Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Angustifolius lupiini (NLL, Lupinus angustifolius L.) on palkokasvi, jota käytetään ruoantuotantoon ja maanparannustamiseen.NLL:n maailmanlaajuinen leviäminen viljelykasvina on houkutellut monia patogeenisiä sieniä, mukaan lukien lupiiniantraknoosi, joka aiheuttaa tuhoisan antraknoositaudin.Kaksi alleelia, Lanr1 ja AnMan, jotka lisäävät resistenssiä, on käytetty NLL-jalostuksessa, mutta taustalla olevat molekyylimekanismit ovat edelleen tuntemattomia.Tässä tutkimuksessa Lanr1- ja AnMan-markkereita käytettiin eurooppalaisten NLL-näytteiden seulomiseen.Rokotteen testaus kontrolloidussa ympäristössä vahvisti molempien resistenttien luovuttajien tehon.Differentiaalinen geeniekspression profilointi suoritettiin edustaville resistenteille ja herkille linjoille.Antraknoosiresistenssi yhdistettiin geeniontologian termien "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" ja "GO:0015979 Photosynthesis" yli-ilmentymiseen.Lisäksi Lanr1(83A:476)-linja osoitti merkittävää transkription uudelleenohjelmointia nopeasti rokotuksen jälkeen, kun taas muut linjat osoittivat tämän vasteen viivettä noin 42 tuntia.Puolustusvasteet liittyvät TIR-NBS-, CC-NBS-LRR- ja NBS-LRR-geeneihin, 10 patogeneesiin osallistuvaan proteiiniin, lipidinsiirtoproteiineihin, endoglukaani-1,3-β-glukosidaasiin, glysiinirikkaisiin soluseinäproteiineihin ja hapen reaktiivisen reitin geeneihin.Varhaiset vasteet 83A:476:lle, mukaan lukien fotosynteesiin liittyvien geenien huolellinen tukahduttaminen, osuivat samaan aikaan onnistuneen suojan kanssa sienibiologian vegetatiivisen kasvuvaiheen aikana, mikä viittaa siihen, että efektori laukaisee immuniteetin.Mandeloop-reaktio hidastuu, kuten myös yleinen vaakasuora vastus.
Kapealehtinen lupiini (NLL, Lupinus angustifolius L.) on proteiinipitoinen vilja, joka on peräisin läntiseltä Välimeren alueelta1,2.Nykyään sitä viljellään eläinten ja ihmisten ravintokasvina.Sitä pidetään myös viherlantana viljelykiertojärjestelmissä symbioottisten typpeä sitovien bakteerien aiheuttaman typen sitomisen ja maaperän rakenteen yleisen parantamisen vuoksi.NLL on käynyt läpi nopean kesyttämisprosessin viime vuosisadalla ja on edelleen suuren lisääntymispaineen alainen3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.NLL:n laajan viljelyn myötä patogeenisten sienten peräkkäisyys loi uusia maatalouden markkinarakoja ja aiheutti uusia satoa tuhoavia sairauksia. Lupiinin viljelijöille ja kasvattajille merkittävintä oli antraknoosin ilmaantuminen, jonka aiheuttivat patogeeninen sieni Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupiinin viljelijöille ja kasvattajille merkittävintä oli antraknoosin ilmaantuminen, jonka aiheuttivat patogeeninen sieni Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванногоныrich памеров, вызванногоныrich памеров Nirenberg, Feiler ja Hagedorn13. Merkittävin lupiinin viljelijöille ja kasvattajille oli patogeenisen sienen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 aiheuttaman antraknoosin ilmaantuminen.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它昏现，它昏由病tondar) enberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它昏现，它是生Colle嵵hiuksinen.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракмрительным для фермеров Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Silmiinpistävin lupiinin viljelijöille ja kasvattajille on patogeenisen sienen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 aiheuttama antraknoosin ilmaantuminen.Varhaisimmat ilmoitukset taudista tulivat Brasiliasta ja Yhdysvalloista, ja tyypillisiä oireita ilmaantui vuosina 1912 ja 1929.Noin 30 vuoden kuluttua taudinaiheuttajalle annettiin kuitenkin nimi Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfi Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfi Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauldin teleomorfi. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .ja H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.ja H. Schlenk, .1900-luvun puolivälissä tehty alustava taudin fenotyyppimääritys osoitti jonkin verran vastustuskykyä NLL:n ja keltaisen lupiinin (L. luteus L.) kasvaimissa, mutta kaikki tutkitut valkoisen lupiinin (L. albus L.) infektiot olivat erittäin herkkiä15,16.Tutkimukset ovat osoittaneet, että antraknoosin kehittyminen liittyy lisääntyneeseen sademäärään (ilman kosteus) ja lämpötilaan (12-28 °C), mikä johtaa vastustuskyvyn rikkomiseen korkeammissa lämpötiloissa17, 18. Itse asiassa aika, joka vaadittiin konidien itämiseen ja taudin alkamiseen, oli neljä kertaa lyhyempi 24 °C:ssa korkeassa kosteudessa (6 tuntia) (12 tuntia).Niinpä meneillään oleva ilmaston lämpeneminen on johtanut antraknoosin leviämiseen.Tauti havaittiin kuitenkin Ranskassa (1982) ja Ukrainassa (1983) uhkaavan uhan ennakkoedustajana, mutta lupiiniteollisuus ilmeisesti jätti sen tuolloin huomiotta20,21.Muutamaa vuotta myöhemmin tämä tuhoisa tauti levisi ympäri maailmaa ja vaikutti myös suuriin lupiinintuottajamaihin, kuten Australiaan, Puolaan ja Saksaan22,23,24.1990-luvun puolivälin antraknoosiepidemian jälkeen laaja seulonta johti useiden vastustuskykyisten luovuttajien tunnistamiseen NLL19-näytteistä.NLL-resistenssiä antraknoosille säätelee kaksi erillistä hallitsevaa alleelia, jotka löytyvät eri ituplasmalähteistä: Lanr1 lajikkeessa Tanjil ja Wonga ja AnMan lajikkeessa.Mandalay 25, 26. Nämä alleelit täydentävät molekyylimarkkereita, jotka tukevat resistenttien ituplasman valintaa jalostusohjelmissa25,26,27,28,29,30.Lanr1-alleelin kantava resistentti jalostuslinja 83A:476 risteytettiin herkän villilinjan P27255 kanssa antraknoosiresistenssin suhteen erottuvan RIL-populaation saamiseksi, mikä mahdollisti Lanr1-lokuksen osoittamisen kromosomiin NLL-1131, 32, 33. Genoamisresistenssin kohdistaminen muurahaisrakenteeseen. paljasti kaikkien kolmen alleelin sijainnin samassa kromosomissa (NLL-11), mutta eri asemissa29,34,35.Kuitenkin, koska RIL:ien määrä on pieni ja geneettinen etäisyys markkerien ja vastaavien alleelien välillä on suuri, niiden taustalla olevista geeneistä ei voida tehdä luotettavia johtopäätöksiä.Toisaalta käänteisen genetiikan käyttö lupiineilla on vaikeaa niiden erittäin alhaisen regeneraatiopotentiaalin vuoksi, mikä tekee geenimanipulaatiosta vaivalloista37.
Homotsygoottisessa tilassa haluttua alleelia, kuten 83A:476 (Lanr1) ja Mandelup (AnMan) kantavan kesytetyn ituplasman kehittyminen on avannut oven antraknoosiresistenssin tutkimukselle, koska luonnonvaraisissa populaatioissa on vastakkaisia ​​alleeliyhdistelmiä.Molekyylimekanismien mahdollisuudet.Vertaa tiettyjen genotyyppien tuottamia puolustusvasteita.Tässä tutkimuksessa arvioitiin NLL:n varhainen transkriptiovaste C. lupini -rokotteelle.Ensin seulottiin eurooppalainen NLL- ituplasmapaneeli, joka sisälsi 215 linjaa, käyttämällä molekyylimarkkereita, jotka merkitsevät Lanr1- ja AnMan-alleelit.Antraknoosin fenotyypitys suoritettiin sitten 50 NLL-linjalle, jotka oli aiemmin valittu molekyylimarkkereille, kontrolloiduissa olosuhteissa.Näiden kokeiden perusteella neljä linjaa, jotka eroavat antraknoosiresistenssistä ja Lanr1/AnMan-alleelisesta koostumuksesta, valittiin differentiaaliseen puolustusgeeniekspression profilointiin käyttämällä kahta toisiaan täydentävää lähestymistapaa: korkean suorituskyvyn RNA-sekvensointia ja reaaliaikaista PCR-kvantifiointia.
NLL- ituplasmasarjan (N = 215) seulonta markkereilla Lanr1 (Anseq3 ja Anseq4) ja AnMan (Anseq4) ja AnMan (AnManM1) osoitti, että vain yksi linja (95726, lähellä Salamanca-b:tä) vahvistaa "resistenssi"-alleelin kaikille allelles-markkereille, kun taas alleles8:n alleles-resepti (~73,5 %) riviä.Kolmetoista linjaa tuotti kaksi Lanr1-markkerin "resistenttiä" alleelia ja 8 linjaa tuotti Lanr1:n "resistenttejä" alleelia.merkki.AnMan-markkerin "resistenssi"-alleeli (lisätaulukko S1).Kaksi linjaa oli heterotsygoottisia Anseq3-markkerille ja yksi heterotsygoottinen AnManM1-markkerille.42 linjaa (19,5 %) kantoi Anseq3- ja Anseq4-alleelien vastakkaisia ​​vaiheita, mikä osoittaa, että näiden kahden lokuksen välillä on korkea rekombinaatiotaajuus.Antraknoosin fenotyypit kontrolloiduissa olosuhteissa (lisätaulukko S2) paljastivat vaihtelua testattujen genotyyppien vastustuskyvyssä, mikä heijastui antraknoosin vakavuuteen.Erot keskiarvopisteissä vaihtelivat välillä 1,8 (kohtalainen resistentti) - 6,9 (herkkä) ja kasvien painoerot välillä 0,62 (herkkä) - 4,45 g (resistentti). Kokeen kahdessa toistossa havaittujen arvojen välillä (0,51 taudin vakavuuspisteille, P = 0,00017 ja 0,61 kasvin painolle, P < 0,0001) sekä näiden kahden parametrin välillä (-0,59 ja -0,77, P < 0,0001) oli merkittävä korrelaatio. Kokeen kahdessa toistossa havaittujen arvojen välillä oli merkittävä korrelaatio (0,51 taudin vakavuuspisteille, P = 0,00017 ja 0,61 kasvin painolle, P < 0,0001) sekä näiden kahden parametrin välillä (-0,59 ja -0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 твизбялдолеяя , P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,7,0,0) 0,7,0). Merkittävä korrelaatio havaittiin kokeen kahdessa toistossa havaittujen arvojen välillä (0,51 taudin vakavuuspisteille, P = 0,00017 ja 0,61 kasvin painolle, P < 0,0001) sekä näiden kahden parametrin välillä (-0,59 ja -0,77, P < 0,0000)1).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评严重程度评严重程度评弥0，0.1，物重量为0,61, P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严 庺 円 评. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p < 0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（，和和 和 .5-9-5-5-9.和 – 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях, 0,0,0,0,0,0,0,5 0017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 ja -0,0001) 0,77, P <0,0001. Kaksinkertaisesti havaittujen arvojen (sairauden vakavuuspisteet 0,51, P = 0,00017 ja kasvin paino 0,61, P < 0,0001) ja näiden kahden parametrin välillä (-0,59 ja -0,0001) oli merkittävä korrelaatio 0,77, P<0,0001. ).Tyypillisiä herkillä kasveilla havaittuja oireita ovat varren taipuminen ja vääntyminen, joka muistuttaa "paimenen jousi" -rakennetta, mitä seuraa soikeat vauriot, joissa on oransseja/vaaleanpunaisia ​​sporotsoiitteja (täydentävä kuva 1).Australialaiset Lanr1- (83A:476 ja Tanjil)- ja AnMan- (Mandelup)-geenit ovat kohtalaisen resistenttejä, 0,0331 ja 0,0036.Jotkut linjat, jotka sisältävät myös "resistenttejä" Lanr1- ja/tai AnMan-alleeleja, osoittavat taudin oireita.
Mielenkiintoista on, että muutamat NLL-linjat, joista puuttui "resistentti" markkerialleeli, paljastivat korkean antraknoosiresistenssin tason (vertailukelpoinen tai korkeampi kuin Lanr1- tai AnMan-genotyypeillä), kuten Boregine (P-arvo < 0,0001 molemmille parametreille), Bojar (P-arvo < 0,0001 pisteille ja 0,001 Populaatioarvo < 0,000 kasville) (0,001 P9b/7 paino) 1 pistemäärälle ja ei-merkittävä painolle). Mielenkiintoista on, että muutamat NLL-linjat, joista puuttui "resistentti" markkerialleeli, paljastivat korkean antraknoosiresistenssin tason (vertailukelpoinen tai korkeampi kuin Lanr1- tai AnMan-genotyypeillä), kuten Boregine (P-arvo < 0,0001 molemmille parametreille), Bojar (P-arvo < 0,0001 pisteille ja 0,001 Populaatioarvo < 0,000 kasville) (0,001 P9b/7 paino) 1 pistemäärälle ja ei-merkittävä painolle). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высовейх высколько высокий кнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 длахеро1 е P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для для чимоцене). Mielenkiintoista on, että useat NLL-linjat, joista puuttui mikään "resistentti" markkerialleeli, osoittivat korkeaa resistenssitasoa antraknoosille (verrattavissa Lanr1- tai AnMan-genotyypeille tai korkeampi), kuten Boregine (P-arvo < 0,0001 molemmille parametreille), Bojar (P-arvo < 0,0001 arvioinnissa ja B-arvo <0,0001 kasvin painolle ja B-arvo 0,0,0b/9) 01 arvioinnissa ja ei merkitse painoa).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高気平示出高気平的炭爊縅平的炭疍基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值侗高.001＇0 .001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）. On mielenkiintoista, että joissakin NLL-järjestelmissä, joissa ei ole "antigeenisiä" markkereita, on korkea vaakasuora vastustuskyky (vastaa Lanr1- tai AnMan-geenejä tai korkeampia), kuten Boregine (molemmat parametrit P < 0,0001), Bojar (P-arvo < 0,0001, kasvin paino 0,001) ja kanta B-549/0,00, ei merkitsevä arvo (P0 <10, paino). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высок ракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,00,00есна1), Boче0,0001 са растения 0,001) ja популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Mielenkiintoista on, että joillakin NLL-linjoilla, joista puuttui resistenssin merkkialleeleja, oli korkea antraknoosiresistenssi (verrattavissa Lanr1- tai AnMan-genotyyppeihin tai suurempi kuin), kuten Boregine (P-arvo molemmille parametreille <0,0001), Bojar (P-arvo <0,0001, kasvin paino < 0,0001, kasvin paino 0,00-51)/P70b041. 01, paino ei merkittävä).Tämä ilmiö viittaa uuden geneettisen resistenssin lähteen mahdollisuuteen, mikä selittää havaitun korrelaation puutteen markkerien genotyyppien ja sairauden fenotyyppien välillä (P-arvot ~ 0,42 - ~ 0,98).Siten Kolmogorov-Smirnov-testi osoitti, että antraknoosiresistenssitiedot jakautuivat suunnilleen normaalisti pisteille (P-arvot 0,25 ja 0,11) ja kasvin massalle (P-arvot 0,47 ja 0,55), mikä viittaa siihen, että oletan, että mukana on enemmän alleeleja kuin Lanr1 ja AnMan.
Antraknoosiresistenssiseulonnan tulosten perusteella transkriptianalyysiin valittiin 4 linjaa: 83A:476, Boregine, Mandelup ja Population 22660. Nämä linjat testattiin uudelleen pernaruttoresistenssin suhteen rokotuskokeissa RNA-sekvensoinnilla edellyttäen, että ne olivat samat kuin edellisessä testissä.Pistearvot olivat seuraavat: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) ja väestö 22 660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000 -protokolla saavutti keskimäärin 40,5 Mread-paria näytettä kohti (29,7 - 54,4 Mreads) (lisätaulukko S3).Kohdistuspisteet vertailusekvenssissä vaihtelivat välillä 75,5 % - 88,6 %.Lukumäärätietojen keskimääräinen korrelaatio kokeellisten varianttien välillä biologisten kopioiden välillä vaihteli välillä 0,812 - 0,997 (keskiarvo 0,959). Analysoiduista 35 170 geenistä 2 917 ei paljastanut ilmentymistä, ja muut 4 785 geeniä ilmentyivät mitättömällä tasolla (peruskeskiarvo < 5). Analysoiduista 35 170 geenistä 2 917 ei paljastanut ilmentymistä, ja muut 4 785 geeniä ilmentyivät mitättömällä tasolla (peruskeskiarvo < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались генов 2917 ое среднее <5). Analysoiduista 35 170 geenistä 2 917 ei osoittanut ekspressiota, ja loput 4 785 geeniä ilmentyivät mitättömällä tasolla (peruskeskiarvo <5).在分析的35 170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽值< 5).35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительсельную генов 2917 е значение <5). Analysoiduista 35 170 geenistä 2917 ei ekspressoitunut ja lopuilla 4785 geenillä oli mitätön ilmentyminen (peruskeskiarvo <5).Siten ekspressoituneiden geenien lukumäärä (peruskeskiarvo ≥ 5) kokeen aikana oli 27 468 (78,1 %) (lisätaulukko S4).
Ensimmäisestä ajankohdasta lähtien kaikki NLL-linjat reagoivat C. lupinin (kanta Col-08) inokulaatioon ohjelmoimalla transkriptomin uudelleen (taulukko 1), mutta linjojen välillä havaittiin merkittäviä eroja.Siten resistenssilinja 83A:476 (joka kantaa Lanr1-geeniä) osoitti merkittävää transkription uudelleenohjelmointia ensimmäisessä aikapisteessä (6 hpi) ja 31-69-kertainen lisäys eristettyjen ylös- ja alaspäin suuntautuvien geenien määrässä verrattuna muihin ajankohtiin tässä ajankohdassa.Lisäksi tämä huippu oli lyhytikäinen, koska vain muutaman geenin ilmentyminen pysyi merkittävästi muuttuneena toisessa aikapisteessä (12 hpi).Mielenkiintoista on, että Boregine, joka osoitti myös korkeaa vastustuskykyä siirretestissä, ei käynyt läpi niin massiivista transkription uudelleenohjelmointia kokeen aikana.Erilaisesti ilmentyneiden geenien (DEG) lukumäärä oli kuitenkin sama Boreginen ja 83A:476:n kohdalla 12 HPI:llä.Sekä Mandelup että populaatio 22660 osoittivat DEG-huippuja viimeisellä aikapisteellä (48 l/s), mikä osoittaa suhteellista viivettä puolustusvasteissa.
Koska 83A:476:lle tehtiin massiivinen transkriptio-uudelleenohjelmointi vasteena C. lupinille 6 HPI:llä verrattuna kaikkiin muihin linjoihin, ~91 % tällä hetkellä havaituista DEG:istä oli sukulinjaspesifisiä (kuvio 1).Tutkimuslinjojen välillä oli kuitenkin jonkin verran päällekkäisyyttä varhaisissa vastauksissa, koska 68,5 %, 50,9 % ja 52,6 % DEG Boreginen, Mandelupissa ja väestössä 22660, vastaavasti, olivat päällekkäisiä 83A:476:n kanssa tiettyinä aikoina.Nämä DEG:t muodostivat kuitenkin vain pienen osan (0,97–1,70 %) kaikista tällä hetkellä 83A:476:lla havaituista DEG:istä.Lisäksi 11 DEG:tä kaikista linjoista oli tällä hetkellä koherentteja (lisätaulukot S4-S6), mukaan lukien kasvien puolustusreaktioiden yhteiset komponentit: lipidinsiirtoproteiini (TanjilG_32225), endoglukaani-1,3-β-glukosidientsyymi (TanjilG_23384), kaksi stressiindusoituvaa proteiinia (TanjilG_2200018, kuten Tanjil518) 31), emäksinen lateksiproteiini (TanjilG_32352) ja kaksi glysiinirikasta rakenteellista soluseinäproteiinia (TanjilG_19701 ja TanjilG_19702).Transkriptiovasteissa oli myös suhteellisen suuri päällekkäisyys 83A:476:n ja Boreginen välillä 24 HPI:ssä (yhteensä 16-38 % DEG) ja Mandelupin ja Population 22660 välillä 48 HPI:ssä (yhteensä 14-20 % DEG).
Venn-diagrammi, joka esittää differentiaalisesti ilmentyneiden geenien (DEG) lukumäärän kapealehtislupiinilinjoissa (NLL), joihin on inokuloitu Colletotrichum lupini (kanta Col-08, joka on saatu lupiinipelloilta Wierzhenicessa, Puolassa, 1999).Analysoidut NLL-linjat olivat: 83A:476 (resistentti, kantaa Lanr1-alleelin), Boregine (resistentti, geneettinen tausta tuntematon), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa AnMan-alleelin) ja populaatio 22660 (erittäin herkkä).Lyhenne hpi tarkoittaa tunteja rokotuksen jälkeen.Nolla-arvot on poistettu kaavion yksinkertaistamiseksi.
Yli-ilmentyneiden geenien sarja 6 hpi:ssä analysoitiin kanonisten R-geenidomeenien läsnäolon suhteen (lisätaulukko S7).Tämä tutkimus paljasti klassisten tautiresistenssigeenien transkription induktion NBS-LRR-domeeneilla vain kohdassa 83A:476.Tämä sarja koostui yhdestä TIR-NBS-LRR-geenistä (tanjilg_05042), viidestä CC-NBS-LRR-geenistä (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 ja tanjilg_16162) ja neljästä NBS_1LR- ja Tanilgjilg6LR (Tanjilg2LR) (tanjilg6,16162). 162) sekä Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) ja Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Kaikilla näillä geeneillä on kanonisia domeeneja, jotka on järjestetty konservoituneiksi sekvensseiksi.NBS-LRR-domeenigeenien lisäksi useita RLL-kinaaseja aktivoitui 6 hpi:ssä, nimittäin yksi Boreginen (TanjilG_19877), kaksi Mandelupissa (TanjilG_07141 ja TanjilG_19877) ja populaatiossa 22660 (TanjilG_02 in361 ja 371) :476.
Geeneille, joiden ilmentyminen oli merkittävästi muuttunut vasteena C. lupinilla (kanta Col-08), suoritettiin geeniontologian (GO) rikastusanalyysi (lisätaulukko S8). Useimmin yliedustettu biologisen prosessin termi oli "GO:0006952 puolustusvaste", joka esiintyi 6:ssa 16:sta (aika × viiva) yhdistelmästä, joilla oli suuri merkitys (P-arvo < 0,001) (kuva 2). Useimmin yliedustettu biologisen prosessin termi oli "GO:0006952 puolustusvaste", joka esiintyi 6:ssa 16:sta (aika × viiva) yhdistelmästä, joilla oli suuri merkitys (P-arvo < 0,001) (kuva 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защиятный», отовсятный 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (ris. 2). Useimmin yliedustettu biologisen prosessin termi oli "GO:0006952 puolustusvaste", joka esiintyi 6:ssa 16:sta (aika × linja) yhdistelmästä, joilla oli suuri merkitys (P-arvo < 0,001) (kuva 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个个中，具有高显着性(P 值< 0,001）（图2）). Edustavin biologinen prosessitermi on "GO:0006952 puolustusvaste", joka esiintyy 6:ssa 16:sta (时间×线) yhdistelmästä, ja sen merkitys on suuri (P-arvo < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», копяры инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (riis. 2). Yleisimmin yliedustettu biologisen prosessin termi oli 'GO:0006952 Defense Response', joka esiintyi 6:ssa 16 yhdistelmästä (aika × viiva), joilla oli suuri merkitys (P-arvo < 0,001) (kuva 2).Tämä termi oli yliedustettu kahdessa aikapisteessä 83A:ssa: 476 ja Boregine (6 ja 24 hpi) ja yhdessä ajankohtana Mandelupissa ja Population 22660:ssa (12 ja 6 hpi).Tämä on odotettu tulos, joka korostaa vastustuskykyisten linjojen antifungaalista vastetta.Lisäksi 83A:476 vastasi C. lupiniin indusoimalla nopeasti geenejä, jotka liittyvät oksidatiiviseen purskeeseen, jota edustaa termi "GO:0055114 redox-prosessi", mikä osoitti spesifistä puolustusvastetta, kun taas Boregine paljasti spesifisiä puolustusreaktioita, jotka liittyvät termiin "GO".:0006950 Stressireaktio”.Populaatio 22660 aktivoi horisontaalisen resistenssivasteen, johon liittyy sekundäärisiä aineenvaihduntatuotteita, korostaen liian suurta määrää termejä "GO:0016104 Triterpeenin biosynteesiprosessi" ja "GO:0006722 Triterpeenin aineenvaihduntaprosessi" (molemmat termit kuuluvat samaan geenisarjaan), ottaen huomioon Boregeenin rikastumisreaktion analyysin tulokset2 GO6-termi. 60. Lisäksi varhainen reaktio 83A:476 (6 hpi) ja viivästetty reaktio Mandelup ja Population 22660 sisältävät termin GO:0015979 "fotosynteesi" ja muita vastaavia biologisia prosesseja.
Biologisen prosessin geeniontologiatermit, jotka on valittu erilaisesti ilmentyneiden geenien annotaatiossa pernaruttolupiinilla inokuloidun kapealehtisen lupiinin (NLL) transkriptiovasteissa (Col-08-kanta, joka on saatu lupiinipelloilta Wierzhenicen Puolassa vuonna 1999), ovat suuresti liioiteltuja.Analysoidut NLL-linjat olivat: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Boregine (resistentti, tuntematon geneettinen tausta), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia) ja populaatio 22660 (herkkä).
Koska tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa geenejä, jotka edistävät antraknoosiresistenssiä, termeille GO ”GO: 0006952 Defensive vasteet” ja ”GO: 0055114 Redox-prosessit” nimetyt geenit analysoitiin raja-arvoilla, koska lähtötilanteen keskiarvo on ≥ 30 vähintään yhdellä rivillä.× ajanhetki, joka yhdistää tilastollisesti merkitsevät log2:n arvot (kertamuutos).Nämä kriteerit täyttävien geenien lukumäärä oli 65 GO:0006952:lle ja 524 GO:0055114:lle.
83A:476 paljasti kaksi DEG-huippua, joihin oli merkitty termi GO:0006952, ensimmäinen 6 geeniä tuumaa kohti (64 geeniä, ylös- ja alassäätö) ja toinen 24 geeniä tuumaa kohti (15 geeniä, vain ylössäätö).Boregine osoitti myös, että GO:0006952 saavutti huippunsa samassa pisteessä, mutta pienemmällä DEG:llä (11 ja 8) ja etusijalla.Mandeloop osoitti kaksi GO:0006952:n huippua kohdissa 12 ja 48 HPI, molemmissa 12 geeniä (ensimmäisessä aktivoivat geenit ja toisessa vain suppressoivat geenit), kun taas 22660:n populaatiolla 6 HPI:llä (13 geeniä) oli suurempi nousuhuippu.säätö.On huomattava, että 96,4 %:lla GO:0006952 DEG:stä näissä huipuissa oli samantyyppinen vaste (ylös tai alas), mikä osoittaa merkittävää päällekkäisyyttä puolustusvasteissa huolimatta eroista mukana olevien geenien lukumäärässä.Suurin sekvenssien ryhmä, joka liittyy termiin GO:0006952, koodaa Starvation Stress-Associated Message Protein 22:ta (SAM22-like), joka kuuluu luokan 10 patogeneesiin liittyvän proteiinin (PR-10) proteiinikladiin ja ydinproteiinilateksiin.samanlainen (MLP:n kaltainen) proteiini) proteiini (kuvio 3).Nämä kaksi ryhmää erosivat ilmaisun luonteesta ja vastauksen suunnasta.Geenit, jotka koodaavat SAM22:n kaltaisia ​​proteiineja, osoittivat johdonmukaista ja merkittävää induktiota aikaisina ajankohtina (6 tai 12 hpi) eivätkä yleensä reagoineet kokeen lopussa (48 hpi), kun taas MLP:n kaltaiset proteiinit osoittivat koordinaatiota 6 hpi:llä.hpi.83A:476 ja Mandelup 48 hv/in, lähes kaikki muut datapisteet eivät reagoineet.Lisäksi erot SAM22:n kaltaisten proteiinigeenien ilmentymisprofiileissa seurasivat antraknoosiresistenssin havaittua vaihtelua, koska vastustuskykyisemmillä linjoilla oli enemmän aikapisteitä, jotka indusoivat merkittävästi näitä geenejä kuin herkemmillä geeneillä.Toinen LlR18A/B:n kaltainen PR-10-geeni osoitti hyvin samanlaista ilmentymismallia kuin SAM22:n kaltainen proteiinigeeni.
Biologisen prosessitermin "GO:0006952 Defense Response" pääkomponentit ja Lanr1- ja AnMan-alleelien ehdokasgeenien ilmentymismallit tunnistettiin.Log2-asteikko edustaa log2-arvoja (kertainen muutos) inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta, Wizhenica, Puola, 1999) ja kontrollikasvien (valesiirrostettu) välillä samaan aikaan.Seuraavat kapealehtiset lupiinilinjat analysoitiin: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Boregine (resistentti, geneettistä taustaa tuntematon), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia) ja populaatio 22660 (herkkä).
Lisäksi arvioitiin RNA-seq-ehdokasgeenien Lanr1 (TanjilG_05042) ja AnMan (TanjilG_12861) ilmentymisprofiilit (kuvio 3).TanjilG_05042-geeni osoitti merkittävää vastetta (aktivaatiota) kohdassa 83A:476 vain ensimmäisessä aikapisteessä (6 hpi), kun taas TanjilG_12861 oli merkittävä Mandeloopissa vain kahdella aikapisteellä: 6 hpi (alassäätö) ja 24 hpi (6 hpi).Kanssa.).säädettävä)).
Eniten yli-ilmennetyt geenit termissä GO:0055114 "pelkistysprosessi" olivat sytokromi P450 -proteiineja ja peroksidaasia koodaavia geenejä (kuvio 4).83A:476:sta eristetyissä näytteissä 6 HPI:llä maksimi- tai minimilog2-arvot (kertainmuutos) (86,6 %:lla geeneistä) havaittiin yleensä inokuloitujen ja kontrollikasvien välillä, mikä korostaa tämän genotyypin suurta vastetta rokotettaviksi sukupuoliksi.83A:476 osoitti merkittävimmän GO: 0055114 DEG 6 hpi:ssä (503 geeniä), kun taas muut linjat 48 hpi:ssä (Boregine, 31 geeniä; Mandelup, 85 geeniä; ja populaatio 22660, 78 geeniä)).Useimmissa GO:0055114-perheen geeneissä havaittiin kahden tyyppisiä vasteita rokotukselle (aktivaatio ja esto).Mielenkiintoista on, että jopa 97,6 % DEG:istä, jotka tunnistettiin termille GO: 0055114 Mandelupessa teholla 48 hv Nämä havainnot viittaavat siihen, että huolimatta huomattavasti pienemmästä mittakaavasta (eli mutatoituneiden redox-geenien määrä, 85 vs. 503), viivästettyjen transkriptiovasteiden malli 6:4:n varhaiselle mandeloosille on samanlainen.Boreginessa ja väestössä 22660 tämä lähentyminen on pienempi, 51,6 % ja 75,6 %.
Biologisen prosessin termin "GO:0055114 Redox-prosessi" pääkomponenttien ilmentymismallit paljastettiin.Log2-asteikko edustaa log2-arvoja (kertainen muutos) inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta, Wizhenica, Puola, 1999) ja kontrollikasvien (valesiirrostettu) välillä samaan aikaan.Seuraavat kapealehtiset lupiinilinjat analysoitiin: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Boregine (resistentti, geneettistä taustaa tuntematon), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia) ja populaatio 22660 (herkkä).
83A:476 Transkriptomiset vasteet C. lupinilla (kanta Col-08) siirrostukseen sisälsivät myös termille GO:0015979 "fotosynteesi" ja muihin vastaaviin biologisiin prosesseihin liittyvien geenien koordinoidun hiljentämisen (kuvio 5).Tämä GO:0015979 DEG-sarja sisälsi 105 geeniä, jotka repressoituivat merkittävästi 6 hpi:llä 83A:476:ssa.Tässä alajoukossa myös 37 geeniä säädeltiin alas Mandelupissa 48 HPI:ssä ja 35 samaan aikaan 22 660:n populaatiossa, mukaan lukien 19 DEG:tä, joka on yhteistä molemmille genotyypeille.Termiin GO: 0015979 liittyviä DEG:itä ei aktivoitu merkittävästi missään yhdistelmässä (rivi x aika).
Biologisen prosessin "GO:0015979 Fotosynteesi" termin pääkomponenttien ilmentymismallit paljastettiin.Log2-asteikko edustaa log2-arvoja (kertainen muutos) inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta, Wizhenica, Puola, 1999) ja kontrollikasvien (valesiirrostettu) välillä samaan aikaan.Seuraavat kapealehtiset lupiinilinjat analysoitiin: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Boregine (resistentti, geneettistä taustaa tuntematon), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia) ja populaatio 22660 (herkkä).
Differentiaalisen ilmentymisanalyysin tulosten perusteella ja oletettavasti mukana puolustusvasteissa patogeenisia sieniä vastaan, tämä seitsemän geenin sarja valittiin ekspressioprofiilien kvantifiointiin reaaliaikaisella PCR:llä (lisätaulukko S9).
Oletettu proteiinigeeni TanjilG_10657 indusoitui merkittävästi kaikissa tutkituissa linjoissa ja aikapisteissä verrattuna kontrollikasveihin (jäljittelevä) (lisätaulukot S10, S11).Lisäksi TanjilG_10657:n ilmentymisprofiili osoitti kasvavaa trendiä kokeen aikana kaikilla linjoilla.Populaatio 22660 osoitti TanjilG_10657:n korkeimman herkkyyden rokotukselle 114-kertaisella aktivaatiolla ja korkeimman suhteellisella ekspressiotasolla (4,4 ± 0,4) 24 HPI:llä (kuvio 6a).PR10 LlR18A -proteiinigeeni TanjilG_27015 osoitti myös aktivaatiota kaikissa linjoissa ja aikapisteissä tilastollisesti merkitsevästi useimmissa datapisteissä (kuvio 6b).Kuten TanjilG_10657, TanjilG_27015:n korkein suhteellinen ilmentymistaso havaittiin 22 660:lla rokotetulla populaatiolla 24 HPI:llä (19,5 ± 2,4).Hapan endokitinaasigeeni TanjilG_04706 oli merkittävästi ylössäädelty kaikissa linjoissa ja kaikkina ajankohtina paitsi Boregine 6 hpi:ssä (kuvio 6c).Se indusoitui voimakkaasti ensimmäisessä aikapisteessä (6 HPI) 83A:476:lla (10,5 kertaa) ja lisääntyi kohtalaisesti muissa linjoissa (6,6-7,5 kertaa).Kokeen aikana TanjilG_04706:n ilmentyminen pysyi samalla tasolla 83A:476:ssa ja Boreginen, kun taas Mandelupissa ja Populaatiossa 22660 se kasvoi merkittävästi saavuttaen suhteellisen korkeat arvot (5,9 ± 1,5 ja 6,2 ± 1,5).Endoglukaani-1,3-β-glukosidaasia muistuttava geeni TanjilG_23384 osoitti suurta aktivaatiota kahdessa ensimmäisessä aikapisteessä (6 ja 12 hpi) kaikissa linjoissa paitsi populaatiossa 22660 (kuvio 6d).TanjilG_23384:n korkeimmat suhteelliset ilmentymistasot havaittiin toisessa ajankohdassa (12 hpi) Mandelupissa (2,7 ± 0,3) ja 83A:476:ssa (1,5 ± 0,1).24 HPI:llä TanjilG_23384:n ilmentyminen oli suhteellisen alhainen kaikissa tutkituissa linjoissa (0,04 ± 0,009 - 0,44 ± 0,12).
Valittujen geenien (ag) ilmentymisprofiilit paljastettiin kvantitatiivisella PCR:llä.Numerot 6, 12 ja 24 edustavat tunteja rokotuksen jälkeen.LanDExH7- ja LanTUB6-geenejä käytettiin normalisointiin ja LanTUB6:ta sarjojen väliseen kalibrointiin.Virhepalkit edustavat standardipoikkeamaa, joka perustuu kolmeen biologiseen toistoon, joista jokainen on kolmen teknisen toiston keskiarvo. Inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu vuonna 1999 lupiinipellolta Wierzenicassa, Puolassa) ja kontrollikasvien (valesiirrostettu) kasvien välisten ilmentymistasojen erojen tilastollinen merkitsevyys on merkitty datapisteiden yläpuolelle (*P-arvo < 0,05, **P-arvo ≤ 01,0,0,0). Inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu vuonna 1999 lupiinipellolta Wierzenicassa, Puolassa) ja kontrollikasvien (valesiirrostettu) kasvien välisten ilmentymistasojen erojen tilastollinen merkitsevyys on merkitty datapisteiden yläpuolelle (*P-arvo < 0,05, **P-arvo ≤ 01,0,0,0). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменпо Col-08, 1999 Col-08 я люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точнихе, 0,5 над точниче ение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Tilastollisesti merkitsevät erot ilmentymistasoissa inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu vuonna 1999 lupiinipellolta Wierzhenicessa, Puolassa) ja kontrollikasvien (valesiirrostettu) välillä havaitaan datapisteiden yläpuolella (*P-arvo < 0,05, **P-arvo ≤ 0,01 e ***0,0.0.0).接种 (Colletotrichum lupini), Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,01, ***P 值0.01)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对玤）平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001) Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменныч-08, ламенюч-08, на в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены отмечены над точкам0, P. ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Tilastollisesti merkitsevät erot ilmentymistasoissa inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta Verzhenicessa, Puolassa, vuonna 1999) ja kontrollikasvien (valesiirrostettu) välillä havaitaan datapisteiden yläpuolella (*P-arvo < 0,05, **P-arvo ≤ 0,01, 0,01.0.0).Analysoidut NLL-linjat olivat: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia), Boregine (resistentti, tuntematon geneettinen tausta) ja populaatio 22660 (herkkä).
Ehdokasgeeni TanjilG_05042 Lanr1-lokuksessa osoitti selvästi erilaisen ilmentymiskuvion RNA-seq-tutkimuksista saaduista profiileista (kuvio 6e).Tämän geenin merkittävä aktivaatio havaittiin Mandelupissa ja 22660-populaatiossa (jopa 39,7 ja 11,7 kertaa, vastaavasti), mikä johti suhteellisen korkeisiin ilmentymistasoihin (jopa 1,4 ± 0,14 ja 7,2 ± 1,3, vastaavasti).83A:476 paljasti myös jonkin verran TanjilG_05042-geenin noususäätelyä (jopa 3,8-kertaiseksi), mutta saavutetut suhteelliset ekspressiotasot (0,044 ± 0,002) olivat yli 30 kertaa alhaisemmat kuin Mandelupissa ja 22660-populaatiossa havaitut.qPCR:llä analysoitu osoitti merkittäviä eroja ilmentymistasoissa valerokotettujen (verrokki) varianttien genotyyppien välillä saavuttaen 58-kertaisen eron populaatioiden 22660 ja 83A:476 välillä sekä populaatioiden 22660 ja 22660 välillä. Boreginen ja Mandalupin välillä saavutettiin kaksinkertainen ero.
Ehdokasgeeni AnMan-lokuksessa, TanjilG_12861, aktivoitui vasteena rokotteelle 83A:476:ssa ja Mandelupissa, oli neutraali 22660-populaatiossa ja säädeltiin alas Boreginessa (kuvio 6f).TanjilG_12861-geenin suhteellinen ilmentyminen oli korkein inokuloidussa 83A:ssa: 476 (0,14 ± 0,01).17,4 kDa:n luokan I lämpösokkiproteiinigeeni TanjilG_05080 HSP17.4 osoitti alhaisempia suhteellisia ilmentymistasoja kaikissa tutkituissa kannoissa ja aikapisteissä (kuvio 6g).Korkein arvo havaittiin 24 HPI:llä 22660:n populaatiossa (0,14 ± 0,02, kahdeksankertainen lisäys vasteessa rokotuksiin).
Geeniekspressioprofiilien vertailu (kuvio 7) paljasti korkean korrelaation TanjilG_10657:n ja neljän muun geenin välillä: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) ja 4 TanjilG_05042 (r = 0,80) ja 4 TanjilG_.9 (r).Tällaiset tulokset voivat viitata näiden geenien yhteissäätelyyn puolustusvasteiden aikana.TanjilG_12861- ja TanjilG_23384-geenit osoittivat erilaisia ​​ilmentymisprofiileja pienemmillä Pearson-korrelaatiokerroinarvoilla (0,08 - 0,43 ja -0,19 - 0,28) verrattuna muihin geeneihin.
Geeniekspressioprofiilien väliset korrelaatiot havaittiin käyttämällä kvantitatiivista PCR:ää.Seuraavat kapealehtiset lupiinilinjat analysoitiin: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia), Boregine (resistentti, geneettinen tausta tuntematon) ja populaatio 22660 (herkkä).Kolme aikapistettä laskettiin (6, 12 ja 24 tuntia siirrostuksen jälkeen), mukaan lukien siirrostetut (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta Wierzhenicessa, Puolassa, vuonna 1999) ja kontrollikasvit (valesiirrostetut) kasvit.Asteikko näyttää Pearson-korrelaatiokertoimen arvon.
Perustuen tietoihin, jotka saatiin 6 hevosvoimalla tuumaa kohden, WGCNA suoritettiin 9981 DEG:llä, joka tunnistettiin vertaamalla inokuloituja ja kontrollikasveja varhaisiin puolustusvasteisiin keskittymiseksi (lisätaulukko S12).Kaksikymmentäkaksi geenimoduulia (klusteria) löydettiin korreloivilla (positiivisilla tai negatiivisilla) ilmentymisprofiileilla genotyyppien ja kokeellisten varianttien välillä. Keskimäärin geenien ilmentymistasot olivat laskevassa järjestyksessä 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaatio 22660 (molemmissa varianteissa tämä suuntaus oli kuitenkin vahvempi kontrollikasveissa). Keskimäärin geenien ilmentymistasot olivat laskevassa järjestyksessä 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaatio 22660 (molemmissa varianteissa tämä suuntaus oli kuitenkin vahvempi kontrollikasveissa). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Asukasluku 22660 (в обоих вариантац, элэантах, нетантах, нотентах, сильнее у контрольных растений). Keskimäärin geenien ilmentymistasot laskivat järjestyksessä 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaatio 22660 (molemmissa varianteissa tämä suuntaus oli kuitenkin vahvempi kontrollikasveissa).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Asukasluku 22660 的顺序下降Ｍ然而，佶两势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> väkiluku 22660 的 顺序 伋 降 （Ｇ 在 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。...。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Asukasluku 22660 (однако в обоих варианянентахлиадильентах е у контрольных растений). Keskimäärin geenin ilmentymistasot laskivat sarjassa 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaatio 22660 (mutta molemmissa varianteissa tämä suuntaus oli vahvempi kontrollikasveissa).Rokotus johti geenin ilmentymisen voimistumiseen, erityisesti moduuleissa 18, 19, 14, 6 ja 1 (vaikutuksen alenevassa järjestyksessä), negatiiviseen säätelyyn (esim. moduulit 9 ja 20) tai neutraaleihin vaikutuksiin (esim. moduulit 11, 22, 8 ja 13).GO-termirikastusanalyysi (lisätaulukko S13) paljasti "GO: 0006952 Suojaavat vasteet" rokotetulle moduulille (18) maksimaalisella aktivaatiolla, mukaan lukien qPCR:llä analysoidut geenit (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_23384, TanjilG_015G), sekä useimmat TanjilG_016l57 ja useimmat puristetut fotosynteesimoduulit (9).Moduulin 18 konsentraattori (kuvio 8) tunnistettiin TanjilG_26536-geeniksi, joka koodaa PR-10:n kaltaista LlR18B-proteiinia, ja moduulin 9 konsentraattori tunnistettiin TanjilG_28955-geeniksi, joka koodaa photosystem II PsbQ -proteiinia.Ehdokas antraknoosiresistenssigeeni Lanr1, TanjilG_05042, löydettiin moduulista 22 (kuva 9), ja se liittyy termeihin "GO:0044260 Solun makromolekyyliset aineenvaihduntaprosessit" ja "GO:0006355 Transkription säätely, DNA-mallinnus", jotka kantavat TanjilG:tä hub_012112.geeni koodaa lämpöstressin transkriptiotekijää A-4a (HSFA4a).
Moduulien geenien yhteisilmentymisen painotettu verkkoanalyysi, joissa on yliedustettuja biologisia prosessitermejä "GO: 0006952 Defence responses".Ligaatiota yksinkertaistettiin korostamaan neljä qPCR:llä analysoitua geeniä (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ja TanjilG_27015).
Painotettu verkkoanalyysi geenin yhteisilmentymisestä moduulissa, jossa on yliedustettu biologinen prosessitermi "GO: 0006355: Transkription säätely, DNA-templaatti" ja joka kantaa ehdokas antraknoosiresistenssigeeniä Lanr1 TanjilG_05042.Ligaatiota yksinkertaistettiin TanjilG_05042-geenin ja keskeisen TanjilG_01212-geenin eristämiseksi.
Australiassa kerätty antraknoosiresistenssiseulonta osoitti, että useimmat varhain vapautetut lajikkeet olivat herkkiä;Kalya, Coromup ja Mandelup on kuvattu kohtalaisen kestäviksi, kun taas Wonga, Tanjil ja 83A:476 on kuvattu erittäin kestäviksi26,27,31.oli sama resistenssialleeli, nimeltään Lanr1, ja Coromupilla ja Mandelupilla oli eri alleeli, nimeltään AnMan10, 26, 39, kun taas Kalya välitti eri alleelin., Lanr2.Antraknoosiresistenssin seulonta Saksassa johti resistentin linjan Bo7212 tunnistamiseen, jossa oli jokin muu ehdokasalleeli kuin Lanr1, nimeltään LanrBo36.
Tutkimuksemme paljasti Lanr1-alleelin erittäin alhaisen esiintymistiheyden (noin 6 %) testatussa ituplasmassa.Tämä havainto on yhdenmukainen Itä-Euroopan ituplasman seulonnan tulosten kanssa käyttämällä Anseq3- ja Anseq4-markkereita, jotka osoittivat, että Lanr1-alleeli on läsnä vain kahdessa Valko-Venäjän linjassa.Tämä viittaa siihen, että Lanr1-alleeli ei ole vielä laajalti käytössä paikallisissa jalostusohjelmissa, toisin kuin Australiassa, jossa se on yksi tärkeimmistä alleeleista markkeriavusteisessa jalostuksessa.Tämä saattaa johtua Lanr1-alleelin alhaisemmasta vastustuskyvystä Euroopan kenttäolosuhteissa verrattuna Australian raporttiin.Lisäksi antraknoositutkimukset Australian runsaiden sateiden alueilla ovat osoittaneet, että Lanr1-alleelin välittämät resistenssivasteet eivät ehkä ole tehokkaita sääolosuhteissa, jotka suosivat patogeenin kasvua ja nopeaa kehitystä19,42.Itse asiassa tässä tutkimuksessa joitakin antraknoosin oireita havaittiin myös genotyypeissä, joissa oli Lanr1-alleeli, mikä viittaa siihen, että resistenssi saattaa kadota optimaalisissa olosuhteissa C. lupinin kehittymiselle.Lisäksi väärät positiiviset tulkinnat Anseq3- ja Anseq4-markkereista, jotka ovat noin 1 cm:n päässä Lanr1-lokuksesta, ovat mahdollisia28,30,43.
Tutkimuksemme osoitti, että Lanr1-alleelin kantava 83A:476 vastasi C. lupinin inokulaatioon laajamittaisella transkription uudelleenohjelmoinnilla ensimmäisessä analysoidussa ajankohtana (6 hpi), kun taas Mandelupissa, joka kantoi AnMan-alleelin, transkriptomiset vasteet havaittiin paljon myöhemmin.(24 - 48 hv).Nämä ajalliset vaihtelut puolustusvasteissa liittyvät eroihin sairauden oireissa, mikä korostaa patogeenien varhaisen tunnistamisen merkitystä resistenssin onnistumiselle.Kasvikudoksen infektoimiseksi pernaruton itiöiden on käytävä läpi useita kehitysvaiheita isäntäpinnalla, mukaan lukien itäminen, solujen jakautuminen ja appressorion muodostuminen.Lisäosa on tarttuva rakenne, joka kiinnittyy isännän pintaan ja helpottaa tunkeutumista isännän kudoksiin.Siten C. gloeosporioides -itiöt herneuutteessa osoittivat ytimen ensimmäisen jakautumisen 75 - 90 minuutin inkuboinnin jälkeen, itiöputken muodostumista 90 - 120 minuutin kuluttua ja suppressiota 4 tunnin kuluttua 45 .Mango C. gloeosporioides osoitti yli 40 % konidioiden itävyyttä 3 tunnin inkuboinnin jälkeen ja noin 20 % appressoreiden muodostumista 4 tunnin jälkeen.C. gloeosporioidesin virulenssiin liittyvä CAP20-geeni osoitti transkriptioaktiivisuutta epifyyttiä muodostavissa konidioissa 3,5 tunnin inkuboinnin jälkeen avokadon pintavahassa korkeilla CAP20-proteiinipitoisuuksilla 4 tunnin ja 46 minuutin kuluttua.Samalla tavalla melaniinin biosynteesigeenien aktiivisuus C. trifoliissa indusoitiin 2 tunnin inkubaation aikana, jota seurasi appressoriumin muodostuminen 1 tunnin kuluttua.Lehtikudoksilla tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että C. acutatumilla rokotetuilla mansikoilla on ensimmäinen vaimennus 8 hpi:llä, kun taas C. coccodesilla inokuloiduilla tomaateilla on ensimmäinen vaimennus 4 hpi:llä48,49.pitkälti yhdenmukainen Colletotrichum spp.tarttuva prosessi.Nopeat puolustusvasteet 83A:476:lle viittaavat kasvin resistenssin ja efektorilaukaiseman immuniteetin (ETI) geenien osallisuuteen tässä linjassa, kun taas Mandelupin viivästyneet vasteet tukevat mikro-assosioituneen molekyylikuvion laukaiseman immuniteetin (MTI) hypoteesia 50. Varhaiset vasteet 83A:lle: 476 ja Mandelup.Osittainen päällekkäisyys ylös- tai alas-säädeltyjen geenien välillä viivästyneessä vasteessa tukee myös tätä käsitettä, koska ETI:tä pidetään usein kiihtyneenä ja tehostettuna MTI-vasteena, joka huipentuu ohjelmoituun solukuolemaan infektiokohdassa, joka tunnetaan nimellä anafylaktinen shokki51,52.
Suurin osa geeneistä, jotka liitetään yliedustettuun termiin Gene Ontology GO:0006952 "puolustusvaste", ovat stressin aiheuttaman paastoviestin 22 proteiinin (samanlainen kuin SAM22) ja seitsemän tärkeimmän lateksiproteiinin kaltaisen proteiinin (MLP:n) 11 homologia.-kaltaiset proteiinit 31, 34, 43 ja 423 osoittivat sekvenssin samankaltaisuutta.SAM22:n kaltaiset geenit osoittivat merkittävää aktivaatiota, joka kesti pidempään, mikä osoitti lisääntynyttä antraknoosiresistenssitasoa (83A:476 ja Boregine).MLP:n kaltaiset geenit kuitenkin vähentyivät vain linjoissa, joissa oli ehdokasresistenssialleeli (83A:476/Lanr1 6 hpi:ssä ja Mandelup/AnMan 24 hpi:ssä).On huomattava, että kaikki tunnistetut SAM22:n kaltaiset homologit ovat peräisin noin 105 kb:n geeniklusterista, kun taas MLP:n kaltaiset geenit ovat peräisin genomin erillisiltä alueilta.Tällaisten SAM22:n kaltaisten geenien koordinoitu aktivoituminen havaittiin myös aiemmassa tutkimuksessamme NLL-resistenssistä Diaporthetoxica-rokotteelle, mikä viittaa siihen, että ne ovat mukana puolustusvasteen horisontaalisissa komponenteissa.Tätä johtopäätöstä tukevat myös raportit SAM22:n kaltaisten geenien positiivisesta vasteesta loukkaantumiseen tai hoitoon salisyylihapolla, sieni-indusoitteilla tai vetyperoksidilla.
MLP:n kaltaisten geenien on osoitettu reagoivan erilaisiin abioottisiin ja bioottisiin stressiin, mukaan lukien bakteeri-, virus- ja patogeeniset sieni-infektiot monissa kasvilajeissa55.Tiettyjen kasvien ja patogeenien välisten vuorovaikutusten vastesuunnat vaihtelivat voimakkaasti lisääntyvästä (ts. puuvillan Verticillium dahliae -tartunnan aikana) merkittävästi laskevaan (eli omenapuun Alternaria spp. -tartunnan jälkeen)56,57.MLP:n kaltaisen 423-geenin merkittävää heikkenemistä on havaittu avokadon F. niger -infektion suojautumisessa ja omenapuun Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola ja Alternaria alternata ovat omenan patotyyppejä58,59.Lisäksi MLP:n kaltaista 423-geeniä yli-ilmentävillä omenakalloilla oli vähemmän resistenssiin liittyvien geenien ilmentymistä ja ne olivat herkempiä sieni-infektioille59.Fusarium oxysporum f:n jälkeen myös MLP:n kaltainen 423-geeni suppressoitui resistentissä tavallisessa papun ituplasmassa.cn.Pavun infektio 60.
Muita RNA-seq-tutkimuksessamme tunnistettuja PR-10-perheen jäseniä olivat LlR18A- ja LlR18B-geenit vasteena noususäätelylle, samoin kuin ylössäädelty (1 geeni) tai vähentynyt (3 geeniä) geeni lipidinsiirtoproteiinille DIR1..Lisäksi WGCNA korostaa LlR18B-geeniä tämän moduulin keskipisteenä, joka on erittäin herkkä rokotteelle ja sisältää useita suojaavia vastegeenejä.LlR18A- ja LlR18B-geenit indusoituivat keltaisissa lupiininlehdissä vasteena patogeenisille bakteereille sekä NLL-varsissa D. toxica -siirrostuksen jälkeen, kun taas näiden geenien riisihomologi, RSOsPR10, indusoitui nopeasti sieni-infektiolla, joka oletettavasti osallistui D6-the-nonsonic-geenin signaalitiehen,563 jasmonic-163. spesifiset lipidien kuljetusproteiinit, joita tarvitaan systeemisen hankitun resistenssin (SAR) puhkeamiseen.Suojareaktioiden kehittyessä DIR1-proteiini kuljetetaan infektiopisteestä floeemin kautta SAR:n indusoimiseksi kaukaisiin elimiin.Mielenkiintoista on, että TanjilG_02313 DIR1-geeni indusoitui merkittävästi ensimmäisessä aikapisteessä linjoissa 84A:476 ja populaatiossa 22660, mutta antraknoosiresistenssi kehittyi onnistuneesti vain linjassa 84A:476.Tämä saattaa viitata jonkin verran DIR1-geenin alifunktionaalisoitumiseen NLL:ssä, koska loput kolme homologia reagoivat rokotteeseen vain 83A:476-linjassa 6 hpi:llä, ja tämä vaste oli suunnattu alaspäin.
Tutkimuksessamme yleisimmät "GO:0055114 Redox-prosessiksi" kutsuttua biologista prosessia vastaavat komponentit olivat sytokromi P450 -proteiini, peroksidaasi, linolihappo-9S-/13S-lipoksigenaasi ja 1-aminosyklopropaani-1-karboksyylihappooksidaasi.Lisäksi WGCNA määrittelee HSFA4a-homologin keskittimeksi, joka kuljettaa moduuleja, kuten Lanr1-resistenssigeenikandidaatti TanjilG_05042.HSFA4a on kasvien tuman transkription redox-riippuvaisen säätelyn komponentti.
Sytokromi P450 -proteiinit ovat oksidoreduktaaseja, jotka katalysoivat NADPH- ja/tai O2-riippuvaisia ​​hydroksylaatioreaktioita primaarisessa ja sekundaarisessa aineenvaihdunnassa, mukaan lukien ksenobioottien aineenvaihdunta sekä hormonien, rasvahappojen, sterolien, soluseinäkomponenttien, biopolymeerien ja suojaavien yhdisteiden biosynteesiä. 0,6 log2 (kertainen muutos) arvoon 5,7 johtuen suuresta määrästä muuttuneita homologia (37) ja eroja vastemalleissa tiettyjen geenien välillä, mikä heijastaa ylöspäin suuntautuvaa muutosta..Vain RNA-seq-tietojen käyttäminen NLL-geenien oletetun biologisen toiminnan selvittämiseen niin suuressa proteiinisuperperheessä olisi erittäin spekulatiivista.On kuitenkin syytä huomata, että jotkin sytokromi P450 -geenit liittyvät lisääntyneeseen vastustuskykyyn patogeenisiä sieniä tai bakteereja vastaan, mukaan lukien allergisten reaktioiden aiheuttaminen69, 70, 71.
Luokan III peroksidaasit ovat monitoimisia kasvientsyymejä, jotka osallistuvat monenlaisiin aineenvaihduntaprosesseihin kasvien kasvun ja kehityksen aikana sekä vasteena ympäristön rasituksille, kuten suolapitoisuudelle, kuivuudelle, korkealle valon intensiteetille ja patogeenien hyökkäyksille72.Peroksidaasit osallistuvat useiden kasvilajien vuorovaikutukseen Anthraciksen kanssa, mukaan lukien Stylosanthes humilis ja C. gloeosporioides, Lens culinaris ja C. truncatum, Phaseolus vulgaris ja C. lindemuthianum, Cucumis sativus ja C. lagenarium73,74,75,76.Vaste on erittäin nopea, joskus jopa 4 HPI:ssä, ennen kuin sieni tunkeutuu kasvikudokseen73.Peroksidaasigeeni vastasi myös D. toxica NLL:n inokulaatioon.Sen lisäksi, että peroksidaasit ovat tyypillisiä oksidatiivisen purskeen säätelyssä tai oksidatiivisen stressin eliminoinnissa, ne voivat häiritä patogeenien kasvua luomalla fysikaalisia esteitä, jotka perustuvat soluseinän vahvistumiseen spesifisten yhdisteiden lignifikaation, alayksiköiden tai silloittumisen aikana.Tämä toiminto voidaan johtua in silico TanjilG_03329-geenistä, joka koodaa oletettua ligniiniä muodostavaa anioniperoksidaasia, jota tutkimuksessamme säädeltiin merkittävästi 83A:476-resistentissä linjassa 6 HPI:ssä, mutta ei muissa kannoissa ja aikapisteissä, jotka eivät reagoineet.
Linolihapon 9S-/13S-lipoksigenaasi on ensimmäinen vaihe lipidien biosynteesin oksidatiivisessa reitissä78.Tämän reitin tuotteilla on useita tehtäviä kasvien puolustuksessa, mukaan lukien soluseinän vahvistaminen kalloosi- ja pektiinikertymien muodostumisen kautta ja oksidatiivisen stressin säätely reaktiivisten happilajien tuotannon kautta79, 80, 81, 82, 83.Tässä tutkimuksessa linolihappo 9S-/13S-lipoksigenaasin ilmentyminen muuttui kaikissa kannoissa, mutta herkässä populaatiossa 22660 noususäätely vallitsi eri ajankohtina, kun taas kannoissa, joissa on resistentti Lanr1 ja AnMan-alleeli, se korostaa oksilipiinireaktion monipuolistumista näiden anthrax-reaktion välillä näiden anthrax-solujen välillä.
1-aminosyklopropaani-1-karboksylaattioksidaasi (ACO) -homologi säädettiin merkittävästi ylös (9 geeniä) tai vähentyi (2 geeniä), kun se siirrostettiin lupiinilla.Kahta poikkeusta lukuun ottamatta kaikki nämä vasteet tapahtuivat 6 hevosvoimalla.kohdassa 83A:476.ACO-proteiinien välittämä entsymaattinen reaktio on nopeutta rajoittava vaihe eteenin tuotannossa ja on siksi erittäin säädelty84.Eteeni on kasvihormoni, jolla on erilaisia ​​rooleja säätelemällä kasvien kehitystä ja vastetta abioottisiin ja bioottisiin stressiolosuhteisiin.ACO:n transkription induktio ja eteenin signalointireitin aktivaatio lisäävät riisin vastustuskykyä hemibiotrofiselle sienelle oryzae oryzae säätelemällä reaktiivisten happilajien ja fytoaleksiinien tuotantoa.Hyvin samanlainen M. oryzaen ja C. lupini88,89:n välillä löydetty lehtien infektioprosessi tässä tutkimuksessa raportoitujen 83A:476-linjan ACO-homologien merkittävän nousun taustalla muuttaa mahdollisuutta antaa resistenssin NLL-antraknoosi-etyleenille signaalin keskeiseksi vaiheeksi molekyylipoluissa.
Tässä tutkimuksessa monien fotosynteesiin liittyvien geenien laajamittaista tukahduttamista havaittiin 6 hpi:llä 83A:476:ssa ja 48 hpi:ssä Mandeloopissa ja 22660-populaatiossa.Näiden muutosten laajuus ja eteneminen on verrannollinen tasoon.Tässä kokeessa havaittiin antraknoosiresistenssi.Viime aikoina fotosynteesiin liittyvien transkriptien voimakasta ja varhaista tukahduttamista on raportoitu useissa kasvien ja patogeenien vuorovaikutusmalleissa, mukaan lukien patogeeniset bakteerit ja sienet.Kiire (joissakin vuorovaikutuksissa 2 HPI:stä) ja fotosynteesiin liittyvien geenien globaali tukahduttaminen vasteena infektiolle voivat laukaista kasvien immuniteetin, joka perustuu reaktiivisten happilajien käyttöön ja niiden vuorovaikutukseen salisyylihapporeitin kanssa allergisten reaktioiden välittämiseksi 90,94.
Yhteenvetona voidaan todeta, että vastustuskykyisimmälle sukulinjalle (83A:476) ehdotettuja puolustusvastemekanismeja ovat nopea patogeenin tunnistaminen R-geenin toimesta (oletettavasti TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ja allergisen vasteen välittämä salisyylihappo- ja eteenisignalointi, jota seuraa pitkän kantaman SAR:n luominen.toimintaa tukee DIR-1-proteiini.On huomattava, että C. lupini -infektion biotrofinen ajanjakso on hyvin lyhyt (noin 2 päivää), jota seuraa nekroottinen kasvu95.Siirtyminen näiden vaiheiden välillä voi liittyä nekroosiin ja eteenin indusoituvien proteiinien ilmentymiseen, jotka toimivat yliherkkyysreaktioiden laukaisimina isäntäkasveissa.Siksi aikaikkuna C. lupinin onnistuneelle sieppaamiselle biotrofisessa vaiheessa on hyvin kapea.Redox- ja fotosynteesiin liittyvien geenien uudelleenohjelmointi, joka havaitaan 83A:476:ssa 6 hpi:ssä, on yhdenmukainen sienihyfien etenemisen kanssa ja ennakoi onnistuneen suojaavan vasteen kehittymistä biotrofisessa vaiheessa.Mandelupin ja 22660-populaation transkriptominen vasteet voivat olla liian viivästyneitä sienen sieppaamiseksi ennen siirtymistä nekroottiseen kasvuun, mutta Mandelup voi olla tehokkaampi kuin 22660-populaatio, koska PR-10-proteiinin suhteellisen nopea säätely edistää vaakasuuntaista vastustuskykyä.
ETI, jota ohjaa kanoninen R-geeni, näyttää olevan yleinen mekanismi papujen resistenssille antraknoosille.Siten palkokasvien Medicago truncatulassa resistenssin antraknoosille antaa RCT1-geeni, joka on TIR-NBS-LRR97-kasvin R-geeniluokan jäsen.Tämä geeni antaa myös laajakirjoisen antraknoosiresistenssin sinimailaselle, kun se siirretään herkkiin kasveihin.Pavussa (P. vulgaris) on tähän mennessä tunnistettu yli kaksi tusinaa antraknoosiresistenssigeeniä.Jotkut näistä geeneistä löytyvät alueilta, joilta puuttuu kanonisia R-geenejä, mutta monet muut sijaitsevat kromosomien reunoilla, jotka kantavat NBS-LRR-geeniklusterin, mukaan lukien TIR-NBS-LRRs99.Genominlaajuinen SSR-tutkimus vahvisti myös NBS-LRR-geenin yhteyden antraknoosiresistenssiin tavallisessa papussa.Kanoninen R-geeni löydettiin myös genomiselta alueelta, jolla oli valkoisen lupiinin 101 tärkein antraknoosiresistenssilokus.
Työmme osoittaa, että välitön resistenssireaktio, joka aktivoituu kasviinfektion varhaisessa vaiheessa (mieluiten viimeistään 12 hpi), suojaa tehokkaasti kapealehtistä lupiinia patogeenisen Collelotrichum lupini -sienen aiheuttamalta antraknoosilta.Käyttämällä korkean suorituskyvyn sekvensointia osoitimme antraknoosiresistenssigeenien erilaiset ilmentymisprofiilit NLL-kasveissa Lanr1- ja AnMan-resistenssigeenien välittämänä.Onnistunut puolustus edellyttää geenien huolellista suunnittelua redox-, fotosynteesiin ja patogeneesiin osallistuville proteiineille muutaman tunnin sisällä kasvin ensimmäisestä kosketuksesta taudinaiheuttajaan.Samanlaiset suojareaktiot, mutta viivästyneet, ovat paljon vähemmän tehokkaita kasvien suojaamisessa taudeilta.Lanr1-geenin välittämä pernaruttoresistenssi muistuttaa R-geenin tyypillistä nopeaa vastetta (effektorin laukaisema immuniteetti), kun taas AnMan-geeni tarjoaa todennäköisimmin horisontaalisen vasteen (mikrobiin liittyvän molekyylimallin laukaisema immuniteetti), joka tarjoaa kohtuullisen kestävyyden.
Antraknoosimarkkerien seulomiseen käytetyt 215 NLL-linjaa koostuivat 74 lajikkeesta, 60 risteyttämällä tai jalostuksella saadusta linjasta, 5 mutantista ja 76 villistä tai alkuperäisestä ituplasmasta.Linjoja tuli 17 maasta, pääasiassa Puolasta (58), Espanjasta (47), Saksasta (27), Australiasta (26), Venäjältä (19), Valko-Venäjältä (7), Italiasta (5) ja muista linjoista.10 maasta.Sarja sisältää myös referenssiresistentit linjat: 83A:476, Tanjil, Wonga, joka kantaa Lanr1-alleelin, ja Mandelup, joka kantaa AnMan-alleelin.Linjat saatiin European Lupine Genetic Resource Database -tietokannasta, jota ylläpitää Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Puola (lisätaulukko S1).
Kasveja kasvatettiin kontrolloiduissa olosuhteissa (valotusjakso 16 tuntia, lämpötila 25°C päivällä ja 18°C ​​yöllä).Kaksi biologista replikaattia analysoitiin.DNA eristettiin kolmen viikon ikäisistä lehdistä käyttämällä DNeasy Plant Mini Kit -sarjaa (Qiagen, Hilden, Saksa) protokollan mukaisesti.Eristetyn DNA:n laatu ja konsentraatio arvioitiin spektrofotometrisilla menetelmillä (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).AnManM1-markkeri, joka merkitsee antraknoosiresistenssigeeniä AnMan (johdettu cv. Mandelupista) ja markkerit Anseq3 ja Anseq4, jotka reunustavat geeniä Lanr1 (johdettu cv. Tanjilista), analysoitiin 11, 26, 28.Resistentin alleelin homotsygootit arvosteltiin arvolla "1", herkät - "0" ja heterotsygootit - 0,5.
AnManM1-, AnSeq3- ja AnSeq4-markkereiden seulonnan tulosten ja loppuseurantakokeiden siementen saatavuuden perusteella valittiin 50 NLL-linjaa antraknoosiresistenssin fenotyypitystä varten.Analyysi suoritettiin kahtena rinnakkaisena tietokoneohjatussa kasvihuoneessa 14 tunnin valojaksolla lämpötila-alueella 22 °C päivällä ja 19 °C yöllä.Siemenet raaputetaan (leikkaa siemenkuori alkion vastakkaiselta puolelta terävällä terällä) ennen kylvöä, jotta estetään siementen lepotila liian kovan siemenkuoren takia ja varmistetaan tasainen itävyys.Kasveja kasvatettiin ruukuissa (11 x 11 x 21 cm) steriilillä maaperällä (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsova, Puola).Rokotus suoritettiin Colletotrichum lupini Col-08 -kannassa, joka kasvatettiin vuonna 1999 kapealehtisten lupiinikasvien varresta, jotka kasvatettiin pellolla Verzhenitsassa, Suur-Puolassa (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E).Hanki alue.Isolaatteja viljeltiin SNA-elatusaineessa 20 °C:ssa mustassa valossa 21 päivän ajan itiöinnin indusoimiseksi.Neljä viikkoa kylvön jälkeen, kun kasvit olivat saavuttaneet 4-6-lehtisen vaiheen, siirrostus suoritettiin ruiskuttamalla konidisuspensiolla pitoisuutena 0,5 x 106 konidia/ml.Inokulaation jälkeen kasveja pidettiin pimeässä 24 tuntia kosteudessa noin 98 % ja lämpötilassa 25 °C konidien itämisen ja infektioprosessin helpottamiseksi.Sitten kasveja kasvatettiin 14 tunnin valojakson alla 22 °C:ssa päivä/19 °C yössä ja 70 %:n kosteudessa.Sairauspisteet tehtiin 22 päivää siirrostuksen jälkeen ja vaihtelivat välillä 0 (immuuni) - 9 (erittäin herkkä) riippuen nekroottisten leesioiden esiintymisestä tai puuttumisesta varressa ja lehdissä.Lisäksi kasvien paino mitattiin pisteytyksen jälkeen.Markkerien genotyyppien ja sairauden fenotyyppien väliset suhteet laskettiin pisteen kahden sekvenssin korrelaatioina (heterotsygoottisten markkerien puuttuminen rivijoukosta antraknoosiresistenssifenotyypin analysointia varten).