Kiitos vierailustasi Nature.comissa. Käyttämäsi selainversio tukee rajoitetusti CSS:ää. Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan Internet Explorerissa). Tällä välin tuen jatkamisen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Huokoisia piidioksidihiukkasia valmistettiin sooli-geeli-menetelmällä ja joitain modifikaatioita makrohuokoisten hiukkasten saamiseksi. Nämä hiukkaset derivatisoitiin reversiibelillä additiofragmentointiketjunsiirrolla (RAFT) -polymeroinnilla N-fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaatilla (PMI) ja styreenillä N-fenyylimaleimidi-kolonnien interkalaatioon (PMP-polystyreenin interkalaatio) 00 × 1,8 mm id) pakattiin lietepakkauksella. Arvioitu PMP-pylväserotus peptidiseoksesta, joka koostuu viidestä peptidistä (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusiinin albumiinin optimaalinen digestio (HA:n seerumikromatografinen enkefaliini). , peptidiseoksen teoreettinen levymäärä on jopa 280 000 levyä/m². Verrattaessa kehitetyn kolonnin erotuskykyä kaupalliseen Ascentis Express RP-Amide -kolonniin havaittiin, että PMP-kolonnin erotuskyky oli parempi kuin kaupallisen kolonnin erotustehokkuuden ja -resoluution suhteen.
Biolääketeollisuudesta on viime vuosina muodostunut kasvavat globaalit markkinat, joilla markkinaosuus on kasvanut merkittävästi. Biolääketeollisuuden räjähdysmäisen kasvun myötä peptidien ja proteiinien analysointi on erittäin toivottavaa. Peptidisynteesin aikana syntyy kohdepeptidin lisäksi useita epäpuhtauksia, jotka edellyttävät proteiinien kromatografiaa ja puhdistuksen kromatografiaa ja puhdistusta. kudokset ja solut on äärimmäisen haastava tehtävä, koska yhdessä näytteessä on suuri määrä mahdollisesti havaittavissa olevia lajeja. Vaikka massaspektrometria on tehokas työkalu peptidien ja proteiinien sekvensointiin, jos tällaiset näytteet injektoidaan massaspektrometriin yhdellä kierrolla, erottelu ei ole ihanteellinen. Tätä ongelmaa voidaan lieventää toteuttamalla nestekromatografia (LC) joka alentaa massaerottelun määrää ennen MS-analyysiä. annettu aika4,5,6.Lisäksi nestefaasierottamisen aikana analyytit voidaan fokusoida kapeille alueille, jolloin nämä analyytit väkevöidään ja MS-detektioherkkyys paranee.Nestekromatografia (LC) on kehittynyt merkittävästi viimeisen vuosikymmenen aikana ja siitä on tullut suosittu tekniikka proteomisessa analyysissä7,8,9,10.
Käänteisfaasinestekromatografiaa (RP-LC) käytetään laajalti peptidiseosten puhdistukseen ja erottamiseen käyttämällä oktadekyylimodifioitua piidioksidia (ODS) stationaarifaasina11,12,13. RP-stationaarifaasit eivät kuitenkaan tarjoa tyydyttävää peptidien ja proteiinien erottelua niiden 4-muotoisen monimutkaisen1 erityisrakenteen5 ja amfifiilisen rakenteensa vuoksi. tarvitaan analysoimaan peptidejä ja proteiineja, joissa on polaarisia ja ei-polaarisia osia, jotta ne ovat vuorovaikutuksessa näiden analyyttien kanssa ja säilyttävät ne ,20,21.Mixed mode stationäärifaasit (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaarinen interkalaatio/RPLC) soveltuvat peptidien ja proteiinien erottamiseen, koska niissä on sekä polaarisia että ei-polaarisia ryhmiä. -polaariset analyytit, koska erotus riippuu analyytin ja stationaarifaasin välisestä vuorovaikutuksesta.Multimodaaliset vuorovaikutukset 29, 30, 31, 32. Äskettäin Zhang et ai.30 valmisti dodekyylipäätteisen polyamiinin stationaarifaasin ja erotti onnistuneesti hiilivedyt, masennuslääkkeet, flavonoidit, nukleosidit, estrogeenit ja useat muut analyytit. Polaarisessa interkalaattorissa on sekä polaarisia että ei-polaarisia ryhmiä, joten sitä voidaan käyttää erottamaan peptidejä ja proteiineja, joissa on sekä hydrofobisia että hydrofiilisiä pylväsosia. ovat kaupallisesti saatavilla kauppanimellä Ascentis Express RP-Amide pylväitä, mutta näitä pylväitä käytetään vain amiinin 33 analysointiin.
Tässä tutkimuksessa valmistettiin polaarisesti upotettu stationäärifaasi (N-fenyylimaleimidiin upotettu polystyreeni) ja arvioitiin HSA:n peptidien ja trypsiinidigestien erottaminen. Stationaarifaasi valmistettiin seuraavaa strategiaa käyttäen. Huokoisia piidioksidihiukkasia valmistettiin edellisessä julkaisussamme esitetyn menettelyn mukaisesti, jossa on joitakin muutoksia valmisteen polyTMOS-protokollaan, glyyleenin suhde EG. etikkahappoa säädettiin valmistamaan suuren huokoskoon omaavia piidioksidihiukkasia. Toiseksi uusi ligandi, fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaatti, syntetisoitiin ja sitä käytettiin piidioksidihiukkasten derivatisoimiseen polaarisen upotetun stationaarifaasin valmistamiseksi. Tuloksena oleva stationäärinen faasi pakattiin mekaaniseen pakkauskaavioon ruostumattomasta teräksestä valmistetun pylvään optimoimiseksi. pylvääseen muodostuu homogeeninen kerros. Arvioi viidestä peptidistä koostuvien peptidiseosten pakatun kolonnin erottelu;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusiinienkefaliini) ja ihmisen seerumin albumiinin trypsiinidigestio (HAS). Peptidiseoksen ja HSA:n trypsiinidigestion havaittiin erottuvan hyvällä resoluutiolla ja tehokkuudella. ja proteiinien havaittiin erottuvan hyvin ja olevan tehokkaita PMP-kolonnilla, joka oli tehokkaampi kuin Ascentis Express RP-Amide -kolonni.
PEG (polyetyleeniglykoli), urea, etikkahappo, trimetoksiortosilikaatti (TMOS), trimetyylikloorisilaani (TMCS), trypsiini, ihmisen seerumialbumiini (HSA), ammoniumkloridi, urea, heksaani metyylidisilatsaani (HMDS), metakryloyyli-SPOtyreeni, bentsoyylikloridi (MCTEPOTYM, -4--4). ), HPLC-luokan asetonitriili (ACN), metanoli, 2-propanoli ja asetoni, ostettu Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA).
Seosta, jossa oli ureaa (8 g), polyetyleeniglykolia (8 g) ja 8 ml 0,01 N etikkahappoa, sekoitettiin 10 minuuttia, ja sitten siihen lisättiin 24 ml TMOS:a jääkylmissä olosuhteissa. Reaktioseosta kuumennettiin 40 °C:ssa autossa 6 tuntia ja sitten 120 °C:ssa, ja terästä poistettiin 8 tuntia. kuivattiin 70 °C:ssa 12 tuntia. Kuivattu pehmeä massa jauhettiin tasaiseksi uunissa ja kalsinoitiin 550 °C:ssa 12 tuntia. Valmistettiin kolme erää ja karakterisoitiin toistettavuuden tutkimiseksi hiukkaskoon, huokoskoon ja pinta-alan suhteen.
Muokkaamalla piidioksidihiukkasten pinta esisyntetisoidulla ligandilla fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaatilla (PCMP), mitä seurasi säteittäinen polymerointi styreenillä, valmistettiin polaarista ryhmää sisältävä yhdiste.Kiinteä faasi kiviaineksille ja polystyreeniketjuille. Valmistusprosessi on kuvattu alla.
N-fenyylimaleimidi (200 mg) ja metyylivinyyli-isosyanaatti (100 mg) liuotettiin kuivaan tolueeniin ja reaktiopulloon lisättiin 0,1 ml 2,2'-atsoisobutyronitriiliä (AIBN) fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaatti-kopolymeerin valmistamiseksi, ja seos kuumennettiin 3 °C:ssa, 6 °C:ssa. uunissa 40°C 3 tuntia.
Kuivatut piidioksidihiukkaset (2 g) dispergoitiin kuivaan tolueeniin (100 ml), sekoitettiin ja sonikoitiin 500 ml:n pyöreäpohjaisessa pullossa 10 minuuttia. PMCP (10 mg) liuotettiin tolueeniin ja lisättiin tipoittain reaktiopulloon tiputussuppilon kautta. Seosta kuivattiin palautusjäähdyttäen 100 °C:ssa ja suodatettiin 6 tuntia. Sen jälkeen PMCP-sidotut piidioksidihiukkaset (100 g) liuotettiin tolueeniin (200 ml) ja lisättiin 4-hydroksi-TEMPO:ta (2 ml), kun läsnä oli 100 ui dibutyylitinadilauraattia katalyyttinä. Seosta sekoitettiin 50 °C:ssa ja kuivattiin 8 tuntia, suodatettiin 0 °C:ssa.
Styreeni (1 ml), bentsoyyliperoksidi BPO (0,5 ml) ja TEMPO-PMCP:hen kiinnitetyt piidioksidipartikkelit (1,5 g) dispergoitiin tolueeniin ja huuhdeltiin typellä. Styreenin polymerointi suoritettiin 100 °C:ssa 12 tunnin ajan. Tuloksena oleva tuote pestiin yön yli 6 °C:ssa metanolissa. Kuva 0 °C.
Näytteistä poistettiin kaasut 393 K:n lämpötilassa 1 tunnin ajan alle 10-3 Torrin jäännöspaineen saamiseksi. Suhteellisella paineella P/P0 = 0,99 adsorboituneen N2:n määrää käytettiin kokonaishuokostilavuuden määrittämiseen. Paljaiden ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten morfologiaa tutkittiin käyttämällä Japani-skannauselektroniikkaa (TokoDokycopylogiita, TooDokycopynäytettä). (paljaat piidioksidit ja ligandisidotut piidioksidihiukkaset) asetettiin alumiinipylvääseen käyttämällä tarrahiiliteippiä. Näytteille pinnoitettiin kultaa käyttämällä Q150T-sputteripäällystyslaitetta ja näytteille kerrostettiin 5 nm:n Au-kerros. Tämä parantaa prosessin tehokkuutta käyttämällä alhaisia ​​jännitteitä ja tarjoaa hienojakoisen, kylmän sputteroinnin. Alkuaineanalyysiin käytettiin r:tä. Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 -hiukkaskokoanalysaattoria käytettiin hiukkaskokojakauman määrittämiseen. Paljaat piidioksidihiukkaset ja ligandiin sitoutuneet piidioksidihiukkaset (5 mg kumpaakin) dispergoitiin 5 ml:aan isopropanolia, sonikoitiin 10 minuutin ajan Mastersicaliin ja sonikoitiin 5 min. ravimetrinen analyysi suoritettiin nopeudella 5 °C minuutissa lämpötila-alueella 30-800 °C.
Lasivuoratut ruostumattomasta teräksestä valmistetut kapeareikäiset kolonnit, joiden mitat (100 × 1,8 mm id) pakattiin käyttämällä lietepakkausmenetelmää, käyttäen samaa menetelmää, jota käytettiin viitteessä.31. Ruostumattomasta teräksestä valmistettu kolonni (lasivuorattu, sisähalkaisija 100 × 1,8 mm), jossa oli 1 µm:n fritti, liitettiin lietteen pakkaajaan (Alltech Deerfield, IL, USA). Valmista kiinteän faasin liete suspendoimalla 150 mg:aa. lietteen liuottimena sekä työntöliuottimena. Täytä kolonni peräkkäin käyttämällä painetta 100 MP 10 minuuttia, 80 MP 15 minuuttia ja 60 MP 30 minuuttia. Pakkaamisen aikana käytettiin mekaanista tärinää kahdella GC-kolonnin ravistelijalla (Alltech, Deerfield, IL, USA, jotta kolonnin paine on tasainen. estä vauriot kolonnissa. Irrota kolonni lietteen pakkausyksiköstä ja liitä toinen liitin tuloaukkoon ja LC-järjestelmään sen suorituskyvyn tarkistamiseksi.
LC-pumppu (10AD Shimadzu, Japani), injektori (Valco (USA) C14 W.05) 50 nL:n ruiskutussilmukalla, kalvonpoistaja (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS-kapillaariikkuna rakennettiin. Erityinen µLC-laitedetektori (UV-2075) ja lasivuorattu kolonnin erittäin kapean kaistan minimointi ja mikrokolonnien lyhentäminen. Pakkaamisen jälkeen kapillaarit (50 μm id 365 ja pelkistävät liitoskapillaarit (50 μm) asennettiin pelkistävän liitoksen 1/16″ ulostuloon. Tiedonkeruu ja kromatografinen käsittely tehtiin Multichro 2000 -ohjelmistolla. Valvonta 254 nm:llä (Analyyttejä testattiin Chromatin Pro8:lla).
Albumiini ihmisen seerumista, lyofilisoitu jauhe, ≥ 96 % (agaroosigeelielektroforeesi) 3 mg sekoitettuna trypsiinin (1,5 mg), 4,0 M urean (1 ml) ja 0,2 M ammoniumbikarbonaatin (1 ml) kanssa. Liuosta sekoitettiin 10 minuuttia ja sitten pidettiin vesihauteessa 10 °C 1 tunnin ajan. % TFA. Suodata liuos ja säilytä alle 4 °C:ssa.
Peptidiseosten ja HSA-trypsiinidigestien erottelu arvioitiin erikseen PMP-kolonneilla. Tarkista peptidiseoksen ja HSA:n trypsiinidigesteen erottuminen PMP-kolonnilla ja vertaa tuloksia Ascentis Express RP-Amide -kolonniin. Teoreettinen levynumero lasketaan seuraavasti:
SEM-kuvia paljaista piidioksidihiukkasista ja ligandiin sitoutuneista piidioksidihiukkasista on esitetty kuviossa 1.2 .SEM-kuvat paljaista piidioksidihiukkasista (A, B) osoittavat, että toisin kuin aikaisemmissa tutkimuksissamme, nämä hiukkaset ovat pallomaisia, joissa partikkelit ovat pitkänomaisia ​​tai niillä on epäsäännöllinen symmetria. Ligandeihin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten (C, D) pinta on sileämpi kuin paljaiden piidioksidihiukkasten pinta, mikä voi johtua pinnan koektiilikuituisesta polykarbonaatista.
Pyyhkäisyelektronimikroskooppikuvat paljaista piidioksidihiukkasista (A, B) ja ligandisidottuista piidioksidihiukkasista (C, D).
Paljaiden piidioksidihiukkasten ja ligandisidottujen piidioksidihiukkasten hiukkaskokojakaumat on esitetty kuvassa 3(A). Tilavuusperusteiset partikkelikokojakaumakäyrät osoittivat, että piidioksidihiukkasten koko kasvoi kemiallisen modifioinnin jälkeen (Kuva 3A). Nykyisen tutkimuksen ja edellisen tutkimuksen piidioksidihiukkasten hiukkaskokojakautumatietoja verrataan taulukossa P.5,-1(AMP) -pohjaisen hiukkasen koko. .36 μm, verrattuna edelliseen tutkimukseemme, jossa ad(0.5)-arvo oli 3.05 μm (polystyreeniin sitoutuneet piidioksidihiukkaset)34.Tällä erällä oli kapeampi hiukkaskokojakauma verrattuna edelliseen tutkimukseemme, koska PEG:n, urean, TMOS:n ja etikkahapon suhteet vaihtelivat hieman aikaisemmin kuin reaktioseoksessa oleva PMP-hiukkaskoko on polystyreenin hiukkaskokoa suurempi. Tämä tarkoittaa, että piidioksidihiukkasten pintafunktionalisointi styreenillä saosti vain polystyreenikerroksen (0,97 µm) piidioksidin pinnalle, kun taas PMP-vaiheessa kerrospaksuus oli 1,38 µm.
Paljaiden piidioksidihiukkasten ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten hiukkaskokojakauma (A) ja huokoskokojakauma (B).
Tämän tutkimuksen piidioksidihiukkasten huokoskoko, huokostilavuus ja pinta-ala on esitetty taulukossa 1(B). Paljaiden piidioksidihiukkasten ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten PSD-profiilit on esitetty kuvassa 3(B). Tulokset ovat verrattavissa aikaisempaan tutkimukseemme. Paljaiden ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten huokoskoot osoittavat, että niiden koko pienenee310 ja vastaavasti. 69 kemiallisen modifioinnin jälkeen, kuten taulukosta 1(B) näkyy, ja käyrän muutos on esitetty kuvassa 3(B). Vastaavasti piidioksidihiukkasten huokostilavuus pieneni 0,67:stä 0,58 cm3/g:iin kemiallisen modifioinnin jälkeen. Tällä hetkellä tutkittujen piidioksidihiukkasten ominaispinta-ala on 116 m2/g (edellinen tutkimuksemme on 124 m2/g). Taulukossa 1(B) myös piidioksidihiukkasten pinta-ala (m2/g) pieneni arvosta 116 m2/g arvoon 105 m2/g kemiallisen modifioinnin jälkeen.
Stationaarifaasin alkuaineanalyysin tulokset on esitetty taulukossa 2. Nykyisen stationaarifaasin hiilikuormitus on 6,35 %, mikä on pienempi kuin edellisen tutkimuksemme hiilikuormitus (polystyreenisidotut piidioksidihiukkaset, vastaavasti 7,93 %35 ja 10,21 %) kuten fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaattia (PCMP) ja 4-hydroksi-TEMPO:a käytettiin. Nykyisen stationaarifaasin typen painoprosentti on 2,21 % verrattuna aiempien tutkimusten typen 0,1735 painoprosenttiin ja 0,85 painoprosenttiin. Tämä tarkoittaa, että nykyisen kiinteän faasin typpikuormituksen suurempi painoprosentti on suurempi. tuotteista (4) ja (5) oli 2,7 % ja 2,9 %, kun taas lopputuotteen (6) hiilikuormitus oli 6,35 %, kuten taulukosta 2 näkyy. Painonpudotus tarkistettiin PMP:n stationaarifaasilla, ja TGA-käyrä on esitetty kuvassa 4. TGA-käyrä näyttää painonpudotuksen 8,6 %, mutta myös hiilikuormitus on yhtäpitävä, koska C, mutta myös 3 % on samaa mieltä. ja H.
Fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaattiligandi valittiin piidioksidihiukkasten pinnan modifiointiin, koska siinä on polaarisia fenyylimaleimidiryhmiä ja vinyyli-isosyanaattiryhmiä. Vinyyli-isosyanaattiryhmät voivat edelleen reagoida styreenin kanssa elävällä radikaalipolymeroinnilla. Toinen syy on lisätä ryhmä, jolla on kohtalainen vuorovaikutus voimakkaan elektroanalyyttisen faasin, analyyttisen faasin ja henteeraalisen faasin välillä. ide-osalla ei ole virtuaalista varausta normaalissa pH:ssa. Stationaarifaasin polariteettia voidaan säätää optimaalisella styreenin määrällä ja vapaaradikaalipolymeroinnin reaktioajalla. Reaktion viimeinen vaihe (vapaaradikaalipolymerointi) on kriittinen ja voi muuttaa stationaarifaasin polaarisuutta. Näiden stationaaristen faasien hiilikuormituksen tarkistamiseksi tehtiin alkuaineanalyysi. .Styreenipitoisuuksilla valmistetuilla SP:illä on erilaiset hiilikuormitukset. Lataa nämä kiinteät faasit jälleen ruostumattomasta teräksestä valmistettuihin pylväisiin ja tarkista niiden kromatografinen suorituskyky (selektiivisyys, erotuskyky, N-arvo jne.). Näiden kokeiden perusteella valittiin optimoitu formulaatio PMP-stationaarisen faasin valmistamiseksi valvotun polariteetin ja hyvän analyytin säilymisen varmistamiseksi.
Viisi peptidiseosta (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusiinienkefaliini) arvioitiin myös käyttämällä PMP-kolonnia käyttäen liikkuvaa faasia;60/40 (v/v) asetonitriili/vesi (0,1 % TFA) virtausnopeudella 80 μL/min. Optimaalisissa eluointiolosuhteissa teoreettinen levynumero (N) kolonnia kohden (100 × 1,8 mm id) on 20 000 ± 100 (200/000 MPT-arvot pylväässä kolmella kromilevyllä). grammat on esitetty kuvassa 5A. Nopea analyysi PMP-kolonnilla suurella virtausnopeudella (700 μL/min), viisi peptidiä eluoitui minuutissa, N-arvot olivat erittäin hyvät, 13 500 ± 330 per pylväs (100 × 1,8 mm pylvään id), vastaa 135,00 tre 135,00 tre 1 m/m (figuure 1 t/m). 00 × 1,8 mm id) pakattiin kolmella eri erällä PMP stationaarifaasia toistettavuuden tarkistamiseksi. Kunkin kolonnin analyytin konsentraatio kirjattiin käyttämällä optimaalisia eluointiolosuhteita ja teoreettisten levyjen lukumäärää N ja retentioaikaa saman testiseoksen erottamiseksi kussakin pylväässä. PMP-kolonnien toistettavuustiedot esitetään hyvin PMP-kolonnin arvoilla. Taulukko 3.
Peptidiseoksen erotus PMP-kolonnilla (B) ja Ascentis Express RP-Amide -kolonnilla (A);liikkuva faasi 60/40 ACN/H20 (TFA 0,1 %), PMP-kolonnin mitat (100 x 1,8 mm id);analyyttinen Yhdisteiden eluointijärjestys: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ja 5 (leusiini)happoenkefaliini)).
PMP-pylväästä (100 × 1,8 mm id) arvioitiin ihmisen seerumin albumiinin tryptisten pilkkomien erottaminen korkean erotuskyvyn nestekromatografiassa. Kuvan 6 kromatogrammi osoittaa, että näyte on hyvin erotettu ja resoluutio on erittäin hyvä. HSA-hajotus analysoitiin käyttämällä virtausnopeutta 100 µl/min, liikkuva faasi 70 µl/min ja liikkuva faasi 70 A.3/0 % asetoniilia. grammaa (kuva 6), HSA-digestio on jaettu 17 piikkiin, jotka vastaavat 17 peptidiä. Jokaisen HSA-digestien piikin erotustehokkuus laskettiin ja arvot on annettu taulukossa 5.
HSA:n tryptinen digestio (100 x 1,8 mm id) erotettiin PMP-pylväässä;virtausnopeus (100 ui/min), liikkuva faasi 60/40 asetonitriili/vesi 0,1 % TFA:lla.
jossa L on kolonnin pituus, η on liikkuvan faasin viskositeetti, ΔP on kolonnin vastapaine ja u on liikkuvan faasin lineaarinen nopeus. PMP-kolonnin läpäisevyys oli 2,5 × 10-14 m2, virtausnopeus oli 25 μL/min ja käytettiin 60/40 v/v pylvään id.0 × ACN/vesi. oli samanlainen kuin aiemmassa tutkimuksessamme Viite 34. Pinnallisesti huokoisilla hiukkasilla pakatun kolonnin läpäisevyys on: 1,7 × 10-15 1,3 μm hiukkasille, 3,1 × 10-15 1,7 μm hiukkasille, 5,2 × 10-15 ja 21-25 μm hiukkasille 2-5 μs. μm hiukkaset 43. Siksi PMP-faasin läpäisevyys on samanlainen kuin 5 μm:n ydin-kuorihiukkasten.
missä Wx on kloroformilla täytetyn pylvään paino, Wy on metanolilla täytetyn kolonnin paino ja ρ on liuottimen tiheys. Metanolin (ρ = 0,7866) ja kloroformin (ρ = 1,484) tiheydet. PIILIIKKAHIukkasten kokonaishuokoisuus. Aiemmin tutkimme ureakolonnit 31 olivat 0,63 ja 0,55. Tämä tarkoittaa, että urealigandien läsnäolo vähentää stationaarifaasin läpäisevyyttä. Toisaalta PMP-kolonnin kokonaishuokoisuus (sisähalkaisija 100 × 1,8 mm) on 0,60. PMP-kolonnien8 läpäisevyys on pienempi kuin C-pylväspakatut C-kolonnit18. tyyppiset stationaarifaasit C18-ligandit kiinnittyvät piidioksidihiukkasiin lineaarisina ketjuina, kun taas polystyreenityyppisissä stationaarisissa faaseissa sen ympärille muodostuu suhteellisen paksu polymeerikerros. Tyypillisessä kokeessa kolonnin huokoisuus lasketaan seuraavasti:
Kuvat 7A, B esittävät PMP-kolonnia (100 x 1,8 mm id) ja Ascentis Express RP-Amide -kolonnia (100 x 1,8 mm id) käyttäen samoja eluointiolosuhteita (eli 60/40 ACN/H20 ja 0,1 % TFA).) van Deemterin tontista.Valitut peptidiseokset (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusiinienkefaliini) valmistettiin 20 µL/ Minimivirtausnopeus molemmille kolonneille on 800 µL/min. centis Express RP-Amide -kolonni olivat 2,6 µm ja 3,9 µm, vastaavasti. HETP-arvot osoittavat, että PMP-kolonnin erotustehokkuus (100 × 1,8 mm id) on paljon parempi kuin kaupallisesti saatavilla oleva Ascentis Express N RP-Amide -kolonni (100 × 1,8 mm:n id:ssä oleva virtauskuvaaja, joka osoittaa, että virtausarvo on (100 × 1,8 mm) id:ssä). ei ole merkittävä verrattuna aiempaan tutkimukseemme. PMP-kolonnin (100 × 1,8 mm id) korkeampi erotustehokkuus verrattuna Ascentis Express RP-Amide -kolonniin perustuu hiukkasten muodon, koon ja monimutkaisten kolonnin pakkausmenetelmien parannuksiin, joita käytetään nykyisessä työssä34.
(A) van Deemterin käyrä (HETP vs. liikkuvan faasin lineaarinen nopeus), saatu käyttämällä PMP-kolonnia (100 × 1,8 mm id) 60/40 ACN/H2O:ssa, jossa on 0,1 % TFA:ta.(B) van Deemterin käyrä (HETP versus liikkuvan faasin lineaarinen nopeus) saatu käyttämällä Ascentis Express Ascentis Express A RP-Amide -kolonnia (10/0 mm2H2) (10/0 mm2H2) 0,1 % TFA:lla.
Polaarinen upotettu polystyreeni stationaarifaasi valmistettiin ja arvioitiin synteettisten peptidiseosten ja ihmisen seerumialbumiinin (HAS) trypsiinidigestien erottamiseksi korkean erotuskyvyn nestekromatografiassa. Peptidiseosten PMP-kolonnien kromatografinen suorituskyky on erinomainen erotustehokkuuden ja -resoluution suhteen. PMP-kolonnien parannettu erotuskyky johtuu mm. sis kiinteän faasin ja monimutkaisen kolonnipakkauksen. Korkean erotustehokkuuden lisäksi alhainen kolonnin vastapaine suurilla virtausnopeuksilla on toinen tämän stationaarifaasin etu. PMP-kolonneilla on hyvä toistettavuus, ja niitä voidaan käyttää peptidiseosten analysointiin ja eri proteiinien trypsiinihajotukseen. Aiomme käyttää tätä kolonnia P-kolonnissa myös nestemäisten kromiyhdisteiden erottamiseen luonnontuotteista, bioaktiivisista yhdisteistä lääkekasveista ja bioaktiivisista yhdisteistä. arvioitiin proteiinien ja monoklonaalisten vasta-aineiden erottamisen suhteen.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Research on Peptide Separation Systems by Reversed Phase Chromatography Osa I: Development of a Column Characterization Protocol.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Parannetut aktiiviset peptidit, jotka on suunniteltu tartuntatautien hoitoon. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synteettiset terapeuttiset peptidit: tiede ja markkinat.drug discovery.15 (1-2) tänään, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Advanced nestekromatografia-massaspektrometria mahdollistaa laajasti kohdistetun metabolomiikan ja proteomiikan sisällyttämisen.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC:n rooli lääkekehityksessä. J.Sep. Sei. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Ultrakorkeapainenestekromatografian perus- ja käytännön näkökohdat nopeita erotuksia varten.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ultra-high performance -nestekromatografian soveltaminen lääkekehitykseen. J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et ai. Monoliittiset makrohuokoiset hydrogeelit, jotka on valmistettu öljy-vedessä korkean sisäisen faasin emulsioista enterovirusten tehokkaaseen puhdistamiseen. Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Nestekromatografian rooli proteomiikassa.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Kehittyviä suuntauksia terapeuttisten peptidien ja proteiinien käänteisfaasinestekromatografiassa: teoria ja sovellukset.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Peptidien kaksiulotteinen erottaminen käyttämällä RP-RP-HPLC-järjestelmää käyttämällä erilaisia ​​pH-arvoja ensimmäisessä ja toisessa erotusmitassa.J.Sep. Sei. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Massansiirto-ominaisuuksia ja kineettistä suorituskykyä korkean hyötysuhteen kromatografiakolonneilla, jotka oli pakattu C18 sub-2 μm täysin ja pinnallisesti huokoisilla hiukkasilla.J.Sep. Sei. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Viimeaikaiset trendit ja analyyttiset haasteet kasvien bioaktiivisten peptidien eristämisessä, tunnistamisessa ja validoinnissa.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-028-08.
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the Kingdom of Life. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et ai. Terapeuttisten peptidien jatkokäsittely preparatiivisella nestekromatografialla. Molecule (Basel, Sveitsi) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode kromatografia ja sen soveltaminen biopolymeereihin.J.Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligands for mix-mode proteiinikromatografia: periaate, karakterisointi ja suunnittelu. J.Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).