Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Tarvitaan luotettava in vitro -järjestelmä, joka pystyy toistamaan tarkasti sydämen fysiologisen ympäristön lääketestausta varten.Ihmisen sydämen kudosviljelyjärjestelmien rajallinen saatavuus on johtanut epätarkkoihin tulkintoihin sydänlääkkeiden vaikutuksista.Täällä olemme kehittäneet sydänkudosviljelymallin (CTCM), joka stimuloi sähkömekaanisesti sydämen viipaleita ja joutuu fysiologiseen venytykseen sydämen systolisen ja diastolisen vaiheen aikana.12 päivän viljelyn jälkeen tämä lähestymistapa paransi osittain sydänleikkeiden elinkelpoisuutta, mutta ei täysin säilyttänyt niiden rakenteellista eheyttä.Siksi pienmolekyyliseulonnan jälkeen havaitsimme, että 100 nM trijodityroniinin (T3) ja 1 µM deksametasonin (Dex) lisääminen elatusaineeseemme säilytti leikkeiden mikrorakenteen 12 päivän ajan.Yhdessä T3/Dex-hoidon kanssa CTCM-järjestelmä piti transkriptioprofiilit, elinkelpoisuuden, metabolisen aktiivisuuden ja rakenteellisen eheyden samalla tasolla kuin tuore sydänkudos 12 päivän ajan.Lisäksi sydänkudoksen liiallinen venyminen viljelmässä indusoi hypertrofista sydämen signalointia, mikä tarjoaa todisteita CTCM:n kyvystä jäljitellä sydämen venytyksen aiheuttamia hypertrofisia tiloja.Yhteenvetona voidaan todeta, että CTCM voi mallintaa sydämen fysiologiaa ja patofysiologiaa viljelmässä pitkiä aikoja, mikä mahdollistaa luotettavan lääkeseulonnan.
Ennen kliinistä tutkimusta tarvitaan luotettavia in vitro -järjestelmiä, jotka pystyvät toistamaan tarkasti ihmisen sydämen fysiologisen ympäristön.Tällaisten järjestelmien tulisi jäljitellä muuttuneita mekaanisia venytys-, syke- ja sähköfysiologisia ominaisuuksia.Eläinmalleja käytetään yleisesti sydämen fysiologian seulontaalustana, jonka luotettavuus heijastaa lääkkeiden vaikutuksia ihmisen sydämeen1,2.Lopulta Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) on malli, joka on erittäin herkkä ja spesifinen erilaisille terapeuttisille ja farmakologisille toimenpiteille, ja se toistaa tarkasti ihmisen sydämen fysiologian ja patofysiologian3.Tällaisen järjestelmän puuttuminen rajoittaa uusien hoitomuotojen löytämistä sydämen vajaatoimintaan4,5 ja on johtanut lääkkeiden kardiotoksisuuteen, joka on merkittävä syy markkinoilta poistumiseen6.
Viimeisen vuosikymmenen aikana kahdeksan ei-kardiovaskulaarista lääkettä on poistettu kliinisestä käytöstä, koska ne aiheuttavat QT-ajan pidentymistä, mikä johtaa kammioiden rytmihäiriöihin ja äkilliseen kuolemaan7.Näin ollen on olemassa kasvava tarve luotettaville prekliinisille seulontastrategioille kardiovaskulaarisen tehon ja toksisuuden arvioimiseksi.Äskettäinen ihmisen aiheuttamien pluripotenttien kantasoluista peräisin olevien sydänlihassolujen (hiPS-CM) käyttö lääkeseulonnassa ja toksisuustestauksessa tarjoaa osittaisen ratkaisun tähän ongelmaan.Kuitenkin hiPS-CM:ien epäkypsä luonne ja sydänkudoksen monisoluisen monimutkaisuuden puute ovat tämän menetelmän suuria rajoituksia.Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä rajoitus voidaan osittain voittaa käyttämällä varhaista hiPS-CM:ää sydänkudoksen hydrogeelien muodostamiseen pian spontaanin supistuksen alkamisen jälkeen ja lisäämällä asteittain sähköistä stimulaatiota ajan myötä.Näiltä hiPS-CM-mikrokudoksilta puuttuu kuitenkin aikuisen sydänlihaksen kypsät sähköfysiologiset ja supistumisominaisuudet.Lisäksi ihmisen sydänkudoksella on monimutkaisempi rakenne, joka koostuu heterogeenisestä seoksesta eri solutyyppejä, mukaan lukien endoteelisolut, hermosolut ja stroomafibroblastit, joita yhdistävät tietyt solunulkoisen matriisin proteiinit.Tämä ei-kardiomyosyyttipopulaatioiden11, 12, 13 heterogeenisyys aikuisen nisäkkään sydämessä on suuri este sydänkudoksen mallintamiselle yksittäisiä solutyyppejä käyttämällä.Nämä suuret rajoitukset korostavat menetelmien kehittämisen tärkeyttä koskemattoman sydänkudoksen viljelemiseksi fysiologisissa ja patologisissa olosuhteissa.
Viljellyt ohuet (300 µm) ihmisen sydämen leikkeet ovat osoittautuneet lupaavaksi malliksi ehjän ihmisen sydänlihaksesta.Tämä menetelmä tarjoaa pääsyn täydelliseen 3D-monisolujärjestelmään, joka on samanlainen kuin ihmisen sydänkudos.Vuoteen 2019 asti viljeltyjen sydänleikkeiden käyttöä rajoitti kuitenkin lyhyt (24 tunnin) viljelmän eloonjääminen.Tämä johtuu useista tekijöistä, kuten fysikaalis-mekaanisen venytyksen puutteesta, ilma-neste-rajapinnasta ja yksinkertaisten välineiden käytöstä, jotka eivät tue sydänkudoksen tarpeita.Vuonna 2019 useat tutkimusryhmät osoittivat, että mekaanisten tekijöiden sisällyttäminen sydämen kudosviljelyjärjestelmiin voi pidentää viljelyn ikää, parantaa sydämen ekspressiota ja jäljitellä sydämen patologiaa.Kaksi tyylikästä tutkimusta 17 ja 18 osoittavat, että yksiakselisella mekaanisella kuormituksella on positiivinen vaikutus sydämen fenotyyppiin viljelyn aikana.Näissä tutkimuksissa ei kuitenkaan käytetty sydämen syklin dynaamista kolmiulotteista fysikaalis-mekaanista kuormitusta, koska sydämen osat kuormitettiin joko isometrisilla vetovoimilla 17 tai lineaarisella auksotonisella kuormituksella 18 .Nämä kudosten venytysmenetelmät johtivat monien sydängeenien tukahduttamiseen tai epänormaaleihin venytysvasteisiin liittyvien geenien yli-ilmentymiseen.Erityisesti Pitoulis et ai.19 kehitti dynaamisen sydämen viipaleviljelykylvyn sydämen syklin rekonstruoimiseen voimaanturin takaisinkytkennän ja jännityskäytön avulla.Vaikka tämä järjestelmä mahdollistaa tarkemman sydämen syklin mallinnuksen in vitro, menetelmän monimutkaisuus ja alhainen suorituskyky rajoittaa tämän järjestelmän soveltamista.Laboratoriomme on äskettäin kehittänyt yksinkertaistetun viljelyjärjestelmän, jossa käytetään sähköstimulaatiota ja optimoitua elatusainetta sian ja ihmisen sydänkudoksen osien elinkelpoisuuden ylläpitämiseksi jopa 6 päivän ajan20,21.
Nykyisessä käsikirjoituksessa kuvaamme sydämen kudosviljelymallia (CTCM), jossa käytetään sian sydämen osia, jotka sisältävät humoraalisia vihjeitä kolmiulotteisen sydämen fysiologian ja patofysiologisen venymisen tiivistämiseksi sydämen syklin aikana.Tämä CTCM voi lisätä prekliinisen lääkeennusteen tarkkuuden tasolle, jota ei koskaan aikaisemmin saavutettu tarjoamalla kustannustehokkaan, keskitehoisen sydänjärjestelmän, joka jäljittelee nisäkkään sydämen fysiologiaa/patofysiologiaa prekliinisissä lääketesteissä.
Hemodynaamisilla mekaanisilla signaaleilla on kriittinen rooli kardiomyosyyttien toiminnan ylläpitämisessä in vitro 22, 23, 24.Nykyisessä käsikirjoituksessa olemme kehittäneet CTCM:n (kuva 1a), joka voi jäljitellä aikuisen sydänympäristöä indusoimalla sekä sähköistä että mekaanista stimulaatiota fysiologisilla taajuuksilla (1,2 Hz, 72 lyöntiä minuutissa).Liiallisen kudoksen venymisen välttämiseksi diastolen aikana käytettiin 3D-tulostuslaitetta kudoksen kokoa lisäämään 25 % (kuva 1b).C-PACE-järjestelmän indusoima sähköinen tahdistus ajoitettiin alkamaan 100 ms ennen systolia käyttämällä tiedonkeruujärjestelmää sydämen syklin täydelliseen toistamiseen.Kudosviljelyjärjestelmä käyttää ohjelmoitavaa pneumaattista toimilaitetta (LB Engineering, Saksa) joustavan silikonikalvon syklisesti laajentamiseen, mikä aiheuttaa sydämen viipaleiden laajenemisen yläkammiossa.Järjestelmä liitettiin ulkoiseen ilmajohtoon paineanturin kautta, mikä mahdollisti paineen (± 1 mmHg) ja ajan (± 1 ms) tarkan säädön (kuva 1c).
a Kiinnitä kudososa laitteen viljelykammion sisällä olevaan 7 mm:n tukirenkaaseen, joka näkyy sinisellä.Viljelykammio on erotettu ilmakammiosta ohuella joustavalla silikonikalvolla.Aseta tiiviste jokaisen kammion väliin vuotojen estämiseksi.Laitteen kannessa on grafiittielektrodeja, jotka tarjoavat sähköstimulaatiota.b Kaavamainen esitys suuresta kudoslaitteesta, ohjausrenkaasta ja tukirenkaasta.Kudososat (ruskeat) asetetaan ylimitoitettuun laitteeseen siten, että ohjausrengas asetetaan laitteen ulkoreunassa olevaan uraan.Aseta akryylikudoksella päällystetty tukirengas varovasti ohjaimen avulla sydänkudoksen osan päälle.c Kaavio, joka esittää sähköisen stimulaation ajan ohjelmoitavan pneumaattisen toimilaitteen (PPD) ohjaaman ilmakammion paineen funktiona.Tiedonkeruulaitetta käytettiin sähköisen stimulaation synkronointiin paineanturien avulla.Kun paine viljelykammiossa saavuttaa asetetun kynnyksen, pulssisignaali lähetetään C-PACE-EM:iin sähköisen stimulaation laukaisemiseksi.d Kuva neljästä CTCM:stä, jotka on sijoitettu inkubaattorin hyllylle.Neljä laitetta on kytketty yhteen PPD:hen pneumaattisen piirin kautta, ja paineanturit asetetaan hemostaattiseen venttiiliin valvomaan pneumaattisen piirin painetta.Jokainen laite sisältää kuusi kudososaa.
Yhdellä pneumaattisella toimilaitteella pystyimme ohjaamaan 4 CTCM-laitetta, joista kuhunkin mahtui kuusi kudosleikkaa (kuva 1d).CTCM:ssä ilmakammion ilmanpaine muunnetaan synkroniseksi paineeksi nestekammiossa ja indusoi sydänviipaleen fysiologista laajenemista (kuva 2a ja täydentävä elokuva 1).Kudosten venymisen arviointi paineessa 80 mm Hg.Taide.osoitti kudosleikkeiden venymistä 25 % (kuvio 2b).Tämän prosentuaalisen venymän on osoitettu vastaavan fysiologista sarkomeerin pituutta 2,2–2,3 µm normaalille sydämen osan supistumiskyvylle17, 19, 25.Kudosten liike arvioitiin käyttämällä mukautettuja kameraasetuksia (lisäkuva 1).Kudosliikkeen amplitudi ja nopeus (kuvio 2c, d) vastasi venytystä sydämen syklin aikana ja aikaa systolen ja diastolen aikana (kuvio 2b).Sydänkudoksen venytys ja nopeus supistumisen ja rentoutumisen aikana pysyivät vakiona 12 päivän ajan viljelmässä (kuvio 2f).Arvioidaksemme sähköisen stimulaation vaikutusta supistumiskykyyn viljelyn aikana, kehitimme menetelmän aktiivisen epämuodostuman määrittämiseksi käyttämällä varjostusalgoritmia (lisäkuva 2a, b) ja pystyimme erottamaan epämuodostumat sähköstimulaatiolla ja ilman.Sama osa sydämestä (kuva 2f).Leikkauksen liikkuvalla alueella (R6-9) jännite sähköstimulaation aikana oli 20 % korkeampi kuin sähköstimulaation puuttuessa, mikä osoittaa sähköstimulaation osuuden supistumistoimintoon.
Edustavia jälkiä ilmakammion paineesta, nestekammion paineesta ja kudoksen liikemittauksista vahvistavat, että kammion paine muuttaa nestekammion painetta aiheuttaen vastaavan kudosviipaleen liikkeen.b Edustavat kudosleikkeiden prosentuaalisen venytyksen jäljet ​​(sininen), jotka vastaavat venymäprosenttia (oranssi).c Sydämen viipaleen mitattu liike on yhdenmukainen mitatun liikenopeuden kanssa.(d) Syklisen liikkeen (sininen viiva) ja nopeuden (oranssi katkoviiva) edustavat liikeradat sydämen siivussa.e Kiertoajan kvantifiointi (n = 19 siivua ryhmää kohden, eri sioista), supistumisaika (n = 19 viipaletta ryhmää kohti), rentoutumisaika (n = 19 viipaletta ryhmää kohden, eri sioista), kudosten liike (n = 25 ).viipaletta)/ryhmä eri sioista), huippusystolinen nopeus (n = 24(D0), 25(D12) viipaletta/ryhmä eri sioista) ja huippurelaksaationopeus (n=24(D0), 25(D12) viipaletta/ryhmä eri sioista).Kaksisuuntainen Studentin t-testi ei osoittanut merkittävää eroa missään parametrissa.f Edustavat venymäanalyysijäljet ​​kudosleikkeistä (punainen) ja ilman (sinistä) sähköstimulaatiota, kymmenen alueellista aluetta kudosleikkeistä samasta leikkeestä.Pohjapaneelit näyttävät prosenttiosuuksien eron kudosleikkeissä sähköstimulaatiolla ja ilman sitä kymmenellä alueella eri leikkeistä. (n = 8 viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritetaan kaksipyrstöisen Studentin t-testi; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritetaan kaksipyrstöisen Studentin t-testi; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 leikettä/ryhmä eri sioista, kaksipyrstöinen Studentin t-testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 leikettä/ryhmä, eri sioista, kaksipyrstöinen Studentin t-testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± standardipoikkeama.
Edellisessä staattisessa biomimeettisessä sydänviipaleviljelyjärjestelmässämme [20, 21] säilytimme sydänviipaleiden elinkelpoisuuden, toiminnan ja rakenteellisen eheyden 6 päivän ajan käyttämällä sähköstimulaatiota ja optimoimalla alustan koostumusta.10 päivän jälkeen nämä luvut kuitenkin putosivat jyrkästi.Viitataan edellisessä staattisessa biomimeettisessä viljelyjärjestelmässämme 20, 21 (Ctrl) viljeltyihin leikkeisiin ja käytämme aiemmin optimoitua elatusalustaa MC-olosuhteina ja viljelmämme samanaikaisessa mekaanisessa ja sähköisessä stimulaatiossa (CTCM).nimeltään .Ensin määritimme, että mekaaninen stimulaatio ilman sähköstimulaatiota ei riittänyt ylläpitämään kudoksen elinkykyä 6 päivän ajan (lisäkuvat 3a, b).Mielenkiintoista on, että kun STCM:ää käyttävä fysio-mekaaninen ja sähköinen stimulaatio otettiin käyttöön, 12 päivän sydänleikkeiden elinkelpoisuus pysyi samana kuin tuoreissa sydänleikkeissä MS-olosuhteissa, mutta ei Ctrl-olosuhteissa, kuten MTT-analyysi osoittaa (kuva 1).3a).Tämä viittaa siihen, että sydämen syklin mekaaninen stimulaatio ja simulointi voivat pitää kudososat elinkelpoisina kaksi kertaa niin kauan kuin aiemmassa staattisessa viljelyjärjestelmässämme on raportoitu.Kuitenkin kudosleikkeiden rakenteellisen eheyden arviointi sydämen troponiini T:n ja konneksiini 43:n immunoleimauksella osoitti, että konneksiini 43:n ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi MC-kudoksissa päivänä 12 kuin kontrolleissa samana päivänä.Yhtenäinen konneksiini 43:n ilmentyminen ja Z-kiekon muodostuminen eivät kuitenkaan säilyneet täysin (kuvio 3b).Käytämme tekoälyn (AI) viitekehystä kudoksen rakenteellisen eheyden kvantifiointiin26, kuvapohjaista syväoppimisputkistoa, joka perustuu troponiini-T- ja konneksiinivärjäykseen43 sydänviipaleiden rakenteellisen eheyden ja fluoresenssin automaattiseen kvantifiointiin lokalisoinnin voimakkuuden suhteen.Tämä menetelmä käyttää konvoluutiohermoverkkoa (CNN) ja syväoppimiskehystä sydänkudoksen rakenteellisen eheyden luotettavaan kvantifiointiin automatisoidulla ja puolueettomalla tavalla, kuten viitteessä on kuvattu.26. MC-kudos osoitti parantunutta rakenteellista samankaltaisuutta päivään 0 verrattuna staattisiin kontrollileikkeisiin.Lisäksi Massonin trikromivärjäys paljasti merkittävästi pienemmän prosenttiosuuden fibroosista MS-olosuhteissa verrattuna kontrolliolosuhteisiin viljelypäivänä 12 (kuvio 3c).Vaikka CTCM lisäsi sydänkudosleikkeiden elinkelpoisuutta päivänä 12 tasolle, joka on samanlainen kuin tuoreen sydänkudoksen, se ei merkittävästi parantanut sydänleikkeiden rakenteellista eheyttä.
pylväsdiagrammi näyttää tuoreiden sydänviipaleiden (D0) tai sydänviipaleviljelmän MTT-elinkelpoisuuden kvantifioinnin 12 päivän ajalta joko staattisessa viljelmässä (D12 Ctrl) tai CTCM:ssä (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC) < eri siivuista #0 #p; 0001 verrattuna D0:aan ja **p < 0,01 verrattuna D12:een Ctrl). pylväsdiagrammi näyttää tuoreiden sydänviipaleiden (D0) tai sydänviipaleviljelmien MTT-elinkelpoisuuden kvantifioinnin 12 päivän ajalta joko staattisessa viljelmässä (D12 Ctrl) tai CTCM:ssä (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) suoritettu eri sliceistä # sika#0/ryhmä; .0001 verrattuna D0:aan ja **p < 0,01 verrattuna D12:een Ctrl).histogrammi näyttää MTT:n tuoreen sydämen leikkeiden (D0) tai sydänleikkeiden viljelyn elinkelpoisuuden kvantifioinnin 12 päivän ajan joko staattisessa viljelmässä (D12 kontrolli) tai CTCM:ssä (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrolli).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja **p < 0,01 verrattuna D12:een Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片煖凃脏切片(D0)天的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向ANOVA 测行单向 测试；伌10 #0#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片个奏切片2杪切片 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12」もも比，**phistogrammi, joka näyttää MTT:n elinkelpoisuuden kvantifioinnin tuoreissa sydänleikkeissä (D0) tai sydänleikkeissä, joita on viljelty 12 päivää staattisessa viljelmässä (D12 kontrolli) tai CTCM:ssä (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrolli)), 12 (D12 MC) leikkettä/ryhmä eri sioista;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan, **p < 0,01 verrattuna D12:een Ctrl).b Troponin-T (vihreä), connexin 43 (punainen) ja DAPI (sininen) juuri eristetyissä sydänleikkeissä (D0) tai sydänleikkeissä, joita on viljelty staattisissa olosuhteissa (Ctrl) tai CTCM-olosuhteissa (MC) 12 päivän ajan) edustavista immunofluoresenssikuvista (tyhjä asteikko = 100 µm). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden tekoälyn kvantifiointi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viipaletta/ryhmä kukin eri sioista, suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja ****p < 0,0001 verrattuna D1201:ään). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden tekoälyn kvantifiointi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viipaletta/ryhmä kukin eri sioista, suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja ****p < 0,001:een verrattuna). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 MC пурзо Ctrl 2), (D12 D12 D12) разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравне12). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden kvantifiointi tekoälyllä (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) leikettä/ryhmää eri sioista, suoritettu yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 vs. D0 ja ****p < 0,001 verrattuna D1201:een).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viipaletta/ryhmä kukin eri sika, yksisuuntainen 且 渔00p10 #. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) viipaletta/ryhmä kukin eri sioista, yksisuuntainen 且渔渔 ANOVAp0.0####D; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), Ctrl MCппп, 7 (D1) (2рес1) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению2). Tekoäly sydänkudoksen rakenteellisen eheyden kvantifioimiseksi (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) leikettä/ryhmä kukin eri sioista, yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p<0,0001 vs. .D0 Vertailun vuoksi ****p < 0,0201 verrattuna D1201). c Edustavat kuvat (vasemmalla) ja kvantifiointi (oikealla) sydänviipaleille, jotka on värjätty Massonin trikromivärillä (paljas asteikko = 500 µm) (n = 10 viipaletta/ryhmä kukin eri sioista, suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna ***p:iin verrattuna 0,0001:een). c Edustavat kuvat (vasemmalla) ja kvantifiointi (oikealla) sydänviipaleille, jotka on värjätty Massonin trikromivärjäyksellä (paljas asteikko = 500 µm) (n = 10 viipaletta/ryhmä kukin eri sioista, suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi; #### p < 0,000,1 ja 0,1 verrattuna). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест0 p1 поронний тест0 p1 поронний тест ANOVA; и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Edustavat kuvat (vasemmalla) ja kvantifiointi (oikealla) sydänleikkeistä, jotka on värjätty Massonin trikromivärillä (päällystämätön asteikko = 500 µm) (n = 10 leikettä/ryhmä eri sioista, suoritettu yksisuuntainen ANOVA-testi; #### p < 0 .0001 verrattuna 0 .0001 D0:aan ja D0:een D0:een verrattuna). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺0）（裸尺0）（裸尺0）切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 伎D0 相比，D1 <丸比，***p2 . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 尸 尦躸 裸尺度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单同 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 个 个 个 00.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихром ая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью # однофактор; # #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Edustavat kuvat (vasemmalla) ja kvantitaatio (oikealla) sydämen leikkeistä, jotka on värjätty Massonin trikromivärillä (tyhjä = 500 µm) (n = 10 leikettä/ryhmä, kukin eri sikasta, testattu yksisuuntaisella varianssianalyysillä ;### # p < 0,0001 ***p < 0,0, 2 verrattuna D0:aan, 0001 ***.01 verrattuna D0:aan).Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± standardipoikkeama.
Oletimme, että lisäämällä pieniä molekyylejä elatusaineeseen kardiomyosyyttien eheyttä voitaisiin parantaa ja fibroosin kehittymistä vähentää CTCM-viljelyn aikana.Siksi seuloimme pieniä molekyylejä käyttämällä staattisia kontrolliviljelmiämme 20, 21, koska hämmentäviä tekijöitä oli vähän.Deksametasoni (Dex), trijodityroniini (T3) ja SB431542 (SB) valittiin tälle seulolle.Näitä pieniä molekyylejä on aiemmin käytetty hiPSC-CM-viljelmissä kardiomyosyyttien kypsymisen indusoimiseksi lisäämällä sarkomeerin pituutta, T-tubuluksia ja johtumisnopeutta.Lisäksi sekä Dexin (glukokortikoidi) että SB:n tiedetään tukahduttavan tulehdusta29,30.Siksi testasimme, parantaisiko yhden tai näiden pienten molekyylien yhdistelmän sisällyttäminen sydämen osien rakenteellista eheyttä.Alkuseulontaa varten kunkin yhdisteen annos valittiin soluviljelymalleissa yleisesti käytettyjen pitoisuuksien perusteella (1 µM Dex27, 100 nM T327 ja 2,5 µM SB31).12 päivän viljelyn jälkeen T3:n ja Dexin yhdistelmä johti optimaaliseen kardiomyosyyttien rakenteelliseen eheyteen ja minimaaliseen kuitujen uudelleenmuodostukseen (lisäkuvat 4 ja 5).Lisäksi kaksinkertaisten tai kaksinkertaisten T3- ja Dex-pitoisuuksien käyttö tuotti haitallisia vaikutuksia normaaleihin pitoisuuksiin verrattuna (lisäkuvat 6a, b).
Alkuseulonnan jälkeen suoritimme neljän viljelyolosuhteiden välisen vertailun (kuvio 4a): Ctrl: sydänleikkeet, joita viljeltiin aiemmin kuvatussa staattisessa viljelmässämme käyttämällä optimoitua väliainetta;20.21 TD: T3 ja Ctrl s lisätty Dex keskiviikkona;MC: sydänleikkeet, joita viljeltiin CTCM:ssä käyttämällä aiemmin optimoitua elatusalustamme;ja MT: CTCM, jossa T3 ja Dex on lisätty elatusaineeseen.12 päivän viljelyn jälkeen MS- ja MT-kudosten elinkelpoisuus pysyi samana kuin tuoreissa kudoksissa, jotka arvioitiin MTT-määrityksellä (kuvio 4b).Mielenkiintoista on, että T3:n ja Dexin lisääminen transwell-viljelmiin (TD) ei johtanut merkittävään elinkelpoisuuden parantumiseen verrattuna Ctrl-olosuhteisiin, mikä osoittaa mekaanisen stimulaation tärkeän roolin sydänleikkeiden elinkyvyn ylläpitämisessä.
kokeellinen suunnittelukaavio, joka kuvaa neljää viljelyolosuhteita, joita käytettiin mekaanisen stimulaation ja T3/Dex-lisäyksen vaikutusten arvioimiseen elatusaineessa 12 päivän ajan. b Pylväsdiagrammi näyttää elinkelpoisuuden kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa 4 viljelyolosuhteissa (Ctrl, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänviipaleisiin (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) on suoritettu eri viipaleista #0 #p; 0001, ###p < 0,001 verrattuna D0:aan ja **p < 0,01 verrattuna D12:een Ctrl). b Pylväsdiagrammi näyttää elinkelpoisuuden kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa 4 viljelyolosuhteissa (Ctrl, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänviipaleisiin (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) on suoritettu eri viipaleista #0 #p; 0001, ###p < 0,001 verrattuna D0:aan ja **p < 0,01 verrattuna D12:een). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 päivää sitten вания (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D122 (D12) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 пнеюю2 пнею2 ). b Pylväsdiagrammi näyttää elinkelpoisuuden kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa 4 viljelyolosuhteissa (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreen sydämen osiin (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), 12 (D12 MC) eri osista ANO #0 p; yksi testi #0 p. 01, ###p < 0,001 vs. D0 ja **p < 0,01 verrattuna D12:een Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D215)D12D15) MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，###p < **0.0001，###p < 丌p01.0.0D01与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC ja MT) по сравнению со свежими срез0дими срез0д8n), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, D12, 0,0001, #0х1 p. p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogrammi, joka näyttää kaikki 4 viljelyolosuhteita (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreen sydämen leikkeisiin (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MT), eri sioista 12 (D12 MC) leikkettä/ryhmä, yksisuuntainen ANOVA-testi; D ####p1<,0 ####p1 **p<0,01 vs. kontrolli D12). c Pylväsdiagrammi näyttää glukoosivirran kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteissa (Ctrl, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänviipaleisiin (D0) (n = 6 viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi; ###p < 0,001, verrattuna D0:aan ja 0,2:een verrattuna D0:aan). c Pylväsdiagrammi näyttää glukoosivirran kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteissa (Ctrl, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänviipaleisiin (D0) (n = 6 viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi; ###p < 0,001, verrattuna D0:aan ja 0,2:een verrattuna D0:aan). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во вохлу4 все (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свитныйястоподнияней, ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogrammi näyttää glukoosivirran kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikissa neljässä viljelyolosuhteissa (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänleikkeisiin (D0) (n = 6 leikettä/ryhmä eri sioista, suoritettu yksisuuntainen ANOVA-testi; ###p < 0,001 verrattuna D0:aan ja 01***01:een). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片廩儩儹褡夡 相掐2糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p < 0.001，与D0（片/组，与D0相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， 捌 猪弌 ANO ， ， ， ，试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после култивирования рования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разныных, от разныных сердца ены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogrammi, joka näyttää glukoosivirran kvantifioinnin 12 päivää viljelyn jälkeen kaikilla 4 viljelyolosuhteilla (kontrolli, TD, MC ja MT) verrattuna tuoreisiin sydänleikkeisiin (D0) (n = 6 leikettä/ryhmä, eri sioista, yksipuolinen Suoritettiinko ANOVA-testejä, ###p < 0,001 verrattuna D0,001 ***p:iin verrattuna D0,001:een).d Tuoreiden (sininen), päivän 12 MC (vihreä) ja päivän 12 MT (punainen) kudosten kannananalyysikäyrät kymmenessä alueellisessa kudosleikkauspisteessä (n = 4 viipaletta/ryhmä, yksisuuntainen ANOVA-testi; ryhmien välillä ei ollut merkittävää eroa).e Tulivuorikaavio, joka näyttää eri tavalla ilmentyneet geenit tuoreissa sydänleikkeissä (D0) verrattuna sydänleikkeisiin, joita viljeltiin staattisissa olosuhteissa (Ctrl) tai MT-olosuhteissa (MT) 10-12 päivää.f Sarkomeerigeenien lämpökartta sydänleikkeille, joita on viljelty kussakin viljelyolosuhteissa.Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± standardipoikkeama.
Metabolinen riippuvuus siirtymisestä rasvahappojen hapettumisesta glykolyysiin on sydänlihassolujen dedifferentioitumisen tunnusmerkki.Epäkypsät sydänlihassolut käyttävät ensisijaisesti glukoosia ATP:n tuotantoon, ja niillä on hypoplastisia mitokondrioita, joissa on vähän cristae5,32.Glukoosin käyttöanalyysit osoittivat, että MC- ja MT-olosuhteissa glukoosin käyttö oli samanlaista kuin päivän 0 kudoksissa (kuvio 4c).Ctrl-näytteet osoittivat kuitenkin merkittävää lisäystä glukoosin käytössä verrattuna tuoreeseen kudokseen.Tämä osoittaa, että CTCM:n ja T3/Dexin yhdistelmä parantaa kudoksen elinkelpoisuutta ja säilyttää 12 päivää viljeltyjen sydänleikkeiden metabolisen fenotyypin.Lisäksi kantaanalyysi osoitti, että kantatasot pysyivät samoina kuin tuoreessa sydänkudoksessa 12 päivän ajan MT- ja MS-olosuhteissa (kuvio 4d).
Analysoidaksemme CTCM:n ja T3/Dexin kokonaisvaikutusta sydänviipalekudoksen globaaliin transkriptiomaisemaan, suoritimme RNAseq:n sydänviipaleille kaikista neljästä eri viljelyolosuhteista (lisätiedot 1).Mielenkiintoista on, että MT-leikkeet osoittivat suurta transkription samankaltaisuutta tuoreen sydänkudoksen kanssa, ja vain 16 ekspressoitui eri tavalla 13 642 geenistä.Kuitenkin, kuten osoitimme aiemmin, Ctrl-viipaleet näyttivät 1229 eri tavalla ilmentynyttä geeniä 10–12 päivän viljelmän jälkeen (kuva 4e).Nämä tiedot vahvistettiin sydämen ja fibroblastigeenien qRT-PCR:llä (lisäkuvat 7a-c).Mielenkiintoista on, että Ctrl-osat osoittivat sydämen ja solusyklin geenien vähenemistä ja tulehduksellisten geeniohjelmien aktivoitumista.Nämä tiedot viittaavat siihen, että erilaistuminen, joka tapahtuu normaalisti pitkäaikaisen viljelyn jälkeen, on täysin heikentynyt MT-olosuhteissa (täydentävä kuva 8a, b).Sarkomeerigeenien huolellinen tutkimus osoitti, että vain MT-olosuhteissa sarkomeeriä (kuva 4f) ja ionikanavaa (lisäkuva 9) koodaavat geenit säilyvät, mikä suojaa niitä suppressiolta Ctrl-, TD- ja MC-olosuhteissa.Nämä tiedot osoittavat, että mekaanisen ja humoraalisen stimulaation (T3/Dex) yhdistelmällä sydänviipaletranskriptomi voi pysyä samanlaisena kuin tuoreet sydänviipaleet 12 päivän viljelmän jälkeen.
Näitä transkriptiohavaintoja tukee se tosiasia, että sydänlihassolujen rakenteellinen eheys sydänleikkeissä säilyy parhaiten MT-olosuhteissa 12 päivän ajan, kuten koskematon ja paikallinen konnekiini 43 osoittaa (kuvio 5a).Lisäksi fibroosi sydänleikkeissä MT-olosuhteissa väheni merkittävästi verrattuna Ctrl:iin ja samankaltaisesti tuoreisiin sydänleikkeisiin (kuvio 5b).Nämä tiedot osoittavat, että mekaanisen stimulaation ja T3/Dex-hoidon yhdistelmä säilyttää tehokkaasti sydämen rakenteen sydämen osissa viljelmässä.
a Edustavia immunofluoresenssikuvia troponiini-T:stä (vihreä), konneksiini 43:sta (punainen) ja DAPI:sta (sininen) juuri eristetyissä sydänleikkeissä (D0) tai viljellään 12 päivää kaikissa neljässä sydänleikkeen viljelyolosuhteissa (mittakaavapalkki = 100 µm).). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden tekoälyn kvantifiointi (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi; ####p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja *5:een < 0.0.1, tai 0.0. ). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden tekoälyn kvantifiointi (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritetaan yksisuuntainen ANOVA-testi; #### p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja *5:een <0.1, tai 0.0. ). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 71,2D10) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению <****и сравнению <****и по 0,0 * с сравнению с D0 п0,0 сравнению с D12 Ctrl). Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden kvantifiointi tekoälyn avulla (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) leikkettä/ryhmä eri sioista, suoritettu yksisuuntainen ANOVA-testi; ##****## p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja *p < 0,0 0,1 verrattuna.对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12臺蛉和D12 MT（工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,00012比D对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc12 mc工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 盔相比）.Sydänkudoksen rakenteellisen eheyden kvantifiointi käyttämällä tekoälyä eri sioissa (n = 7 (D0 ja D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ja D12 MT) leikkeitä/ryhmä) yksisuuntaisella ANOVA-testillä;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 verrattuna D0:aan ja *p < 0,05 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12:een Ctrl). b Edustavat kuvat ja kvantifiointi sydämen viipaleille, jotka on värjätty Massonin trikromivärillä (mittakaava = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) viipaletta/ryhmä suoritettu eri sioista; <0 #0 testiä verrataan 1-suuntaiseen ANO##0:aan. D0 ja ***p < 0,001 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12:een Ctrl). b Edustavat kuvat ja kvantifiointi sydämen viipaleille, jotka on värjätty Massonin trikromivärillä (mittakaava = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) viipaletta/ryhmä suoritettu eri sioista; <0 #0 testiä verrataan 1-suuntaiseen ANO##0:aan. D0 ja ***p < 0,001 tai ****p < 0,0001 verrattuna D12:een Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителейм красителеным ка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется #0, выполняется #0#0#1; по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Edustavat kuvat ja kvantitatiiviset sydänleikkeet, jotka on värjätty Massonin trikromivärjäyksellä (mittakaavaviiva = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) leikettä/ryhmä eri sioista, suoritettu yksisuuntainen D*** v.0 ANOP.1. 0,001 tai ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（D20＀D =1D010（n和D12 MC），来自不同猪的 9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；方差分析；####p0D12. 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 100 µ0 n = 100 µm！ ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切燇 片片 片 切片 切片 切片 切片 切切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组，进行单因素方差 䯁因素方差 < 䯁因素方差 切片 #. ***p < 0,001, 或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массца (тим00ромом Массца) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) sрезов от разных свиней / группы, один- способ*** ANOVA; ####p <не пою0сра1 по,0,0,0сра1 ,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Edustavat kuvat ja Massonin trikromilla värjättyjen sydänleikkeiden kvantifiointi (mittakaavapalkki = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ja D12 MC), 9 (D12 MT) leikkettä eri sioista/ryhmä, yksi ANOVA-menetelmä ****** 0 verrattuna 0 tai 0 0p.1. ****p < 0,0001 verrattuna D12 Ctrl).Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± standardipoikkeama.
Lopuksi CTCM:n kyky jäljitellä sydämen hypertrofiaa arvioitiin lisäämällä sydänkudoksen venymistä.CTCM:ssä ilmakammion huippupaine nousi 80 mmHg:stä 80 mmHg:iin.Taide.(normaali venytys) 140 mmHg asti Art.(Kuvio 6a).Tämä vastaa 32 %:n lisäystä venytyksessä (kuvio 6b), joka aiemmin esitettiin vastaavana prosenttiosuutena venymisestä, joka vaadittiin sydänleikkeille saavuttamaan samanlainen sarkomeeripituus kuin hypertrofiassa havaittu.Sydänkudoksen venytys ja nopeus supistumisen ja rentoutumisen aikana pysyivät vakiona kuuden viljelypäivän ajan (kuvio 6c).MT-tiloista peräisin olevaa sydänkudosta altistettiin normaalille venytysolosuhteille (MT (normaali)) tai ylivenytysolosuhteille (MT (OS)) kuuden päivän ajan.Jo neljän päivän viljelmän jälkeen hypertrofinen biomarkkeri NT-ProBNP oli merkittävästi kohonnut alustassa MT (OS) olosuhteissa verrattuna MT (normaali) olosuhteisiin (kuvio 7a).Lisäksi kuuden päivän viljelyn jälkeen solukoko MT:ssä (OS) (kuvio 7b) kasvoi merkittävästi verrattuna MT-sydämen leikkeisiin (normaali).Lisäksi NFATC4:n tuman translokaatio lisääntyi merkittävästi ylivenyneissä kudoksissa (kuvio 7c).Nämä tulokset osoittavat patologisen uudelleenmuodostumisen asteittaisen kehittymisen hyperdensionin jälkeen ja tukevat ajatusta, että CTCM-laitetta voidaan käyttää alustana venytyksen aiheuttaman sydämen hypertrofian signaloinnin tutkimiseen.
Edustavia jälkiä ilmakammion paineesta, nestekammion paineesta ja kudoksen liikemittauksista vahvistavat, että kammion paine muuttaa nestekammion painetta aiheuttaen vastaavan kudosviipaleen liikkeen.b Edustavat venytysprosentti- ja venytysnopeuskäyrät normaalisti venytetyille (oranssi) ja ylivenyneille (sininen) kudosleikkeille.c Pylväsdiagrammi, joka näyttää syklin ajan (n = 19 viipaletta ryhmää kohden, eri sioista), supistumisaikaa (n = 18-19 viipaletta per ryhmä, eri sioista), rentoutumisaikaa (n = 19 viipaletta ryhmää kohden, eri sioista) ), kudosliikkeen amplitudia (n = 14 viipaletta/ryhmä, eri sioista, nopeus = 1 siivua/ryhmä), siat) ja huippurelaksaationopeus (n = 14 (D0), 15 (D6) ) leikkeitä/ryhmiä) eri sioista), kaksipyrstöinen Studentin t-testi ei osoittanut merkittävää eroa missään parametrissa, mikä osoittaa, että nämä parametrit pysyivät vakioina 6 päivän viljelyn aikana ylijännitteellä.Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± standardipoikkeama.
pylväsdiagrammi NT-ProBNP-konsentraation kvantifiointi elatusaineessa sydänviipaleista, jotka on viljelty MT-normaalissa venytys- (Norm) tai ylivenytys-olosuhteissa (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4 MTOS) viipaletta/ryhmä eri sioista, verrattuina 0:aan, **p:hen on kaksisuuntainen; pylväsdiagrammi NT-ProBNP-pitoisuuden kvantitatiivisesta elatusaineesta sydänviipaleista, jotka on viljelty MT-normaalissa venytys- (Norm) tai ylivenytys-olosuhteissa (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4 MTOS) viipaleita/ryhmä eri sioista, **pANO on suoritettu <0;.0 normaaliin, kaksisuuntaiseen).Kvantitatiivinen histogrammi NT-ProBNP-pitoisuudesta elatusaineessa sydänviipaleista, jotka on viljelty normaalin MT-venytyksen (norm) tai ylivenytys (OS) olosuhteissa (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ja D4).MTOS) viipaletta / ryhmä eri sioista, kaksitekijäinen varianssianalyysi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 verrattuna normaaliin venytykseen). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓庡(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析，p < 0,01）. a NT-ProBNP-konsentraation kvantifiointi sydämen viipaleissa, jotka on viljelty MT normaalin venytys (Norm) tai overstretch (OS) olosuhteissa (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) eri 猪的幇片䏐叐叐幌叐叐组！动; **verrattuna normaaliin venytykseen, p < 0,01).histogrammi NT-ProBNP-pitoisuuksien kvantifiointi sydänviipaleissa, jotka on viljelty normaalin MT-venytyksen (norm) tai ylivenytys (OS) olosuhteissa (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ja D4 MTOS) viipaletta/ryhmä eri sioista, kaksisuuntainen varianssianalyysi;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 verrattuna normaaliin venytykseen). b Edustavat kuvat troponiini-T:llä ja WGA:lla värjätyistä sydänviipaleista (vasemmalla) ja solukoon kvantifiointi (oikealla) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) solua/ryhmä 10 eri viipaleesta eri sioista, Two-taled Student t-1 verrataan 0 normaaliin . ****0 p-testiin. b Edustavat kuvat troponiini-T:llä ja WGA:lla värjätyistä sydänviipaleista (vasemmalla) ja solukoon kvantifiointi (oikealla) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) solua/ryhmä 10:stä eri viipaleesta eri sioista, Kaksipyrstöinen Studentin t-1 verrataan 0 normaaliin . ****0 p-testiin. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественадголкерасрадца ва) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится два- проводится ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Edustavat kuvat troponiini-T:llä ja AZP:llä värjätyistä sydänleikeistä (vasemmalla) ja solukoon kvantifiointi (oikealla) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) solua/ryhmä 10 eri leikeestä eri sioista, kaksipyrstöinen Studentin t-testi suoritettiin normaaliin 0; ****p01:een. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代脏切片片的代辨揃30D OS左） ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学玌有尾学生t比，****p < 0,0001）. b Edustavia kuvia sydänviipaleista, jotka on värjätty calcarein-T:llä ja WGA:lla (vasemmalla) ja solukoolla (oikealla) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 eri viipaleesta (D6 MTNorm)). 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ja АЗП (слева) и количественкаn (количественкаn) = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, ****тьа, двусторонние критей,0денСритей,0денСритери; сравнению с нормальным растяжением). b Edustavat kuvat troponiini-T:llä ja AZP:llä värjätyistä sydänleikeistä (vasemmalla) ja solukoon kvantifiointi (oikealla) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 eri leikeestä eri sioista) Solut/ryhmä, kaksisuuntainen kriteeri Studentin t;****p < 0,0001 normaaliin kantaan verrattuna). c Edustavia kuvia päiviltä 0 ja 6 MTOS-sydänviipaleet, jotka on immunoleimattu troponiini-T:lle ja NFATC4:lle, sekä NFATC4:n translokaation kvantifiointi CM:iden ytimiin (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viipaletta/ryhmä eri sioista, suoritettu kaksipyrstöinen *t0.0p-testi. c Edustavia kuvia päiviltä 0 ja 6 MTOS-sydänviipaleet, jotka on immunoleimattu troponiini-T:lle ja NFATC4:lle, sekä NFATC4:n translokaation kvantifiointi CM:ien ytimiin (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viipaletta/ryhmä eri sioista *t-ptai suoritettiin 0 ;0.ptai). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т ja NFATC4, ченерастина, слокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинеристодриврийстояСннияетсо ента; *p < 0,05). c Edustavia kuvia sydänleikkeistä 0 ja 6 päivän MTOS:lla, immunoleimattu troponiini-T:lle ja NFATC4:lle, ja NFATC4-translokaation kvantifiointi paisuvaisten solujen ytimessä (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viipaletta/ryhmä eri sioista) suorittivat kaksitaitoiset Studentin testit;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第 6 天 和第 天 MTOS 心脏切片仼匪个表性的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 曂〼 5 p) 「＂. c Edustavia kuvia kalkaniini-T:n ja NFATC4:n immunoleimauksesta 第0天和第6天MTOS-sydänviipaleista ja NFATC4:stä eri NFATC4 易位至CM-solutumasta的痗痄痴 (D0), 痴凤OS3 (D6嶇 3)双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т ja NFATC4: кации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюде <, Стьюде). c Edustavia kuvia MTOS-sydänviipaleista päivinä 0 ja 6 troponiini-T- ja NFATC4-immunoleimaukselle ja NFATC4-translokaation kvantifiointiin eri sikojen CM-ytimessä (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) viipaletta/ryhmä, kaksipyrstöinen t.05 *suoritus: 05p).Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± keskihajonta.
Translationaalinen kardiovaskulaarinen tutkimus vaatii solumalleja, jotka toistavat tarkasti sydämen ympäristön.Tässä tutkimuksessa kehitettiin ja karakterisoitiin CTCM-laite, joka voi stimuloida sydämen erittäin ohuita osia.CTCM-järjestelmä sisältää fysiologisesti synkronoidun sähkömekaanisen stimulaation ja T3- ja Dex-nesteen rikastamisen.Kun sian sydänleikkeet altistettiin näille tekijöille, niiden elinkelpoisuus, rakenteellinen eheys, metabolinen aktiivisuus ja transkription ilmentyminen pysyivät samoina kuin tuoreessa sydänkudoksessa 12 päivän viljelyn jälkeen.Lisäksi sydänkudoksen liiallinen venyminen voi aiheuttaa hypertensiosta johtuvaa sydämen hypertrofiaa.Kaiken kaikkiaan nämä tulokset tukevat fysiologisten viljelyolosuhteiden kriittistä roolia normaalin sydämen fenotyypin ylläpitämisessä ja tarjoavat alustan lääkeaineseulonnalle.
Monet tekijät myötävaikuttavat optimaalisen ympäristön luomiseen sydänlihassolujen toiminnalle ja selviytymiselle.Ilmeisimpiä näistä tekijöistä liittyvät (1) solujen välisiin vuorovaikutuksiin, (2) sähkömekaaniseen stimulaatioon, (3) humoraalisiin tekijöihin ja (4) metabolisiin substraatteihin.Fysiologiset solujen väliset vuorovaikutukset vaativat monimutkaisia ​​kolmiulotteisia verkkoja useista solutyypeistä, joita solunulkoinen matriisi tukee.Tällaisia ​​monimutkaisia ​​soluvuorovaikutuksia on vaikea rekonstruoida in vitro yksittäisten solutyyppien yhteisviljelyllä, mutta ne voidaan saavuttaa helposti käyttämällä sydänleikkeiden organotyyppistä luonnetta.
Kardiomyosyyttien mekaaninen venytys ja sähköinen stimulaatio ovat kriittisiä sydämen fenotyypin ylläpitämisessä33,34,35.Vaikka mekaanista stimulaatiota on käytetty laajalti hiPSC-CM-käsittelyyn ja kypsymiseen, useat tyylikkäät tutkimukset ovat viime aikoina yrittäneet stimuloida sydänviipaleita mekaanisesti viljelmässä käyttämällä yksiakselista kuormitusta.Nämä tutkimukset osoittavat, että 2D yksiaksiaalinen mekaaninen kuormitus vaikuttaa positiivisesti sydämen fenotyyppiin viljelyn aikana.Näissä tutkimuksissa sydämen osia joko kuormitettiin isometrisilla vetovoimilla17, lineaarisella auksotonisella kuormituksella18 tai sydämen sykli luotiin uudelleen käyttämällä voima-anturin takaisinkytkentää ja jännitysvoimaa.Näissä menetelmissä käytetään kuitenkin yksiakselista kudoksen venytystä ilman ympäristön optimointia, mikä johtaa monien sydämen geenien tukahduttamiseen tai epänormaaleihin venytysvasteisiin liittyvien geenien yli-ilmentymiseen.Tässä kuvattu CTCM tarjoaa 3D-sähkömekaanisen ärsykkeen, joka jäljittelee luonnollista sydämen sykliä syklin ajan ja fysiologisen venytyksen suhteen (25 % venytys, 40 % systolia, 60 % diastolia ja 72 lyöntiä minuutissa).Vaikka tämä kolmiulotteinen mekaaninen stimulaatio ei yksinään riitä ylläpitämään kudoksen eheyttä, humoraalisen ja mekaanisen stimulaation yhdistelmää T3/Dexiä käyttämällä tarvitaan kudoksen elinkelpoisuuden, toiminnan ja eheyden ylläpitämiseksi riittävästi.
Humoraalisilla tekijöillä on tärkeä rooli aikuisen sydämen fenotyypin muokkaamisessa.Tämä korostettiin HiPS-CM-tutkimuksissa, joissa T3:a ja Dexiä lisättiin viljelyalustaan ​​solujen kypsymisen nopeuttamiseksi.T3 voi vaikuttaa aminohappojen, sokereiden ja kalsiumin kuljettamiseen solukalvojen läpi36.Lisäksi T3 edistää MHC-α:n ilmentymistä ja MHC-β:n alasäätelyä edistäen nopeiden nykivien myofibrillien muodostumista kypsissä sydänlihassoluissa verrattuna hitaisiin nykimismyofibrilleihin sikiön CM:ssä.T3-puutos kilpirauhasen vajaatoimintaa sairastavilla potilailla johtaa myofibrillaaristen vyöhykkeiden katoamiseen ja sävyn kehittymisen hidastumiseen37.Dex vaikuttaa glukokortikoidireseptoreihin ja sen on osoitettu lisäävän sydänlihaksen supistumiskykyä eristetyissä perfusoiduissa sydämissä;38 tämän parannuksen uskotaan liittyvän vaikutukseen kalsiumkertymän vaikutukseen (SOCE) 39,40.Lisäksi Dex sitoutuu reseptoreihinsa aiheuttaen laajan solunsisäisen vasteen, joka vaimentaa immuunitoimintaa ja tulehdusta30.
Tuloksemme osoittavat, että fysikaalinen mekaaninen stimulaatio (MS) paransi viljelyn yleistä suorituskykyä verrattuna Ctrl:iin, mutta ei säilyttänyt elinkelpoisuutta, rakenteellista eheyttä ja sydämen ilmentymistä 12 päivän ajan viljelmässä.Verrattuna Ctrl:iin T3:n ja Dexin lisääminen CTCM (MT) -viljelmiin paransi elinkelpoisuutta ja säilytti samanlaiset transkriptioprofiilit, rakenteellinen eheys ja metabolinen aktiivisuus tuoreella sydänkudoksella 12 päivän ajan.Lisäksi kudosten venymisen astetta säätelemällä luotiin STCM:n avulla hypertensiosta johtuva sydämen hypertrofiamalli, joka havainnollistaa STCM-järjestelmän monipuolisuutta.On huomattava, että vaikka sydämen uudelleenmuotoilu ja fibroosi sisältävät yleensä ehjiä elimiä, joiden kiertävät solut voivat tarjota sopivia sytokiineja sekä fagosytoosia ja muita uudelleenmuotoilutekijöitä, sydämen osat voivat silti jäljitellä fibroottista prosessia vasteena stressille ja traumalle.myofibroblasteihin.Tämä on arvioitu aiemmin tässä sydämen viipalemallissa.On huomattava, että CTCM-parametreja voidaan moduloida muuttamalla painetta/sähköistä amplitudia ja taajuutta monien tilojen, kuten takykardian, bradykardian ja mekaanisen verenkierron tuen (mekaaninen kuormittamaton sydän) simuloimiseksi.Tämä tekee järjestelmästä keskitehoisen huumetestauksen.CTCM:n kyky mallintaa ylikuormituksen aiheuttamaa sydämen hypertrofiaa tasoittaa tietä tämän järjestelmän testaamiseen yksilölliseen hoitoon.Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus osoittaa, että mekaaninen venytys ja humoraalinen stimulaatio ovat kriittisiä sydänkudosleikkeiden viljelyn ylläpitämisessä.
Vaikka tässä esitetyt tiedot viittaavat siihen, että CTCM on erittäin lupaava alusta ehjän sydänlihaksen mallintamiseen, tällä viljelymenetelmällä on joitain rajoituksia.CTCM-viljelmän päärajoitus on, että se asettaa viipaleille jatkuvia dynaamisia mekaanisia rasituksia, mikä estää kyvyn seurata aktiivisesti sydämen viipaleiden supistuksia jokaisen syklin aikana.Lisäksi sydänosien pienen koon (7 mm) vuoksi kyky arvioida systolista toimintaa viljelyjärjestelmien ulkopuolella perinteisten voimaanturien avulla on rajoitettu.Nykyisessä käsikirjoituksessa voimme osittain voittaa tämän rajoituksen arvioimalla optista jännitettä supistuvan toiminnan indikaattorina.Tämä rajoitus vaatii kuitenkin lisätyötä, ja sitä voidaan käsitellä tulevaisuudessa ottamalla käyttöön menetelmiä sydänviipaleiden toiminnan optiseen seurantaan viljelmässä, kuten optinen kartoitus kalsium- ja jänniteherkkiä väriaineita käyttämällä.Toinen CTCM:n rajoitus on, että työmalli ei manipuloi fysiologista stressiä (esi- ja jälkikuormitus).CTCM:ssä painetta indusoitiin vastakkaisiin suuntiin 25 %:n fysiologisen venymisen tuottamiseksi diastolessa (täysi venytys) ja systolassa (supistuksen pituus sähköstimulaation aikana) hyvin suurissa kudoksissa.Tämä rajoitus tulisi poistaa tulevissa CTCM-malleissa riittävällä paineella sydänkudokseen molemmilta puolilta ja soveltamalla täsmällisiä paine-tilavuussuhteita, joita esiintyy sydämen kammioissa.
Tässä käsikirjoituksessa raportoitu ylivenytys-indusoitu uudelleenmuotoilu rajoittuu hypertrofisten hypervenymäsignaalien matkimiseen.Siten tämä malli voi auttaa venytys-indusoidun hypertrofisen signaloinnin tutkimuksessa ilman humoraalisia tai hermotekijöitä (jotka eivät ole tässä järjestelmässä).Lisätutkimuksia tarvitaan lisäämään CTCM:n moninaisuutta, esimerkiksi yhteisviljely immuunisolujen kanssa, kiertävät plasman humoraaliset tekijät ja hermotus yhteisviljelyssä hermosolujen kanssa parantavat sairauden mallintamisen mahdollisuuksia CTCM:llä.
Tässä tutkimuksessa käytettiin 13 sikaa.Kaikki eläintoimenpiteet suoritettiin laitosten ohjeiden mukaisesti, ja ne hyväksyttiin Louisvillen yliopiston laitoseläinten hoito- ja käyttökomiteassa.Aortan kaari puristettiin ja sydän perfusoitiin 1 litralla steriiliä kardioplegiaa (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/ml hepariinia, pH jopa 7,4); sydämet säilytettiin jääkylmässä kardiologisessa liuoksessa, kunnes ne kuljetettiin laboratorioon jäällä, joka on yleensä <10 min. sydämet säilytettiin jääkylmässä kardiologisessa liuoksessa, kunnes ne kuljetettiin laboratorioon jäällä, joka on yleensä <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обнично <br> sydämet säilytettiin jääkylmässä kardiologisessa liuoksessa, kunnes ne kuljetettiin laboratorioon jäillä, mikä kestää yleensä <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Pidä sydämet jäällä kardioplegiaa laboratorioon kuljetukseen asti jäällä, yleensä <10 min.
CTCM-laite kehitettiin SolidWorksin tietokoneavusteisessa suunnittelussa (CAD).Viljelykammiot, jakajat ja ilmakammiot on valmistettu kirkkaasta CNC-akryylimuovista.Halkaisijaltaan 7 mm:n tukirengas on valmistettu korkeatiheyspolyeteenistä (HDPE) keskellä, ja siinä on o-renkaan ura, johon mahtuu silikoni-o-rengas, jota käytetään materiaalin tiivistämiseen alla.Ohut piidioksidikalvo erottaa viljelykammion erotuslevystä.Silikonikalvo on laserleikattu 0,02 tuuman paksuisesta silikonilevystä ja sen kovuus on 35 A.Ala- ja yläsilikonitiivisteet on leikattu laserilla 1/16" paksusta silikonilevystä ja niiden kovuus on 50A.316L ruostumattomasta teräksestä valmistettuja ruuveja ja siipimuttereita käytetään lohkon kiinnittämiseen ja ilmatiiviin tiivisteen luomiseen.
Erillinen piirilevy (PCB) on suunniteltu integroitavaksi C-PACE-EM-järjestelmään.Piirilevyn sveitsiläiset koneen liitinpistokkeet on kytketty grafiittielektrodeihin hopeoiduilla kuparilangoilla ja pronssisilla 0-60 ruuveilla, jotka on ruuvattu elektrodeihin.Painettu piirilevy sijoitetaan 3D-tulostimen kanteen.
CTCM-laitetta ohjataan ohjelmoitavalla pneumaattisella toimilaitteella (PPD), joka luo kontrolloidun verenkierron paineen, joka muistuttaa sydänsykliä.Kun paine ilmakammion sisällä kasvaa, joustava silikonikalvo laajenee ylöspäin ja pakottaa väliaineen kudoskohdan alle.Kudosalue venyy sitten tämän nesteen poistumisen seurauksena, mikä jäljittelee sydämen fysiologista laajentumista diastolen aikana.Rentoutumisen huipulla käytettiin sähköstimulaatiota grafiittielektrodien kautta, mikä alensi painetta ilmakammiossa ja aiheutti kudososien supistumista.Putken sisällä on hemostaattinen venttiili, jossa on paineanturi, joka havaitsee paineen ilmajärjestelmässä.Paineanturin havaitsema paine kohdistetaan kannettavaan tietokoneeseen kytkettyyn tiedonkeruulaitteeseen.Tämä mahdollistaa kaasukammion sisäisen paineen jatkuvan seurannan.Kun kammion maksimipaine saavutettiin (standardi 80 mmHg, 140 mmHg OS), tiedonkeruulaite käskettiin lähettämään signaali C-PACE-EM-järjestelmään generoimaan kaksivaiheinen jännitesignaali 2 ms:ksi, asetettuna 4 V:ksi.
Sydänleikkeet saatiin ja viljelyolosuhteet 6 kaivossa suoritettiin seuraavasti: Siirrä kerätyt sydämet siirtoastiasta alustalle, joka sisälsi kylmää (4 °C) kardioplegiaa.Vasen kammio eristettiin steriilillä terällä ja leikattiin 1-2 cm3:n paloiksi.Nämä kudoslohkot kiinnitettiin kudosalustalle kudosliimalla ja asetettiin tärisevään mikrotomikudoskylpyyn, joka sisälsi Tyroden liuosta ja hapetettiin jatkuvasti (3 g/l 2,3-butaanidionimonooksiimi (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 g), H-6 M glukoosi (0,4 mM glukoosi (0,4 mM 1047 g), 2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M liuosta), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M liuosta), 1 l ddH20 asti).Värähtelevä mikrotomi asetettiin leikkaamaan 300 µm paksuja viipaleita 80 Hz:n taajuudella, vaakasuuntaisella värähtelyamplitudilla 2 mm ja etenemisnopeudella 0,03 mm/s.Kudoshaude ympäröitiin jäällä liuoksen pitämiseksi viileänä ja lämpötila pidettiin 4 °C:ssa.Siirrä kudosleikkeitä mikrotomihauteesta inkubaatiohauteeseen, joka sisältää jatkuvasti hapetettua Tyrode-liuosta jäillä, kunnes saadaan tarpeeksi leikkeitä yhdelle viljelylevylle.Transwell-viljelmiä varten kudosleikkeet kiinnitettiin steriileihin 6 mm leveisiin polyuretaanialustaihin ja asetettiin 6 ml:aan optimoitua alustaa (199 elatusainetta, 1 x ITS-lisä, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-emäksistä ja 2X antibiootti-sieni-aine).Kudosleikkeisiin kohdistettiin sähköstimulaatiota (10 V, taajuus 1,2 Hz) C-Pacen kautta.TD-olosuhteita varten tuoretta T3:a ja Dexiä lisättiin 100 nM ja 1 µM jokaisen väliaineen vaihdon yhteydessä.Väliaine kyllästetään hapella ennen vaihtoa 3 kertaa päivässä.Kudosleikkeitä viljeltiin inkubaattorissa 37 °C:ssa ja 5 % C02:ssa.
CTCM-viljelmiä varten kudosleikkeet asetettiin mittatilaustyönä tehdylle 3D-tulostimelle petrimaljalle, joka sisälsi modifioitua Tyroden liuosta.Laite on suunniteltu lisäämään sydämen viipaleen kokoa 25 % tukirenkaan pinta-alasta.Tämä tehdään siten, että sydämen osat eivät veny, kun ne on siirretty Tyroden liuoksesta väliaineeseen ja diastolen aikana.Histoakryyliliimalla kiinnitettiin 300 um paksut osat halkaisijaltaan 7 mm:n tukirenkaaseen.Kun kudosleikkeet on kiinnitetty tukirenkaaseen, leikkaa ylimääräiset kudosleikkeet irti ja aseta kiinnitetyt kudosleikkeet takaisin Tyrode-liuoshauteeseen jäillä (4°C), kunnes yhdelle laitteelle on valmistettu tarpeeksi leikkeitä.Kaikkien laitteiden kokonaiskäsittelyaika ei saa ylittää 2 tuntia.Kun 6 kudosleiketta oli kiinnitetty niiden tukirenkaisiin, CTCM-laite koottiin.CTCM-viljelykammio on esitäytetty 21 ml:lla esihapetettua väliainetta.Siirrä kudosleikkeet viljelykammioon ja poista kaikki ilmakuplat varovasti pipetillä.Kudososa ohjataan sitten reikään ja painetaan varovasti paikalleen.Aseta lopuksi elektrodin korkki laitteeseen ja siirrä laite inkubaattoriin.Liitä sitten CTCM ilmaputkeen ja C-PACE-EM-järjestelmään.Pneumaattinen toimilaite avautuu ja ilmaventtiili avaa CTCM:n.C-PACE-EM-järjestelmä on määritetty toimittamaan 4 V 1,2 Hz:n taajuudella kaksivaiheisen tahdistuksen aikana 2 ms:n ajan.Väliaine vaihdettiin kahdesti päivässä ja elektrodit vaihdettiin kerran päivässä grafiitin kerääntymisen välttämiseksi elektrodeille.Tarvittaessa kudosleikkeitä voidaan poistaa niiden viljelykuopista niiden alle mahdollisesti pudonneiden ilmakuplien poistamiseksi.MT-käsittelyolosuhteissa T3/Dex lisättiin tuoreena jokaisen väliaineen vaihdon yhteydessä 100 nM T3:lla ja 1 µM Dex:llä.CTCM-laitteita viljeltiin inkubaattorissa 37 °C:ssa ja 5 % C02:ssa.
Sydänviipaleiden venytettyjen lentoratojen saamiseksi kehitettiin erityinen kamerajärjestelmä.SLR-kameraa (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japani) käytettiin Navitar Zoom 7000 18-108mm -makroobjektiivin kanssa (Navitar, San Francisco, CA).Visualisointi suoritettiin huoneenlämpötilassa väliaineen korvaamisen jälkeen tuoreella alustalla.Kamera on sijoitettu 51 asteen kulmaan ja video tallennetaan nopeudella 30 kuvaa sekunnissa.Ensinnäkin avoimen lähdekoodin ohjelmistoa (MUSCLEMOTION43) käytettiin Image-J:n kanssa sydänviipaleiden liikkeen kvantifiointiin.Maski luotiin käyttämällä MATLABia (MathWorks, Natick, MA, USA) määrittämään kiinnostavat alueet sykkivälle sydämen viipaleelle melun välttämiseksi.Manuaalisesti segmentoituja maskeja käytetään kaikkiin kuviin kehyssarjassa ja siirretään sitten MUSCLEMOTION-laajennukseen.Muscle Motion käyttää kunkin kehyksen pikselien keskimääräistä voimakkuutta sen liikkeen kvantifioimiseksi suhteessa vertailukehykseen.Tiedot tallennettiin, suodatettiin ja niitä käytettiin syklin ajan kvantifiointiin ja kudoksen venymisen arvioimiseen sydämen syklin aikana.Tallennettu video jälkikäsiteltiin ensimmäisen asteen nollavaiheen digitaalisella suodattimella.Kudosten venymisen (huipusta huippuun) kvantifioimiseksi suoritettiin huipusta huippuun -analyysi, jotta voidaan erottaa piikit ja pohjat tallennetussa signaalissa.Lisäksi trendinpoisto suoritetaan käyttämällä kuudennen asteen polynomia signaalin ajautuman eliminoimiseksi.Ohjelmakoodi kehitettiin MATLABissa globaalin kudoksen liikkeen, syklin ajan, rentoutumisajan ja supistumisajan määrittämiseksi (lisäohjelmakoodi 44).
Jännitysanalyysiä varten jäljitimme ensin kaksi kuvaa, jotka edustavat liikehuippuja (korkein (ylempi) ja alin (alempi) liikepiste) käyttämällä samoja mekaaniseen venytyksen arviointiin luotuja videoita MUSCLEMOTION-ohjelmiston mukaan.Sitten segmentoimme kudosalueet ja sovelsimme varjostusalgoritmin muotoa segmentoituun kudokseen (täydentävä kuva 2a).Segmentoitu kudos jaettiin sitten kymmeneen alapintaan, ja kunkin pinnan jännitys laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä: Jännitys = (Sup-Sdown)/Sdown, jossa Sup ja Sdown ovat muodon etäisyydet kankaan ylä- ja alavarjoista, vastaavasti (lisäkuva .2b).
Sydänleikkeet kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 48 tunnin ajan.Kiinteät kudokset kuivattiin 10-prosenttisessa ja 20-prosenttisessa sakkaroosissa 1 tunnin ajan, sitten 30-prosenttisessa sakkaroosissa yön yli.Leikkeet upotettiin sitten optimaalisen leikkauslämpötilan yhdisteeseen (OCT-yhdiste) ja jäädytettiin vähitellen isopentaani/kuivajäähauteessa.Säilytä OCT-upotuslohkot -80 °C:ssa erotukseen asti.Diat valmistettiin osiksi, joiden paksuus oli 8 μm.
Poistaaksesi OCT sydänleikkeistä, lämmitä objektilasit kuumennuslohkossa 95 °C:ssa 5 minuuttia.Lisää 1 ml PBS:ää jokaiseen objektilasiin ja inkuboi 30 minuuttia huoneenlämmössä, läpäise sitten leikkeet asettamalla 0,1 % Triton-X PBS:ssä 15 minuutiksi huoneenlämpötilassa.Estä epäspesifisten vasta-aineiden sitoutuminen näytteeseen lisäämällä 1 ml 3-prosenttista BSA-liuosta objektilaseille ja inkuboimalla 1 tunti huoneenlämmössä.Sitten BSA poistettiin ja objektilasit pestiin PBS:llä.Merkitse jokainen näyte lyijykynällä.Primääriset vasta-aineet (laimennettu 1:200 1-prosenttiseen BSA:han) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ja troponiini-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) lisättiin 90 minuutin aikana (sekundaarisesti laimennettu 1:2:ssa BSA:ssa) a Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), kania vastaan ​​Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) vielä 90 minuuttia. Pestiin 3 kertaa PBS:llä Kohteen värjäytymisen erottamiseksi taustasta, käytimme kontrollina vain sekundaarista vasta-ainetta. Lopuksi lisättiin DAPI-sinetöintia ja vektoreita ja vektoreita. kynsilakka. -x suurennus) ja Keyence-mikroskooppi 40x suurennuksella.
WGA-värjäykseen käytettiin WGA-Alexa Fluor 555:tä (Thermo Scientific; #W32464) pitoisuudella 5 μg/ml PBS:ssä ja sitä levitettiin kiinteisiin leikkeihin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.Sitten objektilasit pestiin PBS:llä ja jokaiseen objektilasiin lisättiin Sudanmustia ja inkuboitiin 30 minuuttia.Objektilasit pestiin sitten PBS:llä ja vectashield-sisälle upotettua väliainetta lisättiin.Objektilasit visualisoitiin Keyence-mikroskoopilla 40-kertaisella suurennuksella.
OCT poistettiin näytteistä edellä kuvatulla tavalla.Kun olet poistanut OCT:n, upota objektilasit Bouinin liuokseen yön yli.Objektilasit huuhdeltiin sitten tislatulla vedellä 1 tunnin ajan ja asetettiin sitten Bibrich aloe acid fuksiiniliuokseen 10 minuutiksi.Sitten objektilasit pestiin tislatulla vedellä ja laitettiin 10 minuutin ajaksi liuokseen, jossa oli 5 % fosfomolybdeeni/5 % fosfovolframihappo.Ilman huuhtelua siirrä objektilasit suoraan aniliinisiniliuokseen 15 minuutiksi.Sitten objektilasit pestiin tislatulla vedellä ja laitettiin 1-prosenttiseen etikkahappoliuokseen 2 minuutiksi.Objektilasit kuivattiin 200 N etanolissa ja siirrettiin ksyleeniin.Värjättyt objektilasit visualisoitiin käyttämällä Keyence-mikroskooppia, jossa oli 10x objektiivi.Fibroosialueen prosenttiosuus määritettiin käyttämällä Keyence Analyzer -ohjelmistoa.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), luettelonumero V13154, valmistajan protokollan mukaan tietyin muutoksin.Erityisesti käytettiin halkaisijaltaan 6 mm:n kirurgista meistiä tasaisen kudoskoon varmistamiseksi MTT-analyysin aikana.Kudokset maljattiin yksittäin MTT-substraattia sisältävän 12-kuoppaisen levyn kuoppiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.Leikkeitä inkuboidaan 37 °C:ssa 3 tuntia ja elävä kudos metaboloi MTT-substraatin muodostaen purppuranpunaisen formatsaaniyhdisteen.Korvaa MTT-liuos 1 ml:lla DMSO:ta ja inkuboi 37 °C:ssa 15 minuuttia purppuranpunaisen formatsaanin uuttamiseksi sydänleikkeistä.Näytteet laimennettiin 1:10 DMSO:lla 96-kuoppaisilla läpinäkyväpohjaisilla levyillä ja purppuranvärisen värin intensiteetti mitattiin 570 nm:ssä käyttämällä Cytation-levynlukijaa (BioTek).Lukemat normalisoitiin kunkin sydämen viipaleen painoon.
Sydänviipaleelatusaine korvattiin väliaineella, joka sisälsi 1 µCi/ml [5-3H]-glukoosia (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) glukoosin hyödyntämismääritystä varten, kuten aiemmin on kuvattu.4 tunnin inkubaation jälkeen lisää 100 µl väliainetta avoimeen mikrosentrifugiputkeen, joka sisältää 100 µl 0,2 N HCl:a.Sitten putki asetettiin tuikeputkeen, joka sisälsi 500 μl dH2O:ta haihduttamaan [3H]2O:ta 72 tunnin ajan 37 °C:ssa.Poista sitten mikrosentrifugiputki tuikeputkesta ja lisää 10 ml tuikenestettä.Tuikelaskennat suoritettiin käyttämällä Tri-Carb 2900TR nestetuikeanalysaattoria (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Sen jälkeen glukoosin käyttö laskettiin ottaen huomioon [5-3H]-glukoosi-spesifinen aktiivisuus, epätäydellinen tasapaino ja tausta, [5-3H]-laimennus leimaamattomaksi glukoosiksi ja tuikelaskurin tehokkuus.Tiedot normalisoidaan sydämen osien massaan.
Kudoshomogenisoinnin jälkeen Trizolissa RNA eristettiin sydänleikkeistä käyttämällä Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 -sarjaa valmistajan protokollan mukaisesti.RNAsec-kirjaston valmistelu, sekvensointi ja data-analyysi suoritettiin seuraavasti:
1 µg RNA:ta näytettä kohti käytettiin lähtöaineena RNA-kirjaston valmistukseen.Sekvensointikirjastot luotiin käyttämällä NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina -sarjaa (NEB, USA) noudattaen valmistajan suosituksia, ja indeksikoodit lisättiin kunkin näytteen ominaisuussekvensseihin.Lyhyesti sanottuna mRNA puhdistettiin kokonais-RNA:sta käyttämällä magneettihelmiä, jotka oli kiinnitetty poly-T-oligonukleotideilla.Fragmentointi suoritetaan käyttämällä kaksiarvoisia kationeja korkeassa lämpötilassa NEBNext First Strand Synthesis Reaction -puskurissa (5X).Ensimmäinen juoste cDNA syntetisoitiin käyttämällä satunnaisia ​​heksameerialukkeita ja M-MuLV-käänteistranskriptaasia (RNaasi H-).Toinen cDNA-juoste syntetisoidaan sitten käyttämällä DNA-polymeraasi I:tä ja RNaasi H:ta. Jäljelle jääneet ulkonevat päät muunnetaan tylpäiksi päiksi eksonukleaasi/polymeraasiaktiivisuuden vaikutuksesta.DNA-fragmentin 3'-pään adenyloinnin jälkeen siihen kiinnitetään NEBNext-sovitin, jossa on hiusneulasilmukkarakenne valmistelemaan sitä hybridisaatiota varten.Edullisen pituisten 150-200 bp cDNA-fragmenttien valintaan.kirjastofragmentit puhdistettiin käyttämällä AMPure XP -järjestelmää (Beckman Coulter, Beverly, USA).Sitten käytettiin 3 µl USER Enzymeä (NEB, USA), jossa oli kokovalittu cDNA, joka oli ligoitu adapterilla, 15 minuuttia 37 °C:ssa ja sitten 5 minuuttia 95 °C:ssa ennen PCR:ää.Sitten PCR suoritettiin käyttämällä Phusion High-Fidelity DNA -polymeraasia, universaaleja PCR-alukkeita ja Index (X) -alukkeita.Lopuksi PCR-tuotteet puhdistettiin (AMPure XP -järjestelmä) ja kirjaston laatu arvioitiin Agilent Bioanalyzer 2100 -järjestelmällä.Sitten cDNA-kirjasto sekvensoitiin käyttämällä Novaseq-sekvensoijaa.Illuminan raakakuvatiedostot muunnettiin raakalukeiksi käyttämällä CASAVA Base Callingia.Raakadata tallennetaan FASTQ(fq)-muotoisiin tiedostoihin, jotka sisältävät lukusekvenssit ja vastaavat perusominaisuudet.Valitse HISAT2 sovittaaksesi suodatetut sekvensointilukemat Sscrofa11.1-viitegenomiin.Yleensä HISAT2 tukee kaikenkokoisia genomeja, mukaan lukien genomit, jotka ovat suurempia kuin 4 miljardia emästä, ja oletusarvot on asetettu useimmille parametreille.RNA Seq -datan silmukointilukemat voidaan kohdistaa tehokkaasti käyttämällä HISAT2:ta, nopeinta tällä hetkellä saatavilla olevaa järjestelmää, samalla tai paremmalla tarkkuudella kuin mikään muu menetelmä.
Transkriptien runsaus heijastaa suoraan geeniekspression tasoa.Geenien ilmentymistasot arvioidaan genomiin tai eksoneihin liittyvien transkriptien (sekvensointimäärä) runsauden perusteella.Lukemien määrä on verrannollinen geenin ilmentymistasoihin, geenin pituuteen ja sekvensointisyvyyteen.FPKM (fragmentteja per tuhat transkriptin emäsparia, sekvensoitu per miljoonaa emäsparia) laskettiin ja differentiaalisen ilmentymisen P-arvot määritettiin käyttämällä DESeq2-pakettia.Laskemme sitten väärän etsintänopeuden (FDR) jokaiselle P-arvolle käyttämällä Benjamini-Hochbergin menetelmää9 sisäänrakennetun R-funktion "p.adjust" perusteella.
Sydänleikkeistä eristetty RNA muutettiin cDNA:ksi konsentraatiolla 200 ng/μl käyttämällä Thermon SuperScript IV Vilo Master -sekoitusta (Thermo, luettelonro 11756050).Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttämällä Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-kuoppaista läpinäkyvää reaktiolevyä (Thermo, luettelonro 4483319) ja mikroampeerin optista liimaa (Thermo, luettelonro 4311971).Reaktioseos koostui 5 µl:sta Taqman Fast Advanced Master -sekoitusta (Thermo, luettelonumero 4444557), 0,5 µl:sta Taqman Primeria ja 3,5 µl:sta H2O:ta sekoitettuna per kuoppa.Normaalit qPCR-syklit ajettiin ja CT-arvot mitattiin käyttämällä Applied Biosystems Quantstudio 5 -reaaliaikaista PCR-laitetta (384-kuoppainen moduuli; tuotenumero A28135).Taqman-alukkeet ostettiin Thermolta (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss060181), RGL1 (Ss06061) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04243805_u1) Kaikkien näytteiden geenipitoisuudet HGA normalisoitiin.
NT-ProBNP:n vapautuminen elatusaineista arvioitiin käyttämällä NT-ProBNP-sarjaa (sika) (luettelonro MBS2086979, MyBioSource) valmistajan protokollan mukaisesti.Lyhyesti, 250 ui kutakin näytettä ja standardia lisättiin kahtena rinnakkaisena kuhunkin kuoppaan.Lisää välittömästi näytteen lisäämisen jälkeen 50 µl määritysreagenssia A kuhunkin kuoppaan.Ravista levyä varovasti ja sulje tiivisteaineella.Sitten tabletteja inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunti.Imu sitten liuos ja pese kuopat 4 kertaa 350 µl:lla 1X pesuliuosta inkuboimalla pesuliuosta 1-2 minuuttia joka kerta.Lisää sitten 100 µl määritysreagenssia B kuoppaa kohti ja sulje levytiivisteaineella.Tablettia ravisteltiin varovasti ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia.Imu liuos ja pese kuopat 5 kertaa 350 µl:lla 1X pesuliuosta.Lisää 90 µl substraattiliuosta kuhunkin kuoppaan ja sulje levy.Inkuboi levyä 37 °C:ssa 10-20 minuuttia.Lisää 50 µl pysäytysliuosta jokaiseen kuoppaan.Levy mitattiin välittömästi käyttämällä Cytation (BioTek) -levylukijaa, joka oli asetettu 450 nm:iin.
Tehoanalyysit suoritettiin sellaisten ryhmäkokojen valitsemiseksi, jotka tarjoavat > 80 % tehon 10 %:n absoluuttisen muutoksen havaitsemiseksi parametrissa 5 %:n tyypin I virhesuhteella. Tehoanalyysit suoritettiin sellaisten ryhmäkokojen valitsemiseksi, jotka tarjoavat > 80 % tehon 10 %:n absoluuttisen muutoksen havaitsemiseksi parametrissa 5 %:n tyypin I virhesuhteella. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнарунежела для обнарунежения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Tehoanalyysi suoritettiin sellaisten ryhmäkokojen valitsemiseksi, jotka antaisivat > 80 % tehon 10 %:n absoluuttisen parametrin muutoksen havaitsemiseksi 5 %:n tyypin I virhesuhteella.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀇变化和5４姤诞进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀇变化和5４姤诞 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечелоѶ10% ния параметров и 5% частоты ошибок типа I. Tehoanalyysi suoritettiin sellaisen ryhmän koon valitsemiseksi, joka antaisi > 80 % tehoa 10 % absoluuttisen parametrin muutoksen ja 5 % tyypin I virhesuhteen havaitsemiseksi.Kudosleikkeet valittiin satunnaisesti ennen koetta.Kaikki analyysit olivat tilasokeita ja näytteet dekoodattiin vasta sen jälkeen, kun kaikki tiedot oli analysoitu.Kaikkien tilastollisten analyysien suorittamiseen käytettiin GraphPad Prism -ohjelmistoa (San Diego, CA). Kaikissa tilastoissa p-arvoja pidettiin merkittävinä arvoilla <0,05. Kaikissa tilastoissa p-arvoja pidettiin merkittävinä arvoilla <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kaikissa tilastoissa p-arvoja pidettiin merkittävinä arvoilla <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kaikissa tilastoissa p-arvoja pidettiin merkittävinä arvoilla <0,05.Kaksisuuntainen Studentin t-testi suoritettiin tiedoille vain kahdella vertailulla.Yksisuuntaista tai kaksisuuntaista ANOVAa käytettiin useiden ryhmien välisen merkitsevyyden määrittämiseen.Post hoc -testejä suoritettaessa käytettiin Tukeyn korjausta useiden vertailujen huomioon ottamiseksi.RNAsec-tiedoissa on erityisiä tilastollisia näkökohtia laskettaessa FDR:ää ja p.adjustia Methods-osiossa kuvatulla tavalla.
Lisätietoja tutkimussuunnittelusta on tähän artikkeliin linkitetyssä Nature Research Reportin tiivistelmässä.