Jotkut LC-vianmääritysaiheet eivät ole koskaan vanhentuneita, koska LC-käytännössä on ongelmia, vaikka instrumenttitekniikka paranee ajan myötä. LC-järjestelmässä voi syntyä ongelmia monella tapaa ja päätyä huonoon piikin muotoon. Kun piikin muotoon liittyviä ongelmia ilmenee, lyhyt luettelo näiden tulosten mahdollisista syistä auttaa yksinkertaistamaan vianetsintäkokemustamme.
On ollut hauskaa kirjoittaa tätä "LC Troubleshooting" -kolumnia ja pohtia aiheita kuukausittain, koska jotkut aiheet eivät koskaan mene pois muodista. Vaikka kromatografiatutkimuksen alalla tietyt aiheet tai ideat vanhenevat, kun ne korvataan uudemmilla ja paremmilla ideoilla, vianmäärityksen alalla, koska ensimmäinen vianetsintäartikkeli ilmestyi tässä lehdessä (LC Journalissa on vielä muutamia vuosia,19)3. Olen keskittynyt useisiin LC-vianetsintäosioihin nestekromatografiaan (LC) vaikuttaviin nykytrendeihin (esimerkiksi suhteellinen vertailu ymmärrystämme paineen vaikutuksesta retentioon [2] Uusia edistysaskeleita) Tulkintamme LC-tuloksista ja vianmäärityksestä nykyaikaisilla LC-instrumenteilla. LC-vianmääritys – elementit, jotka sopivat erinomaisesti mihin tahansa vianmääritykseen, ovat välttämättömiä käyttämämme järjestelmän iästä riippumatta.Tämän sarjan ydinaihe liittyy erittäin hyvin LCGC:n kuuluisaan "LC Troubleshooting Guide" -seinätaulukkoon (4), joka roikkuu monissa laboratorioissa.Tämän sarjan kolmannessa osassa päätin keskittyä ongelmiin, jotka liittyvät huippujen muotoon, seinän potentiaalisten ominaisuuksien 4 potentiaalisiin syihin. Emme voi käsitellä kaikkia näitä asioita yksityiskohtaisesti yhdessä artikkelissa, joten tässä aiheen ensimmäisessä osassa keskityn joihinkin niistä, joita näen useimmiten.Toivon, että nuoret ja vanhat LC-käyttäjät löytävät hyödyllisiä vinkkejä ja muistutuksia tästä tärkeästä aiheesta.
Huomaan vastaavani yhä useammin vianetsintäkysymyksiin sanalla "kaikki on mahdollista". Tämä vastaus saattaa tuntua helpolta, kun otetaan huomioon vaikeasti tulkittavia havaintoja, mutta mielestäni se on usein sopiva. Huonon huipun muodon monien mahdollisten syiden vuoksi on tärkeää pysyä avoimena pohtiessani, mikä ongelma voi olla, ja pystyä priorisoimaan mahdolliset syyt, jotta voimme aloittaa vianetsintätyömme, keskittyen kaikkein tärkeimpiin mahdollisuuksiin.
Keskeinen askel missä tahansa vianetsintätehtävässä – mutta mielestäni se on aliarvioitu – on sen tunnistaminen, että ongelma on ratkaistava. Ongelman olemassaolon tunnustaminen tarkoittaa usein sen tunnustamista, että työkalulle tapahtuu erilaista kuin odotuksemme, jotka ovat teorian, empiirisen tiedon ja kokemuksen muovaamia (5). reuna, pyrstö jne.), mutta myös leveyteen. Odotuksemme todellisesta piikin muodosta ovat yksinkertaiset. Teoria (6) tukee hyvin oppikirjan odotusta, että useimmissa tapauksissa kromatografisten huippujen tulee olla symmetrisiä ja mukautua Gaussin jakauman muotoon, kuten kuvassa 1a. Mitä odotamme havaittujen piikkien leveydeltä, on monimutkaisempi kysymys. Toisen aiheen muoto on monimutkaisempi aihe. Toisessa artikkelissa voisimme keskustella tästä aiheesta1. -toisin sanoen joitakin tapoja, joilla asiat voivat mennä pieleen. Tämän osan loppuosassa käytämme aikaa keskustelemaan joistakin konkreettisista esimerkeistä tilanteista, jotka voivat johtaa tällaisiin muototyyppeihin.
Joskus piikkejä ei havaita ollenkaan kromatogrammissa, jossa niiden odotetaan eluoituvan. Yllä oleva seinäkaavio osoittaa, että piikin puuttuminen (olettaen, että näyte todella sisältää kohdeanalyytin pitoisuudessa, jonka pitäisi tehdä detektorin vasteesta riittävä näkemään se kohinan yläpuolella) liittyy yleensä johonkin laiteongelmaan tai virheellisiin liikkuvan vaiheen olosuhteisiin (jos havaitaan ollenkaan).huiput, yleensä liian "heikko"). Lyhyt luettelo tämän luokan mahdollisista ongelmista ja ratkaisuista löytyy taulukosta I.
Kuten edellä mainittiin, kysymys siitä, kuinka paljon piikkien levenemistä tulisi sietää ennen kuin kiinnitän huomiota ja yritän korjata sitä, on monimutkainen aihe, jota käsittelen seuraavassa artikkelissa. Kokemukseni on, että merkittävään piikkien levenemiseen liittyy usein merkittävä muutos huipun muodossa, ja huipun pyrstö on yleisempää kuin ennen huippua tai halkeilua. Kuitenkin nimellisesti harvoin huiput voivat johtua erilaisista syistä: levenevät symmetriset, jotka voivat olla myös erilaisia.
Kutakin näistä ongelmista on käsitelty yksityiskohtaisesti aiemmissa Troubleshooting LC -julkaisun numeroissa, ja näistä aiheista kiinnostuneet lukijat voivat lukea näistä aiemmista artikkeleista saadakseen tietoa näiden ongelmien perimmäisistä syistä ja mahdollisista ratkaisuista.Lisätietoja.
Huippujen pyrstö, piikkien eteneminen ja halkeaminen voivat kaikki johtua kemiallisista tai fysikaalisista ilmiöistä, ja mahdollisten ratkaisujen luettelo näihin ongelmiin vaihtelee suuresti riippuen siitä, onko kyseessä kemiallinen vai fysikaalinen ongelma. Usein vertaamalla kromatogrammin eri huippuja voit löytää tärkeitä vihjeitä siitä, mikä on syyllinen. piikit vaikuttavat, mutta loput näyttävät hyvältä, syy on todennäköisesti kemiallinen.
Huippujen hännän kemialliset syyt ovat liian monimutkaisia ​​käsitelläkseen lyhyesti tässä. Kiinnostunut lukija on tarkoitettu äskettäin ilmestyneeseen "LC Troubleshooting" -julkaisuun syvällisempää keskustelua varten (10). Helppo tapa on kuitenkin yrittää vähentää injektoidun analyytin massaa ja katsoa, ​​paraneeko piikin muoto. Jos näin on, niin tämä on hyvä vihje, että ongelman "ylikuormittaminen" on pieni tapaus. tai kromatografisia olosuhteita on muutettava niin, että hyvät piikkien muodot voidaan saada myös suuremmilla injektoinneilla.
Huipun jätteen muodostumiseen on myös monia mahdollisia fyysisiä syitä. Mahdollisuuksien yksityiskohtaisesta keskustelusta kiinnostuneita lukijoita viitataan toiseen tuoreeseen "LC Troubleshooting" -lehden numeroon (11). Yksi yleisimmistä fysikaalisista syistä piikin jätteen muodostumiseen on huono yhteys ruiskun ja ilmaisimen välillä (12). Äärimmäinen esimerkki on esitetty kuvassa 1d, saatu laboratoriossani kotelossani, jossa oli muutama viikko sitten asennettuna ruiskutus, jota käytimme uudella venttiilillä. p holkilla, joka oli valettu ruostumattomasta teräksestä valmistettuun kapillaariin. Muutamien alkuperäisten vianetsintäkokeiden jälkeen huomasimme, että injektioventtiilin staattorin aukon syvyys oli paljon syvempi kuin olimme tottuneet, mikä johti suureen kuolleeseen tilavuuteen portin alareunassa. Tämä ongelma on helppo ratkaista korvaamalla ruiskutussilmukka toisella putkella, voimme säätää portin oikeaa tilavuutta.
Kuvan 1e kaltaiset piikkirintamat voivat johtua myös fysikaalisista tai kemiallisista ongelmista. Yleinen fyysinen syy etureunaan on se, että kolonnin hiukkaspeti ei ole hyvin pakattu tai että hiukkaset ovat järjestyneet uudelleen ajan myötä. Kuten tämän fysikaalisen ilmiön aiheuttaman huipun pyrstön tapauksessa, paras tapa korjata tämä on vaihtaa kolonni ja jatkaa. (lineaarisissa) olosuhteissa stationaarifaasin pidättämän analyytin määrä (siis retentiotekijä) on lineaarisessa suhteessa analyytin konsentraatioon kolonnissa. Kromatografisesti tämä tarkoittaa, että kolonniin ruiskutetun analyytin massan kasvaessa piikki tulee korkeammaksi, mutta ei leveämmäksi. Tämä suhde katkeaa, kun retentio-käyttäytyminen ei ole vain leveämpi, mutta myös massa on leveämpi. Lisäksi epälineaariset muodot määrittävät kromatografisten piikkien muodon, mikä johtaa etureunoihin. Kuten massaylikuormituksessa, joka aiheuttaa piikin pyrstön (10), myös epälineaarisen retention aiheuttama piikin johtaminen voidaan diagnosoida vähentämällä injektoidun analyytin massaa. Jos piikin muoto paranee, menetelmää on muutettava niin, ettei se ylitä injektoinnin laatua, tai on muutettava tämän etureunan olosuhteiden minimoimista.
Joskus havaitsemme, mikä näyttää "jakaneelta" huipulta, kuten kuvassa 1f näkyy. Ensimmäinen vaihe tämän ongelman ratkaisemisessa on määrittää, johtuuko piikin muoto osittaisesta yhteiseluutiosta (eli kahden erillisen, mutta tiiviisti eluoituvan yhdisteen läsnäolosta). Jos todella kaksi erilaista analyyttiä eluoituu lähellä toisiaan, on kyse niiden näennäisen erottelukyvyn parantamisesta, fysikaalisesta kuvasta, valikoinnista tai uudelleenlaskemisesta. formaatiolla ei ole mitään tekemistä itse kolonnin kanssa. Usein tärkein vihje tähän päätökseen on, ovatko kromatogrammin kaikki piikit jakautuneet vai vain yksi tai kaksi. Jos kyseessä on vain yksi tai kaksi, se on luultavasti yhteiseluointiongelma;Jos kaikki huiput on jaettu, se on luultavasti fyysinen ongelma, joka liittyy todennäköisesti itse sarakkeeseen.
Itse kolonnin fysikaalisiin ominaisuuksiin liittyvät jakaantumishuiput johtuvat yleensä osittain tukkeutuneista sisään- tai ulostulofritteistä tai hiukkasten uudelleenjärjestelystä kolonnissa, jolloin liikkuva faasi pääsee virtaamaan nopeammin kuin liikkuva faasi tietyillä kolonnikanavan muodostumisen alueilla. Muilla alueilla (11). Osittain tukkeutunut sintti voidaan joskus puhdistaa kääntämällä virtaus kolonnin läpi;Kuitenkin kokemukseni mukaan tämä on yleensä lyhytaikainen ratkaisu pitkän aikavälin ratkaisun sijaan. Tämä on usein kohtalokasta nykyaikaisissa kolonneissa, jos hiukkaset yhdistyvät uudelleen kolonnissa. Tässä vaiheessa on parasta vaihtaa kolonni ja jatkaa.
Kuvan 1g huippu, myös äskettäin omasta laboratoriostani, osoittaa yleensä, että signaali on niin korkea, että se on saavuttanut vastealueen ylärajan. Optisissa absorbanssiilmaisimissa (tässä tapauksessa UV-vis), kun analyytin pitoisuus on erittäin korkea, analyytti absorboi suurimman osan ilmaisimen virtauskennon läpi kulkevasta valosta, jättäen hyvin vähän valoa näiden valonlähteiden valonlähteestä havaittavaksi. , kuten hajavalo ja "tumma virta", mikä tekee signaalista erittäin "sumean" ulkonäöltään ja riippumattoman analyytin pitoisuudesta.Kun näin tapahtuu, ongelma voidaan usein ratkaista helposti vähentämällä analyytin injektiotilavuutta – pienentämällä injektiotilavuutta, laimentamalla näytettä tai molempia.
Kromatografiakoulussa käytämme detektorisignaalia (eli kromatogrammin y-akselia) analyytin pitoisuuden indikaattorina näytteessä. Joten näyttää oudolta nähdä kromatogrammi, jonka signaali on alle nollan, koska yksinkertainen tulkinta on, että tämä osoittaa negatiivista analyytin pitoisuutta - mikä ei tietenkään ole fyysisesti mahdollista. Kokemukseni mukaan havaitaan useimmiten optisia, negatiivisia detektoreja.
Tässä tapauksessa negatiivinen piikki tarkoittaa yksinkertaisesti sitä, että pylväästä eluoituvat molekyylit absorboivat vähemmän valoa kuin itse liikkuva faasi juuri ennen huippua ja sen jälkeen. Tämä voi tapahtua esimerkiksi käytettäessä suhteellisen pieniä detektioaallonpituuksia (<230 nm) ja liikkuvan faasin lisäaineita, jotka itse asiassa absorboivat suurimman osan valosta näillä aallonpituuksilla. Tällaisia ​​lisäaineita voidaan käyttää esimerkiksi liikkuvan faasin liuottimena tai kananaattikomponenttina. negatiiviset piikit kalibrointikäyrän laatimiseksi ja tarkan kvantitatiivisen tiedon saamiseksi, joten ei ole perustavanlaatuista syytä välttää niitä sinänsä (tätä menetelmää kutsutaan joskus "epäsuoraksi UV-ilmaisuksi") (13). Jos kuitenkin todella haluamme välttää negatiiviset piikit kokonaan, absorbanssin havaitsemisen tapauksessa paras ratkaisu on käyttää erilaista ilmaisuaallonpituutta kuin liikkuvaa valon aallonpituutta, jolloin liikkuvan vaiheen koostumus muuttuu vähemmän kuin absorboiva vaihe niin, että ne vaihtavat enemmän anaalia. lyytit.
Negatiivisia piikkejä voi esiintyä myös käytettäessä taitekerroin (RI) ilmaisua, kun näytteessä olevien muiden komponenttien kuin analyytin, kuten liuotinmatriisin, taitekerroin on eri kuin liikkuvan faasin taitekerroin. Näin tapahtuu myös UV-vis-detektiossa, mutta tämä vaikutus yleensä heikkenee suhteessa RI-detektioon. Molemmissa tapauksissa negatiiviset näytteen matriisin koostumukset voidaan minimoida lähempänä liikkuvan faasin koostumusta.
Kolmannessa osassa LC-vianmäärityksen perusaiheesta pohdin tilanteita, joissa havaittu piikin muoto poikkeaa odotetusta tai normaalista piikin muodosta. Tällaisten ongelmien tehokas vianetsintä alkaa odotettujen piikin muotojen tiedosta (perustuu teoriaan tai aikaisempaan kokemukseen olemassa olevista menetelmistä), joten poikkeamat näistä odotuksista ovat ilmeisiä. Huippumuotoongelmilla on monia erilaisia ​​mahdollisia syitä, joissa kerrotaan useimmissa asennuksen etureunassa, jne. .Näiden yksityiskohtien tunteminen tarjoaa hyvän paikan aloittaa vianetsintä, mutta se ei sisällä kaikkia mahdollisuuksia. Syitä ja ratkaisuja koskevasta perusteellisesta luettelosta kiinnostuneet lukijat voivat tutustua LCGC:n "LC Troubleshooting Guide" -seinätaulukkoon.
(4) LCGC "LC Troubleshooting Guide" -seinäkaavio.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ja Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.