Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Liquid biopsia (LB) on käsite, joka on nopeasti saamassa suosiota biolääketieteen alalla.Konsepti perustuu pääasiassa kiertävän ekstrasellulaarisen DNA:n (ccfDNA) fragmenttien havaitsemiseen, jotka vapautuvat pääasiassa pieninä fragmentteina solukuoleman jälkeen eri kudoksissa.Pieni osa näistä fragmenteista on peräisin vieraista (vieraista) kudoksista tai organismeista.Nykyisessä työssämme olemme soveltaneet tätä käsitettä simpukoihin, vartiolajiin, jotka tunnetaan korkeasta meriveden suodatuskyvystään.Käytämme simpukoiden kykyä toimia luonnollisina suodattimina sieppaaksemme ympäristön DNA-fragmentteja useista eri lähteistä tarjotaksemme tietoa meren rannikkoekosysteemien biologisesta monimuotoisuudesta.Tuloksemme osoittavat, että simpukan hemolymfi sisältää DNA-fragmentteja, joiden koko vaihtelee suuresti, 1 - 5 kb.Haulikkosekvensointi osoitti, että suuri määrä DNA-fragmentteja on peräisin vieraista mikrobista.Löysimme niiden joukosta DNA-fragmentteja bakteereista, arkeista ja viruksista, mukaan lukien virukset, joiden tiedetään saastuttavan erilaisia ​​isäntiä, joita tavallisesti esiintyy rannikkomeren ekosysteemeissä.Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme osoittaa, että simpukoihin sovellettu LB-konsepti edustaa rikasta, mutta toistaiseksi tutkimatonta tiedonlähdettä meren rannikkoekosysteemien mikrobien monimuotoisuudesta.
Ilmastonmuutoksen (CC) vaikutus meriekosysteemien monimuotoisuuteen on nopeasti kasvava tutkimusalue.Ilmaston lämpeneminen ei ainoastaan ​​aiheuta merkittäviä fysiologisia rasituksia, vaan myös työntää meren eliöiden lämpöstabiilisuuden evoluution rajoja, mikä vaikuttaa useiden lajien elinympäristöön ja saa heidät etsimään suotuisampia olosuhteita [1, 2].Sen lisäksi, että CC vaikuttaa metaeläinten biologiseen monimuotoisuuteen, se häiritsee isäntä-mikrobivuorovaikutusten herkkää tasapainoa.Tämä mikrobien aiheuttama dysbakterioosi muodostaa vakavan uhan meren ekosysteemeille, koska se tekee meren eliöistä herkempiä tarttuville patogeeneille [3, 4].Uskotaan, että SS:llä on tärkeä rooli joukkokuolemissa, mikä on vakava ongelma maailmanlaajuisten meriekosysteemien hallinnassa [5, 6].Tämä on tärkeä kysymys, kun otetaan huomioon monien meren lajien taloudelliset, ekologiset ja ravitsemukselliset vaikutukset.Tämä pätee erityisesti napa-alueilla eläviin simpukoisiin, joilla CK:n vaikutukset ovat välittömämpiä ja vakavampia [6, 7].Itse asiassa simpukat, kuten Mytilus spp.Niitä käytetään laajalti seuraamaan CC:n vaikutuksia meren ekosysteemeihin.Ei ole yllättävää, että suhteellisen suuri määrä biomarkkereita on kehitetty seuraamaan heidän terveyttään, käyttäen usein kaksitasoista lähestymistapaa, joka sisältää entsymaattiseen aktiivisuuteen tai solutoimintoihin, kuten solujen elinkelpoisuuteen ja fagosyyttiaktiivisuuteen, perustuvia toiminnallisia biomarkkereita [8].Näihin menetelmiin kuuluu myös suurten merivesimäärien imeytymisen jälkeen pehmytkudoksiin kerääntyvien spesifisten paineindikaattoreiden pitoisuuden mittaaminen.Kuitenkin simpukoiden korkea suodatuskapasiteetti ja puoliavoin verenkiertojärjestelmä tarjoavat mahdollisuuden kehittää uusia hemolymfi-biomarkkereita käyttämällä nestebiopsian (LB) konseptia, yksinkertaista ja minimaalisesti invasiivista lähestymistapaa potilaiden hoitoon.verinäytteitä [9, 10].Vaikka ihmisen LB:stä löytyy monenlaisia ​​kiertäviä molekyylejä, tämä käsite perustuu ensisijaisesti plasmassa kiertävien ekstrasellulaaristen DNA-fragmenttien (ccfDNA) DNA-sekvensointianalyysiin.Itse asiassa verenkierrossa olevan DNA:n esiintyminen ihmisen plasmassa on ollut tiedossa 1900-luvun puolivälistä lähtien [11], mutta vasta viime vuosina korkean suorituskyvyn sekvensointimenetelmien tulo on johtanut ccfDNA:han perustuvaan kliiniseen diagnoosiin.Näiden kiertävien DNA-fragmenttien läsnäolo johtuu osittain genomisen DNA:n (ydin- ja mitokondrioiden) passiivisesta vapautumisesta solukuoleman jälkeen. Terveillä yksilöillä ccfDNA:n pitoisuus on normaalisti alhainen (<10 ng/ml), mutta sitä voidaan nostaa 5–10-kertaiseksi potilailla, jotka kärsivät erilaisista sairauksista tai ovat alttiita stressille, mikä johtaa kudosvaurioihin. Terveillä yksilöillä ccfDNA:n pitoisuus on normaalisti alhainen (<10 ng/ml), mutta sitä voidaan nostaa 5–10-kertaiseksi potilailla, jotka kärsivät erilaisista sairauksista tai ovat alttiita stressille, mikä johtaa kudosvaurioihin. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатьлуся в 5–10 разный разнычия огией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Terveillä ihmisillä cccDNA:n pitoisuus on normaalisti alhainen (<10 ng/ml), mutta se voi nousta 5–10-kertaiseksi potilailla, joilla on erilaisia ​​sairauksia tai stressiä, joka johtaa kudosvaurioihin.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承傞病理或承加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承 壎 或可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 працинынынто патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-pitoisuudet ovat yleensä alhaiset (<10 ng/ml) terveillä yksilöillä, mutta ne voidaan nostaa 5-10-kertaisesti potilailla, joilla on erilaisia ​​patologioita tai stressiä, mikä johtaa kudosvaurioihin.ccfDNA-fragmenttien koko vaihtelee laajasti, mutta vaihtelee yleensä välillä 150 - 200 bp.[12].Itse johdetun ccfDNA:n eli normaaleista tai transformoiduista isäntäsoluista peräisin olevan ccfDNA:n analyysiä voidaan käyttää geneettisten ja epigeneettisten muutosten havaitsemiseen ydin- ja/tai mitokondriogenomissa, mikä auttaa kliinikoita valitsemaan spesifisiä molekyylikohdistettuja hoitoja [13].ccfDNA:ta voidaan kuitenkin saada vieraista lähteistä, kuten ccfDNA:sta sikiön soluista raskauden aikana tai siirretyistä elimistä [14,15,16,17].ccfDNA on myös tärkeä tietolähde tartunnanaiheuttajan (vieraan) nukleiinihappojen läsnäolon havaitsemiseksi, mikä mahdollistaa laajalle levinneiden infektioiden ei-invasiivisen havaitsemisen, jota veriviljelmät eivät tunnista, välttäen invasiivisen biopsian infektoituneesta kudoksesta [18].Viimeaikaiset tutkimukset ovat todellakin osoittaneet, että ihmisveri sisältää runsaasti tietoa, jota voidaan käyttää virus- ja bakteeripatogeenien tunnistamiseen, ja että noin 1 % ihmisen plasmasta löydetystä ccfDNA:sta on vierasta alkuperää [19].Nämä tutkimukset osoittavat, että organismin kiertävän mikrobiomin biologista monimuotoisuutta voidaan arvioida ccfDNA-analyysin avulla.Viime aikoihin asti tätä käsitettä käytettiin kuitenkin yksinomaan ihmisillä ja vähemmässä määrin muilla selkärankaisilla [20, 21].
Tässä artikkelissa käytämme LB-potentiaalia analysoimaan Aulacomya atran ccfDNA:ta, joka on eteläinen laji, jota tavataan yleisesti subantarktisilla Kerguelen-saarilla, saariryhmällä suuren tasangon huipulla, joka muodostui 35 miljoonaa vuotta sitten.tulivuorenpurkaus.Käyttämällä in vitro -koejärjestelmää havaitsimme, että meriveden DNA-fragmentit imevät nopeasti simpukat ja pääsevät hemolymfi-osastoon.Haulikkosekvensointi on osoittanut, että simpukoiden hemolymfi ccfDNA sisältää DNA-fragmentteja sen omasta ja ei-itse-alkuperästä, mukaan lukien symbioottiset bakteerit ja DNA-fragmentit biomeista, jotka ovat tyypillisiä kylmille vulkaanisille meren rannikkoekosysteemeille.Hemolymph ccfDNA sisältää myös virussekvenssejä, jotka on johdettu viruksista, joilla on eri isäntäalueet.Löysimme myös DNA-fragmentteja monisoluisista eläimistä, kuten luukaloista, merivuokoista, levistä ja hyönteisistä.Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme osoittaa, että LB-konseptia voidaan soveltaa menestyksekkäästi meren selkärangattomiin rikkaan genomisen repertuaarin luomiseksi meren ekosysteemeissä.
Aikuiset (55-70 mm pitkät) Mytilus platensis (M. platensis) ja Aulacomya atra (A. atra) kerättiin Port-au-Francen (049°21.235 S, 070°13.490 E .) kivisiltä vuorovesirannoilta.Kerguelenin saaret joulukuussa 2018. Muut aikuiset sinisimpukat (Mytilus spp.) hankittiin kaupalliselta toimittajalta (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) ja laitettiin lämpötilasäädeltyyn (4°C) ilmastettuun säiliöön, joka sisälsi 10–20 litraa 32‰ keinotekoista suolavettä.(keinotekoinen merisuola Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Jokaista koetta varten mitattiin yksittäisten kuorien pituus ja paino.
Tämän ohjelman ilmainen avoimen pääsyn protokolla on saatavilla verkossa (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Lyhyesti sanottuna LB hemolymfi kerättiin sieppaajalihaksista kuvatulla tavalla [22].Hemolymfi kirkastettiin sentrifugoimalla 1200 x g 3 minuuttia, supernatantti jäädytettiin (-20 °C) käyttöön asti.CfDNA:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi näytteet (1,5-2,0 ml) sulatettiin ja käsiteltiin käyttämällä NucleoSnap cfDNA -kittiä (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.ccfDNA:ta säilytettiin -80 °C:ssa lisäanalyysiin asti.Joissakin kokeissa ccfDNA eristettiin ja puhdistettiin käyttämällä QIAamp DNA Investigator Kit -sarjaa (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Puhdistetun DNA:n määrä määritettiin käyttämällä standardia PicoGreen-määritystä.Eristetyn ccfDNA:n fragmenttien jakautuminen analysoitiin kapillaarielektroforeesilla käyttäen Agilent 2100 -bioanalysaattoria (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) käyttämällä High Sensitivity DNA Kit -pakkausta.Määritys suoritettiin käyttämällä 1 ui ccfDNA-näytettä valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Hemolymfin ccfDNA-fragmenttien sekvensointia varten Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) valmisti haulikkokirjastoja käyttämällä Illumina MiSeq PE75 -sarjan Illumina DNA Mix -pakkausta.Käytettiin tavallista sovitinta (BioO).Raakadatatiedostot ovat saatavilla NCBI:n sekvenssilukuarkistosta (SRR8924808 ja SRR8924809).Lukemisen peruslaatu arvioitiin FastQC:llä [23].Trimmomaticia [24] on käytetty sovittimien leikkaamiseen ja huonolaatuisiin lukemiin.Haulikkolukemat, joissa oli parilliset päät, yhdistettiin FLASH pidempiin yksittäisiin lukemiin, joiden päällekkäisyys oli vähintään 20 emäsparia yhteensopimattomuuden välttämiseksi [25]. Yhdistettyjen lukujen merkinnät tehtiin BLASTN:llä käyttämällä kaksiperäistä NCBI Taxonomy -tietokantaa (e-arvo < 1e-3 ja 90 % homologiaa), ja matalan kompleksisuuden sekvenssien peittäminen suoritettiin käyttämällä DUSTia [26]. Yhdistettyjen lukujen merkinnät tehtiin BLASTN:llä käyttämällä kaksiperäistä NCBI Taxonomy -tietokantaa (e-arvo < 1e-3 ja 90 % homologiaa), ja matalan kompleksisuuden sekvenssien peittäminen suoritettiin käyttämällä DUSTia [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двусты таксономии двусты чение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с испольно с использо. Yhdistetyt lukemat annotoitiin BLASTN:llä käyttämällä NCBI:n kaksisäilyketaksonomiatietokantaa (e-arvo < 1e-3 ja 90 % homologiaa), ja matalan monimutkaisuuden sekvenssin maskaus suoritettiin käyttämällä DUSTia [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释吼并的读数]低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 6复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данскотли базы данческой базы дануных BI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с испо Yhdistetyt lukemat merkittiin BLASTN:llä käyttäen NCBI:n kaksisäilyketaksonomista tietokantaa (e-arvo <1e-3 ja 90 % homologiaa), ja matalan monimutkaisuuden sekvenssin maskaus suoritettiin käyttämällä DUSTia [26].Lukemat jaettiin kahteen ryhmään: bivalve-sekvensseihin liittyvät (tässä kutsutaan itselukemiseksi) ja ei-liittyvät (ei-self-reads).Kaksi ryhmää koottiin erikseen käyttämällä MEGAHIT-yhteyttä jatkuvien ryhmien luomiseksi [27].Sillä välin alien-mikrobiomilukujen taksonominen jakauma luokiteltiin Kraken2:n [28] avulla ja esitettiin graafisesti Krona-ympyräkaaviolla Galaxysta [29, 30].Alustavien kokeiden perusteella optimaaliseksi kmersiksi määritettiin kmers-59. Itsejatkuumat tunnistettiin sitten linjaamalla BLASTN:n kanssa (bivalve NCBI -tietokanta, e-arvo < 1e-10 ja 60 % homologia) lopullista huomautusta varten. Itsejatkuumat tunnistettiin sitten linjaamalla BLASTN:n kanssa (bivalve NCBI -tietokanta, e-arvo < 1e-10 ja 60 % homologia) lopullista huomautusta varten. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN e <1e-10 ja гомология 60%) для окончательной аннотации. Sen jälkeen omat jatkumot tunnistettiin yhdistämällä BLASTN:ään (NCBI-kaksoispohjainen tietokanta, e-arvo <1e-10 ja 60 % homologia) lopullista annotaatiota varten.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来迤辡对齐来迤辫最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления сопоставления с BLASTNАвставставления с BLASTN ворчатых моллюсков, значение e <1e-10 ja гомология 60%). Sitten identifioitiin itsejatkuumat lopullista annotaatiota varten sovittamalla yhteen BLASTN:ään (NCBI:n bivalve-tietokanta, e-arvo <1e-10 ja 60 % homologia). Samanaikaisesti ei-self-ryhmien jatkumot merkittiin BLASTN:llä (nt NCBI-tietokanta, e-arvo < 1e-10 ja 60 % homologia). Samanaikaisesti ei-self-ryhmien jatkumot merkittiin BLASTN:llä (nt NCBI-tietokanta, e-arvo < 1e-10 ja 60 % homologia). Паралеьно черодные груоые контиги ыи аннотированы с помощ база даных nt ncBi, зач 60а да 1e-с ncBi. Samanaikaisesti vieraiden ryhmien jatkumot merkittiin BLASTN:llä (NT NCBI-tietokanta, e-arvo <1e-10 ja 60 % homologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参用平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参用 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннч1хе1 зntанч1хе1 гомология 60%). Samanaikaisesti ei-itse-ryhmän jatkumot merkittiin BLASTN:llä (nt NCBI-tietokanta, e-arvo <1e-10 ja 60 % homologia). BLASTX suoritettiin myös nonself contigs käyttäen nr- ja RefSeq-proteiinin NCBI-tietokantoja (e-arvo < 1e-10 ja 60 % homologia). BLASTX suoritettiin myös nonself contigs käyttäen nr- ja RefSeq-proteiinin NCBI-tietokantoja (e-arvo < 1e-10 ja 60 % homologia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (знае10ло1e) %). BLASTX suoritettiin myös ei-itse jatkuville kontigeille käyttämällä nr- ja RefSeq NCBI -proteiinitietokantoja (e-arvo < 1e-10 ja 60 % homologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 傌源 倧 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 傌源 倧 60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX suoritettiin myös ei-itse jatkuville käyttämällä nr- ja RefSeq NCBI-proteiinitietokantoja (e-arvo <1e-10 ja 60 % homologia).Ei-itse jatkuvien ryhmien BLASTN- ja BLASTX-poolit edustavat lopullisia jatkumoja (katso lisätiedosto).
PCR:ssä käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa S1.Taq-DNA-polymeraasia (Bio Basic Canada, Markham, ON) käytettiin ccfDNA-kohdegeenien monistamiseen.Käytettiin seuraavia reaktio-olosuhteita: denaturointi 95 °C:ssa 3 minuuttia, 95 °C:ssa 1 minuutti, asetettu hehkutuslämpötila 1 minuutiksi, pidennys 72 °C:ssa 1 minuutin ajan, 35 sykliä ja lopuksi 72 °C 10 minuutin kuluessa..PCR-tuotteet erotettiin elektroforeesilla agaroosigeeleissä (1,5 %), jotka sisälsivät SYBRTM Safe DNA Gel Stain -väriä (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) 95 V:n jännitteellä.
Sinisimpukoita (Mytilus spp.) aklimatisoitiin 500 ml:ssa hapetettua merivettä (32 PSU) 24 tunnin ajan 4 °C:ssa.Plasmidi-DNA:ta, joka sisälsi insertin, joka koodaa ihmisen galektiini-7-cDNA-sekvenssiä (NCBI-talletusnumero L07769), lisättiin pulloon lopullisena pitoisuutena 190 μg/μl.Samoissa olosuhteissa ilman DNA:n lisäystä inkuboidut simpukat olivat kontrolli.Kolmas kontrollisäiliö sisälsi DNA:ta ilman simpukoita.Meriveden DNA:n laadun seuraamiseksi otettiin merivesinäytteet (20 μl; kolme toistoa) jokaisesta säiliöstä ilmoitettuna aikana.Plasmidi-DNA:n jäljitettävyyttä varten LB-sinisimpukat kerättiin ilmoitettuina aikoina ja analysoitiin qPCR:llä ja ddPCR:llä.Meriveden korkean suolapitoisuuden vuoksi erät laimennettiin PCR-laatuveteen (1:10) ennen kaikkia PCR-määrityksiä.
Digitaalinen pisara-PCR (ddPCR) suoritettiin käyttämällä BioRad QX200 -protokollaa (Mississauga, Ontario, Kanada).Käytä lämpötilaprofiilia optimaalisen lämpötilan määrittämiseen (taulukko S1).Pisarat luotiin käyttämällä QX200 pisarageneraattoria (BioRad).ddPCR suoritettiin seuraavasti: 95 °C 5 minuuttia, 50 sykliä 95 °C 30 sekuntia ja annettu pariutumislämpötila 1 min ja 72 °C 30 s, 4 °C 5 minuuttia ja 90 °C 5 minuutin sisällä.Pisaroiden ja positiivisten reaktioiden lukumäärä (kopioiden määrä/µl) mitattiin käyttämällä QX200-tippalukijaa (BioRad).Näytteet, joissa oli alle 10 000 pisaraa, hylättiin.Kuvion hallintaa ei suoritettu joka kerta, kun ddPCR ajettiin.
qPCR suoritettiin käyttämällä Rotor-Gene® 3000:ta (Corbett Research, Sydney, Australia) ja LGALS7-spesifisiä alukkeita.Kaikki kvantitatiiviset PCR:t suoritettiin 20 ul:ssa käyttämällä QuantiFast SYBR Green PCR Kit -sarjaa (QIAGEN).qPCR aloitettiin 15 minuutin inkubaatiolla 95 °C:ssa, mitä seurasi 40 sykliä 95 °C:ssa 10 sekunnin ajan ja 60 °C:ssa 60 sekunnin ajan yhdellä tiedonkeruulla.Sulamiskäyrät luotiin käyttämällä peräkkäisiä mittauksia 95 °C:ssa 5 sekunnin ajan, 65 °C:ssa 60 sekunnin ajan ja 97 °C:ssa qPCR:n lopussa.Jokainen qPCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena kontrollinäytteitä lukuun ottamatta.
Koska simpukat tunnetaan korkeasta suodatusnopeudestaan, tutkimme ensin, voisivatko ne suodattaa ja säilyttää meriveden DNA-fragmentteja.Olimme myös kiinnostuneita siitä, kerääntyvätkö nämä fragmentit puoliavoimeen imunestejärjestelmäänsä.Ratkaisimme tämän ongelman kokeellisesti seuraamalla simpukkasäiliöihin lisättyjen liukoisten DNA-fragmenttien kohtaloa.DNA-fragmenttien jäljittämisen helpottamiseksi käytimme vierasta (ei omaa) plasmidi-DNA:ta, joka sisälsi ihmisen galektiini-7-geenin.ddPCR jäljittää plasmidi-DNA-fragmentteja merivedestä ja simpukoista.Tuloksemme osoittavat, että jos DNA-fragmenttien määrä merivedessä pysyi suhteellisen vakiona ajan kuluessa (jopa 7 päivää) ilman simpukoita, niin simpukoiden läsnä ollessa tämä taso hävisi lähes kokonaan 8 tunnissa (kuvio 1a, b).Eksogeenisen DNA:n fragmentit havaittiin helposti 15 minuutissa intravalvulaarisessa nesteessä ja hemolymfassa (kuvio 1c).Nämä fragmentit voitiin havaita vielä 4 tuntia altistuksen jälkeen.Tämä DNA-fragmenttien suodatusaktiivisuus on verrattavissa bakteerien ja levien suodatusaktiivisuuteen [31].Nämä tulokset viittaavat siihen, että simpukat voivat suodattaa ja kerätä vierasta DNA:ta nesteosastoihinsa.
Plasmidi-DNA:n suhteelliset pitoisuudet merivedessä simpukoiden läsnä ollessa (A) tai ilman (B) ddPCR:llä mitattuna.A:ssa tulokset ilmaistaan ​​prosentteina, ja ruutujen reunat edustavat 75. ja 25. prosenttipistettä.Sovitettu logaritminen käyrä näkyy punaisena ja harmaalla varjostettu alue edustaa 95 %:n luottamusväliä.B:ssä punainen viiva edustaa keskiarvoa ja sininen viiva edustaa pitoisuuden 95 %:n luottamusväliä.C Plasmidi-DNA:n kerääntyminen simpukoiden hemolymfiin ja läppänesteeseen eri aikoina plasmidi-DNA:n lisäämisen jälkeen.Tulokset esitetään absoluuttisina kopioina/ml (±SE).
Seuraavaksi tutkimme ccfDNA:n alkuperää sinisimpukoista, jotka on kerätty sinisimpukoista Kerguelen-saarilta, syrjäiseltä saariryhmältä, jolla on rajoitettu ihmisen vaikutus.Tätä tarkoitusta varten simpukoiden hemolymfistä peräisin oleva cccDNA eristettiin ja puhdistettiin menetelmillä, joita käytetään yleisesti ihmisen cccDNA:n puhdistamiseen [32, 33].Havaitsimme, että sinisimpukoiden keskimääräiset hemolymfi-ccfDNA-pitoisuudet ovat alhaisella mikrogrammaa/ml hemolymfi-alueella (katso taulukko S2, lisätiedot).Tämä pitoisuusalue on paljon suurempi kuin terveillä ihmisillä (pieni nanogrammaa millilitraa kohti), mutta harvinaisissa tapauksissa syöpäpotilailla ccfDNA:n taso voi nousta useisiin mikrogrammiin millilitraa kohti [34, 35].Hemolymfi-ccfDNA:n kokojakauman analyysi osoitti, että nämä fragmentit vaihtelevat suuresti kooltaan 1000 emäsparista 1000 emäspariin.jopa 5000 bp (kuva 2).Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä piidioksidipohjaista QIAamp Investigator Kit -sarjaa, joka on oikeuslääketieteessä yleisesti käytetty menetelmä genomisen DNA:n nopeaan eristämiseen ja puhdistamiseen pienipitoisuuksista DNA-näytteistä, mukaan lukien ccfDNA [36].
Edustava simpukan hemolymfin ccfDNA-elektroforegrammi.Uutettu NucleoSnap Plasma Kitillä (ylhäällä) ja QIAamp DNA Investigator Kitillä.B Viulukaavio, joka näyttää hemolymfin ccfDNA-pitoisuuksien (±SE) jakautumisen simpukoissa.Mustat ja punaiset viivat edustavat mediaania ja ensimmäistä ja kolmatta kvartiilia, vastaavasti.
Noin 1 %:lla ihmisten ja kädellisten ccfDNA:sta on vieras lähde [21, 37].Ottaen huomioon simpukoiden puoliavoin verenkiertojärjestelmän, mikrobirikkaan meriveden ja simpukan ccfDNA:n kokojakauman, oletimme, että simpukoiden hemolymfi ccfDNA voi sisältää runsaan ja monipuolisen mikrobi-DNA:n.Tämän hypoteesin testaamiseksi sekvensoimme hemolymfiä ccfDNA:ta Aulacomya atra -näytteistä, jotka kerättiin Kerguelen-saarilta, mikä tuotti yli 10 miljoonaa lukua, joista 97,6 % läpäisi laadunvalvonnan.Lukemat luokiteltiin sitten mukaan itse ja ei-itse lähteistä käyttäen BLASTN ja NCBI kaksisävyisten tietokantoja (kuva S1, lisätiedot).
Ihmisillä sekä ydin- että mitokondrio-DNA voi vapautua verenkiertoon [38].Tässä tutkimuksessa ei kuitenkaan ollut mahdollista kuvata yksityiskohtaisesti simpukoiden tuman genomista DNA:ta, koska A. atra -genomia ei ole sekvensoitu tai kuvattu.Pystyimme kuitenkin tunnistamaan useita omaa alkuperäämme olevia ccfDNA-fragmentteja käyttämällä simpukankirjastoa (kuva S2, lisätiedot).Vahvistimme myös omaa alkuperäämme olevien DNA-fragmenttien läsnäolon niiden A. atra -geenien suunnatulla PCR-monistuksella, jotka sekvensoitiin (kuvio 3).Samoin ottaen huomioon, että A. atran mitokondrioiden genomi on saatavilla julkisissa tietokannassa, voidaan löytää todisteita mitokondrioiden ccfDNA-fragmenttien läsnäolosta A. atran hemolymfissä.Mitokondrioiden DNA-fragmenttien läsnäolo varmistettiin PCR-monistuksella (kuvio 3).
A. atran (punaiset pisteet – varastonumero: SRX5705969) ja M. platensiksen (siniset pisteet – varastonumero: SRX5705968) hemolymfissä PCR-monistettuina esiintyi erilaisia ​​mitokondriogeenejä.Kuvio mukautettu julkaisusta Breton et ai., 2011 B Hemolymfisupernatantin monistus A. atrasta Säilytetty FTA-paperille.Lisää 3 mm:n meistillä suoraan PCR-seoksen sisältävään PCR-putkeen.
Koska meriveden mikrobipitoisuus on runsas, keskityimme aluksi hemolymfissä olevien mikrobi-DNA-sekvenssien karakterisointiin.Tätä varten käytämme kahta erilaista strategiaa.Ensimmäisessä strategiassa käytettiin Kraken2:ta, algoritmipohjaista sekvenssiluokitteluohjelmaa, joka pystyy tunnistamaan mikrobisekvenssejä BLASTin ja muiden työkalujen kanssa verrattavissa olevalla tarkkuudella [28].Yli 6 719 lukemaa määritettiin olevan bakteerialkuperää, kun taas 124 ja 64 olivat peräisin arkeasta ja 64 viruksista (kuva 4).Yleisimmät bakteerien DNA-fragmentit olivat Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) ja Bacteroidetes (17 %) (kuvio 4a).Tämä jakauma on yhdenmukainen aiempien merisinisimpukoiden mikrobiomitutkimusten kanssa [39, 40].Gammaproteobakteerit olivat proteobakteerien pääluokka (44 %), mukaan lukien monet Vibrionales (kuvio 4b).DdPCR-menetelmä vahvisti Vibrio DNA -fragmenttien läsnäolon A. atra hemolymph -bakteerin ccfDNA:ssa (kuvio 4c) [41].Saadaksesi lisätietoja ccfDNA:n bakteeriperäisestä otettiin käyttöön toinen lähestymistapa (kuva S2, lisätiedot). Tässä tapauksessa päällekkäiset lukemat koottiin parillisen pään lukuina ja luokiteltiin itsestään (simpukka) tai ei-self-alkuperäisiksi käyttämällä BLASTN:ää ja e-arvoa 1e-3 ja raja-arvoa > 90 % homologialla. Tässä tapauksessa päällekkäiset lukemat koottiin parillisen pään lukuina ja luokiteltiin itsestään (simpukka) tai ei-self-alkuperäisiksi käyttämällä BLASTN:ää ja e-arvoa 1e-3 ja raja-arvoa > 90 % homologialla. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классировафиц орчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечемия>90миолсгния%. Tässä tapauksessa päällekkäiset lukemat kerättiin paripäisinä lukuina, ja ne luokiteltiin alkuperäisiksi (kaksikuoriksi) tai ei-alkuperäisiksi käyttämällä BLASTN:ää ja e-arvoa 1e-3 ja raja-arvoa > 90 % homologialla.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 梌和暄庐暄 值 值值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使缍 用 使用 使用 使用 使用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицивстустуныны тые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гом>9 гомолога гом> 9 гом. Tässä tapauksessa päällekkäiset lukemat kerättiin pariperäisinä lukuina ja luokiteltiin omiksi (simpukat) tai ei-alkuperäisiksi käyttämällä e BLASTN- ja 1e-3-arvoja ja homologiakynnystä > 90%.Koska A. atra -genomia ei ole vielä sekvensoitu, käytimme MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) -kokoonpanolaitteen de novo -kokoonpanostrategiaa.Yhteensä 147 188 jatkumoa on tunnistettu riippuvaiseksi (simpukka) alkuperästä.Nämä jatkumot räjäytettiin sitten e-arvoilla 1e-10 käyttämällä BLASTN- ja BLASTX-laitteita.Tämä strategia antoi meille mahdollisuuden tunnistaa 482 ei-kaksoisherkkää fragmenttia, jotka olivat läsnä A. atra ccfDNA:ssa.Yli puolet (57 %) näistä DNA-fragmenteista saatiin bakteereista, pääasiassa kidussymbionteista, mukaan lukien sulfotrofiset symbionteit, ja kidussymbionteista Solemya velum (kuva 5).
Suhteellinen runsaus tyyppitasolla.B Kahden pääfylan (Firmicutes ja Proteobacteria) mikrobien monimuotoisuus.Edustava ddPCR C Vibrio spp.A. 16S-rRNA-geenin fragmentit (sininen) kolmessa atra-hemolümfissa.
Yhteensä 482 kerättyä jatkoa analysoitiin.Yleisprofiili metagenomisten jatkuvien annotaatioiden taksonomisesta jakaumasta (prokaryootit ja eukaryootit).B BLASTN:n ja BLASTX:n tunnistamien bakteerien DNA-fragmenttien yksityiskohtainen jakautuminen.
Kraken2-analyysi osoitti myös, että simpukan ccfDNA sisälsi arkeaalisia DNA-fragmentteja, mukaan lukien Euryarchaeotan (65 %), Crenarchaeotan (24 %) ja Thaurmarcheotan (11 %) DNA-fragmentit (kuvio 6a).Euryarchaeotasta ja Crenarchaeotasta peräisin olevien DNA-fragmenttien esiintymisen, joita aiemmin löydettiin Kalifornian simpukoiden mikrobiyhteisöstä, ei pitäisi tulla yllätyksenä [42].Vaikka Euryarchaeota yhdistetään usein ääriolosuhteisiin, nyt tiedetään, että sekä Euryarchaeota että Crenarcheota ovat yleisimpiä prokaryootteja meren kryogeenisessä ympäristössä [43, 44].Metanogeenisten mikro-organismien esiintyminen simpukoissa ei ole yllättävää, kun otetaan huomioon viimeaikaiset raportit laajoista metaanivuodoista Kerguelenin tasangon pohjavuodoista [45] ja mahdollisesta mikrobien metaanituotannosta, joka on havaittu Kerguelen-saarten rannikolla [46].
Sitten huomiomme siirtyi DNA-virusten lukemiin.Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen off-kohteista tehty tutkimus simpukoiden viruspitoisuudesta.Kuten odotettiin, löysimme bakteriofagien (Caudovirales) DNA-fragmentteja (kuvio 6b).Yleisin virus-DNA tulee kuitenkin nukleosytovirusten ryhmästä, joka tunnetaan myös nimellä nukleosytoplasminen suuri DNA-virus (NCLDV), jolla on kaikista viruksista suurin genomi.Tämän suvun sisällä useimmat DNA-sekvensseistä kuuluvat perheisiin Mimimidoviridae (58 %) ja Poxviridae (21 %), joiden luonnollisia isäntiä ovat selkärankaiset ja niveljalkaiset, kun taas pieni osa näistä DNA-sekvensseistä kuuluu tunnettuihin virologisiin leviin.Infektoi meren eukaryoottisia leviä.Sekvenssit saatiin myös Pandora-viruksesta, jättiläisviruksesta, jonka genomikoko on suurin tunnetuista virussukuista.Mielenkiintoista on, että viruksen tartuttamien isäntien valikoima hemolymph ccfDNA -sekvensoinnilla määritettynä oli suhteellisen suuri (kuva S3, lisätiedot).Se sisältää viruksia, jotka infektoivat hyönteisiä, kuten Baculoviridae ja Iridoviridae, sekä viruksia, jotka infektoivat ameebaa, leviä ja selkärankaisia.Löysimme myös Pithovirus sibericum -genomia vastaavia sekvenssejä.Pitovirukset (tunnetaan myös nimellä "zombievirukset") eristettiin ensimmäisen kerran 30 000 vuotta vanhasta ikiroutasta Siperiassa [47].Näin ollen tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien kanssa, jotka osoittavat, että kaikki näiden virusten nykyaikaiset lajit eivät ole kuolleet sukupuuttoon [48] ja että näitä viruksia saattaa esiintyä syrjäisissä subarktisissa meriekosysteemeissä.
Lopuksi testasimme, voisimmeko löytää DNA-fragmentteja muista monisoluisista eläimistä.BLASTN ja BLASTX tunnistivat yhteensä 482 vierasta jatkumoa nt-, nr- ja RefSeq-kirjastoilla (genominen ja proteiini).Tuloksemme osoittavat, että monisoluisten eläinten ccfDNA:n vieraiden fragmenttien joukossa luisten luiden DNA on vallitseva (kuvio 5).Myös hyönteisten ja muiden lajien DNA-fragmentteja on löydetty.Suhteellisen suurta osaa DNA-fragmenteista ei ole tunnistettu, mikä saattaa johtua siitä, että suuri määrä merilajeja on aliedustettuna genomitietokannassa verrattuna maanpäällisiin lajeihin [49].
Tässä artikkelissa käytämme LB-konseptia simpukoihin väittäen, että hemolymph ccfDNA -sekvensointi voi antaa käsityksen meren rannikkoekosysteemien koostumuksesta.Erityisesti havaitsimme, että 1) simpukan hemolymfi sisältää suhteellisen korkeita pitoisuuksia (mikrogrammatasoja) suhteellisen suuria (~1-5 kb) kiertäviä DNA-fragmentteja;2) nämä DNA-fragmentit ovat sekä itsenäisiä että ei-riippumattomia. 3) Näiden DNA-fragmenttien vieraista lähteistä löysimme bakteeri-, arkeaali- ja virus-DNA:ta sekä muiden monisoluisten eläinten DNA:ta;4) Näiden vieraiden ccfDNA-fragmenttien kerääntyminen hemolymfiin tapahtuu nopeasti ja myötävaikuttaa simpukoiden sisäiseen suodatusaktiivisuuteen.Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme osoittaa, että LB:n käsite, jota on toistaiseksi sovellettu pääasiassa biolääketieteen alalla, koodaa rikkaan mutta tutkimattoman tietolähteen, jonka avulla voidaan paremmin ymmärtää vartijalajien ja niiden ympäristön vuorovaikutusta.
Kädellisten lisäksi ccfDNA:n eristämistä on raportoitu nisäkkäillä, mukaan lukien hiiret, koirat, kissat ja hevoset [50, 51, 52].Tietojemme mukaan tutkimuksemme on kuitenkin ensimmäinen, joka raportoi ccfDNA:n havaitsemisesta ja sekvensoinnista merilajeissa, joissa on avoin kiertojärjestelmä.Tämä simpukoiden anatominen ominaisuus ja suodatuskyky voivat ainakin osittain selittää kiertävien DNA-fragmenttien erilaiset kokoominaisuudet muihin lajeihin verrattuna.Ihmisillä useimmat veressä kiertävät DNA-fragmentit ovat pieniä fragmentteja, joiden koko vaihtelee välillä 150-200 bp.maksimipiikin ollessa 167 bp [34, 53].Pieni mutta merkittävä osa DNA-fragmenteista on kooltaan 300 - 500 emäsparia, ja noin 5 % on pidempiä kuin 900 emäsparia.[54].Syynä tähän kokojakaumaan on, että ccfDNA:n pääasiallinen lähde plasmassa tapahtuu solukuoleman seurauksena, joko solukuoleman seurauksena tai verenkierrossa olevien hematopoieettisten solujen nekroosin seurauksena terveillä yksilöillä tai kasvainsolujen apoptoosin vuoksi syöpäpotilailla (tunnetaan kiertävänä kasvain-DNA:na)., ctDNA).Sinisimpukoista löytämämme hemolymfi-ccfDNA:n kokojakauma vaihteli välillä 1000-5000 bp, mikä viittaa siihen, että simpukoiden ccfDNA:lla on eri alkuperä.Tämä on looginen hypoteesi, koska simpukoilla on puoliavoin verisuonijärjestelmä ja ne elävät merivesiympäristöissä, joissa on korkeita pitoisuuksia mikrobien genomista DNA:ta.Itse asiassa laboratoriokokeemme käyttämällä eksogeenistä DNA:ta ovat osoittaneet, että simpukat keräävät DNA-fragmentteja meriveteen, ainakin muutaman tunnin kuluttua ne hajoavat soluunoton jälkeen ja/tai vapautuvat ja/tai varastoituvat erilaisiin organisaatioihin.Ottaen huomioon solujen (sekä prokaryoottisten että eukaryoottisten) harvinaisuuden, intravalvulaaristen osastojen käyttö vähentää ccfDNA:n määrää omista lähteistä sekä vieraista lähteistä.Ottaen huomioon simpukan synnynnäisen immuniteetin tärkeyden ja kiertävien fagosyyttien suuren määrän, oletimme lisäksi, että jopa vieras ccfDNA on rikastunut kiertävistä fagosyyteistä, jotka kerääntyvät vieraaseen DNA:han nieltyään mikro-organismeja ja/tai solujätettä.Yhdessä tuloksemme osoittavat, että simpukan hemolymfi ccfDNA on ainutlaatuinen molekyylitietovarasto ja vahvistaa niiden asemaa sentinellilajina.
Tietomme osoittavat, että bakteereista peräisin olevien hemolymfi-ccfDNA-fragmenttien sekvensointi ja analysointi voi tarjota avaintietoa isäntäbakteerifloorasta ja ympäröivässä meriekosysteemissä olevista bakteereista.Shot-sekvensointitekniikat ovat paljastaneet kommensaalibakteerien A. atra gill sekvenssejä, jotka olisivat jääneet huomaamatta, jos tavanomaisia ​​16S rRNA:n tunnistusmenetelmiä olisi käytetty, mikä johtuu osittain vertailukirjaston harhasta.Itse asiassa meidän käyttö LB kerättyjen tietojen M. platensis samassa simpukka kerros Kerguelen osoitti, että koostumus kiduksiin liittyvät bakteerien symbionts oli sama molemmille simpukkalajeille (kuva S4, lisätiedot).Tämä kahden geneettisesti erilaisen simpukan samankaltaisuus saattaa heijastaa bakteeriyhteisöjen koostumusta Kerguelenin kylmissä, rikkipitoisissa ja vulkaanisissa kerrostumissa [55, 56, 57, 58].Korkeammat rikkiä vähentävien mikro-organismien tasot on kuvattu hyvin, kun simpukoita kerätään bioturboiduilta rannikkoalueilta [59], kuten Port-au-Francen rannikolta.Toinen mahdollisuus on, että horisontaalinen leviäminen voi vaikuttaa simpukoiden kommensaaliflooraan [60, 61].Lisää tutkimusta tarvitaan meriympäristön, merenpohjan pinnan ja simpukoiden symbioottisten bakteerien koostumuksen välisen korrelaation määrittämiseksi.Nämä tutkimukset ovat parhaillaan käynnissä.
Hemolymfi-ccfDNA:n pituus ja pitoisuus, sen puhdistuksen helppous ja korkea laatu nopean haulikkosekvensoinnin mahdollistamiseksi ovat joitain monista eduista, joita käytetään simpukoiden ccfDNA:n käyttämisessä merien rannikkoekosysteemien biologisen monimuotoisuuden arvioinnissa.Tämä lähestymistapa on erityisen tehokas luonnehdittaessa virusyhteisöjä (viromeja) tietyssä ekosysteemissä [62, 63].Toisin kuin bakteerit, arkeat ja eukaryootit, virusgenomit eivät sisällä fylogeneettisesti konservoituneita geenejä, kuten 16S-sekvenssejä.Tuloksemme osoittavat, että nestemäisiä biopsioita indikaattorilajeista, kuten simpukoista, voidaan käyttää tunnistamaan suhteellisen suuri määrä ccfDNA-virusfragmentteja, joiden tiedetään infektoivan isäntiä, jotka tyypillisesti asuvat rannikon meren ekosysteemeissä.Tämä sisältää virukset, joiden tiedetään saastuttavan alkueläimiä, niveljalkaisia, hyönteisiä, kasveja ja bakteeriviruksia (esim. bakteriofaageja).Samanlainen jakautuminen havaittiin, kun tutkimme sinisimpukoiden (M. platensis) hemolymfi-ccfDNA-viromia, joka oli kerätty samaan simpukkakerrokseen Kerguelenissa (taulukko S2, lisätiedot).ccfDNA:n haulikkosekvensointi on todellakin uusi lähestymistapa, joka on saamassa vauhtia ihmisten tai muiden lajien viromin tutkimuksessa [21, 37, 64].Tämä lähestymistapa on erityisen hyödyllinen kaksijuosteisten DNA-virusten tutkimisessa, koska yksittäinen geeni ei ole konservoitunut kaikkien kaksijuosteisten DNA-virusten joukossa, jotka edustavat Baltimoren monimuotoisinta ja laajinta virusluokkaa [65].Vaikka useimmat näistä viruksista ovat edelleen luokittelemattomia ja voivat sisältää viruksia täysin tuntemattomasta virusmaailmasta [66], havaitsimme, että simpukoiden A. atra ja M. platensis viromit ja isäntäalueet ovat näiden kahden lajin välissä.samoin (katso kuva S3, lisätietoja).Tämä samankaltaisuus ei ole yllättävää, koska se saattaa heijastaa selektiivisyyden puutetta ympäristössä olevan DNA:n oton yhteydessä.Tulevia tutkimuksia, joissa käytetään puhdistettua RNA:ta, tarvitaan tällä hetkellä RNA-viromin karakterisoimiseksi.
Tutkimuksessamme käytimme erittäin tiukkaa putkilinjaa, joka oli mukautettu Kowarskin ja kollegoiden [37] työstä. He käyttivät yhdistettyjen lukujen ja jatkuvien osien kaksivaiheista poistamista ennen ja jälkeen natiivin ccfDNA:n kokoamisen, mikä johti suureen määrään kartoittamattomia lukuja.Siksi emme voi sulkea pois sitä, että joillakin näistä kartoittamattomista lukemista voi silti olla oma alkuperänsä, pääasiassa siksi, että meillä ei ole tälle simpukkalajille referenssigenomia.Käytimme myös tätä liukuhihnaa, koska olimme huolissamme oman ja ei-itse lukujen välisistä kimeeroista ja Illumina MiSeq PE75:n luomista lukupituuksista.Toinen syy suurimmalle osalle kartoittamattomista lukemista on se, että suurta osaa meren mikrobeista, erityisesti syrjäisillä alueilla, kuten Kerguelen, ei ole merkitty.Käytimme Illumina MiSeq PE75:tä olettaen, että ccfDNA-fragmenttien pituudet ovat samanlaisia ​​kuin ihmisen ccfDNA.Tulevia tutkimuksia varten, ottaen huomioon tulokset, jotka osoittavat, että hemolymfi ccfDNA:lla on pidemmät lukemat kuin ihmisillä ja/tai nisäkkäillä, suosittelemme käyttämään sekvensointialustaa, joka sopii paremmin pidempiin ccfDNA-fragmentteihin.Tämä käytäntö tekee paljon helpommaksi tunnistaa lisää merkkejä syvempää analyysiä varten.Tällä hetkellä puuttuvan täydellisen A. atran tuman genomisekvenssin saaminen helpottaisi myös suuresti ccfDNA:n erottamista omasta ja ei-omasta lähteestä.Koska tutkimuksemme on keskittynyt mahdollisuuteen soveltaa nestebiopsian käsitettä simpukoihin, toivomme, että koska tätä käsitettä käytetään tulevassa tutkimuksessa, kehitetään uusia työkaluja ja putkia, jotka lisäävät tämän menetelmän mahdollisuuksia tutkia simpukoiden mikrobien monimuotoisuutta.meren ekosysteemi.
Ei-invasiivisena kliinisenä biomarkkerina ihmisen plasman ccfDNA:n kohonneet tasot liittyvät erilaisiin sairauksiin, kudosvaurioihin ja stressitiloihin [67, 68, 69].Tämä lisääntyminen liittyy omasta alkuperästään peräisin olevien DNA-fragmenttien vapautumiseen kudosvaurion jälkeen.Käsittelimme tätä ongelmaa akuutilla lämpöstressillä, jossa simpukat altistettiin hetkeksi 30 °C:n lämpötilalle.Teimme tämän analyysin kolmella eri tyyppisellä simpukoilla kolmessa riippumattomassa kokeessa.Emme kuitenkaan löytäneet mitään muutosta ccfDNA-tasoissa akuutin lämpöstressin jälkeen (katso kuva S5, lisätietoja).Tämä löytö voi selittää ainakin osittain sen tosiasian, että simpukoilla on puoliavoin verenkiertojärjestelmä ja ne keräävät suuria määriä vierasta DNA:ta korkean suodatusaktiivisuutensa vuoksi.Toisaalta simpukat, kuten monet selkärangattomat, voivat olla vastustuskykyisempiä stressin aiheuttamille kudosvaurioille, mikä rajoittaa ccfDNA:n vapautumista hemolymfissään [70, 71].
Tähän mennessä vesiekosysteemien biologisen monimuotoisuuden DNA-analyysi on keskittynyt pääasiassa ympäristön DNA:n (eDNA) metabarkoodaukseen.Tämä menetelmä on kuitenkin yleensä rajoitettu biologisen monimuotoisuuden analysoinnissa, kun käytetään alukkeita.Haulikkosekvensoinnin käyttö kiertää PCR:n rajoitukset ja alukesarjojen puolueellisen valinnan.Näin ollen menetelmämme on tietyssä mielessä lähempänä äskettäin käytettyä korkean suorituskyvyn eDNA Shotgun -sekvensointimenetelmää, joka pystyy sekvensoimaan suoraan fragmentoitunutta DNA:ta ja analysoimaan lähes kaikkia organismeja [72, 73].On kuitenkin olemassa useita peruskysymyksiä, jotka erottavat LB:n tavallisista eDNA-menetelmistä.Tietenkin tärkein ero eDNA:n ja LB:n välillä on luonnollisten suodatinisäntien käyttö.Meren lajien, kuten sienien ja simpukoiden (Dresseina spp.) käyttöä luonnollisena suodattimena eDNA:n tutkimisessa on raportoitu [74, 75].Dreiisenan tutkimuksessa käytettiin kuitenkin kudosbiopsioita, joista DNA erotettiin.LB:n ccfDNA:n analyysi ei vaadi kudosbiopsiaa, erikoistuneita ja joskus kalliita laitteita ja eDNA:han tai kudosbiopsiaan liittyvää logistiikkaa.Itse asiassa raportoimme äskettäin, että LB:stä peräisin olevaa ccfDNA:ta voidaan tallentaa ja analysoida FTA-tuella ilman kylmäketjua, mikä on suuri haaste syrjäisten alueiden tutkimukselle [76].ccfDNA:n erottaminen nestemäisistä biopsioista on myös yksinkertaista ja tarjoaa korkealaatuista DNA:ta haulikkosekvensointia ja PCR-analyysiä varten.Tämä on suuri etu, kun otetaan huomioon eräät eDNA-analyysiin liittyvät tekniset rajoitukset [77].Näytteenottomenetelmän yksinkertaisuus ja edullinen hinta soveltuvat erityisen hyvin myös pitkäaikaisiin seurantaohjelmiin.Korkean suodatuskyvyn lisäksi toinen simpukoiden tunnettu ominaisuus on niiden liman kemiallinen mukopolysakkaridikoostumus, joka edistää virusten imeytymistä [78, 79].Tämä tekee simpukoista ihanteellisen luonnollisen suodattimen biologisen monimuotoisuuden ja ilmastonmuutoksen vaikutusten karakterisointiin tietyssä vesiekosysteemissä.Vaikka isännästä peräisin olevien DNA-fragmenttien läsnäolo voidaan nähdä menetelmän rajoituksena eDNA:han verrattuna, tällaisen natiivin ccfDNA:n hankkimiseen liittyvät kustannukset eDNA:han verrattuna ovat samalla ymmärrettäviä, kun otetaan huomioon terveystutkimuksia varten saatavilla oleva valtava määrä tietoa.offset isäntä.Tämä sisältää isäntäisännän genomiin integroituneiden virussekvenssien läsnäolon.Tämä on erityisen tärkeää simpukoille, koska simpukoissa on horisontaalisesti leviäviä leukeemisia retroviruksia [80, 81].Toinen LB:n etu eDNA:han verrattuna on, että se hyödyntää hemolymfissä kiertävien verisolujen fagosyyttistä aktiivisuutta, mikä imee mikro-organismeja (ja niiden genomeja).Fagosytoosi on simpukoiden verisolujen päätehtävä [82].Lopuksi menetelmä hyödyntää simpukoiden suurta suodatuskykyä (keskimäärin 1,5 l/h merivettä) ja kahden päivän kiertoa, mikä lisää merivesikerrosten sekoittumista, mikä mahdollistaa heterologisen eDNA:n talteenoton.[83, 84].Siten simpukoiden ccfDNA-analyysi on mielenkiintoinen keino ottaen huomioon simpukoiden ravitsemukselliset, taloudelliset ja ympäristövaikutukset.Samalla tavalla kuin ihmisistä kerätyn LB:n analyysi, tämä menetelmä avaa myös mahdollisuuden mitata geneettisiä ja epigeneettisiä muutoksia isäntä-DNA:ssa vasteena eksogeenisille aineille.Voidaan esimerkiksi ajatella kolmannen sukupolven sekvensointitekniikoita genominlaajuisen metylaatioanalyysin suorittamiseksi natiivissa ccfDNA:ssa nanohuokosekvensointia käyttämällä.Tätä prosessia helpottaa se, että simpukan ccfDNA-fragmenttien pituus on ihanteellisesti yhteensopiva pitkään luettujen sekvensointialustojen kanssa, jotka mahdollistavat genomin laajuisen DNA-metylaatioanalyysin yhdestä sekvensointiajosta ilman kemiallisia transformaatioita.85,86] Tämä on mielenkiintoinen mahdollisuus, koska on osoitettu, että DNA:n metylaatiomallit heijastavat monien ympäristöstressien aiheuttamia reaktioita.Siksi se voi tarjota arvokasta tietoa taustalla olevista mekanismeista, jotka ohjaavat reagointia ilmastonmuutokselle tai saasteille altistumisen jälkeen [87].LB:n käyttö ei kuitenkaan ole rajoituksia.Sanomattakin on selvää, että tämä edellyttää indikaattorilajien läsnäoloa ekosysteemissä.Kuten edellä mainittiin, LB:n käyttäminen tietyn ekosysteemin biologisen monimuotoisuuden arvioimiseen edellyttää myös tiukkaa bioinformatiikkaa, joka ottaa huomioon lähteestä peräisin olevien DNA-fragmenttien läsnäolon.Toinen suuri ongelma on merilajien vertailugenomien saatavuus.Toivotaan, että aloitteet, kuten Merinisäkkäiden genomiprojekti ja äskettäin perustettu Fish10k-hanke [88], helpottavat tällaista analysointia tulevaisuudessa.LB-konseptin soveltaminen meren suodattimia ruokkiviin organismeihin on myös yhteensopiva sekvensointitekniikan uusimpien edistysten kanssa, joten se soveltuu hyvin moniohmien biomarkkerien kehittämiseen antamaan tärkeää tietoa meren elinympäristöjen terveydestä vastauksena ympäristön stressiin.
Genomin sekvensointitiedot on tallennettu NCBI:n sekvenssilukuarkistoon https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojekteihin SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Ilmastonmuutoksen vaikutus meren elämään ja ekosysteemeihin.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et ai.Harkitse ilmastonmuutoksen ja muiden paikallisten stressitekijöiden yhteisvaikutuksia meriympäristöön.yleinen tieteellinen ympäristö.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et ai.).Maaliskuun ensimmäisen tiede.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Alennettu lämmönsietokyky toistuvissa lämpöstressiolosuhteissa selittää sinisimpukoiden korkean kesäkuolleisuuden.Tieteellinen raportti 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et ai.Viimeaikaiset muutokset eläinten kuolemien tiheydessä, syissä ja laajuudessa.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et ai.Useat ei-lajikohtaiset patogeenit ovat saattaneet aiheuttaa Pinna nobilisin massakuolleisuutta.Elämä.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Ilmastonmuutoksen mahdollinen vaikutus arktisiin zoonoottisiin sairauksiin.Int J Circumpolaarinen terveys.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et ai.Sinisimpukat (Mytilus edulis spp.) signaaliorganismeina rannikkoalueiden pilaantumisen seurannassa: katsaus.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Nestebiopsian integrointi syövän hoidossa.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et ai.Nestebiopsian kypsyminen: Sallii kasvaimen DNA:n kiertää.Nat Rev Syöpä.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleiinihapot ihmisen plasmassa.Soc Biolin tytäryhtiöiden kokouspöytäkirjat.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Soluttoman DNA:n uusi rooli molekyylimarkkerina syövän hoidossa.Biomolaarisen analyysin kvantifiointi.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Nestebiopsia tulee klinikalle – toteutusongelmat ja tulevaisuuden haasteet.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ja muut.Sikiön DNA:ta on läsnä äidin plasmassa ja seerumissa.Lansetti.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Tutkimus raskauden kulusta ja sen komplikaatioista käyttämällä kiertävää ekstrasellulaarista RNA:ta naisen veressä raskauden aikana.Dopediatria.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J et ai.Nestebiopsia: luovuttajan solutonta DNA:ta käytetään allogeenisten leesioiden havaitsemiseen munuaissiirreessä.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovaatioita synnytystä edeltävässä diagnostiikassa: äidin plasman genomin sekvensointi.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et ai.Nopea patogeenien havaitseminen tartunnan saaneiden kehon nesteiden seuraavan sukupolven metagenomisella sekvensoinnilla.Nat Lääketiede.2021;27:115-24.