Kiitos vierailustasi Nature.comissa. Käyttämäsi selainversio tukee rajoitetusti CSS:ää. Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan Internet Explorerissa). Tällä välin tuen jatkamisen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Ihmisen suoliston morfogeneesi vahvistaa kryptavilluksen piirteitä 3D-epiteelin mikroarkkitehtuurissa ja tilaorganisaatiossa. Tätä ainutlaatuista rakennetta tarvitaan suoliston homeostaasin ylläpitämiseen suojaamalla tyvi kryptan kantasoluja eksogeenisiltä mikrobiantigeeneiltä ja niiden metaboliiteilta. Lisäksi suoliston toiminnalliset villit ja erittävät limakalvot sisältävät epiteelin pinnalla erittyviä limakalvoja. .Siksi 3D-epiteelirakenteiden uudelleenluominen on ratkaisevan tärkeää in vitro -suolistomallien rakentamisessa. Varsinkin orgaaninen mimeettinen gut-on-a-chip voi indusoida suoliston epiteelin spontaanin 3D-morfogeneesin, jossa on parannetut fysiologiset toiminnot ja biomekaniikka. t mikrofluidisessa sirussa sekä Transwellin sulautetussa hybridisirussa. Kuvaamme yksityiskohtaisia ​​menetelmiä laitteen valmistamiseksi, Caco-2:n tai suoliston organoidiepiteelisolujen viljelyyn tavanomaisissa olosuhteissa sekä mikrofluidisessa alustassa, 3D-morfogeneesin induktiossa ja vakiintuneiden 3D-pohjaisten epiteelien funktionaalisten ominaisuuksien karakterisoinnissa. nestevirtaus 5 d. In vitro -morfogeneesimenetelmämme käyttää fysiologisesti merkityksellistä leikkausjännitystä ja mekaanista liikettä, eikä se vaadi monimutkaista solujen muokkausta tai manipulointia, mikä voi olla muita olemassa olevia tekniikoita parempi. Uskomme, että ehdotetulla protokollallamme voisi olla laaja vaikutus biolääketieteen tutkimusyhteisöön, koska se tarjoaa menetelmän 3D-suolen epiteelisovelluksiin, kliinisiin ja in vitro -lääketieteellisiin biolääketieteellisiin sovelluksiin.
Kokeet osoittavat, että suoliston epiteeli Caco-2-solut, jotka on viljelty suolen sirulla1, 2, 3, 4, 5 tai kaksikerroksisissa mikrofluidilaitteissa6,7, voivat käydä läpi spontaanin 3D-morfogeneesin in vitro ilman selkeää ymmärrystä taustalla olevasta mekanismista. Äskettäisessä tutkimuksessamme havaitsimme, että epiteelisolujen poistaminen ja antagonistien poistaminen morphogeneaalisista laitteista on välttämätöntä3. esis in vitro, mikä on osoitettu Caco-2:lla ja potilaista peräisin olevilla suolistoorganoideilla.Epiteelisolut validoitiin. Tässä tutkimuksessa keskityimme erityisesti voimakkaan Wnt-antagonistin Dickkopf-1:n (DKK-1) solutuotantoon ja pitoisuuksien jakautumiseen gut-on-a-chip- ja modifioiduissa mikrofluidilaitteissa, jotka sisältävät Transwell-insertit, nimeltään ”Hybridisiru”. Osoitamme, että eksogeenisten Wnt-sukuisten antagonistien (kuten Wnt-, S-, S-, S-, S-, S-, repressed-tai frizz-)-antagonistien lisääminen oggy-1) sirulle suolistolle estää morfogeneesiä tai häiritsee esistrukturoitua 3D-epiteelikerrosta, mikä viittaa siihen, että antagonistinen stressi viljelyn aikana on vastuussa suoliston morfogeneesistä in vitro. Tästä syystä käytännöllinen tapa saavuttaa vankka morfogeneesi epiteelin rajapinnassa on poistaa flunssan antagonistipitoisuudet tai ylläpitää minimaalisesti aktiivisten ingumenttien tasoja. - on-a-chip tai hybrid-on-a-chip alustat) tai diffuusio. Basolateraalinen väliaine (esim. Transwell-inserteistä suuriin basolateraalisiin säiliöihin kaivoissa).
Tässä protokollassa tarjoamme yksityiskohtaisen menetelmän gut-on-a-chip -mikrolaitteiden ja Transwell-inserttisirujen valmistamiseksi (vaiheet 1-5) suoliston epiteelisolujen viljelemiseksi polydimetyylisiloksaani- (PDMS)-pohjaisilla huokoisilla kalvoilla (vaiheet 6A, 7A, 8, 9) tai polyesterikalvoilla (insertti-, 7-, 6-, 7-, 8-duktiokalvoilla). 3D-morfogeneesi in vitro (vaihe 10). Tunnistamme myös solu- ja molekyylipiirteitä, jotka viittaavat kudosspesifiseen histogeneesiin ja sukulinjasta riippuvaiseen solujen erilaistumiseen useiden kuvantamismenetelmien avulla (vaiheet 11-24). Indusoimme morfogeneesiä käyttämällä ihmisen suolen epiteelisoluja tai kalvon pintamodifikaatioita2, mukaan lukien kalvon pinnan2, mukaan lukien intest intest in Caco- s, 2D yksikerroksisten kerrosten luominen ja suoliston biokemialliset ja biomekaanisen mikroympäristön lisääntyminen. in vitro. Indusoidaksemme 3D-morfogeneesin 2D-epiteelin yksikerroksisista kerroksista poistimme morfogeenin antagonistit molemmissa viljellyissä muodoissa virtaamalla elatusainetta viljelyn basolateraaliseen osaan, joka edustaa viljelyn uusiutuvaa kerrosta. morfogeeniriippuvaisen epiteelin kasvun, pitkittäisten isäntä-mikrobiomien yhteisviljelmien, patogeeni-infektion, tulehdusvaurion, epiteelin esteen toimintahäiriön ja probioottipohjaisten hoitojen mallintamiseen Esimerkki.vaikutuksia.
Protokollamme voi olla hyödyllinen laajalle joukolle tutkijoita perustutkimuksessa (esim. suolen limakalvon biologia, kantasolubiologia ja kehitysbiologia) ja soveltavassa tutkimuksessa (esim. prekliiniset lääketutkimukset, sairauksien mallinnus, kudostekniikka ja gastroenterologia) laajalla vaikutuksella. Protokollamme toistettavuuden ja kestävyyden ansiosta voimme indusoida 3D-näön teknisen strategian. levitetään yleisölle, joka tutkii solujen signaloinnin dynamiikkaa suoliston kehityksen, regeneraation tai homeostaasin aikana. Lisäksi protokollamme on hyödyllinen tutkittaessa infektioita eri infektioiden aiheuttajien, kuten Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium Vibrphimurium.Sairauden patologian ja patogeneesin yleisöt ovat myös hyödyllisiä. Suoliston mikrofysiologiajärjestelmän käyttö voi mahdollistaa pitkittäisen yhteisviljelyn 10 ja myöhemmän isännän puolustuskyvyn, immuunivasteiden ja taudinaiheuttajien aiheuttamien vaurioiden korjaamisen arvioinnin maha-suolikanavassa 11 . Muut maha-suolikanavan häiriöt, jotka liittyvät vuotavaan suolistotautiin, pohjukaissuolen oireyhtymään, poceliuchritis -syndrooma, suolen oireyhtymä voidaan simuloida, kun 3D-suolen epiteelikerroksia valmistetaan käyttämällä potilaan 3D-suoliepiteelikerroksia, näitä sairauksia ovat villosatrofia, kryptan lyheneminen, limakalvovaurio tai heikentynyt epiteelisuoja. Biopsia tai kantasoluista johdettu suolistosairaus, voidaan ottaa huomioon korkeampi lukijaympäristön monimutkaisuus12. muurahaissolutyypit, kuten potilaan perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC), malleihin, jotka sisältävät 3D-suolivillus-crypt-mikroarkkitehtuureja.kudosspesifiset immuunisolut, 5.
Koska 3D-epiteelin mikrorakenne voidaan kiinnittää ja visualisoida ilman leikkausprosessia, spatiaalisen transkriptomiikan ja korkearesoluutioisen tai superresoluution kuvantamisen parissa työskentelevät katsojat voivat olla kiinnostuneita kartoituksestamme geenien ja proteiinien spatiotemporaalisesta dynamiikasta epiteelisoluissa.Kiinnostunut tekniikasta.Reaktio mikrobi- tai immuuniärsykkeisiin.Lisäksi pitkittäissuuntainen isäntä-mikrobiomi-ristikuulutus 10, 14, joka koordinoi suoliston homeostaasia, voidaan muodostaa 3D-suolen limakalvokerrokseen viljelemällä yhdessä erilaisia ​​mikrobilajeja, mikrobiyhteisöjä tai erityisesti ulosteen mikrobisuussa.alustalla.Tämä lähestymistapa on erityisen houkutteleva yleisölle, joka tutkii limakalvojen immunologiaa, gastroenterologiaa, ihmisen mikrobiomia, kulturomiikkaa ja kliinistä mikrobiologiaa ja pyrkii viljelemään aiemmin viljelemätöntä suoliston mikrobiotaa laboratoriossa.Jos in vitro -morfogeneesiprotokollamme voidaan mukauttaa skaalautuviin viljelymuotoihin, kuten jatkuvaan 38-pohjaiseen täyttölevyyn962s4. Protokollaa voidaan levittää myös niille, jotka kehittävät elintarviketeollisuudelle farmaseuttisia, biolääketieteellisiä tai suuritehoisia seulonta- tai validointialustoja.Periaatteen todisteena osoitimme äskettäin moninkertaisen, tehokkaan morfogeneesijärjestelmän toteutettavuuden, joka skaalautuu 24-kuoppaiseen levymuotoon. in vitro -morfogeneesimenetelmäämme voidaan nopeuttaa ja mahdollisesti omaksua useissa tutkimuslaboratorioissa, teollisuudessa tai hallituksessa ja sääntelyvirastoissa ymmärtääkseen suoliston in vitro morfogeneesin solujen uudelleenohjelmoinnin transkriptomisella tasolla lääkkeiden tai bioterapeuttisten aineiden testaamiseksi. suoliston morfogeneesiprosessi.
Suoliston epiteelin morfogeneesin tutkimiseen on käytetty rajoitettua määrää ihmisille tärkeitä kokeellisia malleja, mikä johtuu pääasiassa siitä syystä, että 3D-morfogeneesin indusoimiseksi in vitro ei ole toteutettavissa olevia protokollia. Itse asiassa suuri osa nykyisestä tiedosta suoliston morfogeneesistä perustuu eläintutkimuksiin (esim. seeprakalat20, hiiret21 ovat työvoimavaltaisia,21-tai kanatöitä). ja mikä tärkeintä, eivät määritä tarkasti ihmisen kehitysprosesseja.Näiden mallien kyky testata monisuuntaisesti skaalautuvalla tavalla on myös hyvin rajallinen. Siksi protokollamme 3D-kudosrakenteiden regeneroimiseksi in vitro ylittää in vivo -eläinmallit sekä muut perinteiset staattiset 2D-soluviljelymallit. Kuten aiemmin on kuvattu, käyttämällä 3D-epiteliaalisten solujen erilaista lokalisointia ja injektioakselia. vasteena erilaisille limakalvo- tai immuuniärsykkeille. 3D-epiteelisolut voivat tarjota tilaa tutkia, kuinka mikrobisolut kilpailevat avaruudellisten markkinarakojen muodostamisesta ja ekologinen kehitys vasteena isäntätekijöille (esim. sisäinen versus ulompi limakerros, IgA:n eritys ja antimikrobiset aineet). Lisäksi 3D-syntologia mahdollistaa sen epiteelin ja kudoskudoksen rakenteen ymmärtämisen. tuottaa ergistisesti mikrobien aineenvaihduntatuotteita (esim. lyhytketjuisia rasvahappoja), jotka muovaavat solujen järjestystä ja kantasolujen markkinarakoja tyvikryptoissa. Nämä ominaisuudet voidaan osoittaa vain, kun 3D-epiteelikerrokset muodostuvat in vitro.
Suoliston 3D-epiteelirakenteiden luomismenetelmämme lisäksi käytössämme on useita in vitro -menetelmiä. Suoliston organoidiviljelmä on huippuluokan kudosteknologiatekniikka, joka perustuu suoliston kantasolujen viljelyyn tietyissä morfogeeniolosuhteissa23,24,25. 3D-organoidimallien käyttö on kuitenkin usein isännöintitestauksen kuljetusbioanalyysissä tai yhteisviljelyssä. Organoidin sisällä, ja siksi luminaalisten komponenttien, kuten mikrobisolujen tai eksogeenisten antigeenien, tuominen on rajoitettua.Organoidisten luumenien saatavuutta voidaan parantaa käyttämällä mikroinjektoria,26,27, mutta tämä menetelmä on invasiivinen ja työvoimavaltainen ja vaatii erikoisosaamista. Lisäksi perinteiset organoidiviljelmät, joita ylläpidetään hydrogeelitelineissä staattisissa olosuhteissa, eivät heijasta tarkasti aktiivista in vivo -biomekaniikkaa.
Muut useiden tutkimusryhmien käyttämät lähestymistavat hyödyntävät esistrukturoituja 3D-hydrogeelitelineitä suoliston epiteelin rakenteen jäljittelemiseen viljelemällä eristettyjä ihmisen suolistosoluja geelin pinnalla. Valmista hydrogeelitelineet 3D-tulostetuilla, mikrojauhetuilla tai litografisesti valmistetuilla muotilla. Tämä menetelmä osoittaa eristetyn graafisen fysiologisen järjestelyn itse epiteelisoitujen solujen kanssa. s, muodostaa korkean kuvasuhteen epiteelirakenteen ja strooma-epiteelin ylikuulumisen sisällyttämällä stroomasoluja rakennustelineeseen. Esistrukturoitujen tukirakenteiden luonne voi kuitenkin estää itse spontaanin morfogeneettisen prosessin ilmentymisen. Nämä mallit eivät myöskään tarjoa dynaamista luminaalista tai interstitiaalista moraalista fysikaalista virtausta, koska ne eivät tarvitse aliperäistä nesteen fysiologista toimintaa. yhdessäkään tuoreessa tutkimuksessa ei käytetty hydrogeelitelineitä mikrofluidisessa alustassa ja kuvioituja suoliston epiteelin rakenteita laseretsaustekniikoilla. Hiiren suolen organoidit noudattavat syövytettyjä kuvioita muodostaen suolen putkimaisia ​​rakenteita, ja intraluminaalinen nestevirtaus voidaan koota yhteen mikrofluidiikkamoduulin avulla.Tämä malli ei kuitenkaan sisällä moraalisen mekanismin spontaantisia liikkeitä. Saman ryhmän 3D-tulostustekniikoilla pystyttiin luomaan miniatyyriä suolistoputkia, joissa on spontaaneja morfogeneettisiä prosesseja. Huolimatta putken sisällä olevien eri suolisegmenttien monimutkaisesta valmistuksesta, tästä mallista puuttuu myös luminaalinen nestevirtaus ja mekaaninen muodonmuutos. Lisäksi mallin toimivuus voi olla rajoitettua, varsinkin kun biotulostusprosessi on valmis, tai häiritsevät solun ja spontaanin vuorovaikutuksen kokeelliset olosuhteet. esis, fysiologisesti merkityksellinen leikkausjännitys, suoliston liikkuvuutta jäljittelevä biomekaniikka, riippumattomien apikaalisten ja basolateraalisten osastojen saatavuus ja monimutkaisten modulaaristen biologisten mikroympäristöjen uudelleenluominen. Siksi in vitro 3D-morfogeneesiprotokollamme voi tarjota täydentävän lähestymistavan olemassa olevien menetelmien haasteiden voittamiseksi.
Protokollamme on täysin keskittynyt 3D-epiteelisolujen morfogeneesiin. Viljelmässä on vain epiteelisoluja eikä muita ympäröiviä soluja, kuten mesenkymaalisia soluja, endoteelisoluja ja immuunisoluja. Kuten aiemmin on kuvattu, protokollamme ydin on epiteelin morfogeneesin indusoiminen poistamalla morfogeeni-inhibiittorit, jotka on lisätty pesäväliaineeseen. a-chip ja hybrid-on-a-chip mahdollistavat aaltoilevan 3D-epiteelikerroksen uudelleenluomisen, lisää biologisia monimutkaisia ​​tekijöitä, kuten epiteelin ja mesenkymaalisen vuorovaikutuksen 33, 34, ekstrasellulaarisen matriisin (ECM) kerrostumisen 35 ja mallissamme kryptavilluksen piirteitä, jotka välittävät fibroblastien kantasolujen syvennykset edelleen messtroeg-soluihin. minulla on keskeinen rooli ECM-proteiinien tuotannossa ja suolen morfogeneesin säätelyssä in vivo Kulttuurikomponentit, jotka voidaan yhdistää kudosmallien välillä, ovat edellytys, kun kudosmallit suunnitellaan osoittamaan useiden elinten vuorovaikutuksia. Siksi endoteelisoluja saatetaan joutua mallintamaan tarkempia fysiologisia piirteitä elintason resoluutiolla. Potilasperäiset immuunisolut ovat myös välttämättömiä synnynnäisten immuunivasteiden, antigeenien esittelyn, synnynnäisen adaptiivisen immuunijärjestelmän ja kudosspesifisten sairauksien testikontekstissa.
Hybridisirujen käyttö on yksinkertaisempaa kuin gut-on-a-chip, koska laitteen asennus on yksinkertaisempaa ja Transwell-insertien käyttö mahdollistaa suoliston epiteelin skaalautuvan viljelyn. Kaupallisesti saatavilla olevat polyesterikalvoilla varustetut Transwell-insertit eivät kuitenkaan ole joustavia eivätkä ne voi simuloida peristalttisia liikkeitä. .On selvää, että apikaalisen osaston staattiset ominaisuudet mahdollistavat harvoin pitkäaikaisen bakteerien yhteisviljelyn hybridisiruissa. Vaikka voimmekin indusoida 3D-morfogeneesin Transwell-inserteissä hybridisiruja käytettäessä, fysiologisesti merkityksellisen biomekaniikan ja apikaalisen nesteen virtauksen puute voi rajoittaa hybridisirualustojen toteutettavuutta mahdollisiin sovelluksiin.
Ihmisen kryptavilluksen akselin täysimittaisia ​​rekonstruktioita gut-on-a-chip- ja hybrid-on-a-chip -viljelmissä ei ole täysin vahvistettu. Koska morfogeneesi alkaa epiteelin yksikerroksisesta kerroksesta, 3D-mikroarkkitehtuurit eivät välttämättä tarjoa morfologista samankaltaisuutta kryptien kanssa in vivo.Vaikka luonnehdimme proliferoivaa solupopulaatiota3 lähellä olevaa tyvialuetta. krypta- ja villousalueita ei rajattu selvästi. Vaikka sirun korkeammat ylemmän kanavat lisäävät mikroteknisen epiteelin korkeutta, enimmäiskorkeus on silti rajoitettu ~300–400 µm:iin. Ihmisen suolen kryptien todellinen syvyys ohutsuolessa ja paksusuolessa on ~135 µm ja paksusuolen korkeus ~400 µm. m41.
Kuvantamisen näkökulmasta 3D-mikroarkkitehtuurien in situ -superresoluutiokuvaus voi rajoittua sirun suoleen, koska tarvittava työetäisyys objektiivin linssistä epiteelikerrokseen on muutaman millimetrin luokkaa. Tämän ongelman ratkaisemiseksi voidaan tarvita etäällä olevaa objektiivia. Lisäksi ohuiden osien tekeminen vaatii PDMS:n joustavuuden vaativan kuvantamisen. suolen kerros-kerroksiseen mikrovalmistukseen sirulla liittyy pysyvä adheesio jokaisen kerroksen välillä, ylemmän kerroksen avaaminen tai poistaminen on äärimmäisen haastavaa epiteelikerroksen pintarakenteen tutkimiseksi. Esimerkiksi pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM).
PDMS:n hydrofobisuus on ollut rajoittava tekijä mikrofluidipohjaisissa tutkimuksissa, joissa käsitellään pieniä hydrofobisia molekyylejä, koska PDMS voi epäspesifisesti adsorboida tällaisia ​​hydrofobisia molekyylejä. Vaihtoehtoja PDMS:lle voidaan harkita muiden polymeeristen materiaalien kanssa. Vaihtoehtoisesti voidaan harkita PDMS:n pinnan modifiointia (esim. pinnoitus lipofiilisillä materiaaleilla3 tai polyglytsyyliaineilla) hydrofobisten molekyylien
Lopuksi, menetelmäämme ei ole luonnehdittu hyvin tehokkaan seulonnan tai "yksi koko sopii kaikille" käyttäjäystävällisen koealustan tarjoamiseksi. Nykyinen protokolla vaatii ruiskupumpun mikrolaitetta kohti, joka vie tilaa CO2-inkubaattorissa ja estää laajamittaiset kokeet. Tätä rajoitusta voidaan merkittävästi parantaa innovatiivisten viljelyformaattien skaalautuvuuden avulla (esim. jotka mahdollistavat basolateraalisen väliaineen jatkuvan täydentämisen ja poistamisen).
Indusoidaksemme ihmisen suoliston epiteelin 3D-morfogeneesin in vitro, käytimme mikrofluidista suolistolaitetta, joka sisälsi kaksi rinnakkaista mikrokanavaa ja joustavan huokoisen kalvon niiden väliin luomaan luumenin ja kapillaarin välisen rajapinnan. Esittelemme myös yksikanavaisen mikrofluidilaitteen (hybridisiru) käyttöä, joka tarjoaa jatkuvan basolateraalisen kalvon virtauksen molempien alustojen alla. on useista ihmisen suoliston epiteelisoluista voidaan osoittaa soveltamalla suunnattua virtauksen manipulointia morfogeenien antagonistien poistamiseksi basolateraalisesta osastosta.Koko kokeellinen toimenpide (kuva 1) koostuu viidestä osasta: (i) suolisirun tai Transwell-insertoitavan hybridisirun mikrovalmistus (vaiheet 1-5; laatikko 1) ihmisen epiteelisolujen valmistukseen, (2-testiaalisoluihin) organoidit;laatikot 2-5), (iii) suolen epiteelisolujen viljely suolisiruilla tai hybridisiruilla (vaiheet 6-9), (iv) 3D-morfogeneesin induktio in vitro (vaihe 10) ja (v)) 3D-epiteelin mikrorakenteen karakterisoimiseksi in vitro (vaiheet 11-24) (vaiheet 11-24). geneesistä vertaamalla epiteelin morfogeneesiä spatiaaliseen, ajalliseen, ehdolliseen tai proseduaaliseen ohjaukseen.
Käytimme kahta erilaista viljelyalustaa: gut-on-a-chip suorilla kanavilla tai epälineaarisilla mutkaisilla kanavilla tai hybridisiruja, jotka sisälsivät Transwell (TW) -insertit mikrofluidilaitteessa, joka on valmistettu laatikon 1 mukaisesti, ja vaihe 1 -5. ”Laitevalmistus” näyttää tärkeimmät vaiheet yhden sirun tai hybridisolun valmistuksessa. kivesten organoidit) ja tässä protokollassa käytetty viljelymenetelmä."In vitro -morfogeneesi" näyttää yleiset vaiheet, joissa Caco-2- tai organoidiperäisiä epiteelisoluja viljellään suolisirulla tai hybridisirun Transwell-inserteillä, mitä seuraa 3D-morfogeneesin induktio ja karakterisoidun epiteelin rakenteen muodostuminen. Alla oleva ohjelman vaiheesimerkki tai laatikko näyttää kunkin rivin sovelluksen numeron. kaikkia kerroksia voidaan käyttää esimerkiksi solujen erilaistumisen karakterisoinnissa, suoliston fysiologisissa tutkimuksissa, isäntä-mikrobiomien ekosysteemien perustamisessa ja sairauden mallintamisessa. Immunofluoresenssikuvat "Cell Differentiation" -sovelluksessa, jotka osoittavat ytimiä, F-aktiinia ja MUC2:ta, jotka ekspressoituvat 3D Caco-2 -epiteelisolujen pinnalla, jotka ovat läsnä goC-2:n mucogut-salaisessa pinnassa. s. Suoliston fysiologian fluoresoivat kuvat osoittavat limaa, joka on tuotettu värjämällä siaalihappo- ja N-asetyyliglukosamiinitähteillä käyttämällä fluoresoivaa vehnänalkioagglutiniinia. "Host-Microbe Co-Cultures" -paneelin kaksi päällekkäistä kuvaa osoittavat edustavia isäntä-mikrobiomi-yhteisviljelmiä. (GFP) mikrotekniikalla muokatuilla 3D Caco-2 epiteelisoluilla. Oikeassa paneelissa näkyy GFP E. colin paikannus, jota viljellään yhdessä 3D Caco-2 epiteelisolujen kanssa, mitä seuraa immunofluoresenssivärjäys F-aktiinilla (punainen) ja ytimillä (sininen). Sairauden mallinnus havainnollistaa terveitä vs. bakteerien alle fysikaalisia tulehdussairauksia. akkaridi, LPS) ja immuunisolut (esim. PBMC;vihreä). Caco-2-soluja viljeltiin 3D-epiteelikerroksen muodostamiseksi. Mittakaavapalkki, 50 µm. Kuvat alimmalla rivillä: "Solujen erottaminen" mukautettu luvalla viitteestä.2.Oxford University Press;Toistettu viitenumeron 5 luvalla.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" mukautettu viitenumeron 3 luvalla.NAS;"Tiedon mallinnus" mukautettu luvalla viitteestä.5.NAS.
Sekä gut-on-chip- että hybridisirut valmistettiin käyttämällä PDMS-kopioita, jotka purettiin silikonimuoteista pehmeällä litografialla1,44 ja kuvioitiin SU-8:lla. Jokaisen sirun mikrokanavien suunnittelu määritetään ottamalla huomioon hydrodynamiikka, kuten leikkausjännitys ja hydrodynaaminen paine1,4,12. ed rinnakkaisia ​​suoria mikrokanavia, on kehittynyt monimutkaiseksi gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b), joka sisältää parin kaarevia mikrokanavia, jotka lisäävät nesteen viipymisaikaa, epälineaarisia virtauskuvioita ja viljeltyjen solujen moniakselisia muodonmuutoksia (kuvat 2a–f) 12. Olemme osoittaneet, että mutkainen Gut-Chip indusoi myös voimakkaasti 3D-morfogeneesiä samanlaisessa aikavälissä ja samalla epiteelin kasvuasteella kuin alkuperäinen Gut-Chip, viljellystä solutyypistä riippumatta. Siksi 3D-morfogeneesin indusoimiseksi käytetään lineaarisia ja monimutkaisia ​​molekyylejä kovetettavia SUPD-suunnitteluja. -8 kuviota tarjosivat negatiivisia piirteitä muotin purkamisen jälkeen (kuva.2a). Suolen valmistamiseksi sirulle valmisteltu ylempi PDMS-kerros sidottiin peräkkäin huokoiseen PDMS-kalvoon ja kohdistettiin sitten alemman PDMS-kerroksen kanssa peruuttamattomalla sidoksella käyttämällä koronakäsittelijää (kuvat 2b–f). Hybridisirujen valmistamiseksi kovettuneet PDMS-kopiot yhdistettiin mikrofluidi-insertti-inserttilevyihin, jotka pystyivät muodostamaan hyvin kanavallisia lasilevyjä. 2h ja laajennetut tiedot kuva 2).Siimausprosessi suoritetaan käsittelemällä PDMS-replikan ja lasin pinnat happiplasmalla tai koronakäsittelyllä.Silikoniputkeen kiinnitetyn mikrovalmisteisen laitteen steriloinnin jälkeen laitekokoonpano oli valmis suorittamaan suoliston epiteelin 3D-morfogeneesi2g (kuva).
a, Kaaviokuva PDMS-osien valmistamisesta SU-8-kuvioiduista piimuoteista. Kovettamaton PDMS-liuos kaadettiin piimuottiin (vasemmalla), kovetettiin 60 °C:ssa (keskellä) ja purettiin muotista (oikealla). Muotista purettu PDMS leikattiin paloiksi ja puhdistettiin jatkokäyttöä varten.b, Valokuva PDMS:stä, jota käytettiin silikon valmistukseen. d käytetään huokoisen PDMS-kalvon valmistukseen.d, sarja valokuvia ylemmästä ja alemmasta PDMS-komponentista ja kootusta sirulla olevasta suolistolaitteesta.e, Kaavio ylemmän, kalvon ja alemman PDMS-komponentin kohdistuksesta.Jokainen kerros on peruuttamattomasti sidottu plasma- tai koronakäsittelyllä.f, Kaavio ylemmästä ja alemmasta PDMS-komponentista. um chambers.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell viljel.Silikoniputkella ja ruiskulla kootulla sirulla valmistettu suolisto asetettiin peitinlasille.Sirulaite asetettiin 150 mm:n petrimaljan kanteen käsittelyä varten.Sideaineella suljetaan silikoniputki, siru- ja silikoniputki. .Transwell-insertit, jotka valmistettiin itsenäisesti suolen epiteelisolujen 2D-yksikerrosten viljelemiseksi, lisättiin hybridisiruun indusoimaan suoliston 3D-morfogeneesi. Elatusaine perfusoidaan mikrokanavien läpi Transwell-inserttiin muodostetun solukerroksen alla. Mittakaavapalkki, 1 cm.h Uudelleenpainettu viitteen 4 luvalla.Elsevier.
Tässä protokollassa Caco-2-solulinjaa ja suoliston organoideja käytettiin epiteelin lähteinä (kuva 3a). Molempia solutyyppejä viljeltiin itsenäisesti (laatikko 2 ja laatikko 5) ja niitä käytettiin siementämään sirulla olevien suolen tai Transwell-solujen ECM-pinnoitettuja mikrokanavia. fi jaksot 10 ja 50) T-pulloissa kerätään dissosioituneiden solususpensioiden valmistamiseksi trypsinointinesteellä (laatikko 2). Ihmisen suoliston organoideja suolistobiopsioista tai kirurgisista resektioista viljeltiin Matrigel-telineiden kupuissa 24-kuoppaisilla levyillä, jotka sisälsivät rakenteellisia mikro-, no- ja essentaalisia R-, mikro-, mikro- ja essentaalilevyjä. ggin) ja laatikossa 3 kuvatulla tavalla valmistettuja kasvutekijöitä täydennettiin joka toinen päivä, kunnes organoidit kasvoivat halkaisijaltaan ~500 µm:iin. Täysin kasvaneet organoidit kerätään ja dissosioidaan yksittäisiksi soluiksi suolistoon tai Transwell-inserteiksi sirulle (laatikko 5). tai normaali luovuttaja), leesiokohta (esim. leesio vs. ei-leesionaalinen alue) ja maha-suolikanavan sijainti traktissa (esim. pohjukaissuoli, jejunum, sykkyräsuoli, umpisuole, paksusuoli tai peräsuole). Tarjoamme laatikossa 5 optimoidun protokollan paksusuolen organoidien (koloidien) viljelyyn, jotka tyypillisesti vaativat suurempia morfogeenipitoisuuksia.
a, Työnkulku suolen morfogeneesin induktioon suolisirussa. Ihmisen Caco-2-suoliepiteeliä ja suoliston organoideja käytetään tässä protokollassa 3D-morfogeneesin osoittamiseen. Eristetyt epiteelisolut siirrostettiin valmistettuun gut-on-a-chip -laitteeseen (siruvalmiste). (D0), apikaalinen (AP) virtaus käynnistetään ja sitä ylläpidetään ensimmäiset 2 päivää (virtaus, AP, D0-D2). Basolateraalinen (BL) virtaus käynnistyy myös syklisten venytysliikkeiden (venytys, virtaus, AP ja BL) ohella, kun muodostuu täydellinen 2D-yksikerros. Suolen 3D-kontrastimorfogeneesi tapahtui 5 päivän flunssan spontaaniviljelyn jälkeen. Kuvissa näkyy edustava Caco-2-solujen morfologia kussakin koevaiheessa tai ajankohdassa (pylväsdiagrammi, 100 µm).Neljä kaaviokuvaa, jotka kuvaavat vastaavia suoliston morfogeneesin kaskadeja (ylhäällä oikealla). Kaavakuvassa olevat katkoviivat nuolet edustavat nesteen virtauksen suuntaa.b, SEM-kuva, joka näyttää vahvistetun 3D-korostusalueen pintatopologian (Caco-2. ) näyttää regeneroidut mikrovillit 3D Caco-2 -kerroksessa (oikealla).c, Vaakasuora etunäkymä vakiintuneesta Caco-2:sta 3D, claudin (ZO-1, punainen) ja jatkuvat harjareunuskalvot, jotka on merkitty F-aktiini (vihreä) ja tumat (sininen) osoittavat kunkin rivin konfokaalisen konfokaalisen visualisoinnin epiteelisolujen keskitasossa. fokusnäkymä.d, Faasikontrastimikroskopialla saatujen sirulla viljeltyjen organoidien morfologisten muutosten aikakulku päivinä 3, 7, 9, 11 ja 13. Upotus (ylhäällä oikealla) näyttää tarjotun kuvan suuren suurennoksen.e, DIC-mikrovalokuva organoidi 3D-epiteelistä, joka on muodostettu suolen fluoresenssisoluista (GR-merkkiset fluoresenssit, jotka on otettu päivällä otettuja kuvia). 5;magenta), pikarisolut (MUC2; vihreä), F-aktiini (harmaa) ja ytimet (syaani), joita kasvatettiin suolen siruilla 3 päivän ajan (vasemmalla) ja 13 päivän (keskimmäinen) organoideilla epiteelikerroksessa. Katso myös laajennetut tiedot Kuva 3, joka korostaa LGR5-signalointia ilman MUC2-organisaatioiden mikrorakennetta tai oikeiden elinten signaalikuvia. epiteeli muodostuu suolistossa sirulle värjäämällä plasmakalvo CellMask-väriaineella (oikealla) viljelypäivänä 13. Mittaviiva on 50 μm, ellei toisin mainita.b Uudelleenpainettu luvalla viitteestä.2.Oxford University Press;c Mukautettu Reference.2:n luvalla.Oxford University Press;e ja f mukautettu viittauksella luvalla.12 Creative Commons License CC BY 4.0 alaisuudessa.
Suolistossa sirulla on tarpeen muokata PDMS-huokoisen kalvon hydrofobista pintaa onnistuneen ECM-pinnoituksen varmistamiseksi. Tässä protokollassa käytämme kahta eri menetelmää PDMS-kalvojen hydrofobisuuden muokkaamiseen. Caco-2-solujen viljelyssä pelkkä pintaaktivointi UV/otsonikäsittelyllä riitti vähentämään ECM-solujen hydrofobisuutta. Organoidiepiteelin mikrofluidiviljelmä vaatii kemiallisesti pohjautuvan pinnan funktionalisoinnin, jotta ECM-proteiinien kerrostumista saadaan aikaan tehokkaasti levittämällä polyetyleeni-imiiniä (PEI) ja glutaraldehydiä peräkkäin PDMS-mikrokanaviin. Pintamodifioinnin jälkeen ECM-proteiinit kerrostettiin peittämään funktionalisoidun PDMS-pinnan ja siirrettiin sitten eristettyyn mikrofluidisoluviljelmään kiinnittyneen perfuusionesteen solujen avulla. ylempi mikrokanava, kunnes solut muodostavat täydellisen yksikerroksen, kun taas alempi mikrokanava ylläpitää staattisia olosuhteita. Tämä optimoitu menetelmä pintaaktivointiin ja ECM-pinnoitukseen mahdollistaa organoidiepiteelin kiinnittymisen 3D-morfogeneesin indusoimiseksi PDMS-pinnalla.
Transwell-viljelmät vaativat myös ECM-pinnoituksen ennen solujen kylvöä;Transwell-viljelmät eivät kuitenkaan vaadi monimutkaisia ​​esikäsittelyvaiheita huokoisten inserttien pinnan aktivoimiseksi. Caco-2-solujen kasvattamiseksi Transwell-inserteissä ECM-pinnoite huokoisissa inserteissä nopeuttaa dissosioituneiden Caco-2-solujen kiinnittymistä (<1 tunti) ja tiiviin liitosesteen muodostumista (<1-2 päivää). Organoidien viljelemiseksi Transwell-soluilla (Transwell-solujen kalvoon kiinnitetyt organoidit on kiinnitetty kalvoon, katso eristetyt elimet h3) säilytetään, kunnes organoidit muodostavat täydellisen yksikerroksen, jolla on esteen eheys. Transwell-viljelmät suoritetaan 24-kuoppalevyillä ilman hybridisirujen käyttöä.
In vitro 3D-morfogeneesi voidaan käynnistää kohdistamalla nestevirtaus vakiintuneen epiteelikerroksen basolateraaliseen osaan. Sirulla olevassa suolessa epiteelin morfogeneesi alkoi, kun väliaine perfusoitiin ylempään ja alempaan mikrokanavaan (kuva 3a). Kuten aiemmin on kuvattu, on kriittistä saada aikaan nestevirtaus riittävän sekalaisen morfonsuunnan vuoksi. ravinteita ja seerumia soluihin, jotka ovat sitoutuneet huokoisille kalvoille ja synnyttävät luminaalista leikkausjännitystä, käytämme tyypillisesti kaksoisvirtausta suolistossa sirulla. Hybridisiruissa epiteelin yksikerroksisia kerroksia sisältävät Transwell-insertit asetettiin hybridisiruihin. Sen jälkeen väliaine levitettiin huokoisen Transwell-viljelyalustan basolateraalisen puolen alle mikrokanavan läpi. Intestinaalista morfologiaa ilmeni 5 päivää sen jälkeen, kun molemmissa morfogeneesissä esiintyy
Mikroteknisten 3D-epiteelikerrosten morfologisia piirteitä voidaan analysoida käyttämällä erilaisia ​​kuvantamismenetelmiä, mukaan lukien vaihekontrastimikroskopia, differentiaalinen interferenssikontrasti (DIC) -mikroskooppi, SEM tai immunofluoresenssikonfokaalimikroskopia (kuvat 3 ja 4). Vaihekontrasti- tai DIC-kuvantaminen voidaan tehdä helposti milloin tahansa epiteelikerroksen muodon3 aikana. PDMS- ja polyesterikalvojen optiseen läpinäkyvyyteen sekä gut-on-a-chip- että hybridisirualustat voivat tarjota reaaliaikaista in situ -kuvausta ilman, että laitetta tarvitsee leikata tai purkaa. Immunofluoresenssikuvausta tehtäessä (kuvat 1, 3c, f ja 4b, c) solut ovat tyypillisesti kiinnittyneitä (XFa:n jälkeen (/) 100 ja 2 % (paino/tilavuus) ) naudan seerumialbumiinia (BSA), järjestyksessä. Solutyypistä riippuen voidaan käyttää erilaisia ​​kiinnitysaineita, läpäisevyyttä lisääviä aineita ja estoaineita. Primaarisia vasta-aineita, jotka kohdistuvat sukulinjasta riippuvaisiin solu- tai aluemarkkereihin, käytetään korostamaan soluja, jotka on immobilisoitu in situ sirulle (joko sekundaarinen antibo, tuma4, jota seuraa sekundaarinen antiboostaatti4). -diamidino-2-fenyleeni) indoli, DAPI) tai F-aktiini (esim. fluoresoivasti leimattu falloidiini). Fluoresenssipohjaista elävää kuvantamista voidaan myös suorittaa in situ liman tuotannon havaitsemiseksi (kuva 1).1, "Solujen erilaistuminen" ja "Suolen fysiologia"), mikrobisolujen satunnainen kolonisaatio (Kuva 1, "Isäntä-mikrobi-yhteisviljely"), immuunisolujen rekrytointi (Kuva 1, "Sairauden mallinnus") tai 3D-epiteelimorfologian ääriviivat, jotka erottelevat, erottelevat ja muokkaavat. ylempi kerros alemmasta mikrokanavakerroksesta, kuten viitteessä on kuvattu. Kuten kuvassa 2 on esitetty, 3D-epiteelin morfologia sekä apikaalisen harjan reunan mikrovillit voidaan visualisoida SEM:llä (kuva 3b). Erilaistumismarkkerien ilmentymistä voidaan arvioida suorittamalla kvantitatiivinen PCR5 tai yksisoluinen RNA-solujen epiteelikerros3 tässä tapauksessa epiteelisekvenssissä tai kasvattamalla solujen RNA-soluja. hybridisirut kerätään trypsinisoimalla ja käytetään sitten molekyyli- tai geneettiseen analyysiin.
a, Työnkulku suoliston morfogeneesin induktioon hybridisirussa. Caco-2:ta ja suoliston organoideja käytetään tässä protokollassa 3D-morfogeneesin osoittamiseen hybridisirualustalla. Irrotetut epiteelisolut siirrostettiin valmistettuihin Transwell-insertteihin (TW-prep; katso alla oleva kuva). Kun solut oli kiinnitetty trans-inserttikalvoihin (istutettu polyesteri-T-soluihin) W-viljelmä). 7 päivän kuluttua yksi Transwell-insertti, joka sisälsi 2D-monokerroksen epiteelisoluja, integroitiin hybridisiruun perustaakseen basolateraalisen virtauksen (Flow, BL), joka lopulta johti 3D-epiteelisolujen syntymiseen (morfogeneesi). Vaihekontrastimikrokuvat, jotka esittävät ihmisen elimen epiteelisolujen morfologisia piirteitä kunkin luovuttajan aikavaiheessa (Csenlon-vaiheen kaaviona)3 kokeen viiva3. s ylemmissä kerroksissa kuvaavat kunkin vaiheen kokeellista konfiguraatiota.b, Hybridisirut (vasemmalla kaavakuva) voivat johtaa organoidiepiteelisolujen 3D-morfogeneesiin ylhäältä alaspäin olevilla konfokaalimikroskopianäkymillä, jotka on otettu eri Z-kohdista (ylempi, keskimmäinen ja alempi;katso oikea kaavio ja vastaavat katkoviivat).osoitti selviä morfologisia ominaisuuksia.F-aktiini (syaani), tuma (harmaa).c, Fluoresenssikonfokaaliset mikrokuvat (3D-kulmakuva) organoidista johdetuista epiteelisoluista, joita viljeltiin staattisessa Transwellissa (TW; upotettu valkoisen katkoviivan sisällä) versus hybridisiru (suurin pystysuora otos) vertaamalla 2D-morfologiaa (vastaavasti 2D:n ristikkäisnäkymiä, 3D-kuvia vastaan-. oikeassa yläkulmassa; "XZ") näyttää myös 2D- ja 3D-ominaisuuksia.Skaalauspalkki, 100 µm.c Uudelleenpainettu viitteen luvalla.4.Elsevier.
Kontrollit voidaan valmistaa viljelemällä samat solut (Caco-2 tai suolen organoidiepiteelisolut) kaksiulotteisiin yksikerroksisiin tavanomaisissa staattisissa viljelyolosuhteissa. Ilmeisesti ravinteiden ehtyminen voi johtua mikrokanavien rajoitetun tilavuuden rajakapasiteetista (ts. 4 µL ennen alkuperäisen suolistovirtauksen suunnittelua.
Pehmeä litografiaprosessi tulisi suorittaa puhtaassa huoneessa. Jokaiselle sirun kerrokselle (ylemmät ja alemmat kerrokset ja kalvot) sekä hybridisiruille käytettiin erilaisia ​​fotomaskeja, jotka valmistettiin erillisille piikiekkoille, koska mikrokanavien korkeudet olivat erilaiset. Sirulla olevan suolen ylemmän ja alemman mikrokanavan tavoitekorkeudet ovat 500 µm:n hybridikorkeus 20 µm ja 20 µm. µm.
Aseta 3 tuuman piikiekko asetonia sisältävään astiaan. Pyöritä levyä varovasti 30 sekuntia ja kuivaa sitten kiekko ilmassa. Siirrä kiekko IPA-levylle ja pyöritä levyä 30 sekuntia puhdistaaksesi.
Piraijaliuosta (vetyperoksidin ja väkevän rikkihapon seos, 1:3 (tilavuus/tilavuus)) voidaan valinnaisesti käyttää maksimoimaan orgaanisten jäännösten poistaminen piikiekon pinnalta.
Piranha-liuos on erittäin syövyttävää ja tuottaa lämpöä.Lisävarotoimet ovat tarpeen.Jätteen hävittämistä varten, anna liuoksen jäähtyä ja siirrä se puhtaaseen, kuivaan jätesäiliöön.Käytä toissijaisia ​​säiliöitä ja merkitse jätesäiliöt asianmukaisesti. Noudata laitoksen turvallisuusohjeita yksityiskohtaisempia menettelyjä varten.
Kuivaa kiekot asettamalla ne 200 °C:n lämpölevylle 10 minuutiksi. Kuivauksen jälkeen kiekkoa ravisteltiin viisi kertaa ilmassa jäähtymään.
Kaada ~10 g fotoresistiä SU-8 2100 puhdistetun piikiekon keskelle. Levitä fotoresisti pinseteillä tasaisesti kiekolle. Aseta kiekko silloin tällöin 65°C:n keittolevylle, jotta fotoresisti jää vähemmän tahmeaksi ja levittyy helpommin. Älä aseta kiekkoa suoraan keittolevylle.
SU-8 jakautui tasaisesti kiekolle ajamalla spin-pinnoitusta. Ohjelmoi SU-8:n tuleva kierto 5–10 sekunniksi etenemään nopeudella 500 rpm kiihtyvyydellä 100 rpm/s. Aseta pääpyöritys 200 µm:n paksuuskuviointiin (paksuus 1500 µm, 50ma, korkeus 200 mm). sirun suolen ylemmälle kerrokselle; katso "Kriittiset vaiheet" alla) asetettu kiihtyvyyteen 300 rpm/s 30 sekuntia nopeudella 1 200 rpm.
Päälinkousnopeutta voidaan säätää piikiekon SU-8-kuvion tavoitepaksuuden mukaan.
500 µm korkeiden SU-8-kuvioiden valmistamiseksi sirun suolen ylempään kerrokseen, tämän laatikon kehruupinnoitus ja pehmeä paistovaiheet (vaiheet 7 ja 8) toistettiin peräkkäin (katso vaihe 9), jolloin saatiin kaksi 250 µm:n kerrosta. Paksu kerros SU-8:aa, joka voidaan kerrostaa 2 µm korkealla UV-valotuksella ja liittämällä 0 µm. .
Paista SU-8-pinnoitetut kiekot pehmeäksi asettamalla kiekot varovasti keittolevylle 65 °C:seen 5 minuutiksi, vaihda sitten asetukseksi 95 °C ja inkuboi vielä 40 minuuttia.
Saavuttaaksesi 500 µm SU-8-kuvion korkeuden ylempään mikrokanavaan, toista vaiheet 7 ja 8 luodaksesi kaksi 250 µm paksua SU-8-kerrosta.
Laske kiekon valotusaika UV Mask Aligneria käyttämällä lampputesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. (altistusaika, ms) = (altistusannos, mJ/cm2)/(lampun teho, mW/cm2).
Valotusajan määrittämisen jälkeen aseta fotomaski UV-maskin kohdistuslaitteen maskin pidikkeeseen ja aseta fotonaamio SU-8-pinnoitetun kiekon päälle.
Aseta valokuvanaamion painettu pinta suoraan piikiekon SU-8-pinnoitetulle puolelle UV-dispersion minimoimiseksi.
Altista SU-8-pinnoitettu kiekko ja valokuvanaamio pystysuunnassa 260 mJ/cm2 UV-valolle ennalta määritetyksi valotusajaksi (katso tämän laatikon vaihe 10).
UV-altistuksen jälkeen SU-8-pinnoitettuja piikiekkoja paistettiin 65 °C:ssa 5 minuuttia ja 95 °C:ssa 15 minuuttia kullakin keittolevyllä 200 µm korkeiden kuvioiden valmistamiseksi. Pidennä jälkipaistamisaikaa 95 °C:ssa 30 minuuttiin valmistaaksesi kuvioita, joiden korkeus oli 500 µm.
Kehite kaadetaan lasimaljaan ja paistettu vohveli asetetaan astiaan. SU-8 kehittimen tilavuus voi vaihdella lasilevyn koon mukaan.Varmista, että käytät tarpeeksi SU-8 kehitettä valottamattoman SU-8:n poistamiseksi kokonaan. Jos esimerkiksi käytät 150 mm:n halkaisijaltaan hellävaraista lasiastiaa, jonka kapasiteetti on 1 litraa, käytä noin 30 lop.8 minuuttia. kierto.
Huuhtele kehitetty muotti ~10 ml:lla tuoretta kehitettä ja sen jälkeen IPA:ta ruiskuttamalla liuos pipetillä.
Aseta kiekko plasmapuhdistimeen ja altista happiplasmalle (ilmakehän kaasu, tavoitepaine 1 × 10-5 Torr, teho 125 W) 1,5 minuutin ajan.
Aseta kiekko tyhjiöksikkaattoriin, jonka sisällä on lasilevy. Kiekot ja objektilasit voidaan sijoittaa vierekkäin. Jos tyhjiökiikaattori on jaettu levyllä useisiin kerroksiin, aseta objektilasit alempaan kammioon ja kiekot ylempään kammioon. Tiputa 100 μL trikloori-, fluorilasiliuosta (1H, 2Horoct, 1H) käytä tyhjiötä silanointiin.
Sulata jäädytettyjä Caco-2-soluja sisältävä pullo 37 °C:n vesihauteessa ja siirrä sitten sulatetut solut T75-pulloon, joka sisältää 15 ml 37 °C:ssa esilämmitettyä Caco-2-elatusainetta.
Caco-2-solujen läpäisemiseksi ~90 %:n konfluenssissa lämmitä ensin Caco-2-elatusaine, PBS ja 0,25 % trypsiini/1 mM EDTA 37 °C:n vesihauteessa.
Ime väliaine tyhjiöimulla. Pese solut kahdesti 5 ml:lla lämmintä PBS:ää toistamalla tyhjiöimu ja lisäämällä tuoretta PBS:ää.