه و تحلیل MTT نشان داده شده است، نبود (شکل 1).3 الف).این نشان می‌دهد که تحریک مکانیکی و شبیه‌سازی چرخه قلبی می‌تواند بخش‌های بافت را دو برابر مدت زمانی که در سیستم کشت استاتیک قبلی ما گزارش شده بود زنده نگه دارد.با این حال، ارزیابی یکپارچگی ساختاری بخش‌های بافت با برچسب‌گذاری ایمنی تروپونین T و کانکسین 43 قلبی نشان داد که بیان کانکسین 43 در بافت‌های MC در روز 12 به طور قابل‌توجهی بیشتر از گروه شاهد در همان روز بود.با این حال، بیان یکنواخت کانکسین 43 و تشکیل دیسک Z به طور کامل حفظ نشد (شکل 3b).ما از یک چارچوب هوش مصنوعی (AI) برای تعیین کمیت یکپارچگی ساختاری بافت استفاده می‌کنیم، یک خط لوله یادگیری عمیق مبتنی بر تصویر مبتنی بر تروپونین-T و رنگ‌آمیزی کانکسین43 برای تعیین کمیت خودکار یکپارچگی ساختاری و فلورسانس برش‌های قلب از نظر قدرت محلی‌سازی.این روش از یک شبکه عصبی کانولوشنال (CNN) و یک چارچوب یادگیری عمیق استفاده می کند تا به طور قابل اعتماد یکپارچگی ساختاری بافت قلب را به صورت خودکار و بی طرفانه، همانطور که در مرجع توضیح داده شد، کمی کند.علاوه بر این، رنگ‌آمیزی تری کروم ماسون درصد کمتری از فیبروز را در شرایط MS در مقایسه با شرایط کنترل در روز 12 کشت نشان داد (شکل 3c).در حالی که CTCM زنده ماندن بخش های بافت قلب را در روز 12 به سطحی مشابه با بافت تازه قلب افزایش داد، اما به طور قابل توجهی یکپارچگی ساختاری بخش های قلب را بهبود نداد.
یک نمودار نواری کمیت زنده ماندن MTT برش‌های قلب تازه (D0) یا کشت برش‌های قلب را به مدت 12 روز در کشت استاتیک (D12 Ctrl) یا در CTCM (D12 MC) نشان می‌دهد (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC، یک طرفه از آزمایش‌های مختلف #p# MC انجام می‌شود. 0.0001 در مقایسه با D0 و **p < 0.01 در مقایسه با D12 Ctrl). یک نمودار میله ای کمیت زنده ماندن MTT برش های قلب تازه (D0) یا کشت برش های قلب را به مدت 12 روز در کشت استاتیک (D12 Ctrl) یا در CTCM (D12 MC) نشان می دهد (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 Ctrl، 12 (D12 MC، یک روش مختلف انجام می شود. 0.0001 در مقایسه با D0 و **p < 0.01 در مقایسه با D12 Ctrl).هیستوگرام کمیت زنده ماندن مقاطع قلب تازه MTT (D0) یا کشت مقاطع قلب را به مدت 12 روز در هر دو روش کشت استاتیک (کنترل D12) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (کنترل D12).####p < 0,0001 در сравнению с D0 و **p < 0,01 در сравнению با D12 Ctrl). ####p <0.0001 در مقایسه با D0 و **p <0.01 در مقایسه با D12 Ctrl). یک 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 东朋0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01). یک 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相*)*هیستوگرام نشان دهنده کمیت زنده ماندن MTT در بخش های قلب تازه (D0) یا بخش های قلب کشت شده به مدت 12 روز در کشت استاتیک (کنترل D12) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (کنترل D12))، 12 (D12 MC) بخش/گروه از آزمایش ANOVA مختلف؛####p < 0,0001 در сравнению с D0، ** p < 0,01 در сравнению با D12 Ctrl). ####p <0.0001 در مقایسه با D0، **p <0.01 در مقایسه با D12 Ctrl).b Troponin-T (سبز)، کانکسین 43 (قرمز) و DAPI (آبی) در بخش‌های قلب تازه جدا شده (D0) یا بخش‌های قلب تحت شرایط استاتیک (Ctrl) یا شرایط CTCM (MC) به مدت 12 روز) از تصاویر ایمونوفلورسانس نماینده (مقیاس خالی = 100 میکرومتر) کشت داده شده‌اند. کمی سازی هوش مصنوعی یکپارچگی ساختاری بافت قلب (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برش/گروه هر کدام از خوک های مختلف، آزمون ANOVA یک طرفه انجام می شود؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ****p <0.01 در مقایسه با D100. کمی سازی هوش مصنوعی یکپارچگی ساختاری بافت قلب (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برش/گروه هر کدام از خوک های مختلف، تست ANOVA یک طرفه انجام می شود؛ ####p < 0.0001 در مقایسه با D0 و ****p <0.01 در مقایسه با C12. Количественная оценка структурной целности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) срезов/групп со разных свиней, проводится однофакторн, проводится однофакторны, проводится однофакторны, проводится однофакторн. D0 و ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). کمی سازی یکپارچگی ساختاری بافت قلب توسط هوش مصنوعی (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) بخش/گروه از خوک های مختلف، تست ANOVA یک طرفه انجام شد؛ ####p <0.0001 در مقابل با D0 و ****p <1trl در مقایسه با D10.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برش/گروه هر کدام از خوک های مختلف، تست ANOVA یک طرفه.###0D0;比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, n=#0 D00, نسبت 0، 0، 0، 0، 0، 0،00، внения ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). c تصاویر معرف (سمت چپ) و کمی سازی (راست) برای برش های قلب رنگ آمیزی شده با رنگ تری کروم ماسون (Scale bare = 500 μm) (n = 10 برش/گروه هر کدام از خوک های مختلف، تست ANOVA یک طرفه انجام می شود؛ #### p < 0.0001 < 0.001 C و 0. c تصاویر معرف (سمت چپ) و تعیین کمیت (راست) مقاطع قلب رنگ آمیزی شده با لکه تری کروم ماسون (مقیاس بدون پوشش = 500 میکرومتر) (n = 10 بخش/گروه از خوک های مختلف، آزمایش ANOVA یک طرفه انجام شد؛ ### p < 0.0001 در مقایسه با D0.1 ***p<0.001). ج切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比Ｘ0*** C . c Репрезентативные изображения (слева) и количественный آنлиз (справа) срезов سرдца, окрашенных трихромным красителем Massona (чистая шкала = 500 mkm) (n = 10 sresov/grupa, cadry تحلیل кторного дисперсионного ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c تصاویر معرف (سمت چپ) و کمیت (راست) مقاطع قلب رنگ آمیزی شده با لکه تری کروم ماسون (جای خالی = 500 میکرومتر) (n = 10 بخش/گروه، هر کدام از خوک متفاوت، آزمایش شده توسط آنالیز واریانس یک طرفه؛ ### # p < 0.0001 ***p <1 D0، در مقایسه با D0).نوارهای خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف استاندارد است.
ما فرض کردیم که با افزودن مولکول‌های کوچک به محیط کشت، می‌توان یکپارچگی کاردیومیوسیت را بهبود بخشید و رشد فیبروز را در طول کشت CTCM کاهش داد.بنابراین ما مولکول‌های کوچک را با استفاده از کشت‌های کنترل استاتیک20،21 به دلیل تعداد کمی از عوامل مخدوش‌کننده غربال کردیم.دگزامتازون (Dex)، تری یدوتیرونین (T3)، و SB431542 (SB) برای این غربال انتخاب شدند.این مولکول‌های کوچک قبلاً در کشت‌های hiPSC-CM برای القای بلوغ کاردیومیوسیت‌ها با افزایش طول سارکومر، لوله‌های T و سرعت هدایت استفاده شده‌اند.علاوه بر این، هر دو Dex (یک گلوکوکورتیکوئید) و SB برای سرکوب التهاب شناخته شده اند 29،30.بنابراین، ما آزمایش کردیم که آیا گنجاندن یک یا ترکیبی از این مولکول‌های کوچک، یکپارچگی ساختاری بخش‌های قلب را بهبود می‌بخشد.برای غربالگری اولیه، دوز هر ترکیب بر اساس غلظت‌هایی که معمولاً در مدل‌های کشت سلولی استفاده می‌شود (1 میکرومولار Dex27، 100 نانومولار T327 و 2.5 میکرومولار SB31) انتخاب شد.پس از 12 روز کشت، ترکیب T3 و Dex منجر به یکپارچگی ساختاری کاردیومیوسیت بهینه و حداقل بازسازی فیبری شد (شکل های تکمیلی 4 و 5).علاوه بر این، استفاده از دو یا دو برابر این غلظت‌های T3 و Dex در مقایسه با غلظت‌های معمولی اثرات مضری ایجاد کرد (شکل تکمیلی 6a,b).
پس از غربالگری اولیه، ما یک مقایسه سر به سر از 4 شرایط کشت را انجام دادیم (شکل 4a): Ctrl: بخش های قلب در کشت استاتیکی که قبلاً توضیح داده شد با استفاده از محیط بهینه سازی شده ما کشت داده شدند.20.21 TD: T3 و Ctrl s Dex در چهارشنبه اضافه شد.MC: مقاطع قلب در CTCM با استفاده از محیط بهینه شده قبلی ما کشت داده شدند.و MT: CTCM با T3 و Dex اضافه شده به رسانه.پس از 12 روز کشت، زنده ماندن بافت‌های MS و MT مانند بافت‌های تازه ارزیابی‌شده با روش MTT باقی ماند (شکل 4b).جالب توجه است که افزودن T3 و Dex به کشت‌های transwell (TD) منجر به بهبود قابل‌توجهی در زنده‌مانی در مقایسه با شرایط Ctrl نشد، که نشان‌دهنده نقش مهم تحریک مکانیکی در حفظ زنده‌مانی بخش‌های قلب است.
یک نمودار طراحی آزمایشی که چهار شرایط کشت مورد استفاده را برای ارزیابی اثرات تحریک مکانیکی و مکمل T3/Dex روی محیط به مدت 12 روز نشان می‌دهد. ب نمودار میله ای کمیت زنده ماندن را 12 روز پس از کشت در هر 4 شرایط کشت (Ctrl، TD، MC، و MT) در مقایسه با برش های قلب تازه (D0) نشان می دهد (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD و D12 MT)، 12 (D12 MC، تست یک گروه متفاوت از #p#p. 0.0001، ###p < 0.001 در مقایسه با D0 و **p < 0.01 در مقایسه با D12 ctrl). b GISTOGRAMMA 12 روز بعد از پایان دوره آموزشی در هر 4 شرط (کنترل، TD، MC و MT) به دلیل 12 روز بعد از پایان دوره D12 TD و D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится رابطهторонний тест ANOVA؛ ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению со D0 и **1 сравни сравний сравний 0,0. b نمودار میله ای کمیت زنده ماندن را در 12 روز پس از کشت در هر 4 شرایط کشت (شاهد، TD، MC، و MT) در مقایسه با مقاطع قلب تازه (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD، و D12 MT)، 12 (D12 یک طرفه MC) از بخش های مختلف #p#p، MC نشان می دهد. 001، ###p < 0.001 در مقابل D0 و **p < 0.01 در مقایسه با Ctrl D12). b. D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.0001，#0##p <0.0001，#0##p < 0.01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 شرطя культивирования (کنترل، TD، MC و MT) در sravneniyu با свежими срезами سرдца (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD2، D12 TD2 و D12) группа, رابطهторонний тест ANOVA؛ ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). نمودار میله‌ای مقدار شار گلوکز را 12 روز پس از کشت در هر 4 شرایط کشت (Ctrl، TD، MC، و MT) در مقایسه با برش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (n = 6 برش/گروه از خوک‌های مختلف، تست ANOVA یک طرفه انجام می‌شود؛ ###p <0.00/1 و D20p<0.001 در مقایسه با C). نمودار میله‌ای مقدار شار گلوکز را 12 روز پس از کشت در هر 4 شرایط کشت (Ctrl، TD، MC، و MT) در مقایسه با برش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (n = 6 برش/گروه از خوک‌های مختلف، تست ANOVA یک طرفه انجام می‌شود؛ ###p <0.00/1 و D20p<0.001 در مقایسه با C). c . й, رابطهторонний Выполняется тест ANOVA؛ ###p < 0,001 по сравнению с D0 و ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c هیستوگرام کمی شار گلوکز را 12 روز پس از کشت تحت هر 4 شرایط کشت (شاهد، TD، MC و MT) در مقایسه با بخش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (n = 6 بخش/گروه از خوک‌های مختلف، آزمایش ANOVA یک طرفه انجام شد؛ ###p < 0.001 در مقایسه با D0 و 0.1***p < 0.001). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掯2，糖通量定量（n = ۶ عکس من . C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 عکس / 组试；###p < 0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c . от разных свиней, رابطهторонний Были проведены тесты ANOVA؛ ###p < 0,001 در сравнению с D0, ***p < 0,001 در сравнению со D12 (کنترل). c هیستوگرام کمی شار گلوکز را در 12 روز پس از کشت برای هر 4 شرایط کشت (شاهد، TD، MC، و MT) در مقایسه با بخش‌های قلب تازه (D0) نشان می‌دهد (6 بخش/گروه، از خوک‌های مختلف، آزمایش‌های ANOVA یک طرفه انجام شد، ###p <0.00p <0.001 در مقایسه با شاهد).d نمودار آنالیز کرنش بافت‌های تازه (آبی)، روز 12 MC (سبز) و روز 12 MT (قرمز) در ده نقطه برش بافت منطقه‌ای (4 برش در گروه، آزمون ANOVA یک طرفه؛ تفاوت معنی‌داری بین گروه‌ها وجود نداشت).نمودار آتشفشانی که ژن‌های بیان شده متفاوت را در بخش‌های قلب تازه (D0) در مقایسه با بخش‌های قلب کشت‌شده در شرایط استاتیک (Ctrl) یا تحت شرایط MT (MT) به مدت 10-12 روز نشان می‌دهد.f نقشه حرارتی ژن‌های سارکومر برای بخش‌های قلب کشت‌شده در هر یک از شرایط کشت.نوارهای خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف استاندارد است.
وابستگی متابولیک به تغییر از اکسیداسیون اسیدهای چرب به گلیکولیز یکی از مشخصه های تمایز زدایی کاردیومیوسیت ها است.کاردیومیوسیت‌های نابالغ عمدتاً از گلوکز برای تولید ATP استفاده می‌کنند و میتوکندری‌های هیپوپلاستیک با تعداد کمی کریستا ۵،۳۲ دارند.تجزیه و تحلیل استفاده از گلوکز نشان داد که در شرایط MC و MT، استفاده از گلوکز مشابه با بافت‌های روز صفر بود (شکل 4c).با این حال، نمونه های Ctrl افزایش قابل توجهی در استفاده از گلوکز در مقایسه با بافت تازه نشان دادند.این نشان می‌دهد که ترکیب CTCM و T3/Dex زنده‌مانی بافت را افزایش می‌دهد و فنوتیپ متابولیکی بخش‌های قلب کشت‌شده 12 روزه را حفظ می‌کند.علاوه بر این، تجزیه و تحلیل کرنش نشان داد که سطوح کرنش به مدت 12 روز در شرایط MT و MS مانند بافت قلب تازه باقی مانده است (شکل 4d).
جالب توجه است که بخش‌های MT شباهت رونویسی بالایی را به بافت تازه قلب نشان می‌دهند، با تنها 16 ژن از 13642 ژن بیان شده است.این داده ها توسط qRT-PCR ژن های قلب و فیبروبلاست تایید شد (شکل تکمیلی 7a-c).جالب توجه است که بخش‌های Ctrl نشان‌دهنده کاهش ژن‌های چرخه‌ی قلب و سلولی و فعال‌سازی برنامه‌های ژن التهابی است.این داده‌ها نشان می‌دهند که تمایز زدایی، که معمولاً پس از کشت طولانی‌مدت رخ می‌دهد، در شرایط MT کاملاً کاهش می‌یابد (شکل تکمیلی 8a,b).مطالعه دقیق ژن‌های سارکومر نشان داد که تنها در شرایط MT، ژن‌های کدکننده سارکومر (شکل 4f) و کانال یونی (شکل تکمیلی 9) حفظ می‌شوند و آنها را از سرکوب تحت شرایط Ctrl، TD و MC محافظت می‌کند.این داده ها نشان می دهد که با ترکیبی از تحریک مکانیکی و هومورال (T3/Dex)، رونوشت برش قلب می تواند پس از 12 روز در کشت مشابه برش های قلب تازه باقی بماند.
این یافته‌های رونویسی با این واقعیت پشتیبانی می‌شوند که یکپارچگی ساختاری کاردیومیوسیت‌ها در بخش‌های قلب به بهترین وجه تحت شرایط MT برای 12 روز حفظ می‌شود، همانطور که توسط کانکسین 43 دست نخورده و موضعی نشان داده شده است (شکل 5a).علاوه بر این، فیبروز در مقاطع قلب تحت شرایط MT به طور قابل توجهی در مقایسه با Ctrl و مشابه مقاطع قلب تازه کاهش یافت (شکل 5b).این داده ها نشان می دهد که ترکیبی از تحریک مکانیکی و درمان T3/Dex به طور موثر ساختار قلب را در بخش های قلب در فرهنگ حفظ می کند.
تصاویر ایمونوفلورسانس نماینده تروپونین-T (سبز)، کانکسین 43 (قرمز) و DAPI (آبی) در بخش های قلب تازه ایزوله شده (D0) یا به مدت 12 روز در هر چهار شرایط کشت برش قلب (نوار مقیاس = 100 میکرومتر) کشت داده شدند.). Количественная оценка структурной целности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) срезов/группу от разных свиней, 01 با sravneniyu با D0 و *p < 0,05 یا ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). کمی سازی یکپارچگی ساختاری بافت قلب با استفاده از هوش مصنوعی (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) بخش/گروه از خوک های مختلف، تست ANOVA یک طرفه انجام شد؛ #### p <0.0001 در مقایسه با D0 و *p 0.5 <0.对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 和D12 MC工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p 2tr1D 与0p <1对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mＥ2 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 C相比）.کمی سازی یکپارچگی ساختاری بافت قلب با استفاده از هوش مصنوعی در خوک های مختلف (n = 7 (D0 و D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC و D12 MT) بخش/گروه) با آزمون ANOVA یک طرفه.#### p < 0,0001 по сравнению с D0 و *p < 0,05 یا ****p < 0,0001 по сравнению با D12 Ctrl). b تصاویر نشان دهنده و تعیین کمیت برای برش های قلب رنگ آمیزی شده با رنگ تری کروم ماسون (نوار مقیاس = 500 میکرومتر) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، و D12 MC)، 9 (D12 MT) برش/گروه از خوک های مختلف در مقایسه با A#0#0 آزمایش انجام می شود. و ***p <0.001، یا ****p <0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). b تصاویر نشان دهنده و تعیین کمیت برای برش های قلب رنگ آمیزی شده با رنگ تری کروم ماسون (نوار مقیاس = 500 میکرومتر) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، و D12 MC)، 9 (D12 MT) برش/گروه از خوک های مختلف در مقایسه با A#0#0 آزمایش انجام می شود. و ***p <0.001، یا ****p <0.0001 در مقایسه با D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD MT/D12 Ctrl, D12 TD, D12 TD) و ых свиней, выполняется رابطهторонний тест ANOVA؛ ####p < 0,0001 در сравнению с D0 و ***p < 0,001 یا ****p < 0,0001 با sravneniyu با D12 Ctrl). b تصاوير نماينده و تعيين كمي مقاطع قلب رنگ آميزي شده با رنگ تريكروم ماسون (نوار مقياس = 500 ميكرومتر) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD و D12 MC)، 9 (D12 MT) بخش/گروه از خوك‌هاي مختلف، انجام شده يك طرفه ##0#0<0. 001 یا ****p < 0.0001 در مقابل D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）10（D1）10D1=D和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； <1####P0 0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов سرдца, окрашенных трихромом Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD و D12 MC) , один- способ ANOVA؛ ####p < 0,0001 در سравнению с D0, ***p < 0,001 یا ****p < 0,0001 در سравнению با D12 Ctrl). نوارهای خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف استاندارد است.
در نهایت، توانایی CTCM برای تقلید هیپرتروفی قلبی با افزایش کشش بافت قلب ارزیابی شد.در CTCM، حداکثر فشار محفظه هوا از 80 میلی متر جیوه به 80 میلی متر جیوه افزایش یافت.هنر(کشش طبیعی) تا 140 میلی متر جیوه هنر.(شکل 6a).این مربوط به افزایش 32 درصدی کشش است (شکل 6b)، که قبلاً به عنوان درصد کشش متناظر مورد نیاز برای برش های قلب برای دستیابی به طول سارکومر مشابه آنچه در هیپرتروفی دیده می شود نشان داده شده بود.کشش و سرعت بافت قلب در طول انقباض و آرامش در طول شش روز کشت ثابت باقی ماند (شکل 6c).بافت قلب از شرایط MT به مدت شش روز تحت کشش طبیعی (MT (طبیعی)) یا شرایط بیش از حد کشش (MT (OS)) قرار گرفت.علاوه بر این، پس از شش روز کشت، اندازه سلول در MT (OS) (شکل 7b) به طور قابل توجهی در مقایسه با بخش‌های قلب MT (طبیعی) افزایش یافت.علاوه بر این، جابجایی هسته ای NFATC4 به طور قابل توجهی در بافت های بیش از حد کشیده افزایش یافته است (شکل 7c).این نتایج نشان‌دهنده توسعه پیشرونده بازسازی پاتولوژیک پس از اتساع بیش از حد است و از این مفهوم حمایت می‌کند که دستگاه CTCM می‌تواند به عنوان یک پلت فرم برای مطالعه سیگنال‌های هیپرتروفی قلبی ناشی از کشش استفاده شود.
نشان‌دهنده فشار محفظه هوا، فشار محفظه سیال و اندازه‌گیری‌های حرکت بافت تأیید می‌کند که فشار محفظه فشار محفظه مایع را تغییر می‌دهد و باعث حرکت متناظر برش بافت می‌شود.b نشان دهنده درصد کشش و منحنی‌های نرخ کشش برای بخش‌های بافت معمولی کشیده (نارنجی) و بیش از حد کشیده شده (آبی).c نمودار میله ای که زمان چرخه (n = 19 برش در هر گروه، از خوک های مختلف)، زمان انقباض (n = 18-19 برش در هر گروه، از خوک های مختلف)، زمان استراحت (n = 19 برش در هر گروه، از خوک های مختلف))، دامنه حرکت بافت (n = 14 برش/گروه)، 14 برش/گروه، از متفاوت است. از خوک های مختلف) و اوج میزان آرامش (n = 14 (D0)، 15 (D6)) بخش/گروه) از خوک های مختلف)، آزمون t دانشجوی دو دنباله تفاوت معنی داری در هیچ پارامتری نشان نداد، که نشان می دهد این پارامترها در طول 6 روز کشت با اضافه ولتاژ ثابت مانده اند.نوارهای خطا نشان دهنده میانگین ± انحراف استاندارد است.
نمودار نواری غلظت NT-ProBNP در محیط کشت از برش های قلب کشت شده در شرایط کشش طبیعی MT (Norm) یا کشش بیش از حد (OS) (n=4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm و D4 MTOS) برش/گروه **1p از خوک های مختلف <0، مقایسه شده است.هیستوگرام کمی غلظت NT-ProBNP در محیط کشت از برش های قلب کشت شده تحت شرایط کشش طبیعی MT (هنجار) یا بیش از حد کشش (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm و D4). MTOS) برش / گروه از خوک های مختلف تجزیه و تحلیل واریانس انجام شد.**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 در مقایسه با کشش نرمال). کمی سازی غلظت NT-ProBNP در برش های قلب کشت شده تحت شرایط کشش نرمال MT (Norm) یا کشش بیش از حد (OS) (n=4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm和D4 MTOS) از 猪的切片/组＄动؛ **در مقایسه با کشش طبیعی، p <0.01).هیستوگرام کمی غلظت NT-ProBNP در برش های قلب کشت شده تحت شرایط کشش طبیعی MT (هنجار) یا بیش از حد کشش (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm) و D4 MTOS) برش / گروه از خوک های مختلف، تجزیه و تحلیل واریانس دو طرفه.**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 در مقایسه با کشش نرمال). b تصاویر نشان‌دهنده برش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با تروپونین-T و WGA (سمت چپ) و اندازه‌گیری اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) سلول/گروه از 10 برش مختلف از خوک‌های مختلف، آزمون t-test Student t-test در مقایسه با نرمال 0 ****p انجام شد. b تصاویر نشان‌دهنده برش‌های قلب رنگ‌آمیزی شده با تروپونین-T و WGA (چپ) و اندازه‌گیری اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) سلول/گروه از 10 برش مختلف از خوک‌های مختلف، آزمون کشش دو طرفه Student t-p<0 با نرمال مقایسه شد. ****0). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных troponinom-T و AZP (слева) و گروه خصوصیات مشخصیя размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) - проводится хвостовой t-критерий Стьюдента؛ ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b تصاوير معرفي از مقاطع قلب رنگ‌آميزي شده با تروپونين-T و AZP (چپ) و اندازه‌گيري اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) سلول/گروه از 10 بخش مختلف از خوك‌هاي مختلف، آزمون t دانشجويي دو دنباله در 0.000 نرمال انجام شد. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表惞3 ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甸t比，****p <0.0001）. b تصاویری از برش‌های قلب رنگ‌شده با calcarein-T و WGA (سمت چپ) و اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 از 10 برش مختلف (D6 MTNorm)) سلول‌ها/组，两方柕有0.0001). b تصاویر نمایانگر مقاطع قلب رنگ‌آمیزی شده با تروپونین-T و AZP (سمت چپ) و اندازه‌گیری اندازه سلول (راست) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) از 10 بخش مختلف از خوک‌های مختلف) سلول‌ها/گروه، معیار دو دم دانشجویی t. c تصاویر نمایشی برای روز 0 و روز 6 برش قلب MTOS نشاندار شده برای تروپونین-T و NFATC4 و تعیین کمیت انتقال NFATC4 به هسته های CMs (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) برش/گروه از خوک های مختلف، Two-tailed Student tp. c تصاویر نمایشی برای روز 0 و روز 6 برش قلب MTOS نشاندار شده برای تروپونین-T و NFATC4 و تعیین کمیت انتقال NFATC4 به هسته های CMs (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) برش / گروه از خوک های مختلف، Student tp <0-test انجام شد. c. ных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента؛ *p < 0,05). c تصاویر نمایشی برای مقاطع قلب در MTOS 0 و 6 روز، نشاندار شده برای تروپونین-T و NFATC4، و تعیین کمیت جابجایی NFATC4 در هسته سلول‌های غار (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) برش / گروه از خوک‌های مختلف دانش‌آموزان دو دم آزمایش شدند.*p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性弛的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组، 进行双尾学甪t 。 0 c تصاویری از calcanin-T و NFATC4 نشان‌گذاری ایمنی 第0天和第6天MTOS برش‌های قلب، و NFATC4 از هسته سلول NFATC4 易位至CM 的 کمیت (n = 4 (D6 MTOS)،间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 و 6 روز для иммуномаркировки troponinom-T و NFATC4 و количественная оценка транслокации NFATC4 در ядра CM от разных свипай (n = 3 (D MT6) -критерий Стьюдента؛ *p < 0,05).
تحقیقات قلبی عروقی ترجمه‌ای به مدل‌های سلولی نیاز دارد که محیط قلبی را با دقت بازتولید کنند.در این مطالعه، یک دستگاه CTCM ساخته و مشخص شد که می‌تواند بخش‌های بسیار نازک قلب را تحریک کند.سیستم CTCM شامل تحریک الکترومکانیکی هماهنگ فیزیولوژیکی و غنی‌سازی مایع T3 و Dex است.هنگامی که بخش‌های قلب خوک در معرض این عوامل قرار گرفتند، زنده ماندن، یکپارچگی ساختاری، فعالیت متابولیک و بیان رونویسی آن‌ها مانند بافت قلب تازه پس از 12 روز کشت باقی ماند.علاوه بر این، کشش بیش از حد بافت قلب می تواند باعث هیپرتروفی قلب ناشی از هایپراکستنشن شود.
عوامل زیادی در ایجاد یک محیط بهینه برای عملکرد و بقای کاردیومیوسیت ها نقش دارند.بارزترین این عوامل مربوط به (1) فعل و انفعالات بین سلولی، (2) تحریک الکترومکانیکی، (3) عوامل هومورال، و (4) بسترهای متابولیک است.بازسازی چنین فعل و انفعالات پیچیده سلولی در شرایط آزمایشگاهی با کشت توأم انواع سلول های فردی دشوار است، اما می توان به راحتی با استفاده از ماهیت ارگانوتیپی بخش های قلب به دست آورد.
کشش مکانیکی و تحریک الکتریکی کاردیومیوسیت ها برای حفظ فنوتیپ قلبی 33،34،35 حیاتی است.در حالی که تحریک مکانیکی به طور گسترده برای تهویه و بلوغ hiPSC-CM استفاده شده است، چندین مطالعه ظریف اخیراً تحریک مکانیکی برش‌های قلب را با استفاده از بارگذاری تک محوری انجام داده‌اند.این مطالعات نشان می دهد که بارگذاری مکانیکی تک محوری 2 بعدی تأثیر مثبتی بر فنوتیپ قلب در طی کشت دارد.با این حال، این روش‌ها از کشش بافت تک محوری بدون بهینه‌سازی محیطی استفاده می‌کنند که منجر به سرکوب بسیاری از ژن‌های قلبی یا بیان بیش از حد ژن‌های مرتبط با پاسخ‌های کششی غیرطبیعی می‌شود.CTCM شرح داده شده در اینجا یک محرک الکترومکانیکی سه بعدی ارائه می دهد که از چرخه طبیعی قلب از نظر زمان چرخه و کشش فیزیولوژیکی تقلید می کند (25٪ کشش، 40٪ سیستول، 60٪ دیاستول و 72 ضربه در دقیقه).اگرچه این تحریک مکانیکی سه بعدی به تنهایی برای حفظ یکپارچگی بافت کافی نیست، ترکیبی از تحریک هومورال و مکانیکی با استفاده از T3/Dex برای حفظ حیات، عملکرد و یکپارچگی بافت به اندازه کافی مورد نیاز است.
عوامل شوخ طبعی نقش مهمی در تعدیل فنوتیپ قلب بزرگسالان ایفا می کنند.این در مطالعات HiPS-CM که در آن T3 و Dex برای تسریع بلوغ سلولی به محیط کشت اضافه شدند برجسته شد.علاوه بر این، T3 باعث افزایش بیان MHC-α و کاهش تنظیم MHC-β می شود، و باعث ایجاد میوفیبریل های سریع انقباض در کاردیومیوسیت های بالغ در مقایسه با میوفیبریل های کند انقباض در CM جنین می شود.کمبود T3 در بیماران هیپوتیروئیدی منجر به از بین رفتن نوارهای میوفیبریلار و کاهش سرعت رشد تون می شود.
نتایج ما نشان می‌دهد که تحریک مکانیکی فیزیکی (MS) عملکرد کلی کشت را در مقایسه با Ctrl بهبود می‌بخشد، اما در حفظ زنده‌مانی، یکپارچگی ساختاری و بیان قلبی در طی 12 روز در کشت شکست خورده است.در مقایسه با Ctrl، افزودن T3 و Dex به فرهنگ CTCM (MT) زنده‌مانی را بهبود بخشید و پروفایل‌های رونویسی مشابه، یکپارچگی ساختاری و فعالیت متابولیک را با بافت تازه قلب به مدت 12 روز حفظ کرد.علاوه بر این، با کنترل میزان کشش بافت، یک مدل هیپرتروفی قلبی ناشی از اکستنشن با استفاده از STCM ایجاد شد که تطبیق پذیری سیستم STCM را نشان می‌دهد.به میوفیبروبلاست هالازم به ذکر است که پارامترهای CTCM را می توان با تغییر دامنه فشار/الکتریکی و فرکانس برای شبیه سازی بسیاری از شرایط مانند تاکی کاردی، برادی کاردی و پشتیبانی مکانیکی گردش خون (قلب بدون بار مکانیکی) مدوله کرد.در نتیجه، مطالعه حاضر نشان می‌دهد که کشش مکانیکی و تحریک هومورال برای حفظ کشت بخش‌های بافت قلب حیاتی هستند.
اگرچه داده های ارائه شده در اینجا نشان می دهد که CTCM یک پلت فرم بسیار امیدوارکننده برای مدل سازی میوکارد دست نخورده است، این روش کشت دارای محدودیت هایی است.محدودیت اصلی کشت CTCM این است که فشارهای مکانیکی دینامیکی مداوم بر برش‌ها تحمیل می‌کند، که از توانایی نظارت فعال بر انقباضات برش قلبی در طول هر چرخه جلوگیری می‌کند.علاوه بر این، به دلیل اندازه کوچک مقاطع قلبی (7 میلی متر)، توانایی ارزیابی عملکرد سیستولیک خارج از سیستم های کشت با استفاده از حسگرهای نیروی سنتی محدود است.با این حال، این محدودیت نیاز به کار بیشتری دارد و ممکن است در آینده با معرفی روش‌هایی برای نظارت نوری بر عملکرد برش‌های قلب در فرهنگ، مانند نقشه‌برداری نوری با استفاده از کلسیم و رنگ‌های حساس به ولتاژ، برطرف شود.در CTCM، فشار در جهت مخالف برای بازتولید 25% کشش فیزیولوژیکی در دیاستول (کشش کامل) و سیستول (طول انقباض در طول تحریک الکتریکی) در بافت‌های بسیار بزرگ القا شد.این محدودیت باید در طراحی‌های بعدی CTCM با فشار کافی بر بافت قلب از هر دو طرف و با اعمال روابط فشار-حجم دقیقی که در حفره‌های قلب رخ می‌دهد برطرف شود.
بنابراین، این مدل می تواند در مطالعه سیگنالینگ هیپرتروفیک ناشی از کشش بدون نیاز به عوامل هومورال یا عصبی (که در این سیستم وجود ندارد) کمک کند.مطالعات بیشتری برای افزایش تعدد CTCM مورد نیاز است، به عنوان مثال، کشت همزمان با سلول های ایمنی، عوامل هومورال پلاسما در گردش، و عصب دهی هنگام کشت همزمان با سلول های عصبی، امکان مدل سازی بیماری با CTCM را بهبود می بخشد.
در این مطالعه از سیزده خوک استفاده شد.تمام روش های حیوانی مطابق با دستورالعمل های سازمانی انجام شد و توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات موسسه دانشگاه لوئیزویل تایید شد.قوس آئورت بسته شد و قلب با 1 لیتر کاردیوپلژی استریل (110 میلی‌مولار NaCl، 1.2 میلی‌مولار CaCl2، 16 میلی‌مولار KCl، 16 میلی‌مولار MgCl2، 10 میلی‌مولار NaHCO3، 5 U/mL هپارین، pH تا 7) پرفیوژن شد. قلب ها در محلول کاردیوپلژیک سرد یخی تا زمانی که به آزمایشگاه روی یخ که معمولاً کمتر از 10 دقیقه است، منتقل شدند. قلب ها در محلول کاردیوپلژیک سرد یخی تا زمانی که به آزمایشگاه روی یخ که معمولاً کمتر از 10 دقیقه است، منتقل شدند. سردца хранили در ледяном кардиоплегическом محلوله تا حمل و نقل در آزمایشگاه های لدو، chto obыchno زیر 10 دقیقه. قلب ها در محلول کاردیوپلژیک سرد با یخ تا انتقال به آزمایشگاه روی یخ ذخیره می شدند که معمولا کمتر از 10 دقیقه طول می کشد.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钒将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钒 Держите сердца во ледяной кардиоплегии до транспортировки در آزمایشگاه های льду, обычно <10 دقیقه.
حلقه پشتیبان با قطر 7 میلی متر از پلی اتیلن با چگالی بالا (HDPE) در مرکز ساخته شده است و دارای یک شیار اورینگ برای قرار دادن حلقه اورینگ سیلیکونی مورد استفاده برای آب بندی محیط زیر است.یک غشای سیلیسی نازک محفظه کشت را از صفحه جداسازی جدا می کند.غشای سیلیکونی برش لیزری از ورق سیلیکونی 0.02 اینچ و دارای سختی 35A است.
سوکت‌های اتصال دستگاه سوئیسی روی PCB توسط سیم‌های مسی با روکش نقره و پیچ‌های برنزی 0-60 که در الکترودها پیچ می‌شوند به الکترودهای گرافیتی متصل می‌شوند.
دستگاه CTCM توسط یک محرک پنوماتیک قابل برنامه ریزی (PPD) کنترل می شود که فشار گردش خون کنترل شده ای شبیه به چرخه قلبی ایجاد می کند.با افزایش فشار داخل محفظه هوا، غشای سیلیکونی انعطاف‌پذیر به سمت بالا منبسط می‌شود و محیط را تحت فشار قرار می‌دهد.سپس ناحیه بافت با این دفع مایع کشیده می‌شود و از انبساط فیزیولوژیکی قلب در طول دیاستول تقلید می‌کند.در اوج آرامش، تحریک الکتریکی از طریق الکترودهای گرافیتی اعمال شد که باعث کاهش فشار در محفظه هوا و انقباض برش‌های بافت شد.در داخل لوله یک دریچه هموستاتیک با سنسور فشار برای تشخیص فشار در سیستم هوا وجود دارد.فشاری که توسط سنسور فشار حس می شود به یک جمع کننده داده متصل به لپ تاپ اعمال می شود.این امکان نظارت مداوم بر فشار داخل محفظه گاز را فراهم می کند.وقتی به حداکثر فشار محفظه رسید (استاندارد 80 میلی‌متر جیوه، سیستم‌عامل 140 میلی‌متر جیوه)، به دستگاه جمع‌آوری داده دستور داده شد تا سیگنالی را به سیستم C-PACE-EM ارسال کند تا یک سیگنال ولتاژ دو فازی برای 2 میلی‌ثانیه تولید کند که روی 4 ولت تنظیم شده است.
برش های قلب گرفته شد و شرایط کشت در 6 چاه به شرح زیر انجام شد: قلب های برداشت شده را از ظرف انتقال به سینی حاوی کاردیوپلژی سرد (4 درجه سانتی گراد) منتقل کنید.بطن چپ با یک تیغه استریل جدا شده و به قطعات 1-2 سانتی متر مکعب بریده شد.این بلوک‌های بافتی با چسب بافت به تکیه‌گاه‌های بافت متصل شدند و در یک حمام بافتی میکروتوم ارتعاشی حاوی محلول تیرود قرار داده شدند و به طور مداوم اکسیژن (3 گرم در لیتر 2،3-بوتاندیون منواکسیم (BDM)، 140 میلی‌مولار NaCl (8.18 گرم)، 6 میلی‌مولار KCl1.6، mM470 g10 (0). میلی‌مولار HEPES (2.38 گرم)، 1 میلی‌مولار MgCl2 (1 میلی‌لیتر محلول 1 مولار)، 1.8 میلی‌مولار CaCl2 (1.8 میلی‌لیتر محلول 1 مولار)، تا 1 لیتر ddH2O).میکروتوم ارتعاشی برای برش برش‌هایی با ضخامت 300 میکرومتر در فرکانس 80 هرتز، دامنه ارتعاش افقی 2 میلی‌متر و سرعت پیشروی 0.03 میلی‌متر بر ثانیه تنظیم شد.حمام بافت با یخ احاطه شد تا محلول خنک بماند و دما در 4 درجه سانتیگراد حفظ شد.بخش های بافت را از حمام میکروتوم به حمام جوجه کشی حاوی محلول تیرود دائماً اکسیژن دار روی یخ منتقل کنید تا زمانی که بخش های کافی برای یک صفحه کشت به دست آید.برای کشت ترانس چاه، مقاطع بافتی به پایه های پلی یورتان استریل به عرض 6 میلی متر متصل شدند و در 6 میلی لیتر محیط بهینه (199 محیط، 1 برابر مکمل ITS، 10% FBS، 5 نانوگرم در میلی لیتر VEGF، 10 نانوگرم در میلی لیتر FGF-قلیایی و 2X آنتی بیوتیک-ضد قارچ) قرار گرفتند.تحریک الکتریکی (10 ولت، فرکانس 1.2 هرتز) از طریق C-Pace به بخش‌های بافت اعمال شد.برای شرایط TD، T3 و Dex تازه در 100 نانومولار و 1 میکرومولار در هر تغییر محیط اضافه شدند.محیط قبل از جایگزینی 3 بار در روز با اکسیژن اشباع می شود.مقاطع بافتی در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد CO2 کشت داده شدند.
برای کشت‌های CTCM، بخش‌های بافت روی یک چاپگر سه بعدی سفارشی در ظرف پتری حاوی محلول اصلاح‌شده تایرود قرار داده شد.این دستگاه به گونه ای طراحی شده است که اندازه برش قلب را تا 25 درصد از مساحت حلقه نگهدارنده افزایش می دهد.این کار به گونه ای انجام می شود که بخش های قلب پس از انتقال از محلول تیرود به محیط و در هنگام دیاستول کشیده نشوند.با استفاده از چسب هیستواکریلیک، برش هایی به ضخامت 300 میکرومتر بر روی یک حلقه نگهدارنده به قطر 7 میلی متر ثابت شدند.پس از اتصال بخش‌های بافت به حلقه نگهدارنده، بخش‌های بافت اضافی را برش دهید و بخش‌های بافت متصل را دوباره در حمام محلول تیرود روی یخ (4 درجه سانتی‌گراد) قرار دهید تا بخش‌های کافی برای یک دستگاه آماده شود.کل زمان پردازش برای همه دستگاه ها نباید بیش از 2 ساعت باشد.پس از اتصال 6 برش بافت به حلقه های نگهدارنده آنها، دستگاه CTCM مونتاژ شد.محفظه کشت CTCM با 21 میلی لیتر محیط از پیش اکسیژنه از قبل پر شده است.بخش های بافت را به محفظه کشت منتقل کنید و با احتیاط حباب های هوا را با پیپت بردارید.سپس بخش بافت به داخل سوراخ هدایت می شود و به آرامی در جای خود فشرده می شود.در نهایت درپوش الکترود را روی دستگاه قرار داده و دستگاه را به دستگاه جوجه کشی منتقل کنید.سپس CTCM را به لوله هوا و سیستم C-PACE-EM متصل کنید.محرک پنوماتیک باز می شود و دریچه هوا CTCM را باز می کند.سیستم C-PACE-EM برای ارائه ولتاژ 4 ولت در 1.2 هرتز در طول ضربان‌سازی دو فازی به مدت 2 میلی‌ثانیه پیکربندی شده است.محیط دو بار در روز و الکترودها یک بار در روز تعویض می شدند تا از تجمع گرافیت روی الکترودها جلوگیری شود.در صورت لزوم، بخش‌های بافت را می‌توان از چاهک‌های کشت خارج کرد تا حباب‌های هوایی که ممکن است در زیر آن‌ها افتاده باشد خارج شود.برای شرایط تیمار MT، T3/Dex تازه با هر تغییر محیط با 100 نانومولار T3 و 1 میکرومولار Dex اضافه شد.دستگاه های CTCM در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد CO2 کشت داده شدند.
برای به دست آوردن مسیرهای کشیده برش های قلب، یک سیستم دوربین ویژه ایجاد شد.یک دوربین SLR (Canon Rebel T7i، کانن، توکیو، ژاپن) با لنز ماکرو 18-108 میلی‌متری Navitar Zoom 7000 (Navitar، San Francisco، CA) استفاده شد.تجسم پس از جایگزینی محیط با محیط تازه در دمای اتاق انجام شد.دوربین در زاویه 51 درجه قرار دارد و فیلم با سرعت 30 فریم بر ثانیه ضبط می شود.ابتدا از نرم افزار متن باز (MUSCLEMOTION43) با Image-J برای تعیین کمیت حرکت برش های قلب استفاده شد.این ماسک با استفاده از MATLAB (MathWorks، Natick، MA، ایالات متحده آمریکا) برای تعریف مناطق مورد علاقه برای برش قلب برای جلوگیری از سر و صدا ایجاد شد.ماسک های تقسیم شده به صورت دستی بر روی همه تصاویر در یک توالی فریم اعمال می شوند و سپس به پلاگین MUSCLEMOTION ارسال می شوند.حرکت ماهیچه ای از میانگین شدت پیکسل ها در هر فریم برای تعیین کمیت حرکت آن نسبت به فریم مرجع استفاده می کند.داده ها ثبت شد، فیلتر شد و برای تعیین کمیت زمان چرخه و ارزیابی کشش بافت در طول چرخه قلبی استفاده شد.ویدئوی ضبط شده با استفاده از فیلتر دیجیتال درجه اول صفر مرحله پس پردازش شد.برای تعیین کمیت کشش بافت (اوج به اوج)، آنالیز اوج به اوج برای تمایز بین قله ها و فرورفتگی ها در سیگنال ثبت شده انجام شد.
برای تجزیه و تحلیل کرنش، با استفاده از ویدئوهای مشابه ایجاد شده برای ارزیابی کشش مکانیکی، ابتدا دو تصویر را که نشان دهنده پیک حرکت (بالاترین (بالایی) و پایین‌ترین (پایین) نقاط حرکتی) با توجه به نرم‌افزار MUSCLEMOTION هستند، ردیابی کردیم.سپس نواحی بافت را قطعه‌بندی کردیم و شکلی از الگوریتم سایه‌زنی را روی بافت قطعه‌بندی شده اعمال کردیم (شکل تکمیلی 2a).سپس بافت قطعه بندی شده به ده سطح زیرین تقسیم شد و تنش روی هر سطح با استفاده از معادله زیر محاسبه شد: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown، که در آن Sup و Sdown به ترتیب فاصله شکل از سایه های بالا و پایین پارچه هستند (شکل تکمیلی .2b).
بافت های ثابت در ساکارز 10 و 20 درصد به مدت 1 ساعت و سپس در ساکارز 30 درصد یک شبه آبگیری شدند.اسلایدها به صورت مقاطعی با ضخامت 8 میکرومتر تهیه شدند.
برای حذف OCT از بخش های قلب، اسلایدها را روی یک بلوک حرارتی در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه گرم کنید.1 میلی لیتر PBS را به هر لام اضافه کنید و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید، سپس با تنظیم 0.1% Triton-X در PBS به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق، بخش ها را نفوذ دهید.برای جلوگیری از اتصال آنتی بادی های غیر اختصاصی به نمونه، 1 میلی لیتر محلول BSA 3 درصد را به لام ها اضافه کنید و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.سپس BSA برداشته شد و لام ها با PBS شسته شدند.هر نمونه را با مداد علامت گذاری کنید.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) با غلظت 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر در PBS برای رنگ‌آمیزی WGA استفاده شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق روی مقاطع ثابت اعمال شد.سپس لام ها با PBS شسته شدند و به هر لام سیاه سودان اضافه شد و به مدت 30 دقیقه انکوبه شد.سپس اسلایدها با PBS شسته شدند و محیط جاسازی وکتاشیلد به آن اضافه شد.اسلایدها روی میکروسکوپ کینس با بزرگنمایی 40 برابر مشاهده شدند.
OCT همانطور که در بالا توضیح داده شد از نمونه ها حذف شد.پس از برداشتن OCT، اسلایدها را یک شب در محلول Bouin غوطه ور کنید.سپس اسلایدها با آب مقطر شسته و به مدت 10 دقیقه در محلول 5% فسفومولیبدنیوم / 5% فسفو تنگستیک اسید قرار داده شدند.بدون شستشو، اسلایدها را مستقیماً به مدت 15 دقیقه داخل محلول آبی آنیلین قرار دهید.سپس لام ها با آب مقطر شسته و به مدت 2 دقیقه در محلول اسید استیک 1 درصد قرار داده شدند.اسلایدها در اتانول 200 نیوتن خشک و به زایلن منتقل شدند.اسلایدهای رنگ‌آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ Keyence با شیئی 10 برابر مشاهده شدند.
به طور خاص، یک پانچ جراحی با قطر 6 میلی متر برای اطمینان از اندازه بافت یکنواخت در طول تجزیه و تحلیل MTT استفاده شد.بافت ها به طور جداگانه در چاهک های یک صفحه 12 چاهی حاوی بستر MTT طبق پروتکل سازنده آبکاری شدند.بخش ها در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 ساعت انکوبه می شوند و بافت زنده بستر MTT را متابولیزه می کند تا یک ترکیب فرمازان بنفش را تشکیل دهد.محلول MTT را با 1 میلی لیتر DMSO جایگزین کنید و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انکوبه کنید تا فورمازان بنفش از قسمت های قلب استخراج شود.قرائت ها به وزن هر تکه از قلب نرمال شد.
رسانه برش قلب با محیطی حاوی 1 μCi/ml [5-3H] -گلوکز (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) برای سنجش استفاده از گلوکز همانطور که قبلاً توضیح داده شد جایگزین شد.پس از 4 ساعت انکوباسیون، 100 میکرولیتر از محیط را به یک لوله میکرو سانتریفیوژ باز حاوی 100 میکرولیتر HCl 0.2 N اضافه کنید.سپس لوله در یک لوله سوسوزن حاوی 500 میکرولیتر dH2O قرار داده شد تا [3H]2O به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد تبخیر شود.سپس لوله میکروسانتریفیوژ را از لوله سوسوزن خارج کرده و 10 میلی لیتر مایع سوسوزن به آن اضافه کنید.شمارش سوسوزن با استفاده از یک آنالایزر سوسوزن مایع Tri-Carb 2900TR (شرکت Packard Bioscience، Meriden، CT، ایالات متحده آمریکا) انجام شد.داده ها به جرم بخش های قلب نرمال می شوند.
پس از همگن سازی بافت در تریزول، RNA طبق پروتکل سازنده با استفاده از کیجن miRNeasy Micro Kit #210874 از مقاطع قلب جدا شد.آماده سازی کتابخانه RNAsec، توالی یابی و تجزیه و تحلیل داده ها به شرح زیر انجام شد:
1 میکروگرم RNA در هر نمونه به عنوان ماده اولیه برای تهیه کتابخانه RNA استفاده شد.به طور خلاصه، mRNA از RNA کل با استفاده از دانه های مغناطیسی متصل به الیگونوکلئوتیدهای پلی-T خالص سازی شد.تکه تکه شدن با استفاده از کاتیون های دو ظرفیتی در دمای بالا در بافر واکنش سنتز رشته اول NEBNext (5X) انجام می شود.cDNA رشته اول با استفاده از پرایمرهای تصادفی هگزامر و M-MuLV رونوشت معکوس (RNase H-) سنتز شد.سپس cDNA رشته دوم با استفاده از DNA پلیمراز I و RNase H سنتز می‌شود. اورهانگ‌های باقی‌مانده توسط فعالیت اگزونوکلئاز/پلیمراز به انتهای بلوط تبدیل می‌شوند.قطعات کتابخانه با استفاده از سیستم AMPure XP (بکمن کولتر، بورلی، ایالات متحده آمریکا) خالص شدند.سپس PCR با استفاده از Phusion High-Fidelity DNA polymerase، پرایمرهای جهانی PCR و پرایمرهای Index (X) انجام شد.در نهایت، محصولات PCR خالص شدند (سیستم AMPure XP) و کیفیت کتابخانه بر روی یک سیستم Agilent Bioanalyzer 2100 ارزیابی شد.سپس کتابخانه cDNA با استفاده از یک توالی سنجی Novaseq تعیین توالی شد.فایل‌های تصویر خام از Illumina با استفاده از CASAVA Base Calling به خواندن‌های خام تبدیل شدند.داده‌های خام در فایل‌های فرمت FASTQ(fq) ذخیره می‌شوند که حاوی دنباله‌های خواندنی و کیفیت‌های پایه مربوطه هستند.HISAT2 را برای تطبیق خواندن توالی فیلتر شده با ژنوم مرجع Sscrofa11.1 انتخاب کنید.
فراوانی رونوشت ها به طور مستقیم سطح بیان ژن را منعکس می کند.سطح بیان ژن توسط فراوانی رونوشت ها (تعداد توالی) مرتبط با ژنوم یا اگزون ها ارزیابی می شود.
RNA جدا شده از مقاطع قلب با استفاده از مخلوط SuperScript IV Vilo Master از Thermo (Thermo, cat. No. 11756050) با غلظت 200 نانوگرم در میکرولیتر به cDNA تبدیل شد.RT-PCR کمی با استفاده از یک صفحه واکنش شفاف Microamp 384 چاهی Applied Biosystems Endura Plate (Thermo, cat. No. 4483319) و چسب نوری microamp (Thermo, Cat. No. 4311971) انجام شد.
به طور خلاصه، 250 میکرولیتر از هر نمونه و استاندارد در دو نسخه به هر چاهک اضافه شد.بلافاصله پس از افزودن نمونه، 50 میکرولیتر از معرف سنجش A به هر چاهک اضافه کنید.بشقاب را به آرامی تکان دهید و با درزگیر ببندید.سپس قرص ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 1 ساعت انکوبه شدند.سپس محلول را آسپیره کرده و چاهک ها را 4 بار با 350 میکرولیتر محلول شستشوی 1X بشویید و هر بار محلول شستشو را به مدت 1-2 دقیقه انکوبه کنید.سپس 100 میکرولیتر از معرف سنجش B را در هر چاه اضافه کنید و با درزگیر صفحه ببندید.قرص به آرامی تکان داده شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شد.محلول را آسپیره کنید و چاهک ها را 5 بار با 350 میکرولیتر محلول شستشوی 1X بشویید.90 میکرولیتر محلول بستر را به هر چاهک اضافه کنید و صفحه را ببندید.صفحه بلافاصله با استفاده از صفحه خوان Cytation (BioTek) در طول موج 450 نانومتر اندازه گیری شد.
تجزیه و تحلیل توان برای انتخاب اندازه های گروه انجام شد که بیش از 80٪ توان را برای تشخیص یک تغییر مطلق 10٪ در پارامتر با نرخ خطای نوع I 5٪ فراهم می کند. Analyz moщnosti bыl vыfullen для выбора размеров групп, cotorыe obesprint >80% moщnosti для обнаружения 10% absolutnogo изменения параметри со 5% частотой ошибок نوع I. 进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褯型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褯型 یک تجزیه و تحلیل توان برای انتخاب اندازه گروهی انجام شد که بیش از 80٪ توان را برای تشخیص 10٪ تغییر پارامتر مطلق و 5٪ نرخ خطای نوع I ارائه دهد.مقاطع بافت قبل از آزمایش به طور تصادفی انتخاب شدند.همه آنالیزها حالت کور بودند و نمونه‌ها تنها پس از تجزیه و تحلیل همه داده‌ها رمزگشایی شدند.برای انجام تمامی تحلیل های آماری از نرم افزار GraphPad Prism (San Diego, CA) استفاده شد. برای همه آمار، p-value در مقادیر <0.05 معنی دار در نظر گرفته شد. برای همه آمارها، p-values ​​در مقادیر <0.05 معنی دار در نظر گرفته شد. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. برای همه آمارها، p-values ​​در مقادیر <0.05 معنی دار در نظر گرفته شد. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. برای همه آمارها، p-values ​​در مقادیر <0.05 معنی دار در نظر گرفته شد.آزمون t Student's Two-tailed روی داده ها تنها با 2 مقایسه انجام شد.برای تعیین معنی داری بین گروه های متعدد از آنالیز واریانس یک طرفه یا دو طرفه استفاده شد.هنگام انجام آزمون‌های تعقیبی، تصحیح توکی برای محاسبه مقایسه‌های متعدد اعمال شد.داده های RNAsec در هنگام محاسبه FDR و p.adjust همانطور که در بخش روش ها توضیح داده شد، ملاحظات آماری خاصی دارند.