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La morphogenèse intestinale humaine établit les caractéristiques crypto-villositaires de la microarchitecture épithéliale 3D et de l'organisation spatiale. Cette structure unique est nécessaire au maintien de l'homéostasie intestinale en protégeant la niche des cellules souches dans la crypte basale des antigènes microbiens exogènes et de leurs métabolites. De plus, les villosités intestinales et le mucus sécréteur présentent des cellules épithéliales fonctionnellement différenciées avec une barrière protectrice à la surface de la muqueuse intestinale. Par conséquent, la recréation de structures épithéliales 3D est cruciale pour la construction de modèles intestinaux in vitro. Notamment, l'intestin sur puce mimétique organique peut induire une morphogenèse 3D spontanée de l'épithélium intestinal avec des fonctions physiologiques et une biomécanique améliorées. Nous fournissons ici un protocole reproductible pour induire de manière robuste la morphogenèse intestinale dans l'intestin sur une puce microfluidique ainsi que dans une puce hybride intégrée Transwell. Nous décrivons en détail les méthodes de fabrication de dispositifs et de culture de Caco-2 ou d'organoïdes intestinaux. cellules épithéliales dans des contextes conventionnels ainsi que sur une plate-forme microfluidique, induction de la morphogenèse 3D et caractérisation des épithéliums 3D établis à l'aide de multiples modalités d'imagerie. Ce protocole permet la régénération de la microarchitecture intestinale fonctionnelle en contrôlant le flux de liquide basolatéral pendant 5 jours. Notre méthode de morphogenèse in vitro utilise une contrainte de cisaillement et un mouvement mécanique physiologiquement pertinents et ne nécessite pas d'ingénierie ou de manipulation cellulaire complexe, ce qui peut surpasser d'autres techniques existantes. Nous envisageons que notre protocole proposé pourrait avoir de larges implications pour la communauté de la recherche biomédicale, en fournissant une méthode pour régénérer les couches épithéliales intestinales 3D in vitro pour des applications biomédicales, cliniques et pharmaceutiques.
Des expériences démontrent que les cellules épithéliales intestinales Caco-2 cultivées dans des dispositifs microfluidiques gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ou bicouches6,7 peuvent subir une morphogenèse 3D spontanée in vitro sans une compréhension claire du mécanisme sous-jacent. Dans notre étude récente, nous avons constaté que l'élimination des antagonistes morphogènes sécrétés basolatéralement des dispositifs de culture est nécessaire et suffisante pour induire une morphogenèse épithéliale 3D in vitro, ce qui a été démontré par Caco-2 et des organoïdes intestinaux dérivés de patients. Les cellules épithéliales ont été validées. Dans cette étude, nous nous sommes spécifiquement concentrés sur la production cellulaire et la distribution de la concentration d'un puissant antagoniste Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), dans des dispositifs microfluidiques intestinaux sur puce et modifiés contenant des inserts Transwell, appelés « puces hybrides ». Nous démontrons que l'ajout d'antagonistes Wnt exogènes (tels que DKK-1, le répresseur Wnt 1, la protéine frizzled-related 1 sécrétée ou Soggy-1) à l'intestin sur puce inhibe la morphogenèse ou perturbe la couche épithéliale 3D préstructurée, suggérant que le stress antagoniste pendant la culture est responsable de la morphogenèse intestinale in vitro. Par conséquent, une approche pratique pour obtenir une morphogenèse robuste à l'interface épithéliale consiste à éliminer ou à maintenir au minimum les niveaux d'antagonistes Wnt dans le compartiment basolatéral par rinçage actif (par exemple, dans des plateformes intestinaux sur puce ou hybrides sur puce) ou par diffusion. .Milieux basolatéraux (par exemple, à partir d'inserts Transwell dans de grands réservoirs basolatéraux dans des puits).
Dans ce protocole, nous fournissons une méthode détaillée pour la fabrication de microdispositifs intestinaux sur puce et de puces hybrides insérables Transwell (étapes 1 à 5) pour la culture de cellules épithéliales intestinales sur des membranes poreuses à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) (étapes 6A, 7A, 8, 9) ou des membranes en polyester d'inserts Transwell (étapes 6B, 7B, 8, 9) et la morphogenèse 3D induite in vitro (étape 10). Nous avons également identifié des caractéristiques cellulaires et moléculaires indicatives d'une histogenèse tissulaire spécifique et d'une différenciation cellulaire dépendante de la lignée en appliquant plusieurs modalités d'imagerie (étapes 11 à 24). Nous induisons la morphogenèse en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines, telles que Caco-2 ou des organoïdes intestinaux, dans deux formats de culture avec des détails techniques incluant la modification de surface des membranes poreuses, la création de monocouches 2D et la reproduction biochimique et biomécanique intestinale. microenvironnement.in vitro.Pour induire la morphogenèse 3D à partir de monocouches épithéliales 2D, nous avons éliminé les antagonistes morphogènes dans les deux formes cultivées en faisant couler le milieu dans le compartiment basolatéral de la culture.Enfin, nous fournissons une représentation de l'utilité d'une couche épithéliale 3D régénérable qui peut être utilisée pour modéliser la croissance épithéliale dépendante du morphogène, les co-cultures longitudinales hôte-microbiome, l'infection par un agent pathogène, les lésions inflammatoires, le dysfonctionnement de la barrière épithéliale et les thérapies à base de probiotiques Exemple.influences.
Notre protocole peut être utile à un large éventail de scientifiques en recherche fondamentale (par exemple, biologie de la muqueuse intestinale, biologie des cellules souches et biologie du développement) et en recherche appliquée (par exemple, tests de médicaments précliniques, modélisation de maladies, ingénierie tissulaire et gastroentérologie) à large impact. En raison de la reproductibilité et de la robustesse de notre protocole pour induire la morphogenèse 3D de l'épithélium intestinal in vitro, nous envisageons que notre stratégie technique puisse être diffusée à des publics étudiant la dynamique de la signalisation cellulaire pendant le développement intestinal, la régénération ou l'homéostasie. De plus, notre protocole est utile pour interroger l'infection sous divers agents infectieux tels que le norovirus 8, le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ou Vibrio cholerae. Français Les publics de pathologie et de pathogenèse des maladies sont également utiles. L'utilisation d'un système de microphysiologie intestinale sur puce peut permettre une co-culture longitudinale 10 et une évaluation ultérieure de la défense de l'hôte, des réponses immunitaires et de la réparation des lésions liées aux agents pathogènes dans le tractus gastro-intestinal (GI) 11. D'autres troubles gastro-intestinaux associés au syndrome de l'intestin qui fuit, à la maladie cœliaque, à la maladie de Crohn, à la colite ulcéreuse, à la pouchite ou au syndrome du côlon irritable peuvent être simulés lorsque des couches épithéliales intestinales 3D sont préparées à l'aide des couches épithéliales intestinales 3D du patient, ces maladies comprennent l'atrophie villositaire, le raccourcissement des cryptes, les lésions muqueuses ou l'altération de la barrière épithéliale. Organoïdes intestinaux dérivés de biopsies ou de cellules souches12,13. Pour mieux modéliser la complexité plus élevée de l'environnement de la maladie, les lecteurs peuvent envisager d'ajouter des types de cellules pertinents pour la maladie, tels que les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) du patient, aux modèles contenant des microarchitectures 3D de villosités intestinales et de cryptes. cellules immunitaires spécifiques des tissus, 5.
Étant donné que la microstructure épithéliale 3D peut être fixée et visualisée sans processus de sectionnement, les utilisateurs travaillant sur la transcriptomique spatiale et l'imagerie haute ou super-résolution pourraient s'intéresser à notre cartographie de la dynamique spatio-temporelle des gènes et des protéines sur les niches épithéliales. Intéressé par la technologie. Réponse aux stimuli microbiens ou immunitaires. De plus, une interaction longitudinale hôte-microbiome 10, 14 qui coordonne l'homéostasie intestinale peut être établie dans la couche muqueuse intestinale 3D par co-culture de diverses espèces microbiennes, communautés microbiennes ou microbiotes fécaux, en particulier dans l'intestin sur puce. Cette approche est particulièrement intéressante pour les publics étudiant l'immunologie muqueuse, la gastroentérologie, le microbiome humain, la culturomique et la microbiologie clinique qui cherchent à cultiver un microbiote intestinal non cultivé en laboratoire. Si notre protocole de morphogenèse in vitro peut être adapté à des formats de culture évolutifs, tels que des inserts multipuits dans des plaques de 24, 96 ou 384 puits qui reconstituent en continu les compartiments basolatéraux, le protocole peut également être diffusé à ceux qui développent des plateformes pharmaceutiques, biomédicales ou de criblage ou de validation à haut débit pour l'industrie alimentaire. À titre de preuve de principe, nous avons récemment démontré la faisabilité d'un système de morphogenèse multiplex à haut débit évolutif à un format de plaque de 24 puits. De plus, plusieurs produits d'organes sur puce ont été commercialisés16,17,18. Par conséquent, la validation de notre méthode de morphogenèse in vitro peut être accélérée et potentiellement adoptée par de nombreux laboratoires de recherche, l'industrie ou les agences gouvernementales et réglementaires pour comprendre les cellules reprogrammation de la morphogenèse intestinale in vitro au niveau transcriptomique pour tester des médicaments ou des produits biothérapeutiques L'absorption et le transport des candidats médicaments ont été évalués à l'aide de substituts intestinaux 3D ou de modèles d'organes sur puce personnalisés ou commerciaux pour évaluer la reproductibilité du processus de morphogenèse intestinale.
Un nombre limité de modèles expérimentaux pertinents pour l'homme ont été utilisés pour étudier la morphogenèse épithéliale intestinale, principalement en raison de l'absence de protocoles applicables pour induire une morphogenèse 3D in vitro. En réalité, une grande partie des connaissances actuelles sur la morphogenèse intestinale repose sur des études animales (par exemple, sur le poisson zèbre20, la souris21 ou le poulet22). Cependant, ces études sont coûteuses et exigeantes en main-d'œuvre, peuvent être éthiquement discutables et, surtout, ne permettent pas de déterminer précisément les processus de développement humain. Ces modèles sont également très limités dans leur capacité à être testés de manière évolutive et multidirectionnelle. Par conséquent, notre protocole de régénération de structures tissulaires 3D in vitro surpasse les modèles animaux in vivo ainsi que d'autres modèles traditionnels de culture cellulaire statique 2D. Comme décrit précédemment, l'utilisation de structures épithéliales 3D nous a permis d'examiner la localisation spatiale des cellules différenciées dans l'axe crypte-villosités en réponse à divers stimuli muqueux ou immunitaires. Les couches épithéliales 3D peuvent fournir un espace pour étudier comment les cellules microbiennes rivalisent pour former des niches spatiales et l'évolution écologique en réponse aux facteurs de l'hôte (par exemple, les couches de mucus internes et externes, la sécrétion d'IgA et de peptides antimicrobiens). De plus, la morphologie épithéliale 3D peut nous permettre de comprendre comment le microbiote intestinal structure ses communautés et produit de manière synergique des métabolites microbiens (par exemple, des acides gras à chaîne courte) qui façonnent l'organisation cellulaire et les niches de cellules souches dans les cryptes basales. Ces caractéristiques ne peuvent être démontrées que lorsque des couches épithéliales 3D sont établies in vitro.
Outre notre méthode de création de structures épithéliales intestinales 3D, il existe plusieurs méthodes in vitro. La culture d'organoïdes intestinaux est une technique d'ingénierie tissulaire de pointe basée sur la culture de cellules souches intestinales dans des conditions morphogènes spécifiques23,24,25. Cependant, l'utilisation de modèles d'organoïdes 3D pour l'analyse du transport ou les co-cultures hôte-microbiome est souvent difficile car la lumière intestinale est enfermée dans l'organoïde et, par conséquent, l'introduction de composants luminaux tels que des cellules microbiennes ou des antigènes exogènes est limitée. L'accès aux lumières des organoïdes peut être amélioré à l'aide d'un micro-injecteur26,27, mais cette méthode est invasive, demande beaucoup de travail et nécessite des connaissances spécialisées. De plus, les cultures d'organoïdes traditionnelles maintenues dans des échafaudages d'hydrogel dans des conditions statiques ne reflètent pas fidèlement la biomécanique active in vivo.
D'autres approches employées par plusieurs groupes de recherche utilisent des échafaudages d'hydrogel 3D préstructurés pour imiter la structure épithéliale intestinale en cultivant des cellules intestinales humaines isolées à la surface du gel. Fabriquer des échafaudages d'hydrogel à l'aide de moules imprimés en 3D, micro-fraisés ou fabriqués par lithographie. Cette méthode montre l'agencement auto-organisé de cellules épithéliales isolées in vitro avec des gradients morphogènes physiologiquement pertinents, établissant une structure épithéliale à rapport d'aspect élevé et une diaphonie stroma-épithéliale en incluant des cellules stromales dans l'échafaudage. Cependant, la nature des échafaudages préstructurés peut empêcher la visualisation du processus morphogénétique spontané lui-même. Ces modèles ne fournissent pas non plus de flux luminal ou interstitiel dynamique, manquant de la contrainte de cisaillement fluide dont les cellules intestinales ont besoin pour subir la morphogenèse et acquérir une fonction physiologique. Une autre étude récente a utilisé des échafaudages d'hydrogel dans une plateforme microfluidique et des structures épithéliales intestinales modelées par des techniques de gravure laser. Souris Les organoïdes intestinaux suivent des motifs gravés pour former des structures tubulaires intestinales, et le flux de fluide intraluminal peut être récapitulé à l'aide d'un module de microfluidique. Cependant, ce modèle ne présente pas de processus morphogénétiques spontanés ni n'inclut les mouvements mécanobiologiques de l'intestin. Les techniques d'impression 3D du même groupe ont permis de créer des tubes intestinaux miniatures avec des processus morphogénétiques spontanés. Malgré la fabrication complexe de différents segments intestinaux dans le tube, ce modèle manque également de flux de fluide luminal et de déformation mécanique. De plus, l'opérabilité du modèle peut être limitée, en particulier une fois le processus de bio-impression terminé, perturbant les conditions expérimentales ou les interactions intercellulaires. Au lieu de cela, notre protocole proposé fournit une morphogenèse intestinale spontanée, une contrainte de cisaillement physiologiquement pertinente, une biomécanique qui imitent la motilité intestinale, l'accessibilité des compartiments apicaux et basolatéraux indépendants et la recréation de microenvironnements biologiques complexes de modularité. Par conséquent, notre protocole de morphogenèse 3D in vitro peut fournir une approche complémentaire pour surmonter les défis des méthodes existantes.
Notre protocole est entièrement axé sur la morphogenèse épithéliale 3D, avec uniquement des cellules épithéliales en culture et aucun autre type de cellules environnantes telles que les cellules mésenchymateuses, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires. Comme décrit précédemment, le cœur de notre protocole est l'induction de la morphogenèse épithéliale en éliminant les inhibiteurs de morphogène sécrétés du côté basolatéral du milieu introduit. Alors que la modularité robuste de notre intestin sur puce et de notre hybride sur puce nous permet de recréer la couche épithéliale 3D ondulante, des complexités biologiques supplémentaires telles que les interactions épithélio-mésenchymateuses33,34, le dépôt de matrice extracellulaire (ECM)35 et, dans notre modèle, les caractéristiques cryptiques-villosités qui véhiculent les niches de cellules souches dans les cryptes basales restent à considérer plus avant. Les cellules stromales (par exemple, les fibroblastes) du mésenchyme jouent un rôle clé dans la production de protéines de la MEC et la régulation de la morphogenèse in vivo35,37,38. L'ajout de cellules mésenchymateuses à notre modèle a amélioré le processus morphogénétique et l'efficacité de l'attachement cellulaire. La couche endothéliale (c'est-à-dire les capillaires ou les lymphatiques) joue un rôle important dans la régulation du transport moléculaire39 et le recrutement des cellules immunitaires40 dans le microenvironnement intestinal. De plus, les composants vasculaires qui peuvent être connectés entre les modèles tissulaires sont une condition préalable lorsque les modèles tissulaires sont conçus pour démontrer des interactions multi-organes. Par conséquent, les cellules endothéliales peuvent devoir être incluses pour modéliser des caractéristiques physiologiques plus précises avec une résolution au niveau de l'organe. Les cellules immunitaires dérivées du patient sont également essentielles pour afficher les réponses immunitaires innées, la présentation de l'antigène, la diaphonie immunitaire adaptative innée et l'immunité spécifique aux tissus dans le contexte de l'imitation des maladies intestinales.
L'utilisation de puces hybrides est plus simple que celle de l'intestin sur puce car la configuration de l'appareil est plus simple et l'utilisation d'inserts Transwell permet une culture évolutive de l'épithélium intestinal. Cependant, les inserts Transwell disponibles dans le commerce avec des membranes en polyester ne sont pas élastiques et ne peuvent pas simuler des mouvements de type péristaltique. De plus, le compartiment apical de l'insert Transwell placé dans la puce hybride est resté stationnaire sans contrainte de cisaillement du côté apical. De toute évidence, les propriétés statiques du compartiment apical permettent rarement une co-culture bactérienne à long terme dans des puces hybrides. Bien que nous puissions induire de manière robuste une morphogenèse 3D dans les inserts Transwell lors de l'utilisation de puces hybrides, le manque de biomécanique physiologiquement pertinente et de flux de fluide apical peut limiter la faisabilité des plates-formes de puces hybrides pour des applications potentielles.
Français Les reconstructions à grande échelle de l'axe crypte-villosités humaines dans les cultures d'intestin sur puce et d'hybride sur puce n'ont pas été entièrement établies. Étant donné que la morphogenèse commence à partir d'une monocouche épithéliale, les microarchitectures 3D ne fournissent pas nécessairement une similitude morphologique avec les cryptes in vivo. Bien que nous ayons caractérisé la population cellulaire proliférante près du domaine cryptique basal dans l'épithélium 3D micro-conçu, les régions cryptiques et villeuses n'étaient pas clairement délimitées. Bien que des canaux supérieurs plus élevés sur la puce conduisent à une hauteur accrue de l'épithélium micro-conçu, la hauteur maximale est toujours limitée à ~300–400 µm. La profondeur réelle des cryptes intestinales humaines dans l'intestin grêle et le gros intestin est respectivement d'environ 135 µm et ~400 µm, et la hauteur des villosités de l'intestin grêle est d'environ 600 µm41.
D'un point de vue d'imagerie, l'imagerie in situ à super-résolution des microarchitectures 3D peut être limitée à l'intestin sur une puce, puisque la distance de travail requise entre la lentille d'objectif et la couche épithéliale est de l'ordre de quelques millimètres. Pour surmonter ce problème, un objectif distant peut être nécessaire. De plus, la réalisation de sections minces pour la préparation des échantillons d'imagerie est difficile en raison de la grande élasticité du PDMS. De plus, comme la microfabrication couche par couche de l'intestin sur une puce implique une adhésion permanente entre chaque couche, il est extrêmement difficile d'ouvrir ou de retirer la couche supérieure pour examiner la structure de surface de la couche épithéliale. Par exemple, en utilisant un microscope électronique à balayage (MEB).
L'hydrophobicité du PDMS a été un facteur limitant dans les études microfluidiques portant sur de petites molécules hydrophobes, car le PDMS peut adsorber de manière non spécifique ces molécules hydrophobes. Des alternatives au PDMS peuvent être envisagées avec d'autres matériaux polymères. Alternativement, une modification de surface du PDMS (par exemple, un revêtement avec des matériaux lipophiles 42 ou du poly(éthylène glycol) 43 ) peut être envisagée pour minimiser l'adsorption des molécules hydrophobes.
Enfin, notre méthode n'a pas été bien caractérisée en termes de fourniture d'un criblage à haut débit ou d'une plate-forme expérimentale conviviale « taille unique ». Le protocole actuel nécessite une pompe à seringue par microdispositif, ce qui prend de la place dans un incubateur à CO2 et empêche les expériences à grande échelle. Cette limitation peut être considérablement améliorée par l'évolutivité des formats de culture innovants (par exemple, des inserts poreux à 24 puits, 96 puits ou 384 puits qui permettent le réapprovisionnement et le retrait continus des milieux basolatéraux).
Français Pour induire la morphogenèse 3D de l'épithélium intestinal humain in vitro, nous avons utilisé un dispositif intestinal à puce microfluidique contenant deux microcanaux parallèles et une membrane poreuse élastique entre les deux pour créer une interface lumière-capillaire. Nous démontrons également l'utilisation d'un dispositif microfluidique à canal unique (une puce hybride) qui fournit un flux basolatéral continu sous des couches épithéliales polarisées cultivées sur des inserts Transwell. Dans les deux plateformes, la morphogenèse de diverses cellules épithéliales intestinales humaines peut être démontrée en appliquant une manipulation directionnelle du flux pour éliminer les antagonistes morphogènes du compartiment basolatéral. L'ensemble de la procédure expérimentale (Figure 1) se compose de cinq parties : (i) microfabrication de la puce intestinale ou de la puce hybride insérable Transwell (étapes 1 à 5 ; Encadré 1), (ii) préparation de cellules épithéliales intestinales (cellules Caco-2) ou d'organoïdes intestinaux humains ; cases 2-5), (iii) culture de cellules épithéliales intestinales sur puces intestinales ou puces hybrides (étapes 6-9), (iv) induction de la morphogenèse 3D in vitro (étape 10) et (v) pour caractériser la microstructure épithéliale 3D (étapes 11-24).Enfin, un groupe témoin approprié (discuté plus en détail ci-dessous) a été conçu pour valider l'efficacité de la morphogenèse in vitro en comparant la morphogenèse épithéliale à des contrôles spatiaux, temporels, conditionnels ou procéduraux.
Nous avons utilisé deux plateformes de culture différentes : un intestin sur puce avec des canaux droits ou des canaux convolutés non linéaires, ou des puces hybrides contenant des inserts Transwell (TW) dans un dispositif microfluidique, fabriqué comme décrit dans l'encadré 1, et les étapes 1 à 5. « Fabrication du dispositif » présente les principales étapes de fabrication d'une puce unique ou d'une puce hybride. « Culture de cellules épithéliales intestinales humaines » explique la source cellulaire (Caco-2 ou organoïdes intestinaux humains) et la procédure de culture utilisée dans ce protocole. « Morphogénèse in vitro » présente les étapes globales au cours desquelles des cellules épithéliales dérivées de Caco-2 ou d'organoïdes sont cultivées sur une puce intestinale ou sur des inserts Transwell d'une puce hybride, suivies de l'induction de la morphogenèse 3D et de la formation d'une structure épithéliale caractérisée. Le numéro de l'étape du programme ou le numéro de la case est affiché sous chaque flèche. L'application fournit des exemples de la manière dont les couches épithéliales intestinales établies peuvent être utilisées, par exemple, dans la caractérisation de la différenciation cellulaire, les études de physiologie intestinale, l'établissement des écosystèmes hôte-microbiome et de la modélisation des maladies. Images d'immunofluorescence dans « Différenciation cellulaire » montrant les noyaux, la F-actine et MUC2 exprimés dans la couche épithéliale 3D Caco-2 générée sur la puce intestinale. La signalisation MUC2 est présente dans les cellules caliciformes et le mucus sécrété par les surfaces muqueuses. Images fluorescentes dans « Physiologie intestinale » montrent le mucus produit par coloration des résidus d'acide sialique et de N-acétylglucosamine à l'aide d'agglutinine de germe de blé fluorescente. Les deux images superposées dans « Co-cultures hôte-microbiome » montrent des co-cultures représentatives hôte-microbiome dans l'intestin sur une puce. Le panneau de gauche montre la co-culture d'E. coli exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) avec des cellules épithéliales 3D Caco-2 micro-conçues. Le panneau de droite montre la localisation d'E. coli GFP co-cultivé avec des cellules épithéliales 3D Caco-2, suivie d'une immunofluorescence Coloration à l'actine F (rouge) et aux noyaux (bleu). La modélisation de la maladie illustre un intestin sain par rapport à un intestin perméable dans des puces d'inflammation intestinale soumises à une provocation physiologique avec des antigènes bactériens (par exemple, lipopolysaccharide, LPS) et des cellules immunitaires (par exemple, PBMC ; vert). Les cellules Caco-2 ont été cultivées pour établir une couche épithéliale 3D. Barre d'échelle, 50 µm. Images de la rangée du bas : « Différenciation des cellules » adaptée avec la permission de la référence. 2. Oxford University Press ; Reproduit avec la permission de la réf. 5. NAS ; « Co-culture hôte-microbe » adaptée avec la permission de la réf. 3. NAS ; « Modélisation de la maladie » adaptée avec la permission de la référence. 5. NAS.
Français Les puces intestin sur puce et les puces hybrides ont été fabriquées à l'aide de répliques PDMS qui ont été démoulées à partir de moules en silicium par lithographie douce1,44 et modelées avec SU-8. La conception des microcanaux de chaque puce est déterminée en tenant compte de l'hydrodynamique, comme la contrainte de cisaillement et la pression hydrodynamique1,4,12. La conception originale de l'intestin sur puce (Fig. 1a des données étendues), qui consistait en deux microcanaux droits parallèles juxtaposés, a évolué vers un intestin sur puce complexe (Fig. 1b des données étendues) qui comprend une paire de microcanaux courbes pour induire un temps de séjour du fluide accru, des modèles d'écoulement non linéaires et une déformation multiaxiale des cellules en culture (Fig. 2a–f) 12. Lorsqu'une biomécanique intestinale plus complexe doit être recréée, des intestins sur puce complexes peuvent être choisis. Nous avons démontré que le Gut-Chip convoluté induit également fortement la 3D Morphogénèse dans un laps de temps similaire avec un degré de croissance épithéliale similaire à celui de la puce Gut-Chip originale, quel que soit le type de cellules cultivées. Par conséquent, pour induire une morphogenèse 3D, les conceptions de tube digestif linéaires et complexes sur puce sont interchangeables. Les répliques de PDMS durcies sur des moules en silicone avec des motifs SU-8 ont fourni des caractéristiques négatives après démoulage (Fig. 2a). Pour fabriquer le tube digestif sur puce, la couche supérieure de PDMS préparée a été collée séquentiellement à un film de PDMS poreux, puis alignée avec la couche inférieure de PDMS par collage irréversible à l'aide d'un appareil de traitement corona (Fig. 2b–f). Pour fabriquer des puces hybrides, les répliques de PDMS durcies ont été collées sur des lames de verre afin de créer des dispositifs microfluidiques monocanal pouvant accueillir des inserts Transwell (Fig. 2h et Données étendues, Fig. 2). Le processus de collage est réalisé en traitant les surfaces de la réplique de PDMS et du verre par plasma d'oxygène ou traitement corona. Après stérilisation, le dispositif microfabriqué est fixé à le tube en silicone, l'appareil configuré était prêt à effectuer la morphogenèse 3D de l'épithélium intestinal (Figure 2g).
a, Illustration schématique de la préparation de pièces en PDMS à partir de moules en silicone à motifs SU-8. La solution de PDMS non durcie a été versée sur un moule en silicone (à gauche), durcie à 60 °C (au milieu) et démoulée (à droite). Le PDMS démoulé a été découpé en morceaux et nettoyé pour une utilisation ultérieure. b, Photographie du moule en silicone utilisé pour préparer la couche supérieure de PDMS. c, Photographie du moule en silicone utilisé pour fabriquer la membrane poreuse en PDMS. d, Série de photographies des composants PDMS supérieur et inférieur et du dispositif intestinal sur puce assemblé. e, Schéma de l'alignement des composants PDMS supérieur, membranaire et inférieur. Chaque couche est liée de manière irréversible par plasma ou traitement corona. f, Schéma du dispositif « intestin sur puce » fabriqué avec des microcanaux convolutés superposés et des chambres à vide. g, Configuration du « intestin sur puce » pour la culture cellulaire microfluidique. Le « intestin sur puce » fabriqué est assemblé avec un tube en silicone et une seringue. a été placé sur une lamelle.Le dispositif à puce a été placé sur le couvercle d'une boîte de Petri de 150 mm pour traitement.Le liant est utilisé pour fermer le tube en silicone.h, Instantanés visuels de la fabrication de puces hybrides et de la morphogenèse 3D à l'aide de puces hybrides.Des inserts Transwell préparés indépendamment pour cultiver des monocouches 2D de cellules épithéliales intestinales ont été insérés dans la puce hybride pour induire la morphogenèse 3D intestinale.Le milieu est perfusé à travers des microcanaux sous la couche cellulaire établie sur l'insert Transwell.Barre d'échelle, 1 cm.h Réimprimé avec la permission de la référence.4. Elsevier.
Français Dans ce protocole, la lignée cellulaire Caco-2 et les organoïdes intestinaux ont été utilisés comme sources épithéliales (Fig. 3a). Les deux types de cellules ont été cultivés indépendamment (Encadré 2 et Encadré 5) et utilisés pour ensemencer les microcanaux recouverts d'ECM des inserts intestinaux sur puce ou Transwell. Lorsque les cellules sont confluentes (couverture > 95 % dans les flacons), les cellules Caco-2 cultivées en routine (entre les passages 10 et 50) dans des flacons en T sont récoltées pour préparer des suspensions cellulaires dissociées par un liquide de trypsinisation (encadré 2). Les organoïdes intestinaux humains provenant de biopsies intestinales ou de résections chirurgicales ont été cultivés dans des dômes d'échafaudage Matrigel dans des plaques à 24 puits pour soutenir le microenvironnement structurel. Un milieu contenant des morphogènes essentiels (tels que Wnt, R-spondin et Noggin) et des facteurs de croissance préparés comme décrit dans l'Encadré 3 a été complété tous les deux jours jusqu'à ce que les organoïdes atteignent ~ 500 µm de diamètre. Les organoïdes entièrement développés sont récoltés et dissociés en cellules individuelles pour être ensemencés sur des inserts intestinaux ou Transwell sur une puce (encadré 5). Comme nous l'avons déjà signalé, il peut être différencié selon le type de maladie12,13 (par exemple, colite ulcéreuse, maladie de Crohn, cancer colorectal ou donneur normal), le site de la lésion (par exemple, lésion par rapport à zone non lésée) et l'emplacement gastro-intestinal dans le tractus (par exemple, duodénum, ​​​​jéjunum, iléon, caecum, côlon ou rectum). Nous fournissons un protocole optimisé dans l'encadré 5 pour la culture d'organoïdes coliques (coloïdes) qui nécessitent généralement des concentrations plus élevées de morphogènes que les organoïdes de l'intestin grêle.
a, Flux de travail pour l'induction de la morphogenèse intestinale dans la puce intestinale. L'épithélium intestinal humain Caco-2 et les organoïdes intestinaux sont utilisés dans ce protocole pour démontrer la morphogenèse 3D. Les cellules épithéliales isolées ont été ensemencées dans le dispositif intestin sur puce préparé (préparation de la puce). Une fois les cellules ensemencées (ensemencées) et attachées (attachées) à la membrane poreuse PDMS le jour 0 (J0), le flux apical (AP) est initié et maintenu pendant les 2 premiers jours (flux, AP, J0-J2). Le flux basolatéral (BL) est également initié avec des mouvements d'étirement cycliques (étirement, flux, AP et BL) lorsqu'une monocouche 2D complète est formée. La morphogenèse 3D intestinale s'est produite spontanément après 5 jours de culture microfluidique (morphogenèse, J5). Les images en contraste de phase montrent la morphologie représentative des cellules Caco-2 à chaque étape expérimentale ou point temporel (graphique à barres, 100 µm). Quatre schémas illustrant les cascades correspondantes de la morphogenèse intestinale (en haut à droite). Les flèches en pointillés dans le schéma représentent la direction du flux de fluide. b, Image MEB montrant la topologie de surface de l'épithélium Caco-2 3D établi (à gauche). L'encart mettant en évidence la zone agrandie (cadre blanc en pointillés) montre les microvillosités régénérées sur la couche 3D Caco-2 (à droite). c, Vue frontale horizontale de Caco-2 3D établi, de claudine (ZO-1, rouge) et de membranes à bordure en brosse continue marquées F-actine (vert) et noyaux (bleu). Visualisation confocale par immunofluorescence de cellules épithéliales sur des puces intestinales. Les flèches pointant vers le schéma du milieu indiquent l'emplacement du plan focal pour chaque vue confocale. d, Évolution temporelle des changements morphologiques dans les organoïdes cultivés sur une puce obtenue par microscopie à contraste de phase aux jours 3, 7, 9, 11 et 13. L'encart (en haut à droite) montre le fort grossissement de l'image fournie. e, Microphotographie DIC d'épithélium organoïde 3D établi dans l'intestin sur une coupe prise le jour 7. f, Images d'immunofluorescence superposées montrant des marqueurs pour les cellules souches (LGR5 ; magenta), les cellules caliciformes (MUC2 ; vert), la F-actine (gris) et les noyaux (cyan) cultivés sur des puces intestinales pendant 3 jours, respectivement (à gauche) et des organoïdes de 13 jours (au milieu) sur la couche épithéliale. Voir également la figure 3 des données étendues, qui met en évidence la signalisation LGR5 sans signalisation MUC2. Images de fluorescence montrant la microstructure épithéliale (à droite) de l'épithélium organoïde 3D établi dans l'intestin sur une puce par coloration de la membrane plasmique avec le colorant CellMask (à droite) au jour 13 de la culture. L'échelle est de 50 μm, sauf indication contraire. b Réimprimé avec la permission de la référence. 2. Oxford University Press ; c Adapté avec la permission de Référence.2. Oxford University Press ; e et f adaptés avec la permission de référence.12 Sous licence Creative Commons CC BY 4.0.
Dans l'intestin sur puce, il est nécessaire de modifier la surface hydrophobe de la membrane poreuse PDMS pour un revêtement ECM réussi. Dans ce protocole, nous appliquons deux méthodes différentes pour modifier l'hydrophobicité des membranes PDMS. Pour la culture de cellules Caco-2, l'activation de surface par traitement UV/ozone seul a été suffisante pour réduire l'hydrophobicité de la surface PDMS, revêtir l'ECM et fixer les cellules Caco-2 à la membrane PDMS. Cependant, la culture microfluidique d'épithélium organoïde nécessite une fonctionnalisation de surface chimique pour obtenir un dépôt efficace de protéines ECM par application séquentielle de polyéthylèneimine (PEI) et de glutaraldéhyde aux microcanaux PDMS. Après modification de surface, les protéines ECM ont été déposées pour recouvrir la surface PDMS fonctionnalisée, puis introduites dans l'épithélium organoïde isolé. Une fois les cellules fixées, la culture cellulaire microfluidique commence par perfuser uniquement le milieu dans le microcanal supérieur jusqu'à ce que les cellules forment une monocouche complète, tandis que le microcanal inférieur maintient des conditions statiques. Cette méthode optimisée pour la surface L'activation et le revêtement ECM permettent la fixation de l'épithélium organoïde pour induire une morphogenèse 3D sur la surface du PDMS.
Les cultures Transwell nécessitent également un revêtement ECM avant l'ensemencement des cellules ; cependant, les cultures Transwell ne nécessitent pas d'étapes de prétraitement complexes pour activer la surface des inserts poreux. Pour la culture de cellules Caco-2 sur des inserts Transwell, le revêtement ECM sur des inserts poreux accélère la fixation des cellules Caco-2 dissociées (< 1 heure) et la formation d'une barrière de jonction serrée (< 1 à 2 jours). Pour cultiver des organoïdes sur des inserts Transwell, des organoïdes isolés sont ensemencés sur des inserts revêtus d'ECM, attachés à la surface de la membrane (< 3 h) et maintenus jusqu'à ce que les organoïdes forment une monocouche complète avec une intégrité de barrière. Les cultures Transwell sont réalisées dans des plaques à 24 puits sans utiliser de puces hybrides.
Français La morphogenèse 3D in vitro peut être initiée en appliquant un flux de fluide sur la face basolatérale d'une couche épithéliale établie. Dans l'intestin sur puce, la morphogenèse épithéliale a commencé lorsque le milieu a été perfusé dans les microcanaux supérieur et inférieur (Fig. 3a). Comme décrit précédemment, il est essentiel d'introduire un flux de fluide dans le compartiment inférieur (basolatéral) pour l'élimination continue des inhibiteurs directionnels de morphogène sécrétés. Pour fournir suffisamment de nutriments et de sérum aux cellules liées aux membranes poreuses et générer une contrainte de cisaillement luminale, nous appliquons généralement un double flux dans l'intestin sur puce. Dans les puces hybrides, des inserts Transwell contenant des monocouches épithéliales ont été insérés dans les puces hybrides. Ensuite, le milieu a été appliqué sous la face basolatérale de l'insert Transwell poreux à travers le microcanal. La morphogenèse intestinale s'est produite 3 à 5 jours après le début du flux basolatéral dans les deux plates-formes de culture.
Français Les caractéristiques morphologiques des couches épithéliales 3D micro-conçues peuvent être analysées en appliquant diverses modalités d'imagerie, y compris la microscopie à contraste de phase, la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC), le MEB ou la microscopie confocale par immunofluorescence (Figures 3 et 4). L'imagerie en contraste de phase ou DIC peut être facilement réalisée à tout moment pendant la culture pour surveiller la forme et la protrusion des couches épithéliales 3D. En raison de la transparence optique des films PDMS et polyester, les plateformes gut-on-a-chip et hybrides peuvent fournir une imagerie in situ en temps réel sans qu'il soit nécessaire de sectionner ou de démonter le dispositif. Lors de la réalisation d'une imagerie par immunofluorescence (Figures 1, 3c, f et 4b, c), les cellules sont généralement fixées avec 4 % (p/v) de paraformaldéhyde (PFA), suivi de Triton X-100 et de 2 % (p/v) d'albumine sérique bovine (BSA), dans l'ordre. Selon la cellule Différents types de fixations, perméabilisants et agents bloquants peuvent être utilisés. Des anticorps primaires ciblant des marqueurs cellulaires ou régionaux dépendants de la lignée sont utilisés pour mettre en évidence les cellules immobilisées in situ sur la puce, suivis d'anticorps secondaires associés à un colorant de contre-coloration ciblant soit le noyau (par exemple, le 4',6-diamidino-2-phénylène indole, DAPI) soit la F-actine (par exemple, la phalloïdine marquée par fluorescence). L'imagerie en direct par fluorescence peut également être réalisée in situ pour détecter la production de mucus (Fig. 1, « Différenciation cellulaire » et « Physiologie intestinale »), la colonisation aléatoire de cellules microbiennes (Fig. 1, « Co-culture hôte-microbe »), le recrutement de cellules immunitaires (Fig. 1, « Modélisation de la maladie ») ou les contours de la morphologie épithéliale 3D (Fig. 3c, f et 4b, c). Lors de la modification de l'intestin sur la puce pour séparer la couche supérieure de la couche inférieure de microcanaux, comme décrit dans ref.Comme le montre la Fig. 2, la morphologie épithéliale 3D ainsi que les microvillosités sur la bordure en brosse apicale peuvent être visualisées par MEB (Fig. 3b).L'expression des marqueurs de différenciation peut être évaluée en effectuant une PCR5 quantitative ou un séquençage d'ARN unicellulaire.Dans ce cas, des couches 3D de cellules épithéliales cultivées dans des puces intestinales ou des puces hybrides sont récoltées par trypsinisation puis utilisées pour une analyse moléculaire ou génétique.
a. Flux de travail pour l'induction de la morphogenèse intestinale dans une puce hybride. Ce protocole utilise Caco-2 et des organoïdes intestinaux pour démontrer la morphogenèse 3D sur une plateforme de puce hybride. Des cellules épithéliales dissociées ont été ensemencées dans des inserts Transwell préparés (préparation TW ; voir figure ci-dessous). Une fois les cellules ensemencées et fixées sur des membranes de polyester dans les inserts Transwell, toutes les cellules ont été cultivées en conditions statiques (culture TW). Après 7 jours, un seul insert Transwell contenant une monocouche 2D de cellules épithéliales a été intégré dans une puce hybride pour introduire un flux basolatéral (flux, BL), ce qui a finalement conduit à la génération d'une couche épithéliale 3D (morphogenèse). Micrographies en contraste de phase montrant les caractéristiques morphologiques des cellules épithéliales d'organes humains dérivées du côlon ascendant d'un donneur normal (lignée C103) à chaque étape expérimentale ou point temporel. Les schémas des couches supérieures illustrent la configuration expérimentale pour chaque étape. b. Puces hybrides (schéma de gauche). peut conduire à une morphogenèse 3D de cellules épithéliales organoïdes avec des vues de microscopie confocale descendantes prises à différentes positions Z (supérieure, moyenne et inférieure ; voir le schéma de droite et les lignes pointillées correspondantes). ont montré des caractéristiques morphologiques évidentes.F-actine (cyan), noyau (gris).c, Micrographies confocales à fluorescence (vue 3D inclinée) de cellules épithéliales dérivées d'organoïdes cultivées dans un Transwell statique (TW ; encart dans un cadre pointillé blanc) par rapport à une puce hybride (plus grande vue complète) comparant respectivement la morphologie 2D et 3D.Une paire de vues en coupe verticale 2D (encart dans le coin supérieur droit ; « XZ ») montre également des caractéristiques 2D et 3D.Barre d'échelle, 100 µm.c Réimprimé avec la permission de la référence.4. Elsevier.
Les contrôles peuvent être préparés en cultivant les mêmes cellules (Caco-2 ou cellules épithéliales organoïdes intestinales) dans des monocouches bidimensionnelles dans des conditions de culture statique conventionnelles. Notamment, l'épuisement des nutriments peut résulter de la capacité volumique limitée des microcanaux (c'est-à-dire ~ 4 µL dans le canal supérieur sur la conception originale de la puce intestinale). Par conséquent, la morphologie épithéliale avant et après l'application du flux basolatéral peut également être comparée.
Le processus de lithographie douce doit être réalisé dans une salle blanche. Pour chaque couche de la puce (couches supérieure et inférieure et membranes) et des puces hybrides, différents photomasques ont été utilisés et fabriqués sur des plaquettes de silicium séparées car les hauteurs des microcanaux étaient différentes. Les hauteurs cibles des microcanaux supérieurs et inférieurs de l'intestin sur la puce sont respectivement de 500 µm et 200 µm. La hauteur cible du canal de la puce hybride est de 200 µm.
Placez une plaquette de silicone de 3 pouces dans un plat avec de l'acétone. Faites tourner doucement la plaque pendant 30 secondes, puis séchez la plaquette à l'air. Transférez la plaquette sur une plaque avec de l'IPA, puis faites tourner la plaque pendant 30 secondes pour la nettoyer.
Une solution de piranha (mélange de peroxyde d'hydrogène et d'acide sulfurique concentré, 1:3 (vol/vol)) peut éventuellement être utilisée pour maximiser l'élimination des résidus organiques de la surface de la plaquette de silicium.
La solution Piranha est extrêmement corrosive et génère de la chaleur. Des précautions de sécurité supplémentaires sont nécessaires. Pour l'élimination des déchets, laissez la solution refroidir et transférez-la dans un conteneur à déchets propre et sec. Utilisez des conteneurs secondaires et étiquetez correctement les conteneurs à déchets. Veuillez suivre les consignes de sécurité de l'établissement pour des procédures plus détaillées.
Déshydratez les gaufrettes en les plaçant sur une plaque chauffante à 200 °C pendant 10 minutes. Après déshydratation, la gaufrette a été secouée cinq fois à l'air pour refroidir.
Versez environ 10 g de résine photosensible SU-8 2100 au centre de la plaquette de silicium nettoyée. Utilisez une pince à épiler pour répartir uniformément la résine photosensible sur la plaquette. Placez occasionnellement la plaquette sur une plaque chauffante à 65 °C pour rendre la résine photosensible moins collante et plus facile à étaler. Ne placez pas la plaquette directement sur la plaque chauffante.
Le SU-8 a été réparti uniformément sur la plaquette en exécutant un revêtement par centrifugation. Programmez une rotation entrante du SU-8 pendant 5 à 10 s pour qu'il se propage à 500 tr/min avec une accélération de 100 tr/min/s. Réglez la rotation principale pour un motif d'épaisseur de 200 µm à 1 500 tr/min, ou obtenez une épaisseur de 250 µm (en créant une hauteur de 500 µm pour la couche supérieure du boyau sur la puce ; voir « Étapes critiques » ci-dessous) réglée à une accélération de 300 tr/min/s pendant 30 secondes à 1 200 tr/min.
La vitesse de rotation principale peut être ajustée en fonction de l'épaisseur cible du motif SU-8 sur la plaquette de silicium.
Pour fabriquer des motifs SU-8 de 500 µm de hauteur pour la couche supérieure du boyau sur la puce, les étapes de revêtement par centrifugation et de cuisson douce de cette boîte (étapes 7 et 8) ont été répétées séquentiellement (voir étape 9) pour produire deux couches de 250 µm d'épaisseur. Une couche épaisse de SU-8, qui peut être superposée et jointe par exposition aux UV à l'étape 12 de cette boîte, créant une couche de 500 µm de haut.
Faites cuire les gaufrettes enrobées de SU-8 en les plaçant soigneusement sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 5 minutes, puis réglez le réglage sur 95 °C et laissez incuber pendant 40 minutes supplémentaires.
Pour obtenir une hauteur de 500 μm du motif SU-8 dans le microcanal supérieur, répétez les étapes 7 et 8 pour générer deux couches SU-8 de 250 μm d'épaisseur.
À l'aide de l'aligneur de masque UV, effectuez un test de lampe conformément aux instructions du fabricant pour calculer le temps d'exposition de la plaquette. (temps d'exposition, ms) = (dose d'exposition, mJ/cm2)/(puissance de la lampe, mW/cm2).
Après avoir déterminé le temps d'exposition, placez le photomasque sur le support de masque de l'aligneur de masque UV et placez le photomasque sur la plaquette revêtue de SU-8.
Placez la surface imprimée du photomasque directement sur le côté revêtu de SU-8 de la plaquette de silicium pour minimiser la dispersion UV.
Exposez la plaquette revêtue de SU-8 et le photomasque verticalement à 260 mJ/cm2 de lumière UV pendant le temps d'exposition prédéterminé (voir l'étape 10 de cette boîte).
Après exposition aux UV, les plaquettes de silicium revêtues de SU-8 ont été cuites à 65 °C pendant 5 min et à 95 °C pendant 15 min sur chaque plaque chauffante pour fabriquer des motifs d'une hauteur de 200 µm. Prolongez le temps de post-cuisson à 95 °C à 30 min pour fabriquer des motifs d'une hauteur de 500 µm.
Le révélateur est versé dans un plat en verre et la plaquette cuite est placée dans le plat. Le volume de révélateur SU-8 peut varier en fonction de la taille de la plaque de verre. Assurez-vous d'utiliser suffisamment de révélateur SU-8 pour éliminer complètement le SU-8 non exposé. Par exemple, lorsque vous utilisez un plat en verre de 150 mm de diamètre avec une capacité de 1 L, utilisez environ 300 ml de révélateur SU-8. Développez le moule pendant 25 minutes en effectuant une rotation douce occasionnelle.
Rincez le moule développé avec environ 10 ml de révélateur frais suivi d'IPA en pulvérisant la solution à l'aide d'une pipette.
Placez la plaquette dans un nettoyeur plasma et exposez-la au plasma d'oxygène (gaz atmosphérique, pression cible 1 × 10−5 Torr, puissance 125 W) pendant 1,5 min.
Placez la plaquette dans un dessiccateur à vide avec une lame de verre à l'intérieur. Les plaquettes et les lames peuvent être placées côte à côte. Si le dessiccateur à vide est divisé en plusieurs couches par une plaque, placez les lames dans la chambre inférieure et les plaquettes dans la chambre supérieure. Déposez 100 μL de solution de trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane sur une lame de verre et appliquez le vide pour la silanisation.
Décongelez un flacon de cellules Caco-2 congelées dans un bain-marie à 37 °C, puis transférez les cellules décongelées dans un flacon T75 contenant 15 ml de milieu Caco-2 préchauffé à 37 °C.
Pour faire passer les cellules Caco-2 à environ 90 % de confluence, réchauffez d'abord le milieu Caco-2, le PBS et 0,25 % de trypsine/1 mM d'EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
Aspirer le milieu par aspiration sous vide. Laver les cellules deux fois avec 5 ml de PBS chaud en répétant l'aspiration sous vide et en ajoutant du PBS frais.