Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Lintujen hedelmällisyys riippuu niiden kyvystä säilyttää tarpeeksi elinkelpoista siittiötä pitkiksi ajoiksi siittiöiden varastointitubuluksiin (SST).Tarkka mekanismi, jolla siittiöt tulevat SST:hen, asuvat siellä ja poistuvat siitä, on edelleen kiistanalainen.Sharkasi-kanojen siittiöillä oli suuri taipumus agglutinoitua, jolloin muodostui liikkuvia rihmamaisia ​​nippuja, jotka sisälsivät monia soluja.Koska siittiöiden liikkuvuutta ja käyttäytymistä oli vaikea havaita läpinäkymättömässä munanjohtimessa, käytimme siittiöiden agglutinaation ja liikkuvuuden tutkimiseen mikrofluidilaitetta, jonka mikrokanavapoikkileikkaus on samanlainen kuin siittiöiden.Tässä tutkimuksessa käsitellään siittiöiden muodostumista, liikkumista ja niiden mahdollista roolia siittiöiden asuinalueen pidentämisessä SST:ssä.Tutkimme siittiöiden nopeutta ja reologista käyttäytymistä, kun nestevirtaus syntyi mikrofluidikanavassa hydrostaattisen paineen vaikutuksesta (virtausnopeus = 33 µm/s).Siittiöillä on taipumus uida virtaa vastaan ​​(positiivinen reologia) ja siittiökimpun nopeus on merkittävästi pienempi verrattuna yksittäisiin siittiöihin.Siittiökimppujen on havaittu liikkuvan kierteessä ja kasvavan pituudeltaan ja paksuudeltaan, kun yksittäisiä siittiöitä rekrytoidaan enemmän. Siittiökimppujen havaittiin lähestyvän ja tarttuvan mikrofluidikanavien sivuseiniin, jotta vältytään pyyhkäiseltä nesteen virtausnopeudella > 33 µm/s. Siittiökimppujen havaittiin lähestyvän ja tarttuvan mikrofluidikanavien sivuseiniin, jotta vältytään pyyhkäiseltä nesteen virtausnopeudella > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюикачх, икрофлюикачено сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Siittiökimppujen on havaittu lähestyvän ja kiinnittyvän mikrofluidikanavien sivuseiniin, jotta ne eivät pyyhkäisi pois nesteen virtausnopeuksilla >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 流体流速> 33 流µ臟> 3333 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного, тания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Siittiökimppujen on havaittu lähestyvän ja kiinnittyvän mikrofluidikanavan sivuseiniin, jotta ne eivät pyyhkäisi pois >33 µm/s:n nestevirtauksesta.Pyyhkäisy- ja transmissioelektronimikroskooppi paljasti, että siittiökimppuja tuki runsaasti tiheää materiaalia.Saadut tiedot osoittavat Sharkazin kanan siittiöiden ainutlaatuisen liikkuvuuden sekä siittiöiden kyvyn agglutinoitua ja muodostaa liikkuvia nippuja, mikä auttaa ymmärtämään paremmin siittiöiden pitkäaikaista varastointia SMT:ssä.
Ihmisten ja useimpien eläinten hedelmöittyminen edellyttää, että siittiöt ja munasolut saapuvat hedelmöityspaikalle oikeaan aikaan.Siksi parittelun on tapahduttava ennen ovulaatiota tai sen aikana.Toisaalta jotkut nisäkkäät, kuten koirat, sekä muut kuin nisäkäslajit, kuten hyönteiset, kalat, matelijat ja linnut, säilyttävät siittiöitä lisääntymiselimissään pitkän aikaa, kunnes niiden munat ovat valmiita hedelmöittymiseen (asynkroninen hedelmöitys 1 ).Linnut pystyvät säilyttämään munasolujen hedelmöittämiseen kykenevien siittiöiden elinkyvyn 2–10 viikkoa2.
Tämä on ainutlaatuinen ominaisuus, joka erottaa linnut muista eläimistä, sillä se tarjoaa suuren todennäköisyyden hedelmöittymiseen yhden siemennyksen jälkeen useiden viikkojen ajan ilman samanaikaista parittelua ja ovulaatiota.Pääasiallinen siittiöiden varastointielin, jota kutsutaan siittiöiden varastointitubulukseksi (SST), sijaitsee sisäisissä limakalvon poimuissa kohdun ja vaginan liitoskohdassa.Tähän mennessä mekanismeja, joilla siittiöt tulevat siittiöpankista, oleskelevat ja poistuvat sieltä, ei ole täysin ymmärretty.Aikaisempien tutkimusten perusteella on esitetty monia hypoteeseja, mutta mikään niistä ei ole vahvistunut.
Forman4 oletti, että siittiöt säilyttävät asuinpaikkansa SST-ontelossa jatkuvalla värähtelevällä liikkeellä nesteen virtauksen suuntaa vastaan ​​SST-epiteelisoluissa sijaitsevien proteiinikanavien kautta (reologia).ATP on loppunut jatkuvan siimatoiminnan vuoksi, jota tarvitaan pitämään siittiöt SST-ontelossa, ja liikkuvuus lopulta heikkenee, kunnes siittiöt siirtyvät ulos siittiöpankista nestevirtauksen avulla ja alkavat uuden matkan alas nousevaa munanjohtimia pitkin hedelmöittääkseen siittiöt.Muna (Forman4).Tätä siittiöiden varastointimallia tukee SST-epiteelisoluissa olevien akvaporiinien 2, 3 ja 9 havaitseminen immunosytokemian avulla.Toistaiseksi ei ole tehty tutkimuksia kanan siemennesteen reologiasta ja sen roolista SST:n varastoinnissa, emättimen siittiöiden valinnassa ja siittiöiden kilpailussa.Kanoilla siittiöt pääsevät emättimeen luonnollisen parittelun jälkeen, mutta yli 80 % siittiöistä poistuu emättimestä pian parittelun jälkeen.Tämä viittaa siihen, että emätin on lintujen siittiöiden ensisijainen valintapaikka.Lisäksi on raportoitu, että alle 1 % emättimessä hedelmöitetyistä siittiöistä päätyy SST:iin2.Poikasten keinosiemennyksessä emättimessä SST:tä saavuttavien siittiöiden määrä pyrkii lisääntymään 24 tunnin kuluttua keinosiemennyksestä.Toistaiseksi siittiöiden valinnan mekanismi tämän prosessin aikana on epäselvä, ja siittiöiden liikkuvuudella voi olla tärkeä rooli SST siittiöiden ottamisessa.Munajohtimien paksujen ja läpinäkymättömien seinien vuoksi lintujen munanjohtimien siittiöiden liikkuvuutta on vaikea seurata suoraan.Siksi meillä ei ole perustietoa siitä, kuinka siittiöt siirtyvät SST:hen hedelmöityksen jälkeen.
Reologia on äskettäin tunnustettu tärkeäksi tekijäksi, joka säätelee siittiöiden kuljetusta nisäkkään sukupuolielimissä.Perustuen liikkuvien siittiöiden kykyyn vaeltaa vastavirtaan, Zaferani et al8 käyttivät corra-mikrofluidista järjestelmää liikkuvien siittiöiden passiiviseen eristämiseen suljetuista siemennesinäytteistä.Tämäntyyppinen siemennesteen lajittelu on välttämätöntä lääketieteellisessä hedelmättömyyden hoidossa ja kliinisessä tutkimuksessa, ja se on parempi kuin perinteisiä menetelmiä, jotka vaativat aikaa ja työtä ja voivat vaarantaa siittiöiden morfologian ja rakenteellisen eheyden.Tähän mennessä ei kuitenkaan ole tehty tutkimuksia kanojen sukuelinten eritteiden vaikutuksesta siittiöiden liikkuvuuteen.
Huolimatta mekanismista, joka säilyttää SST:hen varastoituneen siittiön, monet tutkijat ovat havainneet, että siellä asuvat siittiöt agglutinoituvat vastakkain kanojen 9, 10, viiriäisten 2 ja kalkkunan 11 SST:ssä muodostaen agglutinoituneita siittiökimppuja.Kirjoittajat ehdottavat, että tämän agglutinaation ja siittiöiden pitkäaikaisen varastoinnin välillä SST:ssä on yhteys.
Tingari ja Lake12 raportoivat vahvasta yhteydestä siittiöiden välillä kanan siittiöitä vastaanottavassa rauhasessa ja kyseenalaistivat, agglutinoituvatko linnun siittiöt samalla tavalla kuin nisäkkäiden siittiöt.He uskovat, että syvät yhteydet siittiöiden välillä verisuonissa voivat johtua stressistä, jonka aiheuttaa suuri määrä siittiöitä pienessä tilassa.
Arvioitaessa siittiöiden käyttäytymistä tuoreilla roikkuvilla lasilevyillä, voidaan havaita ohimeneviä agglutinaation merkkejä erityisesti siemenpisaroiden reunoilla.Agglutinaatiota kuitenkin häiritsi usein jatkuvaan liikkeeseen liittyvä pyörimisvaikutus, mikä selittää tämän ilmiön ohimenevän luonteen.Tutkijat huomasivat myös, että kun laimennusainetta lisättiin siemennesteeseen, ilmaantui pitkänomaisia ​​"lankamaisia" soluaggregaatteja.
Varhaiset yritykset jäljitellä siittiötä tehtiin poistamalla ohut lanka roikkuvasta pisarasta, mikä johti pitkänomaiseen siittiön kaltaiseen rakkulaan, joka työntyi ulos siemennestepisarasta.Siittiöt asettuivat välittömästi rinnakkain rakkulan sisällä, mutta koko yksikkö katosi nopeasti 3D-rajoituksen vuoksi.Siksi siittiöiden agglutinaation tutkimiseksi on välttämätöntä tarkkailla siittiöiden liikkuvuutta ja käyttäytymistä suoraan eristetyissä siittiöiden varastointitiehyissä, mikä on vaikeasti saavutettavissa.Siksi on välttämätöntä kehittää väline, joka jäljittelee siittiöitä, tukemaan siittiöiden liikkuvuutta ja agglutinaatiokäyttäytymistä koskevia tutkimuksia.Brillard et al13 raportoivat, että aikuisten kananpoikien siittiöiden varastointitubulusten keskipituus on 400–600 µm, mutta jotkut SST:t voivat olla jopa 2000 µm pitkiä.Mero ja Ogasawara14 jakoivat siemenrauhaset laajentuneisiin ja ei-laajentuneisiin siittiöiden varastointitubuluksiin, jotka molemmat olivat pituudeltaan (~ 500 µm) ja kaulan leveydeltään (~ 38 µm), mutta tubulusten keskimääräinen ontelon halkaisija oli 56,6 ja 56,6 µm.., vastaavasti 11,2 μm.Tässä tutkimuksessa käytimme mikrofluidilaitetta, jonka kanavakoko on 200 µm × 20 µm (W × H), jonka poikkileikkaus on jonkin verran lähellä vahvistetun SST:n poikkileikkausta.Lisäksi tutkimme siittiöiden liikkuvuutta ja agglutinaatiokäyttäytymistä virtaavassa nesteessä, mikä on yhdenmukainen Foremanin hypoteesin kanssa, että SST-epiteelisolujen tuottama neste pitää siittiöt ontelossa vastavirtaan (reologiseen) suuntaan.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli voittaa siittiöiden liikkuvuuden havainnointi munanjohtimessa ja välttää siittiöiden reologian ja käyttäytymisen tutkimisen vaikeudet dynaamisessa ympäristössä.Käytettiin mikrofluidilaitetta, joka luo hydrostaattisen paineen simuloimaan siittiöiden liikkuvuutta kanan sukupuolielimissä.
Kun pisara laimennettua siittiönäytettä (1:40) laitettiin mikrokanavalaitteeseen, voitiin tunnistaa kahdenlaisia ​​siittiöiden liikkuvuutta (eristetty siittiö ja sitoutunut siittiö).Lisäksi siittiöillä oli taipumus uida virtaa vastaan ​​(positiivinen reologia; video 1, 2). Vaikka siittiökimppujen nopeus oli pienempi kuin yksinäisten siittiöiden (p < 0,001), ne lisäsivät positiivisen reotaksisen siittiöiden prosenttiosuutta (p < 0,001; taulukko 2). Vaikka siittiökimppujen nopeus oli pienempi kuin yksinäisten siittiöiden (p < 0,001), ne lisäsivät positiivisen reotaksisen siittiöiden prosenttiosuutta (p < 0,001; taulukko 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), валончу01 рматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Vaikka siittiökimpuilla oli pienempi nopeus kuin yksittäisillä siittiöillä (p < 0,001), ne lisäsivät positiivista reotaksista osoittavien siittiöiden prosenttiosuutta (p < 0,001; taulukko 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们筐碞加了昁槵槺阳分比 (p < 0,001；表2）).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显羧 阧 显羧分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они уверматозоидов они уверматозоидов они уверматозоидов в с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Vaikka siittiökimppujen nopeus oli pienempi kuin yksittäisten siittiöiden (p < 0,001), ne lisäsivät positiivisen reologian omaavien siittiöiden prosenttiosuutta (p < 0,001; taulukko 2).Positiivinen reologia yksittäisille siittiöille ja kimppuille on arvioitu olevan noin 53 % ja 85 %.
On havaittu, että sharkasi-kanojen siittiöt muodostavat välittömästi siemensyöksyn jälkeen lineaarisia nippuja, jotka koostuvat kymmenistä yksilöistä.Näiden kimppujen pituus ja paksuus kasvavat ajan myötä ja voivat pysyä in vitro useita tunteja ennen kuin ne hajoavat (video 3).Nämä rihmamaiset kimput ovat muodoltaan echidnan siittiöitä, jotka muodostuvat lisäkiveksen loppuun.Sharkashi-kanojen siemennesteellä on havaittu olevan suuri taipumus agglutinoitua ja muodostaa verkkomainen nippu alle minuutissa keräämisen jälkeen.Nämä palkit ovat dynaamisia ja pystyvät tarttumaan läheisiin seiniin tai staattisiin esineisiin.Vaikka siittiökimput vähentävät siittiösolujen nopeutta, on selvää, että makroskooppisesti ne lisäävät niiden lineaarisuutta.Kimppujen pituus vaihtelee nippuihin kerättyjen siittiöiden lukumäärän mukaan.Kaksi osaa nipusta eristettiin: alkuosa, joka sisälsi agglutinoituneen siittiön vapaan pään, ja terminaalinen osa, mukaan lukien siittiön häntä ja koko distaalinen pää.Nopealla kameralla (950 fps) havaittiin nipun alkuosassa vapaita agglutinoituneiden siittiöiden päitä, jotka olivat vastuussa nipun liikkeestä värähtelevän liikkeensä vuoksi, vetäen loput kimppuun kierteisellä liikkeellä (video 4).Pitkissä kimppuissa on kuitenkin havaittu, että jotkut vapaat siittiöiden päistä kiinnittyneet runkoon ja tupsun pääteosa toimivat siipinä auttamaan kimppua eteenpäin.
Hitaassa nestevirtauksessa siittiökimput liikkuvat rinnakkain toistensa kanssa, mutta ne alkavat mennä päällekkäin ja tarttuvat kaikkeen, mikä on paikallaan, jotta virta ei huuhtoutuisi pois virtausnopeuden kasvaessa.Kimput muodostuvat, kun kourallinen siittiösoluja lähestyy toisiaan, ne alkavat liikkua synkronisesti ja kietoutuvat toistensa ympärille ja tarttuvat sitten tahmeaan aineeseen.Kuvat 1 ja 2 esittävät kuinka siittiöt lähestyvät toisiaan ja muodostavat liitoksen, kun hännät kietoutuvat toistensa ympärille.
Tutkijat käyttivät hydrostaattista painetta nestevirtauksen luomiseksi mikrokanavassa sperman reologian tutkimiseksi.Käytettiin mikrokanavaa, jonka koko oli 200 µm × 20 µm (L × K) ja pituus 3,6 µm.Käytä mikrokanavia säiliöiden välissä ruiskujen päissä.Elintarvikeväriä käytettiin kanavien näkyvyyden lisäämiseksi.
Kiinnitä liitäntäkaapelit ja lisävarusteet seinään.Video on otettu vaihekontrastimikroskoopilla.Jokaisen kuvan yhteydessä esitetään vaihekontrastimikroskopia ja kartoituskuvat.(A) Kahden virran välinen yhteys vastustaa kierteisen liikkeen aiheuttamaa virtausta (punainen nuoli).(B) Putkinipun ja kanavan seinämän välinen yhteys (punaiset nuolet), samalla ne on yhdistetty kahteen muuhun nippuun (keltaiset nuolet).(C) Mikrofluidikanavassa olevat siittiökimput alkavat liittyä toisiinsa (punaiset nuolet) muodostaen siittiökimppuverkon.(D) Siittiökimppujen verkoston muodostuminen.
Kun pisara laimennettua siittiötä laitettiin mikrofluidilaitteeseen ja virtaus luotiin, spermasäteen havaittiin liikkuvan virtauksen suuntaa vastaan.Kimput sopivat tiukasti mikrokanavien seiniä vasten, ja nippujen alkuosassa olevat vapaat päät sopivat tiukasti niitä vasten (video 5).Ne kiinnittyvät myös tiellään oleviin paikallaan oleviin hiukkasiin, kuten roskiin, vastustaakseen virran pyyhkäisemistä pois.Ajan myötä näistä tupsuista tulee pitkiä filamentteja, jotka vangitsevat muita yksittäisiä siittiöitä ja lyhyempiä kimppuja (video 6).Kun virtaus alkaa hidastua, pitkät siittiölinjat alkavat muodostaa siittiölinjojen verkostoa (video 7; kuva 2).
Suurella virtausnopeudella (V > 33 µm/s) lankojen kierteiset liikkeet lisääntyvät yrittäessään saada kiinni useita yksittäisiä siittiöitä muodostavia nippuja, jotka vastustavat paremmin virtauksen ajovoimaa. Suurella virtausnopeudella (V > 33 µm/s) lankojen kierteiset liikkeet lisääntyvät yrittäessään saada kiinni useita yksittäisiä siittiöitä muodostavia nippuja, jotka vastustavat paremmin virtauksen ajovoimaa. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытанются х сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Suurilla virtausnopeuksilla (V > 33 µm/s) säikeiden kierteiset liikkeet lisääntyvät, kun ne yrittävät saada kiinni useita yksittäisiä siittiöitä muodostaen nippuja, jotka pystyvät paremmin vastustamaan virtauksen ajelehtivaa voimaa.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉䴭䛐多形成束的多形成束的好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 䐭 弚 形成 侪 单 束更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватеть попытке захватеть зоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Suurilla virtausnopeuksilla (V > 33 µm/s) filamenttien kierteinen liike lisääntyy yrittäessään vangita useita yksittäisiä siittiöitä muodostaen nippuja vastustaakseen paremmin virtauksen ajovoimia.He yrittivät myös kiinnittää mikrokanavia sivuseiniin.
Siittiökimput tunnistettiin siittiöiden päistä ja käpristyneistä pyrstöistä käyttämällä valomikroskopiaa (LM).Siittiökimppuja, joissa on erilaisia ​​aggregaatteja, on myös tunnistettu kiertyneiksi päiksi ja siima-aggregaatteiksi, useiksi fuusioituneiksi siittiöiden pyrstöiksi, häntään kiinnitetyiksi siittiöiden päiksi ja taipuneilla ytimillä varustettuina ytiminä useiksi fuusioituneiksi ytimiksi.transmissioelektronimikroskooppi (TEM).Pyyhkäisyelektronimikroskooppi (SEM) osoitti, että siittiökimput olivat päällystettyjä siittiöiden päiden aggregaatteja ja siittiöaggregaatit osoittivat kiinnittyneen verkoston käärittyjä häntää.
Siittiöiden morfologiaa ja ultrarakennetta, siittiökimppujen muodostumista tutkittiin valomikroskopialla (puolileikkaus), pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM) ja transmissioelektronimikroskoopilla (TEM), siittiösolunäytteet värjättiin akridiinioranssilla ja tutkittiin epifluoresenssimikroskopialla.
Siittiötetön värjäys akridiinioranssilla (kuva 3B) osoitti, että siittiöiden päät olivat tarttuneet yhteen ja peittyneet eritysmateriaalilla, mikä johti suurten kimppujen muodostumiseen (kuvio 3D).Siittiökimput koostuivat siittiöaggregaateista, joihin oli kiinnitetty häntäverkko (kuvio 4A-C).Siittiökimput koostuvat monien toisiinsa kiinnittyneiden siittiöiden hännistä (kuva 4D).Salaisuudet (kuvat 4E, F) peittivät siittiökimppujen päät.
Siittiökimpun muodostuminen Faasikontrastimikroskopiaa ja akridiinioranssilla värjättyjä siittiönäytteitä käyttäen osoitti, että siittiöiden päät tarttuvat toisiinsa.(A) Varhainen siittiötupun muodostuminen alkaa siittiöstä (valkoinen ympyrä) ja kolmesta siittiöstä (keltainen ympyrä), ja kierre alkaa hännästä ja päättyy päähän.(B) Mikrovalokuva akridiinioranssilla värjätystä siittiönäytteestä, jossa näkyy kiinnittyviä siittiöiden päitä (nuolet).Vuoto kattaa pään (päät).Suurennus × 1000. (C) Mikrofluidikanavassa virtauksen kuljettaman suuren säteen kehittäminen (käyttämällä nopeaa kameraa nopeudella 950 fps).(D) Mikrovalokuva akridiinioranssilla värjätystä siittiösolunäytteestä, jossa näkyy suuria kimppuja (nuolet).Suurennus: × 200.
Pyyhkäisyelektronimikroskooppikuva siittiösäteestä ja akridiinioranssilla värjätystä siittiösolunäytteestä.(A, B, D, E) ovat digitaalisia väripyyhkäisyelektronimikroskooppeja siittiöistä, ja C ja F ovat mikrokuvia akridiinioranssilla värjätyistä siittiösoluista, jotka osoittavat useiden siittiöiden kiinnittymisen kaudaaliverkkoon.(AC) Siittiöiden aggregaatit esitetään kiinnittyneiden pyrstöjen (nuolien) verkostona.(D) Useiden siittiöiden (liima-aineella, vaaleanpunainen ääriviiva, nuoli) tarttuminen hännän ympärille.(E ja F) Siittiönpään aggregaatit (osoittimet), jotka on peitetty liimamateriaalilla (osoittimet).Siittiöt muodostivat nippuja, joissa oli useita pyörremäisiä rakenteita (F).(C) × 400 ja (F) × 200 suurennokset.
Transmissioelektromikroskopiaa käyttämällä havaitsimme, että siittiökimpuissa oli kiinnittynyt häntä (kuva 6A, C), päitä kiinnitettynä häntiin (kuvio 6B) tai päitä kiinnitettynä häntiin (kuvio 6D).Nipussa olevien siittiöiden päät ovat kaarevia, ja niissä on kaksi ydinaluetta (kuvio 6D).Viiltokimppussa siittiöillä oli kierretty pää, jossa oli kaksi tuma-aluetta ja useita flagellaarisia alueita (kuvio 5A).
Digitaalinen värielektronimikroskooppikuva, jossa näkyy siittiökimpun yhdistävät hännät ja siittiöiden päitä yhdistävä agglutinoiva materiaali.(A) Suuren määrän siittiöitä kiinnittynyt häntä.Huomaa, miltä häntä näyttää sekä pysty (nuoli) että vaaka (nuoli) projektiossa.(B) Siittiön pää (nuoli) on yhdistetty häntään (nuoli).(C) Useita siittiöiden häntää (nuolia) on kiinnitetty.(D) Agglutinaatiomateriaali (AS, sininen) yhdistää neljä siittiön päätä (violetti).
Pyyhkäisyelektronimikroskooppia käytettiin siittiöiden päiden havaitsemiseen eritteillä tai kalvoilla peitetyistä siittiökimppuista (kuvio 6B), mikä osoitti, että siittiökimput olivat ankkuroituja solunulkoiseen materiaaliin.Agglutinoitunut materiaali konsentroitiin siittiön päähän (meduusan pään kaltainen kokoonpano; kuva 5B) ja laajennettiin distaalisesti, jolloin fluoresenssimikroskopiassa saatiin loistavan keltainen ulkonäkö, kun se värjättiin akridiinioranssilla (kuvio 6C).Tämä aine näkyy selvästi pyyhkäisymikroskoopissa ja sitä pidetään sideaineena.Puoliohuissa leikkeissä (kuvio 5C) ja akridiinioranssilla värjätyissä siittiösoluissa näkyi siittiökimppuja, jotka sisälsivät tiheästi pakattuja päitä ja käpristyneitä häntää (kuvio 5D).
Erilaisia ​​mikrovalokuvia, joissa näkyy siittiöiden päiden ja taittuneiden pyrstöjen aggregaatiota eri menetelmillä.(A) Poikkileikkaus digitaalinen värinsiirtoelektronimikroskooppi siittiökimppusta, jossa näkyy kierretty siittiöpää, jossa on kaksiosainen ydin (sininen) ja useita flagellariosia (vihreä).(B) Digitaalinen väripyyhkäisyelektronimikroskooppivalokuva, jossa näkyy rypäle meduusan kaltaisia ​​siittiöiden päitä (nuolia), jotka näyttävät olevan peitossa.(C) Puoliohut leikkaus, jossa näkyy aggregoidut siittiöiden päät (nuolet) ja käpristyneet hännät (nuolet).(D) Mikrovalokuva akridiinioranssilla värjätystä siittiösolunäytteestä, jossa näkyy siittiöiden päiden (nuolet) ja käpristyneiden kiinnittyneiden pyrstöjen aggregaatteja (nuolet).Huomaa, että tahmea aine (S) peittää siittiön pään.(D) × 1000 suurennus.
Transmissioelektronimikroskooppia (kuvio 7A) käyttämällä havaittiin myös, että siittiöiden päät olivat kiertyneet ja ytimet olivat spiraalin muotoisia, minkä varmistivat akridiinioranssilla värjätty ja fluoresenssimikroskopiaa käyttäen tutkitut siittiönäytteet (kuvio 7B).
(A) Digitaalinen värinsiirtoelektronimikroskooppi ja (B) akridiinioranssilla värjätty siittiönäyte, jossa näkyy kiertyneet päät ja siittiöiden päiden ja pyrstöjen kiinnittyminen (nuolet).(B) × 1000 suurennus.
Mielenkiintoinen havainto on, että Sharkazin siittiöt aggregoituvat muodostaen liikkuvia rihmamaisia ​​nippuja.Näiden nippujen ominaisuuksien avulla voimme ymmärtää niiden mahdollisen roolin siittiöiden imeytymisessä ja varastoinnissa SST:ssä.
Pariutumisen jälkeen siittiöt tulevat emättimeen ja läpikäyvät intensiivisen valintaprosessin, jolloin vain rajoitettu määrä siittiöitä pääsee SST15,16.Tähän mennessä mekanismit, joilla siittiöt saapuvat ja poistuvat SST:stä, ovat epäselviä.Siipikarjassa siittiöitä säilytetään SST:ssä pidennetyn 2–10 viikon ajan lajista riippuen6.Siemennesteen tilasta SST:ssä säilytyksen aikana on edelleen kiistaa.Ovatko ne liikkeessä vai levossa?Toisin sanoen, kuinka siittiösolut säilyttävät asemansa SST:ssä niin kauan?
Forman4 ehdotti, että SST:n oleskelu ja ejektio voitaisiin selittää siittiöiden liikkuvuudella.Kirjoittajat olettavat, että siittiöt säilyttävät asemansa uimalla SST-epiteelin luomaa nestevirtausta vastaan ​​ja että siittiöt irtoavat SST:stä, kun niiden nopeus laskee alle pisteen, jossa ne alkavat liikkua taaksepäin energian puutteen vuoksi.Zaniboni5 vahvisti akvaporiinien 2, 3 ja 9 läsnäolon SST-epiteelisolujen apikaalisessa osassa, mikä saattaa epäsuorasti tukea Foremanin siittiöiden varastointimallia.Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että lähes puolet Sharkashin siittiöistä osoittaa positiivista reologiaa virtaavassa nesteessä ja että agglutinoituneet siittiökimput lisäävät positiivista reologiaa osoittavien siittiöiden määrää, vaikka agglutinaatio hidastaa niitä.Sitä, kuinka siittiösolut kulkevat linnun munanjohtimia pitkin hedelmöityskohtaan, ei täysin ymmärretä.Nisäkkäillä follikulaarinen neste kemoatttelee siittiöitä.Kemoattraktanttien uskotaan kuitenkin ohjaavan siittiöitä lähestymään pitkiä matkoja7.Siksi muut mekanismit ovat vastuussa siittiöiden kuljetuksesta.Siittiöiden kyvyn orientoitua ja virrata parittelun jälkeen vapautuvaa munanjohdinnestettä vasten on raportoitu olevan tärkeä tekijä siittiöiden kohdistamisessa hiirissä.Parker 17 ehdotti, että siittiöt ylittävät munanjohdet uivat vasten lintujen ja matelijoiden sädevirtausta.Vaikka sitä ei ole kokeellisesti osoitettu linnuilla, Adolphi18 havaitsi ensimmäisenä, että lintujen siittiö antaa positiivisia tuloksia, kun ohut nestekerros peitinlasin ja objektilasin väliin muodostetaan suodatinpaperinauhalla.Reologia.Hino ja Yanagimachi [19] asettivat hiiren munasarja-munaputki-kohdun kompleksin perfuusiorenkaaseen ja ruiskuttivat 1 µl mustetta kannakseen nesteen virtauksen visualisoimiseksi munanjohtimissa.He havaitsivat munanjohtimessa erittäin aktiivisen supistumis- ja rentoutumisliikkeen, jossa kaikki mustepallot liikkuivat tasaisesti kohti munanjohtimen ampullaa.Kirjoittajat korostavat munanjohtimen nesteen virtauksen merkitystä alemmasta munanjohtimien yläosaan siittiöiden kohoamisen ja hedelmöittymisen kannalta.Brillard20 raportoi, että kanoissa ja kalkkunoissa siittiöt liikkuvat aktiivisesti emättimen sisäänkäynnistä, jossa ne säilytetään, kohdun ja emättimen liitoskohtaan, jossa ne säilytetään.Tätä liikettä ei kuitenkaan vaadita kohdun vaginaalisen liitoksen ja infundibulumin välillä, koska siittiöt kuljetetaan passiivisen siirtymän avulla.Nämä aikaisemmat suositukset ja tässä tutkimuksessa saadut tulokset tuntemalla voidaan olettaa, että siittiöiden kyky liikkua ylävirtaan (reologia) on yksi valintaprosessin perustana olevista ominaisuuksista.Tämä määrittää siittiöiden kulkemisen emättimen läpi ja niiden pääsyn CCT:hen varastointia varten.Kuten Forman4 ehdotti, tämä voi myös helpottaa prosessia, jossa siittiöt saapuvat SST:hen ja sen elinympäristöön jonkin aikaa ja poistuvat sitten, kun niiden nopeus alkaa hidastua.
Toisaalta Matsuzaki ja Sasanami 21 ehdottivat, että lintujen siittiöiden liikkuvuus muuttuu lepotilasta liikkuvuuteen uros- ja naaraspuolisissa lisääntymisväylissä.SST:ssä pysyvän siittiöiden liikkuvuuden estämisen on ehdotettu selittävän siittiöiden pitkän säilytysajan ja sitten nuorentumisen SST:stä poistumisen jälkeen.Hypoksisissa olosuhteissa Matsuzaki et ai.1 raportoi korkeasta laktaatin tuotannosta ja vapautumisesta SST:ssä, mikä voi johtaa siittiöiden liikkuvuuden estymiseen.Tässä tapauksessa siittiöiden reologian merkitys näkyy siittiöiden valinnassa ja imeytymisessä, ei niiden varastoinnissa.
Siittiöiden agglutinaatiomallia pidetään uskottavana selityksenä siittiöiden pitkälle säilytysajalle SST:ssä, koska tämä on yleinen malli siittiöiden pidättymisestä siipikarjassa2,22,23.Bakst et ai.2 havaitsi, että suurin osa siittiöistä kiinnittyi toisiinsa muodostaen fascikulaarisia aggregaatteja, ja yksittäisiä siittiöitä löydettiin harvoin viiriäisen CCM:stä.Toisaalta Wen et ai.24 havaitsi enemmän hajallaan olevia siittiöitä ja vähemmän siittiöitä SST-ontelossa kanoilla.Näiden havaintojen perusteella voidaan olettaa, että taipumus siittiöiden agglutinaatioon vaihtelee lintujen ja samassa siemensyöksyssä olevien siittiöiden välillä.Lisäksi Van Krey et ai.9 ehdotti, että agglutinoituneiden siittiöiden satunnainen dissosiaatio on vastuussa siittiöiden asteittaisesta tunkeutumisesta munanjohdin onteloon.Tämän hypoteesin mukaan siittiöt, joilla on pienempi agglutinaatiokyky, tulisi ensin poistaa SST:stä.Tässä yhteydessä siittiöiden kyky agglutinoitua voi olla tekijä, joka vaikuttaa siittiöiden kilpailun lopputulokseen likaisissa linnuissa.Lisäksi mitä kauemmin agglutinoitunut siittiö dissosioituu, sitä pidempään hedelmällisyys säilyy.
Vaikka siittiöiden aggregoitumista ja aggregoitumista nippuihin on havaittu useissa tutkimuksissa 2, 22, 24, niitä ei ole kuvattu yksityiskohtaisesti, koska niiden kinemaattinen havainnointi on monimutkainen SST: ssä.On tehty useita yrityksiä tutkia siittiöiden agglutinaatiota in vitro.Laajaa mutta ohimenevää aggregaatiota havaittiin, kun ohut lanka poistettiin roikkuvasta siemenpisarasta.Tämä johtaa siihen, että pisarasta työntyy esiin pitkänomainen kupla, joka jäljittelee siemenrauhasta.3D-rajoitusten ja lyhyiden tippukuivausaikojen vuoksi koko lohko rapistui nopeasti9.Tässä tutkimuksessa pystyimme kuvaamaan Sharkashi-kanojen ja mikrofluidisirujen avulla, kuinka nämä kimput muodostuvat ja kuinka ne liikkuvat.Siittiökimppuja muodostui välittömästi siemennesteen keräämisen jälkeen, ja niiden havaittiin liikkuvan kierteessä osoittaen positiivista reologiaa, kun niitä oli virrassa.Lisäksi makroskooppisesti tarkasteltuna siittiökimppujen on havaittu lisäävän liikkuvuuden lineaarisuutta verrattuna eristettyihin siittiöihin.Tämä viittaa siihen, että siittiöiden agglutinaatiota voi tapahtua ennen SST:n tunkeutumista ja että siittiöiden tuotanto ei rajoitu pienelle alueelle stressin vuoksi, kuten aiemmin ehdotettiin (Tingari ja Lake12).Kimppumuodostuksen aikana siittiöt uivat synkronisesti, kunnes ne muodostavat risteyksen, sitten niiden hännät kietoutuvat toistensa ympärille ja siittiön pää pysyy vapaana, mutta siittiön häntä ja distaalinen osa tarttuvat yhteen tahmealla aineella.Siksi nivelsiteen vapaa pää on vastuussa liikkeestä, vetämällä loput nivelsiteestä.Siittiökimppujen pyyhkäisyelektronimikroskooppi osoitti kiinnittyneitä siittiöiden päitä, jotka oli peitetty paljon tahmealla materiaalilla, mikä viittaa siihen, että siittiöpäät olivat kiinnittyneet lepääviin nippuihin, mikä saattoi tapahtua varastointipaikalle (SST) saapumisen jälkeen.
Kun siittiönäyte värjätään akridiinioranssilla, siittiösolujen ympärillä oleva solunulkoinen liimamateriaali voidaan nähdä fluoresoivassa mikroskoopissa.Tämän aineen ansiosta siittiökimput voivat kiinnittyä ja tarttua ympäröiviin pintoihin tai hiukkasiin, jotta ne eivät ajaudu ympäröivän virtauksen mukana.Näin ollen havainnot osoittavat siittiöiden adheesion roolin liikkuvien kimppujen muodossa.Niiden kyky uida vastaan ​​virtaa ja tarttua lähellä oleviin pintoihin mahdollistaa siittiöiden pysymisen pidempään SST:ssä.
Rothschild25 käytti hemosytometriakameraa naudan siemennesteen kelluvan jakautumisen tutkimiseen suspensiopisarassa ottamalla mikrovalokuvia kameran läpi, jossa oli sekä pysty- että vaakasuuntainen mikroskoopin optinen akseli.Tulokset osoittivat, että siittiöt vetivät puoleensa kammion pintaa.Kirjoittajat ehdottavat, että siittiöiden ja pinnan välillä voi olla hydrodynaamisia vuorovaikutuksia.Kun tämä otetaan huomioon, sekä Sharkashi-poikien siemennesteen kyky muodostaa tahmeita kimppuja, se voi lisätä todennäköisyyttä, että siemenneste tarttuu SST-seinään ja säilyy pitkiä aikoja.
Bccetti ja Afzeliu26 raportoivat, että siittiöiden glykokaliksia tarvitaan sukusolujen tunnistamiseen ja agglutinaatioon.Forman10 havaitsi, että glykoproteiini-glykolipidipäällysteiden α-glykosidisidosten hydrolyysi käsittelemällä linnun siemennestettä neuraminidaasilla johti heikentyneeseen hedelmällisyyteen vaikuttamatta siittiöiden liikkuvuuteen.Kirjoittajat ehdottavat, että neuraminidaasin vaikutus glykokaliksiin heikentää siittiöiden sekvestraatiota kohdun ja emättimen liitoksessa, mikä vähentää hedelmällisyyttä.Heidän havainnot eivät voi sivuuttaa mahdollisuutta, että neuraminidaasihoito voi vähentää siittiöiden ja munasolujen tunnistamista.Forman ja Engel10 havaitsivat, että hedelmällisyys heikkeni, kun kanoja siemennettiin emättimensisäisesti neuraminidaasilla käsitellyllä siemennesteellä.IVF neuraminidaasilla käsitellyllä siittiöllä ei kuitenkaan vaikuttanut hedelmällisyyteen verrattuna kontrollikanoihin.Kirjoittajat päättelivät, että muutokset siittiöiden kalvoa ympäröivässä glykoproteiini-glykolipidipäällysteessä heikensivät siittiöiden hedelmöittymiskykyä heikentämällä siittiöiden sekvestraatiota kohdun ja emättimen liitoskohdassa, mikä puolestaan ​​lisäsi siittiöiden häviämistä kohdun ja emättimen liitoksen nopeuden vuoksi, mutta ei vaikuta siittiöiden ja munasolujen tunnistamiseen.
Kalkkunoissa Bakst ja Bauchan 11 löysi pieniä rakkuloita ja kalvofragmentteja SST:n ontelosta ja havaitsi, että osa näistä rakeista oli fuusioitunut siittiökalvon kanssa.Kirjoittajat ehdottavat, että nämä suhteet voivat edistää siittiöiden pitkäaikaista varastointia SST:ssä.Tutkijat eivät kuitenkaan täsmentäneet näiden hiukkasten lähdettä, olivatko ne CCT-epiteelisolujen erittämiä, miehen lisääntymisjärjestelmän tuottamia ja erittämiä vai siittiöiden itsensä tuottamia.Myös nämä hiukkaset ovat vastuussa agglutinaatiosta.Grützner et al27 raportoivat, että lisäkivesepiteelisolut tuottavat ja erittävät spesifistä proteiinia, jota tarvitaan yksihuokosisten siementeiden muodostumiseen.Kirjoittajat raportoivat myös, että näiden nippujen dispersio riippuu lisäkivesproteiinien vuorovaikutuksesta.Nixon ym.28 havaitsivat, että adnexa erittää proteiinia, hapanta kysteiiniä sisältävää osteonektiiniä;SPARC osallistuu siittiokimppujen muodostumiseen lyhytnokkaisissa echidnasissa ja vesinokkakoissa.Näiden säteiden sironta liittyy tämän proteiinin häviämiseen.
Tässä tutkimuksessa ultrarakenneanalyysi elektronimikroskopiaa käyttäen osoitti, että siittiöt tarttuivat suureen määrään tiheää materiaalia.Näiden aineiden uskotaan olevan vastuussa agglutinaatiosta, joka tiivistyy kiinnittyneiden päiden väliin ja ympärille, mutta pienemmillä pitoisuuksilla hännän alueella.Oletamme, että tämä agglutinoiva aine erittyy miehen lisääntymisjärjestelmästä (epididymis tai vas deferens) siemennesteen mukana, koska havaitsemme usein siemennesteen erottuvan imusolmukkeesta ja siemennesteen plasmasta siemensyöksyssä.On raportoitu, että kun linnun siittiöt kulkevat lisäkiveksen ja verisuonten läpi, ne läpikäyvät kypsymiseen liittyviä muutoksia, jotka tukevat niiden kykyä sitoa proteiineja ja hankkia plasman lemmaan liittyviä glykoproteiineja.Näiden proteiinien pysyvyys SST:ssä olevilla siittiöiden kalvoilla viittaa siihen, että nämä proteiinit voivat vaikuttaa siittiökalvon stabiiliuden saavuttamiseen 30 ja määrittää niiden hedelmällisyyden 31 .Ahammad et al32 raportoivat, että urospuolisten lisääntymisjärjestelmän eri osista (kiveksistä distaaliseen suonikalvoon) saadut siittiöt osoittivat asteittaista elinkelpoisuuden kasvua nestemäisissä säilytysolosuhteissa säilytyslämpötilasta riippumatta, ja kanojen elinkelpoisuus lisääntyy myös munanjohtimissa keinosiemennyksen jälkeen.
Sharkashi-kanan siittiökimpuilla on erilaiset ominaisuudet ja toiminnot kuin muilla lajeilla, kuten echidnasilla, vesinokkakoilla, metsähiirillä, hirvirotilla ja marsuilla.Sharkasi-kanoilla siittiökimppujen muodostuminen hidasti niiden uintinopeutta verrattuna yksittäisiin siittiöihin.Nämä niput lisäsivät kuitenkin reologisesti positiivisten siittiöiden prosenttiosuutta ja lisäsivät siittiöiden kykyä stabiloida itseään dynaamisessa ympäristössä.Siten tuloksemme vahvistavat aiemman ehdotuksen, jonka mukaan siittiöiden agglutinaatio SST:ssä liittyy pitkäaikaiseen siittiöiden varastointiin.Oletamme myös, että siittiöiden taipumus muodostaa kimppuja voi kontrolloida siittiöiden häviämisnopeutta SST:ssä, mikä voi muuttaa siittiöiden kilpailun lopputulosta.Tämän oletuksen mukaan siittiöt, joilla on alhainen agglutinaatiokyky, vapauttavat SST:n ensin, kun taas siittiöt, joilla on korkea agglutinaatiokyky, tuottavat suurimman osan jälkeläisistä.Yksihuokosisten siittiokimppujen muodostuminen on hyödyllistä ja vaikuttaa vanhempien ja lasten väliseen suhteeseen, mutta käyttää eri mekanismia.Echidnasissa ja vesinokkakoissa siittiöt on sijoitettu yhdensuuntaisesti toistensa kanssa lisäämään säteen eteenpäinkulkunopeutta.Echidnas-kimput liikkuvat noin kolme kertaa nopeammin kuin yksittäiset siittiöt.Uskotaan, että tällaisten siittiökimppujen muodostuminen echidnasissa on evoluution mukainen sopeutuminen hallitsevan aseman ylläpitämiseen, koska naaraat ovat sivistynyttä ja yleensä parittelevat useiden urosten kanssa.Siksi eri siemensyöksyistä peräisin olevat siittiöt kilpailevat kiivaasti munasolun hedelmöityksestä.
Sharkasi-kanojen agglutinoituneet siittiöt on helppo visualisoida faasikontrastimikroskopialla, jota pidetään edullisena, koska sen avulla on helppo tutkia siittiöiden käyttäytymistä in vitro.Mekanismi, jolla siittiötupun muodostuminen edistää sharkasi-kanojen lisääntymistä, on myös erilainen kuin joissakin istukan nisäkkäissä, jotka edustavat yhteistyökykyistä siittiökäyttäytymistä, kuten metsähiirissä, joissa osa siittiöistä saavuttaa munat auttaen muita sukulaisia ​​saavuttamaan ja vahingoittamaan munia.todistaaksesi itsesi.altruistista käytöstä.Itsehedelmöitys 34. Toinen esimerkki yhteistoiminnallisesta käyttäytymisestä siittiöissä löydettiin hirvihiiristä, joissa siittiöt pystyivät tunnistamaan ja yhdistymään geneettisesti sukulaisimpien siittiöiden kanssa ja muodostamaan yhteistoiminnallisia ryhmiä lisätäkseen nopeuttaan verrattuna muihin siittiöihin35.
Tässä tutkimuksessa saadut tulokset eivät ole ristiriidassa Fomanin teorian kanssa siittiöiden pitkäaikaisesta varastoinnista SWS:ssä.Tutkijat raportoivat, että siittiösolut jatkavat liikkumista SST:tä peittävien epiteelisolujen virtauksessa pitkän aikaa, ja tietyn ajan kuluttua siittiösolujen energiavarastot tyhjenevät, mikä johtaa nopeuden laskuun, mikä mahdollistaa pienmolekyylipainoisten aineiden karkottamisen.siittiöiden energia nesteen virtauksen kanssa SST:n ontelosta Munanjohtimen ontelo.Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että puolet yksittäisistä siittiöistä osoitti kykyä uida vastaan ​​virtaavia nesteitä, ja niiden tarttuminen nippuun lisäsi niiden kykyä osoittaa positiivista reologiaa.Lisäksi tietomme ovat yhdenmukaisia ​​Matsuzakin et al.1, joka ilmoitti, että lisääntynyt laktaatin eritys SST:ssä voi estää siittiöiden liikkuvuutta.Tuloksemme kuvaavat kuitenkin siittiöiden liikkuvien nivelsiteiden muodostumista ja niiden reologista käyttäytymistä mikrokanavan sisällä olevan dynaamisen ympäristön läsnä ollessa yrittäessään selvittää niiden käyttäytymistä SST:ssä.Tulevaisuuden tutkimus voi keskittyä agglutinoivan aineen kemiallisen koostumuksen ja alkuperän määrittämiseen, mikä epäilemättä auttaa tutkijoita kehittämään uusia tapoja varastoida nestemäistä siemennestettä ja pidentää hedelmällisyyden kestoa.
Viisitoista 30 viikon ikäistä paljaskaulaista urossharkasia (homotsygoottinen dominantti; Na Na) valittiin siittiöiden luovuttajiksi tutkimukseen.Lintuja kasvatettiin Ashitin yliopiston maataloustieteellisen tiedekunnan tutkimussiipikarjatilalla, Ashit Governoratessa, Egyptissä.Linnut pidettiin yksittäisissä häkeissä (30 x 40 x 40 cm), niille kohdistettiin valoohjelma (16 tuntia valoa ja 8 tuntia pimeyttä) ja niille ruokittiin ruokavaliota, joka sisälsi 160 g raakaproteiinia, 2800 kcal metaboloituvaa energiaa ja 35 g kalsiumia.5 grammaa saatavilla olevaa fosforia kiloa kohden.
Tietojen 36, 37 mukaan siemennestettä kerättiin miehiltä vatsahieronnalla.Yhteensä 45 siemennäytettä kerättiin 15 mieheltä kolmen päivän aikana.Siemenneste (n = 15/päivä) laimennettiin välittömästi suhteessa 1:1 (tilavuus:tilavuus) Belsville Poultry Semen Diluent -liuoksella, joka sisältää kaliumdifosfaattia (1,27 g), mononatriumglutamaattimonohydraattia (0,867 g), fruktoosia (0,5 d) vedetöntä natriumia.asetaatti (0,43 g), tris(hydroksimetyyli)aminometaani (0,195 g), kaliumsitraattimonohydraatti (0,064 g), kaliummonofosfaatti (0,065 g), magnesiumkloridi (0,034 g) ja H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaarisuus 3 3 kg/m8/3Laimennetut siemennestenäytteet tutkittiin ensin valomikroskoopilla hyvän siemennesteen laadun (kosteuden) varmistamiseksi ja säilytettiin sitten vesihauteessa 37 °C:ssa käyttöön asti puolen tunnin sisällä keräämisestä.
Siittiöiden kinematiikkaa ja reologiaa kuvataan käyttämällä mikrofluidilaitteiden järjestelmää.Siemennestenäytteet laimennettiin edelleen suhteeseen 1:40 Beltsville Avian Semen Diluentissa, ladattiin mikrofluidilaitteeseen (katso alla), ja kineettiset parametrit määritettiin käyttämällä tietokoneistettua siemennesteen analyysijärjestelmää (CASA), joka oli aiemmin kehitetty mikrofluidiikan karakterisointiin.siittiöiden liikkuvuudesta nestemäisessä väliaineessa (konetekniikan laitos, tekniikan tiedekunta, Assiut University, Egypti).Laajennuksen voi ladata osoitteesta: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Käyränopeus (VCL, μm/s), lineaarinen nopeus (VSL, μm/s) ja keskimääräinen liikeratanopeus (VAP, μm/s) mitattiin.Videoita siittiöistä otettiin käyttämällä käänteistä Optika XDS-3 -vaihekontrastimikroskooppia (jossa 40x objektiivi), joka oli yhdistetty Tucson ISH1000 -kameraan nopeudella 30 fps 3 sekunnin ajan.Käytä CASA-ohjelmistoa tutkiaksesi vähintään kolme aluetta ja 500 siittiön liikerataa näytettä kohti.Tallennettu video on käsitelty kotitekoisella CASA:lla.CASA-liitännäisen liikkuvuuden määritelmä perustuu siittiöiden uintinopeuteen verrattuna virtausnopeuteen, eikä se sisällä muita parametreja, kuten sivuttaisliikettä, koska sen on todettu olevan luotettavampi nestevirtauksessa.Reologista liikettä kuvataan siittiöiden liikkeeksi nesteen virtaussuuntaa vastaan.Siittiöt, joilla on reologisia ominaisuuksia, jaettiin liikkuvien siittiöiden lukumäärällä;levossa olleet siittiöt ja konvektiivisesti liikkuvat siittiöt jätettiin pois laskennasta.
Kaikki käytetyt kemikaalit hankittiin Elgomhoria Pharmaceuticalsilta (Kairo, Egypti), ellei toisin mainita.Laite valmistettiin julkaisussa El-sherry et ai.40 pienin muutoksin.Mikrokanavien valmistukseen käytettyjä materiaaleja olivat lasilevyt (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatiivinen resist (MicroChem, Newton, CA), diasetonialkoholi (Sigma Aldrich, Steinheim, Saksa) ja polyasetoni.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanavat valmistetaan pehmeällä litografialla.Ensin korkearesoluutioiselle tulostimelle (Prismatic, Kairo, Egypti ja Pacific Arts and Design, Markham, ON) painettiin kirkas suojakasvomaski halutulla mikrokanavasuunnittelulla.Mestarit valmistettiin lasilevyillä substraattina.Levyt puhdistettiin asetonissa, isopropanolissa ja deionisoidussa vedessä ja päällystettiin sitten 20 um:n SU8-25-kerroksella spin-pinnoituksella (3000 rpm, 1 min).SU-8-kerrokset kuivattiin sitten varovasti (65 °C, 2 min ja 95 °C, 10 min) ja altistettiin UV-säteilylle 50 sekunnin ajan.Altistuksen jälkeinen paista 65 °C:ssa ja 95 °C:ssa 1 minuutin ja 4 minuutin ajan paljaiden SU-8-kerrosten silloittamiseksi, minkä jälkeen kehitetään diasetonialkoholissa 6,5 ​​minuuttia.Paista vohvelit kovaksi (200°C 15 min) SU-8-kerroksen jähmettämiseksi edelleen.
PDMS valmistettiin sekoittamalla monomeeri ja kovetin painosuhteessa 10:1, sitten poistettiin kaasut tyhjiöeksikkaattorissa ja kaadettiin SU-8-päärunkoon.PDMS kovetettiin uunissa (120 °C, 30 min), sitten kanavat leikattiin pois, erotettiin isännästä ja rei'itettiin, jotta putket voidaan kiinnittää mikrokanavan sisään- ja ulostuloon.Lopuksi PDMS-mikrokanavat kiinnitettiin pysyvästi mikroskoopin objektilaseihin käyttämällä kannettavaa koronaprosessoria (Electro-Technic Products, Chicago, IL), kuten muualla on kuvattu.Tässä tutkimuksessa käytetyn mikrokanavan mitat ovat 200 µm × 20 µm (L × K) ja se on 3,6 cm pitkä.
Hydrostaattisen paineen aiheuttama nestevirtaus mikrokanavan sisällä saavutetaan pitämällä nestetaso tulosäiliössä poistosäiliön korkeuseron Δh39 yläpuolella (kuva 1).
missä f on kitkakerroin, joka määritellään f = C/Re laminaarivirtaukselle suorakulmaisessa kanavassa, jossa C on vakio kanavan kuvasuhteesta riippuen, L on mikrokanavan pituus, Vav on keskinopeus mikrokanavan sisällä, Dh on kanavan hydraulinen halkaisija, g – painovoiman kiihtyvyys.Tätä yhtälöä käyttämällä keskimääräinen kanavan nopeus voidaan laskea käyttämällä seuraavaa yhtälöä: