Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Ihmisen suoliston morfogeneesi muodostaa krypta-nulisukkeen 3D-epiteelin mikroarkkitehtuurin ja spatiaalisen organisaation. Tätä ainutlaatuista rakennetta tarvitaan suoliston homeostaasin ylläpitämiseen suojaamalla kantasolulokeroa tyvikryptassa eksogeenisiltä mikrobien antigeeneiltä ja niiden metaboliiteilta. Lisäksi suoliston nukat ja erittävä lima edustavat toiminnallisesti erilaistuneita epiteelisoluja, joilla on suojaava este suoliston limakalvon pinnalla. Siksi 3D-epiteelirakenteiden uudelleenluominen on ratkaisevan tärkeää in vitro -suolistomallien rakentamiselle. Erityisesti orgaaninen mimeettinen suolisto sirulla voi indusoida suoliston epiteelin spontaanin 3D-morfogeneesin, jolla on parannetut fysiologiset toiminnot ja biomekaniikka. Tässä tarjoamme toistettavan protokollan suoliston morfogeneesin indusoimiseksi tehokkaasti suolistossa mikrofluidistisella sirulla sekä Transwell-upotetulla hybridisirulla. Kuvaamme yksityiskohtaiset menetelmät laitteiden valmistukseen, Caco-2- tai suoliston organoidiepiteelisolujen viljelyyn tavanomaisissa olosuhteissa sekä mikrofluidi-alustalla, 3D-morfogeneesin indusointiin ja vakiintuneen 3D-epiteelin karakterisointiin useilla kuvantamismenetelmillä. Tämä protokolla saavuttaa toiminnallisen suoliston regeneraation. mikroarkkitehtuuria kontrolloimalla basolateraalista nestevirtausta 5 päivän ajan. In vitro -morfogeneesimenetelmämme hyödyntää fysiologisesti relevanttia leikkausjännitystä ja mekaanista liikettä eikä vaadi monimutkaista solujen suunnittelua tai manipulointia, mikä voi olla muita olemassa olevia tekniikoita parempi. Uskomme, että ehdotetulla protokollallamme voisi olla laaja-alaisia ​​vaikutuksia biolääketieteen tutkimusyhteisölle, sillä se tarjoaisi menetelmän 3D-suoliston epiteelikerrosten regeneroimiseksi in vitro biolääketieteellisiin, kliinisiin ja farmaseuttisiin sovelluksiin.
Kokeet osoittavat, että suoliston epiteelin Caco-2-solut, joita viljellään gut-on-a-chip1,2,3,4,5 tai kaksikerroksisissa mikrofluidilaitteissa6,7, voivat läpikäydä spontaanin 3D-morfogeneesin in vitro ilman selkeää ymmärrystä taustalla olevasta mekanismista. Äskettäisessä tutkimuksessamme havaitsimme, että basolateraalisesti erittyvien morfogeeniantagonistien poistaminen viljelylaitteista on välttämätöntä ja riittävää 3D-epiteelin morfogeneesin indusoimiseksi in vitro, mikä on osoitettu Caco-2:lla ja potilaista peräisin olevilla suolistoorganoidilla. Epiteelisolut validoitiin. Tässä tutkimuksessa keskityimme erityisesti voimakkaan Wnt-antagonistin, Dickkopf-1:n (DKK-1), solutuotantoon ja pitoisuusjakaumaan suolisto-sirussa ja muunnelluissa Transwell-inserttejä sisältävissä mikrofluidilaitteissa, joita kutsutaan "hybridi-siruiksi". Osoitamme, että eksogeenisten Wnt-antagonistien (kuten DKK-1:n, Wnt-repressori 1:n, erittyvän frizzled-sukulaisen proteiinin 1:n tai Soggy-1:n) lisääminen sirulle sijoitettuun suolistoon estää morfogeneesiä tai häiritsee esirakenteista 3D-epiteelikerrosta, mikä viittaa siihen, että antagonistinen stressi viljelyn aikana on vastuussa suoliston morfogeneesistä in vitro. Siksi käytännöllinen lähestymistapa vankan morfogeneesin saavuttamiseksi epiteelirajapinnassa on poistaa tai minimoida Wnt-antagonistien tasot basolateraalisessa osastossa aktiivisella huuhtelulla (esim. suolisto-sirussa tai hybridi-sirussa olevissa alustoissa) tai diffuusiolla basolateraalisessa mediassa (esim. Transwell-inserteistä suuriin basolateraalisiin säiliöihin kaivoissa).
Tässä protokollassa tarjoamme yksityiskohtaisen menetelmän gut-on-a-chip -mikrolaitteiden ja Transwell-insertoitavien hybridisirujen (vaiheet 1-5) valmistamiseksi suoliston epiteelisolujen viljelyyn polydimetyylisiloksaani (PDMS) -pohjaisilla huokoisilla kalvoilla (vaiheet 6A, 7A, 8, 9) tai Transwell-inserttien polyesterikalvoilla (vaiheet 6B, 7B, 8, 9) ja 3D-morfogeneesin indusoimiseksi in vitro (vaihe 10). Tunnistimme myös solu- ja molekyylipiirteitä, jotka viittaavat kudoskohtaiseen histogeneesiin ja suvusta riippuvaan solujen erilaistumiseen käyttämällä useita kuvantamismenetelmiä (vaiheet 11-24). Indusoimme morfogeneesiä käyttämällä ihmisen suoliston epiteelisoluja, kuten Caco-2:ta tai suoliston organoideja, kahdessa viljelymuodossa, joissa on teknisiä yksityiskohtia, mukaan lukien huokoisten kalvojen pinnanmuokkaus, 2D-yksikerroksisten solujen luominen sekä suoliston biokemiallinen ja biomekaanisen mikroympäristön lisääntyminen in vitro. 3D-morfogeneesin indusoimiseksi 2D-epiteelisoluista poistimme morfogeeniantagonistit molemmista viljelymuodoista virtaattamalla väliaineen... viljelmän basolateraalinen osasto. Lopuksi esitämme regeneroituvan 3D-epiteelikerroksen hyödyllisyyden, jota voidaan käyttää morfogeenistä riippuvaisen epiteelin kasvun, pitkittäisten isäntä-mikrobiomi-yhteisviljelmien, patogeeni-infektion, tulehdusvaurion, epiteelisuojan toimintahäiriön ja probioottipohjaisten hoitojen mallintamiseen. Esimerkki.vaikutukset.
Protokollamme voi olla hyödyllinen laajalle joukolle tutkijoita sekä perustutkimuksessa (esim. suoliston limakalvobiologia, kantasolubiologia ja kehitysbiologia) että soveltavassa tutkimuksessa (esim. prekliininen lääketestaus, tautien mallinnus, kudosteknologia ja gastroenterologia) ja sillä voi olla laaja vaikutus. Koska protokollamme on toistettava ja luotettava indusoimaan suoliston epiteelin 3D-morfogeneesiä in vitro, uskomme, että tekninen strategiamme voidaan levittää yleisölle, joka tutkii solusignaloinnin dynamiikkaa suoliston kehityksen, uudistumisen tai homeostaasin aikana. Lisäksi protokollamme on hyödyllinen tutkittaessa infektioita erilaisten tartuntatautien aiheuttajien, kuten norovirus 8:n, vakavan akuutin hengitystieoireyhtymän (SARS-CoV-2), Clostridium difficilen, Salmonella Typhimurium 9:n tai Vibrio choleraen, aiheuttamina. Myös taudin patologian ja patogeneesin kohdeyleisöt ovat hyödyllisiä. Sirulle sijoitetun suoliston mikrofysiologiajärjestelmän käyttö voi mahdollistaa pitkittäisen yhteisviljelyn 10 ja sitä seuraavan isännän puolustuksen, immuunivasteiden ja patogeeneihin liittyvien vaurioiden korjauksen arvioinnin ruoansulatuskanavassa (GI) 11. Muita vuotavan suolen oireyhtymään, keliakiaan, Crohnin tautiin, haavaiseen paksusuolen tulehdukseen, pussiittiin tai ärtyvän suolen oireyhtymään liittyviä ruoansulatuskanavan häiriöitä voidaan simuloida, kun 3D-suoliston epiteelikerrokset valmistetaan käyttämällä potilaan 3D-suoliston epiteelikerroksia. Näitä sairauksia ovat villusatrofia, kryptien lyheneminen, limakalvovauriot tai heikentynyt epiteelisuoja. Biopsia tai kantasoluista peräisin olevat suolistoorganoidit 12,13. Tautiympäristön suuremman monimutkaisuuden paremman mallintamisen varmistamiseksi lukijat voivat harkita taudille relevanttien solutyyppien, kuten potilaan perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC), lisäämistä malleihin, jotka sisältävät 3D-suoliston villus-krypta-mikroarkkitehtuureja. Kudosspesifiset immuunisolut, 5.
Koska epiteelin 3D-mikrorakenne voidaan kiinnittää ja visualisoida ilman leikkausprosessia, spatiaalisen transkriptomiikan ja korkean resoluution tai superresoluution kuvantamisen parissa työskentelevät katsojat saattavat olla kiinnostuneita kartoituksestamme geenien ja proteiinien spatiaalisesta ja ajallisesta dynamiikasta epiteelin lokeroissa. Kiinnostaako teknologia. Vastaus mikrobi- tai immuuniärsykkeisiin. Lisäksi pitkittäinen isäntä-mikrobiomi-vuorovaikutus 10, 14, joka koordinoi suoliston homeostaasia, voidaan muodostaa 3D-suoliston limakalvokerroksessa viljelemällä yhdessä erilaisia ​​mikrobilajeja, mikrobiyhteisöjä tai ulosteen mikrobistoa, erityisesti suolisto-sirussa. alustalla. Tämä lähestymistapa on erityisen houkutteleva yleisölle, joka tutkii limakalvojen immunologiaa, gastroenterologiaa, ihmisen mikrobiomia, kulturomiikkaa ja kliinistä mikrobiologiaa ja pyrkii viljelemään aiemmin viljelemätöntä suoliston mikrobiota laboratoriossa. Jos in vitro -morfogeneesiprotokollamme voidaan mukauttaa skaalautuviin viljelyformaatteihin, kuten monikuoppaisiin insertteihin 24-, 96- tai 384-kuoppalevyillä, jotka jatkuvasti täydentävät basolateraalisia osastoja, protokollaa voidaan myös levittää niille, jotka kehittävät lääke-, biolääketieteellisiä tai suuren läpimenon seulonta- tai validointialustoja elintarviketeollisuudelle. Periaatetodistuksena osoitimme äskettäin moninkertaisen suuren läpimenon morfogeneesijärjestelmän toteutettavuuden, joka voidaan skaalata 24-kuoppalevyformaattiin. Lisäksi useita organ-on-a-chip -tuotteita on kaupallistettu16,17,18. Siksi in vitro -morfogeneesimenetelmämme validointia voidaan nopeuttaa ja mahdollisesti ottaa käyttöön monissa tutkimuslaboratorioissa, teollisuudessa tai hallituksessa ja sääntelyvirastoissa ymmärtääkseen in vitro -suoliston morfogeneesin solujen uudelleenohjelmointia transkriptoomitasolla lääkkeiden tai bioterapeuttisten aineiden testaamiseksi. Lääke-ehdokkaiden imeytymistä ja kuljetusta arvioitiin käyttämällä 3D-suolen korvikkeet tai räätälöityjen tai kaupallisten elin-sirumallien käyttö suolen morfogeneesiprosessin toistettavuuden arvioimiseksi.
Rajoitettua määrää ihmiselle merkityksellisiä kokeellisia malleja on käytetty suoliston epiteelin morfogeneesin tutkimiseen, pääasiassa siksi, ettei 3D-morfogeneesin indusoimiseksi in vitro ole olemassa toteutettavia protokollia. Itse asiassa suuri osa nykyisestä tiedosta suoliston morfogeneesistä perustuu eläinkokeisiin (esim. seeprakala20, hiiret21 tai kanat22). Ne ovat kuitenkin työläitä ja kustannusintensiivisiä, voivat olla eettisesti kyseenalaisia ​​ja mikä tärkeintä, ne eivät määritä tarkasti ihmisen kehitysprosesseja. Näiden mallien kyky testata monisuuntaisesti skaalautuvalla tavalla on myös hyvin rajallinen. Siksi 3D-kudosrakenteiden regenerointiin in vitro -protokollamme on parempi kuin in vivo -eläinmallit sekä muut perinteiset staattiset 2D-soluviljelymallit. Kuten aiemmin on kuvattu, 3D-epiteelirakenteiden hyödyntäminen mahdollisti erilaistuneiden solujen spatiaalisen sijainnin tutkimisen krypta-villus-akselilla vasteena erilaisille limakalvo- tai immuuniärsykkeille. 3D-epiteelikerrokset voivat tarjota tilan tutkia, miten mikrobisolut kilpailevat muodostaakseen spatiaalisia lokeroita ja ekologista evoluutiota vasteena isäntätekijöille (esim. sisempi vs. ulompi limakerros, IgA:n ja antimikrobisten peptidien eritys). Lisäksi, 3D-epiteelin morfologia voi auttaa meitä ymmärtämään, miten suoliston mikrobiota rakentaa yhteisöjään ja tuottaa synergistisesti mikrobien metaboliitteja (esim. lyhytketjuisia rasvahappoja), jotka muokkaavat solujen organisaatiota ja kantasolujen lokeroita tyvitumakkeissa. Nämä ominaisuudet voidaan osoittaa vain, kun 3D-epiteelikerrokset on muodostettu in vitro.
Kolmiulotteisten suoliston epiteelirakenteiden luomismenetelmämme lisäksi on olemassa useita in vitro -menetelmiä. Suoliston organoidiviljely on huippuluokan kudosteknologiatekniikka, joka perustuu suoliston kantasolujen viljelyyn tietyissä morfogeeniolosuhteissa23,24,25. Kolmiulotteisten organoidimallien käyttö kuljetusanalyysissä tai isäntä-mikrobiomi-yhteisviljelmissä on kuitenkin usein haastavaa, koska suoliston ontelo on organoidin sisällä ja siksi ontelon komponenttien, kuten mikrobisolujen tai eksogeenisten antigeenien, lisääminen on rajoitettua. Pääsyä organoidionteloihin voidaan parantaa mikroinjektorilla26,27, mutta tämä menetelmä on invasiivinen ja työvoimavaltainen ja vaatii erikoisosaamista. Lisäksi perinteiset hydrogeelirakenteissa staattisissa olosuhteissa ylläpidetyt organoidiviljelmät eivät heijasta tarkasti aktiivista in vivo -biomekaniikkaa.
Useiden tutkimusryhmien käyttämät muut lähestymistavat hyödyntävät esirakenteisia 3D-hydrogeelirakenteita suoliston epiteelin rakenteen jäljittelemiseksi viljelemällä eristettyjä ihmisen suolistosoluja geelin pinnalla. Valmista hydrogeelirakenteita käyttämällä 3D-tulostettuja, mikrojyrsittyjä tai litografisesti valmistettuja muotteja. Tämä menetelmä osoittaa eristettyjen epiteelisolujen itseorganisoituneen järjestyksen in vitro fysiologisesti relevanteilla morfogeenigradienteilla, mikä luo korkean sivusuhteen epiteelirakenteen ja strooma-epiteeli-vuorovaikutuksen sisällyttämällä stroomasoluja rakenteeseen. Esirakenteisten rakenteiden luonne voi kuitenkin estää itse spontaanin morfogeneettisen prosessin näkymisen. Nämä mallit eivät myöskään tarjoa dynaamista luminaalista tai interstitiaalista virtausta, koska niistä puuttuu nesteen leikkausjännitys, jota suolistosolut tarvitsevat morfogeneesiin ja fysiologisen toiminnan saavuttamiseen. Toisessa äskettäisessä tutkimuksessa käytettiin hydrogeelirakenteita mikrofluidi-alustalla ja kuvioitiin suoliston epiteelirakenteita laseretsaustekniikoilla. Hiiren suolistoorganoidit seuraavat syövytettyjä kuvioita muodostaen suoliston putkimaisia ​​rakenteita, ja luminaalinen nestevirtaus voidaan koota uudelleen mikrofluidimoduulin avulla. Tämä malli ei kuitenkaan esitä spontaaneja morfogeneettisiä prosesseja eikä sisällä suoliston mekanobiologiset liikkeet. Saman ryhmän 3D-tulostustekniikat pystyivät luomaan miniatyyrikokoisia suolistoputkia, joilla on spontaanisti morfogeneettisiä prosesseja. Huolimatta monimutkaisesta eri suolistosegmenttien valmistuksesta putken sisällä, tästä mallista puuttuu myös ontelon nesteen virtaus ja mekaaninen muodonmuutos. Lisäksi mallin toimivuus voi olla rajallista, erityisesti biotulostusprosessin päätyttyä, mikä häiritsee kokeellisia olosuhteita tai solujen välisiä vuorovaikutuksia. Sen sijaan ehdottamamme protokolla tarjoaa spontaanin suoliston morfogeneesin, fysiologisesti relevantin leikkausjännityksen, biomekaniikkaa, joka jäljittelee suoliston liikkuvuutta, itsenäisten apikaalisten ja basolateraalisten osastojen saavutettavuuden ja monimutkaisten modulaaristen biologisten mikroympäristöjen uudelleenluomisen. Siksi in vitro 3D-morfogeneesiprotokollamme voi tarjota täydentävän lähestymistavan olemassa olevien menetelmien haasteiden ratkaisemiseksi.
Protokollamme keskittyy kokonaan 3D-epiteelin morfogeneesiin, ja viljelmässä on vain epiteelisoluja eikä muita ympäröiviä soluja, kuten mesenkymaalisia soluja, endoteelisoluja tai immuunisoluja. Kuten aiemmin on kuvattu, protokollamme ydin on epiteelin morfogeneesin indusointi poistamalla morfogeenin estäjät, joita erittyy syötetyn väliaineen basolateraaliselle puolelle. Vaikka gut-on-a-chip- ja hybrid-on-a-chip-järjestelmien vankka modulaarisuus mahdollistaa aaltoilevan 3D-epiteelikerroksen luomisen uudelleen, muita biologisia monimutkaisuuksia, kuten epiteeli-mesenkymaalisia vuorovaikutuksia33,34, solunulkoisen matriisin (ECM) laskeutumista35 ja mallissamme krypta-villus-ominaisuuksia, jotka välittävät kantasolujen lokeroita basaalisissa kryptoissa, on vielä tarkasteltava lisää. Mesenkyymin stroomasoluilla (esim. fibroblasteilla) on keskeinen rooli ECM-proteiinien tuotannossa ja suoliston morfogeneesin säätelyssä in vivo35,37,38. Mesenkymaalisten solujen lisääminen malliimme paransi morfogeneesiprosessia ja solujen kiinnittymistehokkuutta. Endoteelikerroksella (eli kapillaareilla tai imusuonilla) on tärkeä rooli säätelyssä molekyylikuljetus39 ja immuunisolujen rekrytointi40 suoliston mikroympäristössä. Lisäksi verisuoniston komponentit, jotka voidaan yhdistää kudosmallien välillä, ovat edellytys, kun kudosmalleja suunnitellaan osoittamaan useiden elinten välisiä vuorovaikutuksia. Siksi endoteelisoluja voidaan joutua sisällyttämään mallintamaan tarkempia fysiologisia ominaisuuksia elintason tarkkuudella. Potilaalta peräisin olevat immuunisolut ovat myös välttämättömiä synnynnäisten immuunivasteiden, antigeenin esittelyn, synnynnäisen adaptiivisen immuunivasteen ja kudoskohtaisen immuniteetin osoittamiseksi suolistosairauksien jäljittelyn yhteydessä.
Hybridisirujen käyttö on suoraviivaisempaa kuin suolisto-siru-tekniikka, koska laitteen kokoonpano on yksinkertaisempi ja Transwell-inserttien käyttö mahdollistaa suolistoepiteelin skaalautuvan viljelyn. Kaupallisesti saatavilla olevat polyesterikalvoilla varustetut Transwell-insertit eivät kuitenkaan ole elastisia eivätkä pysty simuloimaan peristalttisia liikkeitä. Lisäksi hybridisiruun sijoitetun Transwell-insertin apikaalinen osasto pysyi paikallaan ilman leikkausjännitystä apikaalisella puolella. On selvää, että apikaalisen osaston staattiset ominaisuudet harvoin mahdollistavat pitkäaikaisen bakteerien yhteisviljelyn hybridisiruissa. Vaikka voimme indusoida luotettavasti 3D-morfogeneesiä Transwell-inserteissä hybridisiruja käytettäessä, fysiologisesti relevantin biomekaniikan ja apikaalisen nestevirtauksen puute voi rajoittaa hybridisirualustojen toteutettavuutta potentiaalisissa sovelluksissa.
Ihmisen krypta-nulisäke-akselin täysimittaisia ​​rekonstruktioita suolisto-siru- ja hybridi-siru-viljelmissä ei ole vielä täysin selvitetty. Koska morfogeneesi alkaa epiteelin monokerroksesta, 3D-mikroarkkitehtuurit eivät välttämättä tarjoa morfologista samankaltaisuutta kryptojen kanssa in vivo. Vaikka karakterisoimme mikromuokatussa 3D-epiteelissä basaalisen krypta-alueen lähellä olevan proliferatiivisen solupopulaation, krypta- ja villusalueet eivät olleet selvästi rajattuja. Vaikka sirun korkeammat yläkanavat johtavat mikromuokatun epiteelin korkeuden kasvuun, enimmäiskorkeus on silti rajoitettu noin 300–400 µm:iin. Ihmisen suoliston kryptojen todellinen syvyys ohutsuolessa ja paksusuolessa on noin 135 µm ja noin 400 µm, ja ohutsuolen nukkalisäkkeiden korkeus on noin 600 µm41.
Kuvantamisen näkökulmasta 3D-mikroarkkitehtuurien in situ -superresoluutiokuvaus voi rajoittua sirun suoleen, koska vaadittava työskentelyetäisyys objektiivista epiteelikerrokseen on muutaman millimetrin luokkaa. Tämän ongelman ratkaisemiseksi saatetaan tarvita kaukainen objektiivi. Lisäksi ohuiden leikkeiden valmistaminen kuvantamisnäytteiden valmistelua varten on haastavaa PDMS:n suuren elastisuuden vuoksi. Lisäksi, koska suoliston kerros kerrokselta tapahtuva mikrovalmistus sirulle sisältää pysyvän tarttumisen jokaisen kerroksen välille, on erittäin haastavaa avata tai poistaa ylempi kerros epiteelikerroksen pintarakenteen tutkimiseksi. Esimerkiksi pyyhkäisyelektronimikroskooppia (SEM) käyttämällä.
PDMS:n hydrofobisuus on ollut rajoittava tekijä mikrofluidipohjaisissa tutkimuksissa, joissa käsitellään hydrofobisia pieniä molekyylejä, koska PDMS voi adsorboida epäspesifisesti tällaisia ​​hydrofobisia molekyylejä. Vaihtoehtoja PDMS:lle voidaan harkita muiden polymeerimateriaalien kanssa. Vaihtoehtoisesti voidaan harkita PDMS:n pinnan modifiointia (esim. päällystäminen lipofiilisillä materiaaleilla 42 tai poly(etyleeniglykolilla) 43) hydrofobisten molekyylien adsorboitumisen minimoimiseksi.
Lopuksi, menetelmäämme ei ole vielä hyvin karakterisoitu sen tarjoamiseksi, että se tarjoaisi suuren läpimenon seulontaa tai "yhden koon" käyttäjäystävällistä kokeellista alustaa. Nykyinen protokolla vaatii ruiskupumpun mikrolaitetta kohden, mikä vie tilaa CO2-inkubaattorissa ja estää laajamittaiset kokeet. Tätä rajoitusta voidaan parantaa merkittävästi innovatiivisten viljelymuotojen skaalautuvuudella (esim. 24-, 96- tai 384-kuoppaiset huokoiset insertit, jotka mahdollistavat basolateraalisen elatusaineen jatkuvan täydentämisen ja poistamisen).
Ihmisen suolistoepiteelin 3D-morfogeneesin indusoimiseksi in vitro käytimme mikrofluidistista siru-suolijärjestelmää, joka sisälsi kaksi rinnakkaista mikrokanavaa ja niiden välissä elastisen huokoisen kalvon luumenin ja kapillaarin rajapinnan luomiseksi. Esittelemme myös yksikanavaisen mikrofluidistisen laitteen (hybridisirun) käytön, joka tarjoaa jatkuvan basolateraalisen virtauksen Transwell-inserteille kasvatettujen polarisoitujen epiteelikerrosten alle. Molemmilla alustoilla erilaisten ihmisen suolistoepiteelisolujen morfogeneesiä voidaan osoittaa soveltamalla virtauksen suuntaavaa manipulointia morfogeeniantagonistien poistamiseksi basolateraalisesta lokerosta. Koko kokeellinen toimenpide (kuva 1) koostuu viidestä osasta: (i) suolistosirun tai Transwell-insertoitavan hybridisirun mikrovalmistus (vaiheet 1-5; laatikko 1), (ii) suolistoepiteelisolujen (Caco-2-solut) tai ihmisen suolistoorganoidien valmistus; laatikot 2–5), (iii) suoliston epiteelisolujen viljely suolistosiruilla tai hybridisiruilla (vaiheet 6–9), (iv) 3D-morfogeneesin induktio in vitro (vaihe 10) ja (v)) 3D-epiteelin mikrorakenteen karakterisoimiseksi (vaiheet 11–24). Lopuksi suunniteltiin sopiva kontrolliryhmä (josta keskustellaan tarkemmin jäljempänä) validoimaan in vitro -morfogeneesin tehokkuutta vertaamalla epiteelin morfogeneesiä spatiaalisiin, temporaalisiin, ehdollisiin tai proseduraalisiin kontrolleihin.
Käytimme kahta erilaista viljelyalustaa: suolisto-siru-tekniikkaa suorilla kanavilla tai epälineaarisilla kiemurtelevilla kanavilla tai hybridisiruja, jotka sisältävät Transwell (TW) -inserttejä mikrofluidilaitteessa, joka on valmistettu laatikossa 1 kuvatulla tavalla, ja vaiheet 1-5. ”Laitteen valmistus” esittää päävaiheet yksittäisen sirun tai hybridisirun valmistuksessa. ”Ihmisen suoliston epiteelisolujen viljely” selittää tässä protokollassa käytetyn solulähteen (Caco-2 tai ihmisen suoliston organoidit) ja viljelymenetelmän. ”In vitro -morfogeneesi” esittää yleiset vaiheet, joissa Caco-2- tai organoideista peräisin olevia epiteelisoluja viljellään suolistosirulla tai hybridisirun Transwell-inserteillä, minkä jälkeen indusoidaan 3D-morfogeneesi ja muodostetaan karakterisoitu epiteelirakenne. Ohjelman vaiheen numero tai laatikon numero näkyy kunkin nuolen alapuolella. Sovellus tarjoaa esimerkkejä siitä, miten vakiintuneita suoliston epiteelikerroksia voidaan käyttää esimerkiksi solujen erilaistumisen karakterisoinnissa, suoliston fysiologian tutkimuksissa, isäntä-mikrobiomi-ekosysteemien luomisessa ja tautien mallintamisessa. Immunofluoresenssikuvat ”Solujen erilaistuminen” -kohdassa näyttävät tumat, F-aktiini ja MUC2:ta ilmentyy suolistosoluissa muodostuneessa 3D Caco-2 -epiteelikerroksessa. MUC2-signalointia esiintyy pikarisoluissa ja limakalvojen pinnoilta erittyvässä limassa. Gut Physiology -ohjelman fluoresoivat kuvat näyttävät limaa, joka on tuotettu värjäämällä siaalihappo- ja N-asetyyliglukosamiinitähteet fluoresoivalla vehnänalkioagglutiniinilla. Kaksi päällekkäistä kuvaa "Host-Microbe Co-Cultures" -ohjelmassa näyttävät edustavia isäntä-mikrobiomi-yhteisviljelmiä suolistossa sirulla. Vasen paneeli näyttää vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP) ilmentävän E. colin ja mikromuokattujen 3D Caco-2 -epiteelisolujen yhteisviljelyn. Oikea paneeli näyttää GFP:n ja 3D Caco-2 -epiteelisolujen yhteisviljelmän E. colin lokalisaation, jota seurasi immunofluoresenssivärjäys F-aktiinilla (punainen) ja tumilla (sininen). Sairausmallinnus havainnollistaa terveen ja vuotavan suolen eroja suolistotulehdussiruissa fysiologisessa altistuksessa bakteeriantigeeneille (esim. lipopolysakkaridi, LPS) ja immuunisoluille (esim. PBMC; vihreä). Caco-2-soluja viljeltiin 3D-epiteelikerroksen muodostamiseksi. Skaala palkki, 50 µm. Alarivillä olevat kuvat: ”Solujen erilaistuminen”, muokattu luvalla viitteestä.2. Oxford University Press; Kopioitu luvalla viitteestä.5. NAS; ”Isäntä-mikrobi-yhteisviljely”, muokattu luvalla viitteestä.3. NAS; ”Tautien mallinnus”, muokattu luvalla viitteestä.5. NAS.
Sekä gut-on-a-chip- että hybridi-sirut valmistettiin käyttämällä PDMS-jäljennöksiä, jotka purettiin piimuoteista pehmeällä litografialla1,44 ja kuvioitiin SU-8:lla. Kunkin sirun mikrokanavien suunnittelu määritetään ottamalla huomioon hydrodynamiikka, kuten leikkausjännitys ja hydrodynaaminen paine1,4,12. Alkuperäinen gut-on-a-chip -rakenne (laajennettu data, kuva 1a), joka koostui kahdesta vierekkäisestä yhdensuuntaisesta suorasta mikrokanavasta, on kehittynyt monimutkaiseksi gut-on-a-chipiksi (laajennettu data, kuva 1b), joka sisältää parin kaarevia mikrokanavia indusoimaan pidentynyttä nesteen viipymäaikaa, epälineaarisia virtauskuvioita ja viljeltyjen solujen moniaksiaalista muodonmuutosta (kuva 2a–f)12. Kun monimutkaisempaa suoliston biomekaniikkaa on luotava uudelleen, voidaan valita monimutkaisia ​​gut-on-a-chippejä. Olemme osoittaneet, että mutkitteleva Gut-Chip indusoi myös voimakkaasti 3D-morfogeneesiä samassa ajassa ja samalla epiteelin kasvuasteella verrattuna alkuperäiseen Gut-Chipiin, riippumatta... viljelty solutyyppi. Siksi lineaariset ja monimutkaiset sirulle asennetut suolistomallit ovat keskenään vaihdettavissa 3D-morfogeneesin indusoimiseksi. Piimuotteihin SU-8-kuvioilla kovetetut PDMS-jäljennökset tarjosivat negatiivisia ominaisuuksia muotista purkamisen jälkeen (kuva 2a). Suolen valmistamiseksi sirulle valmistettu ylempi PDMS-kerros sidottiin peräkkäin huokoiseen PDMS-kalvoon ja sitten kohdistettiin alempaan PDMS-kerrokseen peruuttamattomalla sidoksella käyttäen koronakäsittelylaitetta (kuva 2b–f). Hybridi-sirujen valmistamiseksi kovetetut PDMS-jäljennökset sidottiin lasilevyille yksikanavaisten mikrofluidilaitteiden luomiseksi, joihin voitiin sijoittaa Transwell-inserttejä (kuva 2h ja laajennetut tiedot kuva 2). Liimausprosessi suoritetaan käsittelemällä PDMS-jäljennöksen ja lasin pinnat happiplasmalla tai koronakäsittelyllä. Silikoniputkeen kiinnitetyn mikrovalmisteisen laitteen steriloinnin jälkeen laitekokoonpano oli valmis suorittamaan suoliston epiteelin 3D-morfogeneesin (kuva 2g).
a, Kaaviokuva PDMS-osien valmistuksesta SU-8-kuvioiduista piimuoteista. Kovettamaton PDMS-liuos kaadettiin piimuottiin (vasemmalla), kovetettiin 60 °C:ssa (keskellä) ja purettiin muotista (oikealla). Muotista purettu PDMS leikattiin paloiksi ja puhdistettiin jatkokäyttöä varten. b, Valokuva piimuotista, jota käytettiin PDMS:n yläkerroksen valmistukseen. c, Valokuva piimuotista, jota käytettiin PDMS:n huokoisen kalvon valmistukseen. d, Sarja valokuvia PDMS:n ylä- ja alakomponenteista sekä kootusta sirulle asennetusta suolistolaitteesta. e, Kaaviokuva ylä-, kalvo- ja alakomponenttien kohdistuksesta. Jokainen kerros on sidottu peruuttamattomasti plasma- tai koronakäsittelyllä. f, Kaaviokuva valmistetusta suolisto-sirulaitteesta, jossa on päällekkäin asetetut kiemurtelevat mikrokanavat ja tyhjiökammiot. g, Suolisto-sirulaitteen kokoonpano mikrofluidista soluviljelyä varten. Valmistettu suolisto sirulle, joka oli koottu silikoniputkella ja ruiskulla, asetettiin peitinlasille. Sirulaite asetettiin 150 mm:n Petrimaljan kannelle käsittely. Sideainetta käytetään silikoniputken sulkemiseen. h, Visuaalisia kuvia hybridisirun valmistuksesta ja 3D-morfogeneesistä hybridisiruja käyttäen. Transwell-insertit, jotka oli valmistettu itsenäisesti suoliston epiteelisolujen 2D-yksikerroksisten solujen viljelyyn, lisättiin hybridisiruun suoliston 3D-morfogeneesin indusoimiseksi. Elatusaine perfusoidaan mikrokanavien kautta Transwell-insertille muodostetun solukerroksen alle. Mittakaava, 1 cm. h Uusintapainos viitteen luvalla. 4. Elsevier.
Tässä protokollassa epiteelin lähteinä käytettiin Caco-2-solulinjaa ja suoliston organoideja (kuva 3a). Molempia solutyyppejä viljeltiin erikseen (laatikko 2 ja laatikko 5) ja niitä käytettiin sirulle kiinnitettyjen suolisto- tai Transwell-inserttien ECM-päällystettyjen mikrokanavien kylvämiseen. Kun solut ovat yhtyneet (>95 %:n peitto pulloissa), rutiininomaisesti viljellyt Caco-2-solut (passaatioiden 10 ja 50 välillä) T-pulloissa kerätään dissosioitujen solususpensioiden valmistamiseksi trypsinisaationesteellä (laatikko 2). Ihmisen suoliston organoideja suolistobiopsioista tai kirurgisista resektioista viljeltiin Matrigel-telineissä 24-kuoppalevyillä rakenteellisen mikroympäristön tukemiseksi. Laatikossa 3 kuvatulla tavalla valmistettua välttämättömiä morfogeenejä (kuten Wnt, R-spondiini ja Noggin) ja kasvutekijöitä sisältävää kasvatusalustaa täydennettiin joka toinen päivä, kunnes organoidit kasvoivat halkaisijaltaan noin 500 µm:iin. Täysin kasvaneet organoidit kerätään ja dissosioidaan yksittäisiksi soluiksi kylvämistä varten sirulle kiinnitettäville suolisto- tai Transwell-inserteille (laatikko 5). Kuten aiemmin olemme raportoineet, se voidaan erottaa tautityypin12,13 (esim. haavainen paksusuolitulehdus, Crohnin tauti, paksusuolen syöpä tai normaali luovuttaja), leesiopaikan (esim. leesio vs. ei-leesioalue) ja sijainnin ruoansulatuskanavassa (esim. pohjukaissuoli, tyhjäsuoli, sykkyräsuoli, umpisuoli, paksusuoli tai peräsuoli) mukaan. Laatikossa 5 tarjoamme optimoidun protokollan paksusuolen organoidien (koloidien) viljelyyn, jotka tyypillisesti vaativat suurempia morfogeenien pitoisuuksia kuin ohutsuolen organoidit.
a, Työnkulku suoliston morfogeneesin indusoimiseksi suolistosoluissa. Tässä protokollassa käytetään ihmisen Caco-2-suoliston epiteeliä ja suoliston organoideja 3D-morfogeneesin osoittamiseksi. Eristetyt epiteelisolut kylvettiin valmistettuun suolisto-siru-laitteeseen (sirun valmistelu). Kun solut on kylvetty ja kiinnitetty PDMS-huokoiseen kalvoon päivänä 0 (D0), apikaalinen (AP) virtaus käynnistetään ja sitä ylläpidetään ensimmäiset 2 päivää (virtaus, AP, D0-D2). Myös basolateraalinen (BL) virtaus käynnistetään yhdessä syklisten venytysliikkeiden (venytys, virtaus, AP ja BL) kanssa, kun täydellinen 2D-yksikerros on muodostunut. Suoliston 3D-morfogeneesi tapahtui spontaanisti 5 päivän mikrofluidiviljelyn jälkeen (morfogeneesi, D5). Vaihekontrastikuvat esittävät Caco-2-solujen edustavaa morfologiaa kussakin kokeellisessa vaiheessa tai aikapisteessä (pylväsdiagrammi, 100 µm). Neljä kaaviota, jotka havainnollistavat vastaavia suoliston morfogeneesin kaskadeja (oikeassa yläkulmassa). Kaaviossa katkoviivat edustavat suuntaa Nesteen virtaus.b, SEM-kuva, joka näyttää vakiintuneen 3D Caco-2 -epiteelin pintatopologian (vasen). Suurennettua aluetta korostava pienoiskuva (valkoinen katkoviivalaatikko) näyttää regeneroituneet mikrovillukset 3D Caco-2 -kerroksessa (oikea).c, Vakiintuneen Caco-2 3D:n, klaudiinin (ZO-1, punainen) ja jatkuvien harjasreunuskalvojen vaakasuora etukuva, jossa on merkintä F-aktiinista (vihreä) ja tumista (sininen). Epiteelisolujen immunofluoresenssi-konfokaalinen visualisointi suolistosiruilla. Keskelle kaaviota osoittavat nuolet osoittavat kunkin konfokaalisen näkymän polttotason sijainnin.d, Sirulla viljeltyjen organoidien morfologisten muutosten aikakulku, saatu faasikontrastimikroskopialla päivinä 3, 7, 9, 11 ja 13. Pienoiskuva (oikea yläkulma) näyttää annetun kuvan suurennoksen.e, DIC-mikrovalokuva suolessa vakiintuneesta organoidista 3D-epiteelistä päivänä 7 otetusta leikkeestä.f, Päällekkäin asetetut immunofluoresenssikuvat, jotka näyttävät kantasolujen (LGR5; magenta) ja pikarisolujen (MUC2; vihreä) markkereita. F-aktiini (harmaa) ja tumakkeet (syaani) kasvatettuna suolistolastuilla 3 päivän ajan (vasen) ja 13 päivän (keskimmäinen) organoidit epiteelikerroksessa. Katso myös laajennettu datakuva 3, joka korostaa LGR5-signalointia ilman MUC2-signalointia. Fluoresenssikuvat, jotka näyttävät suolistossa sirulle muodostetun 3D-organoidiepiteelin epiteelin mikrorakenteen (oikea) värjäämällä plasmamembraani CellMask-väriaineella (oikea) viljelypäivänä 13. Skaalapalkki on 50 μm, ellei toisin mainita. b Uusintapainos luvalla viitteestä.2. Oxford University Press; c Mukailtu luvalla viitteestä.2. Oxford University Press; e ja f muokattu luvalla viitteestä.12 Creative Commons -lisenssillä CC BY 4.0.
Sirun suolistossa on välttämätöntä muokata PDMS-huokoisen kalvon hydrofobista pintaa onnistuneen ECM-pinnoituksen saavuttamiseksi. Tässä menetelmässä käytämme kahta eri menetelmää PDMS-kalvojen hydrofobisuuden muokkaamiseen. Caco-2-solujen viljelyssä pelkkä pinnan aktivointi UV/otsonikäsittelyllä riitti vähentämään PDMS-pinnan hydrofobisuutta, päällystämään ECM:n ja kiinnittämään Caco-2-solut PDMS-kalvoon. Organoidiepiteelin mikrofluidiviljely vaatii kuitenkin kemialliseen pohjaan perustuvaa pinnan funktionalisointia, jotta ECM-proteiinit saadaan tehokkaasti kerrostettua levittämällä peräkkäin polyetyleeni-imiiniä (PEI) ja glutaraldehydiä PDMS-mikrokanaviin. Pinnan modifioinnin jälkeen ECM-proteiinit kerrostettiin peittämään funktionalisoitu PDMS-pinta ja sitten lisättiin eristettyyn organoidiepiteeliin. Kun solut on kiinnitetty, mikrofluidisoluviljely alkaa perfusoimalla vain väliainetta ylempään mikrokanavaan, kunnes solut muodostavat täydellisen yksikerroksen, kun taas alempi mikrokanava ylläpitää staattisia olosuhteita. Tämä optimoitu pinnan aktivointi- ja ECM-pinnoitusmenetelmä mahdollistaa organoidiepiteelin kiinnittymisen, mikä indusoi 3D-morfogeneesiä PDMS-pinnalle.
Transwell-viljelmät vaativat myös ECM-pinnoituksen ennen solujen kylvämistä; Transwell-viljelmät eivät kuitenkaan vaadi monimutkaisia ​​esikäsittelyvaiheita huokoisten inserttien pinnan aktivoimiseksi. Caco-2-solujen kasvattamiseksi Transwell-inserteillä ECM-pinnoitus huokoisissa inserteissä nopeuttaa dissosioituneiden Caco-2-solujen kiinnittymistä (<1 tunti) ja tiiviin liitosnesteen muodostumista (<1-2 päivää). Organoidien viljelyä varten Transwell-inserteillä eristetyt organoidit kylvetään ECM-päällystetyille inserteille, kiinnitetään kalvon pintaan (<3 h) ja ylläpidetään, kunnes organoidit muodostavat täydellisen yksisolukerroksen, jolla on eheä este. Transwell-viljelmät suoritetaan 24-kuoppalevyillä ilman hybridisiruja.
In vitro 3D-morfogeneesi voidaan käynnistää kohdistamalla nestevirtausta vakiintuneen epiteelikerroksen basolateraaliseen osaan. Sirun suolistossa epiteelin morfogeneesi alkoi, kun väliaine perfusoitiin ylempään ja alempaan mikrokanavaan (kuva 3a). Kuten aiemmin on kuvattu, on kriittistä tuoda nestevirtaus alempaan (basolateraaliseen) osastoon suunnattujen erittyvien morfogeenin estäjien jatkuvan poistamisen varmistamiseksi. Jotta huokoisiin kalvoihin sitoutuneille soluille saadaan riittävästi ravinteita ja seerumia ja syntyy luminaalinen leikkausjännitys, käytämme tyypillisesti kaksoisvirtausta sirun suolistossa. Hybridisiruissa epiteelimonokerroksia sisältävät Transwell-insertit asetettiin hybridisiruihin. Sitten väliaine levitettiin huokoisen Transwell-insertin basolateraalisen puolen alle mikrokanavan kautta. Suoliston morfogeneesi tapahtui 3–5 päivää basolateraalisen virtauksen aloittamisen jälkeen molemmissa viljelyalustoissa.
Mikromuokattujen 3D-epiteelikerrosten morfologisia piirteitä voidaan analysoida käyttämällä erilaisia ​​kuvantamismenetelmiä, kuten faasikontrastimikroskopiaa, differentiaalisen interferenssin (DIC) mikroskopiaa, SEM-kuvausta tai immunofluoresenssikonfokaalimikroskopiaa (kuvat 3 ja 4). Faasikontrasti- eli DIC-kuvaus voidaan helposti suorittaa milloin tahansa viljelyn aikana 3D-epiteelikerrosten muodon ja ulkoneman seuraamiseksi. PDMS:n ja polyesterikalvojen optisen läpinäkyvyyden ansiosta sekä gut-on-a-chip- että hybridi-sirualustat voivat tarjota reaaliaikaista in situ -kuvantamista ilman laitteen leikkaamista tai purkamista. Immunofluoresenssikuvausta suoritettaessa (kuvat 1, 3c, f ja 4b, c) solut kiinnitetään tyypillisesti 4 %:lla (paino/tilavuus) paraformaldehydiä (PFA), jota seuraa Triton X-100 ja 2 %:lla (paino/tilavuus) naudan seerumialbumiinia (BSA), tässä järjestyksessä. Solutyypistä riippuen voidaan käyttää erilaisia ​​fiksatiiveja, permeabilisaattoreita ja estoaineita. Lineaaririippuvaisiin solu- tai aluemarkkereihin kohdistuvia primaarisia vasta-aineita käytetään korostamaan liikkumattomia soluja. in situ sirulla, jota seuraavat sekundaariset vasta-aineet yhdessä vastaväriaineen kanssa, joka kohdistuu joko tumaan (esim. 4',6-diamidino-2-fenyleeni)indoli, DAPI) tai F-aktiiniin (esim. fluoresoivasti leimattu falloidiini). Fluoresenssiin perustuvaa reaaliaikaista kuvantamista voidaan myös suorittaa in situ liman tuotannon (kuva 1, "Solujen erilaistuminen" ja "Suoliston fysiologia"), mikrobisolujen satunnaisen kolonisaation (kuva 1, "Isäntä-mikrobi-yhteisviljely"), immuunisolujen rekrytoinnin (kuva 1, "Taudin mallinnus") tai 3D-epiteelin morfologian ääriviivojen (kuva 3c, f ja 4b, c) havaitsemiseksi. Kun sirun suolta muokataan ylemmän kerroksen erottamiseksi alemmasta mikrokanavakerroksesta, kuten viitteessä on kuvattu. Kuten kuvassa 2 on esitetty, 3D-epiteelin morfologia sekä apikaalisella harjasreunalla olevat mikrovillukset voidaan visualisoida SEM:llä (kuva 3b). Erilaistumismerkkien ilmentymistä voidaan arvioida suorittamalla kvantitatiivinen PCR5 tai yksisoluinen RNA-sekvensointi. Tässä tapauksessa suolistosiruissa tai hybridisiruissa kasvatettujen epiteelisolujen 3D-kerrokset kerätään trypsinoinnilla ja käytetään sitten molekyyli- tai geneettiseen analyysiin.
a, Työnkulku suoliston morfogeneesin indusoimiseksi hybridi-sirussa. Tässä protokollassa käytetään Caco-2:ta ja suoliston organoideja 3D-morfogeneesin demonstroimiseksi hybridi-sirualustalla. Dissosioituneet epiteelisolut kylvettiin valmistettuihin Transwell-insertteihin (TW-valmistelu; katso alla oleva kuva). Kun solut oli kylvetty ja kiinnitetty polyesterikalvoihin Transwell-inserteissä, kaikkia soluja viljeltiin staattisissa olosuhteissa (TW-viljely). Seitsemän päivän kuluttua yksi Transwell-insertti, joka sisälsi 2D-epiteelisolujen monokerroksen, integroitiin hybridi-siruun basolateraalisen virtauksen aikaansaamiseksi (Flow, BL), mikä lopulta johti 3D-epiteelikerroksen muodostumiseen (morfogeneesi). Vaihekontrastimikrokuvat, jotka esittävät normaalista luovuttajasta (C103-linja) peräisin olevien ihmisen elinten epiteelisolujen morfologisia piirteitä kussakin kokeellisessa vaiheessa tai ajankohdassa. Ylempien kerrosten kaaviot havainnollistavat kunkin vaiheen kokeellista kokoonpanoa. b, Hybridi-sirut (vasen kaavio) voivat johtaa organoidiepiteelisolujen 3D-morfogeneesiin ylhäältä alas -konfokaalimikroskopiakuvilla eri Z-kohdista (ylempi, keskimmäinen ja alempi; (katso oikea kaavio ja vastaavat katkoviivat). osoittivat selviä morfologisia ominaisuuksia. F-aktiini (syaani), tuma (harmaa). c, Fluoresenssi-konfokaalimikroskooppikuvat (3D-kulmakuva) organoidiperäisistä epiteelisoluista, joita on viljelty staattisessa Transwell-laitteessa (TW; valkoisen katkoviivan sisällä) verrattuna hybridisiruun (suurin täysi kuva), joissa verrataan 2D- ja 3D-morfologiaa. Pari 2D-pystysuuntaista poikkileikkauskuvaa (oikeassa yläkulmassa; ”XZ”) näyttää myös 2D- ja 3D-ominaisuudet. Skaalapalkki, 100 µm. c Uusintapainos viitteen luvalla. 4. Elsevier.
Kontrollit voidaan valmistaa viljelemällä samoja soluja (Caco-2 tai suoliston organoidiepiteelisoluja) kaksiulotteisiksi yksikerroksiksi tavanomaisissa staattisissa viljelyolosuhteissa. Huomionarvoista on, että ravinteiden ehtyminen voi johtaa mikrokanavien rajalliseen tilavuuskapasiteettiin (eli noin 4 µl ylimmässä kanavassa alkuperäisessä suolisto-sirumallissa). Siksi epiteelin morfologiaa ennen basolateraalisen virtauksen levittämistä ja sen jälkeen voidaan myös verrata.
Pehmeä litografiaprosessi tulee suorittaa puhdastilassa. Jokaiselle sirun kerrokselle (ylempi ja alempi kerros sekä kalvot) ja hybridisiruille käytettiin erilaisia ​​fotomaskeja, jotka valmistettiin erillisille piikiekoille, koska mikrokanavien korkeudet olivat erilaiset. Sirun suolen ylemmän ja alemman mikrokanavan kohdekorkeudet ovat vastaavasti 500 µm ja 200 µm. Hybridisirun kanavan kohdekorkeus on 200 µm.
Aseta 3-tuumainen piikiekko asetonilla kastettuun astiaan. Pyörittele levyä varovasti 30 sekunnin ajan ja kuivaa kiekko sitten ilmassa. Siirrä kiekko IPA:lla kastetulle levylle ja pyöritä levyä 30 sekuntia puhdistaaksesi sen.
Piraijaliuosta (vetyperoksidin ja väkevän rikkihapon seos, 1:3 (tilavuus/tilavuus)) voidaan valinnaisesti käyttää orgaanisten jäämien poiston maksimoimiseksi piikiekon pinnalta.
Piraijaliuos on erittäin syövyttävää ja tuottaa lämpöä. Lisävarotoimia tarvitaan. Jätteen hävittämistä varten anna liuoksen jäähtyä ja siirrä se puhtaaseen, kuivaan jäteastiaan. Käytä toissijaisia ​​astioita ja merkitse jäteastiat asianmukaisesti. Noudata laitoksen turvallisuusohjeita saadaksesi tarkempia menettelytapoja.
Kuivaa kiekot asettamalla ne 200 °C:een kuumalle levylle 10 minuutiksi. Kuivauksen jälkeen kiekkoa ravisteltiin viisi kertaa ilmassa jäähtyäkseen.
Kaada noin 10 g fotoresistia SU-8 2100 puhdistetun piikiekon keskelle. Levitä fotoresisti tasaisesti kiekolle pinseteillä. Aseta kiekko silloin tällöin 65 °C:n kuumalle levylle, jotta fotoresisti ei tahmeudu ja levittyy helpommin. Älä aseta kiekkoa suoraan kuumalle levylle.
SU-8 jakautui tasaisesti kiekolle pyörittämällä sitä linkouspinnoitusta käyttäen. Ohjelmoi SU-8:n sisäänpäin pyörivä pyöritys 5–10 sekunnin ajaksi, jotta se etenee nopeudella 500 rpm ja kiihdytyksellä 100 rpm/s. Aseta päälinkous 200 µm:n paksuiselle kuvioinnille nopeudella 1 500 rpm tai saavuta 250 µm:n paksuus (jolloin sirun suolen yläkerrokselle tulee 500 µm korkeus; katso ”Kriittiset vaiheet” alla) kiihtyvyydellä 300 rpm/s 30 sekunnin ajan nopeudella 1 200 rpm.
Päälinkousnopeutta voidaan säätää piikiekon SU-8-kuvion tavoitepaksuuden mukaan.
Sirun suolen yläkerroksen 500 µm korkuisten SU-8-kuvioiden valmistamiseksi toistettiin tämän laatikon linkouspinnoitus- ja pehmeäpaistovaiheet (vaiheet 7 ja 8) peräkkäin (katso vaihe 9), jolloin saatiin kaksi 250 µm paksua SU-8-kerrosta. Nämä voidaan kerrostaa ja yhdistää UV-altistuksella tämän laatikon vaiheessa 12, jolloin saadaan 500 µm korkea kerros.
Pehmeäpaista SU-8-päällystetyt kiekot asettamalla kiekot varovasti kuumalle levylle 65 °C:seen 5 minuutiksi, kytke sitten asetus 95 °C:seen ja inkuboi vielä 40 minuuttia.
Jotta ylemmän mikrokanavan SU-8-kuvion korkeus olisi 500 μm, toista vaiheet 7 ja 8 kahden 250 μm paksun SU-8-kerroksen muodostamiseksi.
Suorita UV-maskin kohdistuslaitteella lampputesti valmistajan ohjeiden mukaisesti laskeaksesi kiekon valotusajan. (valotusaika, ms) = (altistusannos, mJ/cm2)/(lampun teho, mW/cm2).
Kun olet määrittänyt valotusajan, aseta fotomaski UV-maskinkohdistimen maskipidikkeelle ja aseta fotomaski SU-8-päällystetylle kiekolle.
Aseta fotomaskin tulostettu pinta suoraan piikiekon SU-8-päällystetylle puolelle UV-säteilyn minimoimiseksi.
Altista SU-8-päällystetty kiekko ja fotomaski pystysuunnassa 260 mJ/cm2 UV-valolle ennalta määrätyn valotusajan (katso tämän laatikon vaihe 10).
UV-altistuksen jälkeen SU-8-päällystetyt piikiekot paistettiin 65 °C:ssa 5 minuuttia ja 95 °C:ssa 15 minuuttia kummallakin kuumalla levyllä 200 μm:n korkuisten kuvioiden valmistamiseksi. Jälkipaistoaikaa 95 °C:ssa pidennettiin 30 minuuttiin 500 µm:n korkuisten kuvioiden valmistamiseksi.
Kehitysaine kaadetaan lasimaljaan ja paistettu kiekko asetetaan maljaan. SU-8-kehitysaineen määrä voi vaihdella lasilevyn koosta riippuen. Varmista, että käytät riittävästi SU-8-kehitysainetta poistaaksesi valottamattoman SU-8:n kokonaan. Esimerkiksi käytettäessä 150 mm:n halkaisijaltaan olevaa ja 1 litran tilavuudella olevaa lasimaljaa, käytä noin 300 ml SU-8-kehitysainetta. Kehitä muottia 25 minuuttia pyöritellen sitä varovasti ajoittain.
Huuhtele kehitetty muotti noin 10 ml:lla tuoretta kehitintä ja sen jälkeen IPA:lla suihkuttamalla liuosta pipetillä.
Aseta kiekko plasmapuhdistimeen ja altista se happiplasmalle (ilmakehäkaasu, kohdepaine 1 × 10−5 Torr, teho 125 W) 1,5 minuutin ajan.
Aseta kiekko tyhjiöeksikaattoriin, jonka sisällä on lasilevy. Kiekot ja lasilevyt voidaan asettaa vierekkäin. Jos tyhjiöeksikaattori on jaettu useisiin kerroksiin levyllä, aseta lasilevyt alempaan kammioon ja kiekot ylempään kammioon. Tiputa 100 μl trikloori(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyyli)silaaniliuosta lasilevylle ja käytä tyhjiötä silanisointia varten.
Sulata pakastettuja Caco-2-soluja sisältävä injektiopullo 37 °C:n vesihauteessa ja siirrä sitten sulatetut solut T75-pulloon, joka sisältää 15 ml 37 °C:een esilämmitettyä Caco-2-elatusainetta.
Jotta Caco-2-solut läpäisevät noin 90 %:n konfluenssin saavuttaneet solut, lämmitä ensin Caco-2-elatusaine, PBS ja 0,25 % trypsiniä/1 mM EDTA 37 °C:n vesihauteessa.
Ime kasvatusalusta tyhjiöimellä. Pese solut kahdesti 5 ml:lla lämmintä PBS:ää toistamalla tyhjiöimetyksen ja lisäämällä tuoretta PBS:ää.