Kiitos, että kävit Nature.com-sivustolla. Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Näyttää kolmen dian karusellin kerralla. Siirry kolmen dian läpi kerrallaan Edellinen- ja Seuraava-painikkeilla tai siirry kolmen dian läpi kerrallaan lopussa olevilla liukusäätimen painikkeilla.
Huokoisia piidioksidihiukkasia valmistettiin sol-geelimenetelmällä, johon tehtiin joitakin muutoksia laajahuokoisten hiukkasten saamiseksi. Nämä hiukkaset derivatisoitiin N-fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaatilla (PMI) ja styreenillä käänteisketjunsiirtofragmentaatiolla (RAFT) polymeroinnin avulla, jolloin saatiin N-fenyylimaleimidi-interkaloituja polyamideja. Styreeni (PMP) -stationäärifaasi. Kapeareikäiset ruostumattomasta teräksestä valmistetut kolonnit (sisähalkaisija 100 × 1,8 mm) täytettiin lietetäytteellä. PMP-kolonnin kromatografista suorituskykyä arvioitiin erottamaan synteettisten peptidien seos, joka koostui viidestä peptidistä (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-aminohappoenkefaliini) ja ihmisen seerumialbumiinin tryptisestä hydrolysaatista (HAS). Optimaalisissa eluointiolosuhteissa peptidiseosta sisältävien levyjen teoreettinen määrä oli 280 000 levyä/neliömetri. Verrattaessa kehitetyn kolonnin erotuskykyä kaupalliseen Ascentis Express RP-Amide -kolonniin havaittiin, että PMP-kolonnin erotustehokkuus oli kaupallista kolonnia parempi erotustehokkuuden ja resoluution suhteen.
Biolääketeollisuudesta on tullut laajeneva maailmanlaajuinen markkina-alue, jonka markkinaosuus on kasvanut merkittävästi viime vuosina. Biolääketeollisuuden räjähdysmäisen kasvun myötä1,2,3 peptidi- ja proteiinianalyysille on suuri tarve. Kohdepeptidin lisäksi peptidisynteesin aikana muodostuu erilaisia ​​epäpuhtauksia, joten halutun peptidin puhtauden saavuttamiseksi tarvitaan kromatografista puhdistusta. Proteiinien analysointi ja karakterisointi kehon nesteissä, kudoksissa ja soluissa on erittäin haastava tehtävä, koska yhdessä näytteessä on suuri määrä mahdollisesti havaittavia lajeja. Vaikka massaspektrometria on tehokas työkalu peptidien ja proteiinien sekvensointiin, jos tällaiset näytteet syötetään suoraan massaspektrometriin, erotus on epätyydyttävää. Tämä ongelma voidaan ratkaista suorittamalla nestekromatografia (LC) ennen MS-analyysiä, mikä vähentää massaspektrometriin tiettynä ajankohtana tulevien analyyttien määrää4,5,6. Lisäksi analyytit voivat tiivistyä kapealle alueelle nestefaasierotuksen aikana, mikä tiivistää näitä analyyttejä ja lisää MS-detektion herkkyyttä. Nestekromatografia (LC) on kehittynyt merkittävästi viimeisen vuosikymmenen aikana ja siitä on tullut laajalti käytetty menetelmä proteomiikka-analyysissä7,8,9,10.
Käänteisfaasinestekromatografiaa (RP-LC) käytetään laajalti peptidiseosten puhdistamiseen ja erottamiseen käyttäen stationäärifaasina oktadekyylimodifioitua piidioksidia (ODS)11,12,13. Monimutkaisen rakenteensa ja amfoteerisen luonteensa vuoksi14,15 RP-stationäärifaasit eivät kuitenkaan pysty tarjoamaan tyydyttävää peptidien ja proteiinien erottelua. Siksi polaaristen ja ei-polaaristen fragmenttien sisältävien peptidien ja proteiinien analysointi vaatii erityisesti suunniteltuja stationäärifaaseja, jotka ovat vuorovaikutuksessa näiden analyyttien kanssa ja pidättävät ne16. Sekakromatografia, joka tarjoaa multimodaalisia vuorovaikutuksia, voi olla vaihtoehto RP-LC:lle peptidien, proteiinien ja muiden monimutkaisten seosten erottamisessa. Valmistettiin useita sekatyyppisiä stationäärifaaseja, ja näillä stationäärifaaseilla täytettyjä kolonneja käytettiin peptidien ja proteiinien erottamiseen17,18,19,20,21. Polaaristen ja ei-polaaristen ryhmien läsnäolon vuoksi sekamuotoiset stationäärifaasit (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaarinen interkalaatio/RPLC) soveltuvat peptidien ja proteiinien erottamiseen22,23,24,25,26,27,28. Kovalenttisesti sitoutuneilla polaarisilla ryhmillä varustetut polaariset interkaloidut stationäärifaasit osoittavat hyviä erotuskykyjä ja ainutlaatuista selektiivisyyttä polaarisille ja ei-polaarisille analyyteille, koska erotus riippuu analyytin ja stationäärifaasin välisestä vuorovaikutuksesta. Multimodaaliset vuorovaikutukset 29,30,31,32. Äskettäin Zhang et al. 30 saivat behenyylipäätteisiä polyamiinien stationäärifaaseja ja erottivat onnistuneesti hiilivetyjä, masennuslääkkeitä, flavonoideja, nukleosideja, estrogeenejä ja joitakin muita analyyttejä. Polaarisessa upotetussa stationäärimateriaalissa on sekä polaarisia että ei-polaarisia ryhmiä, joten sitä voidaan käyttää peptidien ja proteiinien erottamiseen hydrofobisiin ja hydrofiilisiin osiin. Polaarisia linjakolonneja (esim. C18-kolonneja, joissa on amidilinjassa) on saatavana kauppanimellä Ascentis Express RP-Amide -kolonnien nimellä, mutta näitä kolonneja on käytetty vain amiinin 33 analysointiin.
Tässä tutkimuksessa valmistettiin polaarinen upottava stationäärifaasi (N-fenyylimaleimidi, upottava polystyreeni) ja arvioitiin sen peptidien erottelua ja tryptistä HSA:n pilkkomista. Stationäärifaasin valmistukseen käytettiin seuraavaa strategiaa. Huokoiset piidioksidihiukkaset valmistettiin aiemmissa julkaisuissamme kuvattujen menetelmien mukaisesti, tehden joitakin muutoksia valmistuskaavioihin 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Urean, polyetyleeniglykolin (PEG), TMOS:n ja vesi-etikkahapon suhteita säädettiin, jotta saatiin suurikokoisia piidioksidihiukkasia. Toiseksi syntetisoitiin uusi fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaattiligandi, ja sen derivatisoituja piidioksidihiukkasia käytettiin polaaristen upotettujen stationäärifaasien valmistukseen. Saatu stationäärifaasi pakattiin ruostumattomasta teräksestä valmistettuun kolonniin (sisähalkaisija 100 × 1,8 mm) optimoidun pakkausmenetelmän mukaisesti. Kolonnin pakkausta autetaan mekaanisella tärinällä, jotta kolonnin sisällä on tasainen kerros. Pakattu kolonni arvioitiin viiden peptidin (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusiini-enkefaliinipeptidi) ja ihmisen seerumialbumiinin (HSA) tryptisten hydrolysaattien seoksen erottelun osalta. Havaittiin, että peptidiseos ja HSA:n tryptinen pilkkominen erottuivat hyvällä resoluutiolla ja tehokkuudella. PMP-kolonnin erotustehokkuutta verrattiin Ascentis Express RP-Amide -kolonniin. Havaittiin, että peptideillä ja proteiineilla on hyvä resoluutio ja korkea erotustehokkuus PMP-kolonnissa, ja PMP-kolonnin erotustehokkuus on korkeampi kuin Ascentis Express RP-Amide -kolonnin.
PEG (polyetyleeniglykoli), urea, etikkahappo, trimetoksiortosilikaatti (TMOS), trimetyylikloorisilaani (TMCS), trypsiini, ihmisen seerumin albumiini (HSA), ammoniumkloridi, urea, heksametyylimetakryloyylidisilatsaani (HMDS), metakryloyylikloridi (MC), styreeni, 4-hydroksi-TEMPO, bentsoyyliperoksidi (BPO), asetonitriili (ACN) HPLC:hen, metanoli, 2-propanoli ja asetoni. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Urean (8 g), polyetyleeniglykolin (8 g) ja 8 ml:n 0,01 N etikkahapon seosta sekoitettiin 10 minuuttia, ja siihen lisättiin 24 ml TMOS:ia jäähauteessa. Reaktioseosta kuumennettiin 40 °C:ssa 6 tuntia ja sitten 120 °C:ssa 8 tuntia ruostumattomasta teräksestä valmistetussa autoklaavissa. Vesi dekantoitiin ja jäännös kuivattiin 70 °C:ssa 12 tuntia. Kuivatut pehmeät lohkot jauhettiin tasaiseksi ja kalsinoitiin uunissa 550 °C:ssa 12 tuntia. Kolme erää valmistettiin ja karakterisoitiin hiukkaskokojen, huokoskoon ja pinta-alan toistettavuuden testaamiseksi.
Polaarinen ryhmä ja stationäärifaasi polystyreeniketjuille. Valmistusmenetelmä on kuvattu alla.
N-fenyylimaleimidi (200 mg) ja metyylivinyyli-isosyanaatti (100 mg) liuotettiin vedettömään tolueeniin, ja sitten reaktiokolviin lisättiin 0,1 ml 2,2′-atsoisobutyronitriiliä (AIBN), jolloin saatiin fenyylimaleimidin ja metyylivinyyli-isosyanaatin (PMCP) kopolymeeri. ) Seosta kuumennettiin 60 °C:ssa 3 tuntia, suodatettiin ja kuivattiin uunissa 40 °C:ssa 3 tuntia.
Kuivattuja piidioksidihiukkasia (2 g) dispergoitiin kuivaan tolueeniin (100 ml), sekoitettiin ja sonikoitiin 10 minuuttia 500 ml:n pyöreäpohjaisessa pullossa. PMCP (10 mg) liuotettiin tolueeniin ja lisättiin tipoittain reaktiopulloon tiputussuppilon kautta. Seosta refluksoitiin 100 °C:ssa 8 tuntia, suodatettiin, pestiin asetonilla ja kuivattiin 60 °C:ssa 3 tuntia. Sitten PMCP:hen (100 g) liittyvät piidioksidihiukkaset liuotettiin tolueeniin (200 ml) ja siihen lisättiin 4-hydroksi-TEMPO:a (2 ml) 100 μl:n dibutyylitinadilauraattia katalysaattorina. Seosta sekoitettiin 50 °C:ssa 8 tuntia, suodatettiin ja kuivattiin 50 °C:ssa 3 tuntia.
Styreeni (1 ml), bentsoyyliperoksidi BPO (0,5 ml) ja TEMPO-PMCP:hen (1,5 g) kiinnittyneet piidioksidihiukkaset dispergoitiin tolueeniin ja huuhdeltiin typellä. Styreenin polymerointi suoritettiin 100 °C:ssa 12 tunnin ajan. Tuloksena oleva tuote pestiin metanolilla ja kuivattiin yön yli 60 °C:ssa. Reaktion yleinen kaavio on esitetty kuvassa 1.
Näytteistä poistettiin kaasua 393 K:n lämpötilassa 1 tunnin ajan, kunnes jäännöspaine oli alle 10–3 Torria. Kokonaishuokostilavuuden määrittämiseen käytettiin suhteellisessa paineessa P/P0 = 0,99 adsorboitunutta N2-määrää. Puhtaan ja ligandiin sitoutuneen piidioksidihiukkasten morfologiaa tutkittiin pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (Hitachi High Technologies, Tokio, Japani). Kuivat näytteet (puhdas piidioksidi ja ligandiin sitoutuneet piidioksidihiukkaset) asetettiin alumiinitangoille hiiliteipin avulla. Kulta kerrostettiin näytteelle Q150T-sputterointilaitteella, ja näytteen päälle kerrostettiin 5 nm:n paksuinen Au-kerros. Tämä parantaa matalajänniteprosessin tehokkuutta ja mahdollistaa hienojakoisen kylmäruiskutuksen. Alkuaineanalyysi suoritettiin Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 -alkuainekoostumusanalysaattorilla. Hiukkaskokojakauman määrittämiseen käytettiin Malvernin (Worcestershire, Iso-Britannia) Mastersizer 2000 -hiukkaskokojakaumaa. Päällystämättömät piidioksidihiukkaset ja ligandiin sitoutuneet piidioksidihiukkaset (5 mg kutakin) dispergoitiin 5 ml:aan isopropanolia, sonikoitiin 10 minuuttia, sekoitettiin 5 minuuttia ja asetettiin Mastersizer-optiselle pöydälle. Termogravimetrinen analyysi suoritettiin nopeudella 5 °C minuutissa lämpötila-alueella 30–800 °C.
Lasikuituvuoratut, kapeareikäiset, ruostumattomasta teräksestä valmistetut kolonnit, joiden mitat olivat 100 × 1,8 mm, pakattiin lietettäytteellä samalla tavalla kuin viitteessä 31. Ruostumattomasta teräksestä valmistettu kolonni (lasivuorattu, sisähalkaisija 100 × 1,8 mm) ja ulostulo, jossa oli 1 µm:n fritti, yhdistettiin lietepakkauskoneeseen (Alltech Deerfield, IL, USA). Valmistele stationäärifaasin suspensio suspendoimalla 150 mg stationäärifaasia 1,2 ml:aan metanolia ja syöttämällä se säiliökolonniin. Metanolia käytettiin lieteliuottimena ja kontrolliliuottimena. Pakkaa kolonni käyttämällä painesarjaa: 100 MP 10 minuutin ajan, 80 MP 15 minuutin ajan ja 60 MP 30 minuutin ajan. Pakkausprosessissa käytettiin kahta kaasukromatografiakolonnitärytintä (Alltech, Deerfield, IL, USA) mekaanista tärytystä varten kolonnin tasaisen pakkautumisen varmistamiseksi. Sulje lietepakkaaja ja vapauta paine hitaasti, jotta naru ei vaurioidu. Kolonni irrotettiin liete-suuttimesta ja toinen liitin kiinnitettiin tuloaukkoon ja kytkettiin LC-järjestelmään sen toiminnan testaamiseksi.
Mukautettu MLC rakennettiin käyttämällä LC-pumppua (10AD Shimadzu, Japani), näytteenottajaa, jossa oli 50 nl:n injektiosilmukka (Valco (USA) C14 W.05), kalvokaasuttajaa (Shimadzu DGU-14A) ja UV-VIS-kapillaari-ikkunaa. Detektorilaite (UV-2075) ja emaloitu mikrokolonni. Käytä erittäin kapeita ja lyhyitä liitosputkia kolonnin lisälaajenemisen vaikutuksen minimoimiseksi. Kolonnin täyttämisen jälkeen asenna kapillaari (50 µm sisähalkaisija 365) 1/16 tuuman pelkistävän liitoksen ulostuloon ja asenna pelkistävän liitoksen kapillaari (50 µm). Tiedonkeruu ja kromatogrammin käsittely suoritetaan Multichro 2000 -ohjelmistolla. 254 nm:ssä koeanalyyttien UV-absorbanssia seurattiin 0:ssa. Kromatografiset tiedot analysoitiin OriginPro8:lla (Northampton, MA).
Ihmisen seerumin albumiinia, kylmäkuivattua jauhetta, ≥ 96 % (agaroosigeelielektroforeesi) 3 mg sekoitettuna trypsiiniin (1,5 mg), 4,0 M ureaan (1 ml) ja 0,2 M ammoniumbikarbonaattiin (1 ml). Liuosta sekoitettiin 10 minuuttia ja pidettiin vesihauteessa 37 °C:ssa 6 tuntia, minkä jälkeen se sammutettiin 1 ml:lla 0,1 % TFA:ta. Suodata liuos ja säilytä alle 4 °C:ssa.
Peptidien ja tryptisesti pilkotun HSA:n seoksen erottelua PMP-kolonnilla arvioitiin erikseen. Tarkista PMP-kolonnilla erotetun peptidien ja HSA:n seoksen tryptinen hydrolyysi ja vertaa tuloksia Ascentis Express RP-Amide -kolonniin. Teoreettisten pohjalevyjen lukumäärä lasketaan seuraavalla yhtälöllä:
Puhtaan piidioksidihiukkasten ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten SEM-kuvat on esitetty kuvassa 2. Puhtaan piidioksidihiukkasten (A, B) SEM-kuvat osoittavat pallomaisen muodon, jossa hiukkaset ovat pitkänomaisia ​​tai epäsäännöllisen symmetrisia verrattuna aiempiin tutkimuksiimme. Ligandin (C, D) sitomien piidioksidihiukkasten pinta on sileämpi kuin puhtaiden piidioksidihiukkasten, mikä voi johtua piidioksidihiukkasten pintaa peittävistä polystyreeniketjuista.
Puhtaan piidioksidihiukkasten (A, B) ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten (C, D) pyyhkäisyelektronimikroskooppikuvat.
Puhtaan piidioksidihiukkasten ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten hiukkaskokojakauma on esitetty kuvassa 2.3(A). Tilavuushiukkaskokojakaumakäyrät osoittivat, että piidioksidihiukkasten koko kasvoi kemiallisen modifioinnin jälkeen (kuva 3A). Nykyisen ja aiemman tutkimuksen piidioksidihiukkasten kokojakaumatietoja verrataan taulukossa 1(A). PMP:n tilavuushiukkaskoko d(0,5) oli 3,36 µm, kun aiemmassa tutkimuksessamme (polystyreenillä sidotut piidioksidihiukkaset)34 se oli ad(0,5)-arvo 3,05 µm. PEG:n, urean, TMOS:n ja etikkahapon suhteen muutoksen vuoksi reaktioseoksessa tämän erän hiukkaskokojakauma oli kapeampi kuin aiemmassa tutkimuksessamme. PMP-faasin hiukkaskoko on hieman suurempi kuin aiemmin tutkimamme polystyreenillä sidotun piidioksidihiukkasfaasin. Tämä tarkoittaa, että piidioksidihiukkasten pintafunktionalisointi styreenillä kerrosti piidioksidin pinnalle vain polystyreenikerroksen (0,97 µm), kun taas PMP-faasissa kerroksen paksuus oli 1,38 µm.
Puhtaan piidioksidihiukkasten ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten hiukkaskokojakauma (A) ja huokoskokojakauma (B).
Tässä tutkimuksessa käytettyjen piidioksidihiukkasten huokoskoko, huokostilavuus ja pinta-ala on esitetty taulukossa 1 (B). Puhtaan piidioksidihiukkasten ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten PSD-profiilit on esitetty kuvissa 3 (B). Tulokset olivat verrattavissa aiempaan tutkimukseemme34. Puhtaan ja ligandiin sitoutuneen piidioksidihiukkasten huokoskoot olivat vastaavasti 310 Å ja 241 Å, mikä osoittaa, että kemiallisen modifioinnin jälkeen huokoskoko pieneni 69 Å, kuten taulukosta 1 (B) käy ilmi, ja siirtymäkäyrä on esitetty kuvassa. Piidioksidihiukkasten ominaispinta-ala tässä tutkimuksessa on 116 m²/g, mikä on verrattavissa aiempaan tutkimukseemme (124 m²/g). Kuten taulukosta 1 (B) käy ilmi, piidioksidihiukkasten pinta-ala (m²/g) kemiallisen modifioinnin jälkeen pieneni myös arvosta 116 m²/g arvoon 105 m²/g.
Stationäärifaasin alkuaineanalyysin tulokset on esitetty taulukossa 2. Nykyisen stationäärifaasin hiilipitoisuus on 6,35 %, mikä on alhaisempi kuin edellisessä tutkimuksessamme (polystyreeniin liittyvät piidioksidihiukkaset 7,93 %35 ja 10,21 %)42. Nykyisen stationäärifaasin hiilipitoisuus on alla, koska SP:n valmistuksessa on käytetty styreenin lisäksi joitakin polaarisia ligandeja, kuten fenyylimaleimidimetyylivinyyli-isosyanaattia (PCMP) ja 4-hydroksi-TEMPO:a. Typen painoprosentti nykyisessä stationäärifaasissa on 2,21 % verrattuna aiempien tutkimusten 0,1735 ja 0,85 %:iin42. Tämä tarkoittaa, että nykyisessä stationäärifaasissa on korkea typen painoprosentti fenyylimaleimidin vuoksi. Vastaavasti tuotteiden (4) ja (5) hiilipitoisuus on vastaavasti 2,7 % ja 2,9 %, kun taas lopputuotteen (6) hiilipitoisuus on 6,35 %, kuten taulukosta 2 käy ilmi. Termogravimetristä analyysiä (TGA) käytettiin PMP:n stationäärifaasille painonpudotuksen testaamiseksi, ja TGA-käyrä on esitetty kuvassa 4. TGA-käyrä osoittaa 8,6 %:n painonpudotuksen, mikä on hyvässä yhteensopivuudessa hiilipitoisuuden (6,35 %) kanssa, koska ligandit sisältävät paitsi C:tä myös N:ää, O:ta ja H:ta.
Piidioksidihiukkasten pinnan modifioimiseksi valittiin ligandi fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaatti sen polaaristen fenyylimaleimidi- ja vinyyli-isosyanaattiryhmien vuoksi. Vinyyli-isosyanaattiryhmät voivat reagoida edelleen styreenin kanssa elävän radikaalin polymeroinnin avulla. Toinen syy on lisätä ryhmä, jolla on kohtalaisia ​​vuorovaikutuksia analyytin kanssa eikä voimakkaita sähköstaattisia vuorovaikutuksia analyytin ja stationäärifaasin välillä, koska fenyylimaleimidiryhmällä ei ole virtuaalivarausta normaalissa pH:ssa. Stationäärifaasin polaarisuutta voidaan kontrolloida optimaalisella styreenin määrällä ja vapaiden radikaalien polymeroinnin reaktioajalla. Reaktion viimeinen vaihe (vapaiden radikaalien polymerointi) on kriittinen, koska se muuttaa stationäärifaasin polaarisuutta. Näiden stationäärifaasien hiilipitoisuuden tarkistamiseksi suoritettiin alkuaineanalyysi. On havaittu, että styreenin määrän ja reaktioajan lisääminen lisää stationäärifaasin hiilipitoisuutta ja päinvastoin. Eri styreenipitoisuuksilla valmistetuilla SP:illä on erilaiset hiilikuormat. Samoin nämä stationäärifaasit asetettiin ruostumattomasta teräksestä valmistetuille kolonneille ja niiden kromatografiset ominaisuudet (selektiivisyys, resoluutio, N-arvo jne.) tarkistettiin. Näiden kokeiden perusteella valittiin PMP-stationäärifaasin valmistukseen optimoitu koostumus, jolla saavutettiin kontrolloitu polaarisuus ja analyytin hyvä retentio.
PMP-kolonnia arvioitiin myös viiden peptidiseoksen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusiini-enkefaliini) analyysin osalta käyttäen liikkuvan faasin kapasiteettia. 60/40 (v/v) ACN/vesi (0,1 % TFA) virtausnopeudella 80 µl/min. Optimaalisissa eluointiolosuhteissa (200 000 levyä/m²) teoreettisten levyjen lukumäärä (N) kolonnia (100 × 1,8 mm) kohden on 20 000 ± 100. Kolmen PMP-kolonnin N-arvot on esitetty taulukossa 3 ja kromatogrammit kuvassa 5A. Nopea analyysi suurella virtausnopeudella (700 µl/min) PMP-kolonnilla, viisi peptidiä eluoitui minuutissa, erinomainen N-arvo 13 500 ± 330 kolonnia kohden (halkaisija 100 x 1,8 mm), mikä vastaa 135 000 levyä/m (kuva 5B). Kolme samankokoista kolonnia (sisähalkaisija 100 x 1,8 mm) täytettiin kolmella eri PMP-stationäärifaasierällä toistettavuuden testaamiseksi. Analyytit rekisteröitiin kullekin kolonnille erottamalla sama testiseos kussakin kolonnissa käyttäen optimaalisia eluointiolosuhteita, teoreettisten levyjen lukumäärää N ja retentioaikaa. PMP-kolonnien toistettavuustiedot on esitetty taulukossa 4. PMP-kolonnin toistettavuus korreloi hyvin erittäin matalien %RSD-arvojen kanssa, kuten taulukosta 3 käy ilmi.
Peptidiseosten erottelu PMP-kolonnilla (B) ja Ascentis Express RP-Amide -kolonnilla (A), liikkuva faasi 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP-kolonnin mitat (100 x 1,8 mm sisähalkaisija), analyysi. Yhdisteiden eluointijärjestys: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ja 5 (leusiinihappo-enkefaliini).
PMP-kolonnia (sisähalkaisija 100 x 1,8 mm) arvioitiin ihmisen seerumialbumiinin tryptiinihydrolysaatin erottamiseksi HPLC:llä. Kuvassa 6 oleva kromatogrammi osoittaa, että näytteet erottuvat hyvin ja niiden resoluutio on erittäin hyvä. HSA-liuokset analysoitiin käyttämällä virtausnopeutta 100 μl/min, liikkuvana faasina asetonitriili/vesi 70/30 ja 0,1 % TFA:ta. HSA:n pilkkoutuminen jaettiin 17 piikkiin, kuten kromatogrammissa (kuva 6) on esitetty, jotka vastaavat 17 peptidiä. Yksittäisten piikkien erotustehokkuudet HSA-hydrolysaatista laskettiin, ja arvot on esitetty taulukossa 5.
HSA-tryptiset hydrolysaatit eroteltiin PMP-kolonnilla (sisähalkaisija 100 x 1,8 mm), virtausnopeus (100 μl/min), liikkuva faasi 60/40 asetonitriili/vesi ja 0,1 % TFA.
jossa L on kolonnin pituus, η on liikkuvan faasin viskositeetti, ΔP on kolonnin vastapaine ja u on liikkuvan faasin lineaarinopeus. PMP-kolonnin permeabiliteetti oli 2,5 × 10–14 m2, virtausnopeus oli 25 µl/min, käytettiin 60/40 v/v. ACN/vesi. PMP-kolonnin (ID 100 × 1,8 mm) permeabiliteetti oli samanlainen kuin aiemmassa Ref.34-tutkimuksessamme. Pinnan huokoisilla hiukkasilla täytetyn kolonnin permeabiliteetti on 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 5 µm:n hiukkasille43. Siksi PMP-faasin permeabiliteetti on samanlainen kuin 5 μm:n kokoisten ydin-kuorihiukkasten permeabiliteetti.
jossa Wx on kloroformilla täytetyn kolonnin massa, Wy on metanolilla täytetyn kolonnin massa ja ρ on liuottimen tiheys. Metanolin tiheys (ρ = 0,7866) ja kloroformin tiheys (ρ = 1,484). Piidioksidi-C18-hiukkaskolonnin (100 × 1,8 mm ID)34 ja aiemmin tutkitun C18-urea31-kolonnin kokonaishuokoisuus oli vastaavasti 0,63 ja 0,55. Tämä tarkoittaa, että urealigandien läsnäolo vähentää stationäärifaasin läpäisevyyttä. Toisaalta PMP-kolonnin (sisähalkaisija 100 × 1,8 mm) kokonaishuokoisuus on 0,60. PMP-kolonnit ovat vähemmän läpäiseviä kuin C18-sidotuilla piidioksidihiukkasilla täytetyt kolonnit, koska C18-tyyppisissä stationäärifaaseissa C18-ligandit ovat kiinnittyneet piidioksidihiukkasiin lineaarisissa ketjuissa, kun taas polystyreenityyppisissä stationäärifaaseissa hiukkasten ympärille muodostuu suhteellisen paksu polymeeri. kerros A. Tyypillisessä kokeessa kolonnin huokoisuus lasketaan seuraavasti:
Kuvassa 7A ja B on esitetty Van Deemter -kuvaajat PMP-kolonnille (sisähalkaisija 100 x 1,8 mm) ja Ascentis Express RP-Amide -kolonnille (sisähalkaisija 100 x 1,8 mm) samoissa eluointiolosuhteissa, 60/40 ACN/H2O ja 0,1 % TFA, 20 µl/min - 800 µl/min molemmissa kolonneissa. Minimi-HETP-arvot optimaalisella virtausnopeudella (80 µl/min) olivat PMP-kolonnilla 2,6 µm ja Ascentis Express RP-Amide -kolonnilla 3,9 µm. HETP-arvot osoittavat, että PMP-kolonnin (sisähalkaisija 100 x 1,8 mm) erotustehokkuus on paljon korkeampi kuin kaupallisesti saatavilla olevan Ascentis Express RP-Amide -kolonnin (sisähalkaisija 100 x 1,8 mm). Kuvassa 7(A) oleva van Deemterin kuvaaja osoittaa, että N-arvon lasku ei ole merkittävästi suurempi virtauksen kasvaessa verrattuna edelliseen tutkimukseemme. PMP-kolonnin (sisähalkaisija 100 × 1,8 mm) korkeampi erotustehokkuus Ascentis Express RP-Amide -kolonniin verrattuna perustuu parannettuun hiukkasmuotoon ja -kokoon sekä nykyisessä työssä käytettyyn kehittyneeseen kolonnin pakkausmenetelmään34.
(A) Van Deemterin käyrä (HETP vs. liikkuvan faasin lineaarinopeus), saatu PMP-kolonnissa (sisähalkaisija 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O-seoksessa, jossa on 0,1 % TFA:ta. (B) Van Deemterin käyrä (HETP vs. liikkuvan faasin lineaarinopeus), saatu Ascentis Express RP-Amide -kolonnissa (sisähalkaisija 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O-seoksessa, jossa on 0,1 % TFA:ta.
Valmistettiin interkaloidusta polystyreenistä valmistettu polaarinen stationäärifaasi ja arvioitiin sen soveltuvuutta synteettisten peptidien ja ihmisen seerumialbumiinin (HSA) tryptisen hydrolysaatin seoksen erottamiseen korkean erotuskyvyn nestekromatografiassa. PMP-kolonnien kromatografinen suorituskyky peptidiseoksille on erinomainen erotustehokkuuden ja resoluution suhteen. PMP-kolonnien parantunut erotustehokkuus johtuu useista syistä, kuten piidioksidipartikkelikoosta ja huokoskoosta, stationäärifaasien hallitusta synteesistä ja monimutkaisista kolonnin pakkausmateriaaleista. Korkean erotustehokkuuden lisäksi tämän stationäärifaasin toinen etu on alhainen kolonnin vastapaine suurilla virtausnopeuksilla. PMP-kolonnien toistettavuus on erittäin hyvä, ja niitä voidaan käyttää peptidiseosten analysointiin ja erilaisten proteiinien tryptiseen pilkkomiseen. Aiomme käyttää tätä kolonnia bioaktiivisten yhdisteiden erottamiseen luonnontuotteista, lääkekasvien uutteista ja sienistä nestekromatografiassa. Tulevaisuudessa PMP-kolonneja arvioidaan myös proteiinien ja monoklonaalisten vasta-aineiden erottamiseen.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Käänteisfaasikromatografiaan perustuvien peptidierotusjärjestelmien tutkimus, osa I: Protokollan kehittäminen kolonnin karakterisointia varten. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Käänteisfaasikromatografiaan perustuvien peptidierotusjärjestelmien tutkimus, osa I: Protokollan kehittäminen kolonnin karakterisointia varten.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ja Petersson, P. Peptidien erotusjärjestelmien tutkimus käänteisfaasikromatografialla, osa I: Protokollan kehittäminen kolonnin karakterisointia varten. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Käänteisfaasikromatografiaan perustuvien peptidierotusjärjestelmien tutkimus, osa I: Protokollan kehittäminen kolonnin ominaisuuksia varten. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Käänteisfaasikromatografiaan perustuvien peptidierotusjärjestelmien tutkimus, osa I: Protokollan kehittäminen kolonnin ominaisuuksia varten.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ja Petersson, P. Peptidien erotusjärjestelmien tutkimus käänteisfaasikromatografialla, osa I: Protokollan kehittäminen kolonnin karakterisointia varten.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. ym. Menetelmiä parannettujen aktiivisten peptidien luomiseksi tartuntatautien hoitoon. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synteettiset terapeuttiset peptidit: Tiede ja markkinat. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synteettiset terapeuttiset peptidit: Tiede ja markkinat.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ja Chreschatyski M. Synteettiset terapeuttiset peptidit: tiede ja markkinat.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ja Khreschatsky M. Synteettiset terapeuttiset peptidit: tiede ja markkinat. Lääkekehitys. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Edistynyt proteomiikkanestekromatografia. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Edistynyt proteomiikkanestekromatografia.Katso F., Smith RD ja Shen Yu. Edistynyt proteomiikkanestekromatografia. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Edistynyt proteiinikoostumus 液相色谱.Katso F., Smith RD ja Shen Yu. Edistynyt proteomiikkanestekromatografia.J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ym. Edistynyt nestekromatografia-massaspektrometria pystyy yhdistämään laaja-alaisen metabolomiikan ja proteomiikan. peräaukko. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC:n rooli lääkekehityksessä. Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC:n rooli lääkekehityksessä.Chesnut, SM ja Salisbury, JJ UHPLC:n rooli lääkekehityksessä.Chesnut, SM ja Salisbury, JJ UHPLC:n rooli lääkekehityksessä. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Ultrakorkean paineen nestekromatografian perus- ja käytännön näkökohtia nopeissa erotteluissa. Wu, N. & Clausen, AM Ultrakorkean paineen nestekromatografian perus- ja käytännön näkökohtia nopeissa erotteluissa.Wu, N. ja Clausen, AM. Korkeapainenestekromatografian perus- ja käytännön näkökohdat nopeaa erottelua varten. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Wu, N. & Clausen, AM Erittäin korkeapainenestekromatografian perus- ja käytännön näkökohtia nopeaa erottelua varten.Wu, N. ja Clausen, AM. Korkeapainenestekromatografian perus- ja käytännön näkökohdat nopeaa erottelua varten.J. Syyskuu Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ultrasuorituskykyisen nestekromatografian käyttö lääkekehityksessä. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ultrasuorituskykyisen nestekromatografian käyttö lääkekehityksessä.Ren, SA ja Chelischeff, P. Erittäin korkean suorituskyvyn nestekromatografian käyttö lääkekehityksessä. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA ja Chelischeff, P. Ultra-tehokasnestekromatografian käyttö lääkekehityksessä.J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. ym. Monoliittinen makrohuokoinen hydrogeeli, joka on johdettu öljy-vedessä-emulsiosta, jossa on korkea sisäinen faasi enterovirus 71:n tehokkaaseen puhdistukseen. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Nestekromatografian rooli proteomiikassa. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Nestekromatografian rooli proteomiikassa.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ja Wilkins, JA Nestekromatografian rooli proteomiikassa. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ja Wilkins, JA Nestekromatografian rooli proteomiikassa.J. Chromatography. A 1053 (1–2), 27–36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Uudet trendit terapeuttisten peptidien ja proteiinien käänteisfaasinestekromatografisissa erotteluissa: Teoria ja sovellukset. & Guillarme, D. Uudet trendit terapeuttisten peptidien ja proteiinien käänteisfaasinestekromatografisissa erotteluissa: Teoria ja sovellukset. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкоистной хромора фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Uudet trendit terapeuttisten peptidien ja proteiinien erotuksessa käänteisfaasinestekromatografialla: teoria ja sovellukset. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.ja Guillarmé, D. Uudet trendit terapeuttisten peptidien ja proteiinien erotuksessa käänteisfaasinestekromatografialla: teoria ja sovellukset.J. Pharm. Biolääketieteellinen tiede. peräaukko. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Peptidien kaksiulotteinen erottelu RP-RP-HPLC-järjestelmällä, jossa on eri pH ensimmäisessä ja toisessa erotusdimensiossa. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Peptidien kaksiulotteinen erottelu RP-RP-HPLC-järjestelmällä, jossa on eri pH ensimmäisessä ja toisessa erotusdimensiossa.Gilar M., Olivova P., Dali AE ja Gebler JK Peptidien kaksiulotteinen erottelu RP-RP-HPLC-järjestelmällä, jossa on eri pH ensimmäisessä ja toisessa erotusdimensiossa.Gilar M., Olivova P., Dali AE ja Gebler JK Peptidien kaksiulotteinen erottelu käyttämällä eri pH-arvoja ensimmäisessä ja toisessa erotusdimensiossa RP-RP-HPLC-järjestelmää käyttäen. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. ym. Täysin huokoisilla ja pinnallisesti huokoisilla alle 2 µm:n C18-hiukkasilla täytettyjen korkean suorituskyvyn kromatografiakolonnien massansiirron ja kineettisten ominaisuuksien tutkimus. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. ym. Viimeaikaiset trendit ja analyyttiset haasteet kasvien bioaktiivisten peptidien eristämisessä, tunnistamisessa ja validoinnissa. peräaukko. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB ym. Elämän valtakunnan proteomiikkamaisema. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. ym. Terapeuttisten peptidien jälkikäsittely preparatiivisella nestekromatografialla. Molecules (Basel, Sveitsi) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Sekamuotoinen kromatografia ja sen sovellukset biopolymeereihin. Yang, Y. & Geng, X. Sekamuotoinen kromatografia ja sen sovellukset biopolymeereihin.Yang, Yu. ja Geng, X. Sekamuotoinen kromatografia ja sen soveltaminen biopolymeereihin. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. & Geng, X. Sekamuotoinen kromatografia ja sen käyttö biopolymeereissä.Yang, Yu. ja Gene, X. Sekamuotoinen kromatografia ja sen soveltaminen biopolymeereihin.J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).