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La morphogenèse intestinale humaine établit les caractéristiques crypto-villositaires de la microarchitecture épithéliale 3D et de l'organisation spatiale. Cette structure unique est nécessaire pour maintenir l'homéostasie intestinale en protégeant la niche des cellules souches dans la crypte basale contre les antigènes microbiens exogènes et leurs métabolites. construction de modèles intestinaux in vitro. Notamment, le mimétique organique gut-on-a-chip peut induire une morphogenèse 3D spontanée de l'épithélium intestinal avec des fonctions physiologiques et une biomécanique améliorées. sur une plate-forme microfluidique, induction de la morphogenèse 3D et caractérisation des épithéliums 3D établis à l'aide de plusieurs modalités d'imagerie. Ce protocole permet la régénération de la microarchitecture intestinale fonctionnelle en contrôlant le flux de fluide basolatéral pendant 5 jours. Couches épithéliales intestinales 3D in vitro pour des applications biomédicales, cliniques et pharmaceutiques.
Des expériences démontrent que les cellules Caco-2 épithéliales intestinales cultivées dans des dispositifs microfluidiques gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ou bicouches6,7 peuvent subir une morphogenèse 3D spontanée in vitro sans une compréhension claire du mécanisme sous-jacent. et les organoïdes intestinaux dérivés du patient.Les cellules épithéliales ont été validées. Dans cette étude, nous nous sommes spécifiquement concentrés sur la production cellulaire et la distribution de la concentration d'un puissant antagoniste de Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), dans des dispositifs microfluidiques gut-on-a-chip et modifiés contenant des inserts Transwell, appelés « Hybrid Chip ». l'intestin sur puce inhibe la morphogenèse ou perturbe la couche épithéliale 3D préstructurée, ce qui suggère que le stress antagoniste pendant la culture est responsable de la morphogenèse intestinale in vitro. .Milieux basolatéral (par exemple, des inserts Transwell dans de grands réservoirs basolatéraux dans les puits).
Dans ce protocole, nous fournissons une méthode détaillée pour fabriquer des microdispositifs gut-on-a-chip et des puces hybrides insérables par Transwell (étapes 1 à 5) pour cultiver des cellules épithéliales intestinales sur des membranes poreuses à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) (étapes 6A, 7A, 8, 9) ou des membranes en polyester d'inserts Transwell (étapes 6B, 7B, 8, 9) et induit une morphogenèse 3D dans in vitro (étape 10). Nous avons également identifié des caractéristiques cellulaires et moléculaires indicatives de l'histogenèse tissu-spécifique et de la différenciation cellulaire dépendante de la lignée en appliquant plusieurs modalités d'imagerie (étapes 11 à 24). induire une morphogenèse 3D à partir de monocouches épithéliales 2D, nous avons éliminé les antagonistes du morphogène dans les deux formes cultivées en faisant couler le milieu dans le compartiment basolatéral de la culture. Enfin, nous fournissons une représentation de l'utilité d'une couche épithéliale 3D régénérable qui peut être utilisée pour modéliser la croissance épithéliale dépendante du morphogène, les co-cultures longitudinales hôte-microbiome, l'infection pathogène, les lésions inflammatoires, le dysfonctionnement de la barrière épithéliale et les thérapies à base de probiotiques Exemple. influences.
Notre protocole peut être utile à un large éventail de scientifiques en recherche fondamentale (par exemple, biologie de la muqueuse intestinale, biologie des cellules souches et biologie du développement) et appliquée (par exemple, tests précliniques de médicaments, modélisation de maladies, ingénierie tissulaire et gastro-entérologie). régénération ou homéostasie. De plus, notre protocole est utile pour interroger l'infection sous divers agents infectieux tels que le norovirus 8, le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ou Vibrio cholerae.L'utilisation d'un système de microphysiologie intestinale sur puce peut permettre une co-culture longitudinale 10 et une évaluation ultérieure de la défense de l'hôte, des réponses immunitaires et de la réparation des lésions liées aux agents pathogènes dans le tractus gastro-intestinal (GI) 11 . en utilisant les couches épithéliales intestinales 3D du patient, ces maladies comprennent l'atrophie villositaire, le raccourcissement des cryptes, les lésions muqueuses ou la barrière épithéliale altérée. Biopsie ou organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches12,13.cellules immunitaires spécifiques aux tissus, 5.
Étant donné que la microstructure épithéliale 3D peut être fixée et visualisée sans le processus de sectionnement, les téléspectateurs travaillant sur la transcriptomique spatiale et l'imagerie haute résolution ou super-résolution peuvent être intéressés par notre cartographie de la dynamique spatio-temporelle des gènes et des protéines sur les niches épithéliales.Intéressé par la technologie.Réponse aux stimuli microbiens ou immunitaires.En outre, la diaphonie longitudinale hôte-microbiome 10, 14 qui coordonne l'homéostasie intestinale peut être établie dans la couche muqueuse intestinale 3D en co-cultivant diverses espèces microbiennes, communautés microbiennes ou microbiote fécal, en particulier dans l'intestin sur puce.dans la plateforme. Cette approche est particulièrement intéressante pour les publics étudiant l'immunologie muqueuse, la gastro-entérologie, le microbiome humain, la culturomique et la microbiologie clinique cherchant à cultiver en laboratoire un microbiote intestinal préalablement non cultivé. plateformes de criblage ou de validation de débit pour l'industrie alimentaire. Comme preuve de principe, nous avons récemment démontré la faisabilité d'un système de morphogenèse multiplex à haut débit évolutif vers un format de plaque de 24 puits. De plus, plusieurs produits d'organes sur puce ont été commercialisés16,17,18. morphogenèse au niveau transcriptomique pour tester des médicaments ou des biothérapies L'absorption et le transport des candidats-médicaments ont été évalués à l'aide de substituts intestinaux 3D ou à l'aide de modèles d'organes sur puce personnalisés ou commerciaux pour évaluer la reproductibilité du processus de morphogenèse intestinale.
Un nombre limité de modèles expérimentaux pertinents pour l'homme ont été utilisés pour étudier la morphogenèse épithéliale intestinale, principalement en raison du manque de protocoles applicables pour induire une morphogenèse 3D in vitro. Ces modèles sont également très limités dans leur capacité à être testés de manière évolutive à plusieurs voies. Par conséquent, notre protocole de régénération des structures tissulaires 3D in vitro surpasse les modèles animaux in vivo ainsi que les autres modèles traditionnels de culture cellulaire statique 2D. les cellules microbiennes entrent en compétition pour former des niches spatiales et l'évolution écologique en réponse aux facteurs de l'hôte (par exemple, couches de mucus internes versus externes, sécrétion d'IgA et de peptides antimicrobiens). sont établis in vitro.
En plus de notre méthode de création de structures épithéliales intestinales 3D, il existe plusieurs méthodes in vitro. La culture organoïde intestinale est une technique d'ingénierie tissulaire de pointe basée sur la culture de cellules souches intestinales dans des conditions morphogènes spécifiques. des cellules ou des antigènes exogènes est limité.L'accès aux lumières organoïdes peut être amélioré à l'aide d'un micro-injecteur, 26, 27 mais cette méthode est invasive et demande beaucoup de travail et nécessite des connaissances spécialisées pour être exécutée.
D'autres approches employées par plusieurs groupes de recherche utilisent des échafaudages d'hydrogel 3D préstructurés pour imiter la structure épithéliale de l'intestin en cultivant des cellules intestinales humaines isolées sur la surface du gel. diaphonie pithéliale en incluant des cellules stromales dans l'échafaudage. Cependant, la nature des échafaudages préstructurés peut empêcher l'affichage du processus morphogénétique spontané lui-même. Les organoïdes intestinaux de souris suivent des motifs gravés pour former des structures tubulaires intestinales et le flux de liquide intraluminal peut être récapitulé à l'aide d'un module microfluidique. l'opérabilité peut être limitée, en particulier après la fin du processus de bio-impression, perturbant les conditions expérimentales ou les interactions cellule-cellule. Au lieu de cela, notre protocole proposé fournit une morphogenèse intestinale spontanée, une contrainte de cisaillement physiologiquement pertinente, une biomécanique qui imite la motilité intestinale, l'accessibilité des compartiments apical et basolatéral indépendants et la recréation de microenvironnements biologiques complexes de modularité. Par conséquent, notre protocole de morphogenèse 3D in vitro peut fournir une approche complémentaire pour surmonter les défis des méthodes existantes.
Notre protocole est entièrement axé sur la morphogenèse épithéliale 3D, avec uniquement des cellules épithéliales en culture et aucun autre type de cellules environnantes telles que les cellules mésenchymateuses, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires. pour recréer la couche épithéliale 3D ondulante, des complexités biologiques supplémentaires telles que les interactions épithéliales-mésenchymateuses33,34, le dépôt de matrice extracellulaire (ECM) 35 et, dans notre modèle, les caractéristiques crypt-villositaires qui véhiculent des niches de cellules souches dans les cryptes basales doivent encore être prises en compte. 37,38. L'ajout de cellules mésenchymateuses à notre modèle a amélioré le processus morphogénétique et l'efficacité de la fixation cellulaire. résolution au niveau de l'organe. Les cellules immunitaires dérivées du patient sont également essentielles pour afficher les réponses immunitaires innées, la présentation de l'antigène, la diaphonie immunitaire adaptative innée et l'immunité spécifique aux tissus dans le contexte de l'imitation des maladies intestinales.
L'utilisation de puces hybrides est plus simple que le gut-on-a-chip car la configuration de l'appareil est plus simple et l'utilisation d'inserts Transwell permet une culture évolutive de l'épithélium intestinal. Cependant, les inserts Transwell disponibles dans le commerce avec des membranes en polyester ne sont pas élastiques et ne peuvent pas simuler des mouvements de type péristaltique. terme de co-culture bactérienne dans des puces hybrides. Bien que nous puissions induire de manière robuste une morphogenèse 3D dans des inserts Transwell lors de l'utilisation de puces hybrides, le manque de biomécanique physiologiquement pertinente et d'écoulement de fluide apical peut limiter la faisabilité des plates-formes de puces hybrides pour des applications potentielles.
Les reconstructions à grande échelle de l'axe crypte-villosité humaine dans les cultures d'intestin sur puce et hybrides sur puce n'ont pas été complètement établies. Puisque la morphogenèse commence à partir d'une monocouche épithéliale, les microarchitectures 3D ne fournissent pas nécessairement une similitude morphologique avec les cryptes in vivo. Bien que des canaux supérieurs plus élevés sur la puce entraînent une augmentation de la hauteur de l'épithélium microtechnique, la hauteur maximale est toujours limitée à environ 300 à 400 µm. La profondeur réelle des cryptes intestinales humaines dans l'intestin grêle et le gros intestin est d'environ 135 µm et d'environ 400 µm, respectivement, et la hauteur des villosités de l'intestin grêle est d'environ 600 µm41.
Du point de vue de l'imagerie, l'imagerie super-résolution in situ des microarchitectures 3D peut être limitée à l'intestin sur une puce, puisque la distance de travail requise entre la lentille d'objectif et la couche épithéliale est de l'ordre de quelques millimètres. Pour surmonter ce problème, un objectif distant peut être nécessaire. est extrêmement difficile d'ouvrir ou de retirer la couche supérieure pour examiner la structure de surface de la couche épithéliale. Par exemple, en utilisant un microscope électronique à balayage (MEB).
L'hydrophobicité du PDMS a été un facteur limitant dans les études microfluidiques traitant de petites molécules hydrophobes, puisque le PDMS peut adsorber de manière non spécifique ces molécules hydrophobes. Des alternatives au PDMS peuvent être envisagées avec d'autres matériaux polymères. Alternativement, la modification de surface du PDMS (par exemple, revêtement avec des matériaux lipophiles 42 ou poly (éthylène glycol) 43) peut être envisagée pour minimiser l'adsorption des molécules hydrophobes.
Enfin, notre méthode n'a pas été bien caractérisée en termes de fourniture d'un dépistage à haut débit ou d'une plate-forme expérimentale conviviale «à une taille unique». ERTS qui permettent une réapprovisionnement continu et l'élimination des milieux basolatéraux).
Pour induire la morphogenèse 3D de l'épithélium intestinal humain in vitro, nous avons utilisé un dispositif intestinal à puce microfluidique contenant deux microcanaux parallèles et une membrane poreuse élastique entre les deux pour créer une interface lumière-capillaire. de flux pour éliminer les antagonistes morphogènes du compartiment basolatéral. L'ensemble de la procédure expérimentale (figure 1) se compose de cinq parties : (i) microfabrication de la puce intestinale ou de la puce hybride insérable Transwell (étapes 1 à 5 ; encadré 1), (ii) préparation de cellules épithéliales intestinales (cellules Caco-2) ou d'organoïdes intestinaux humains ;cases 2-5), (iii) culture de cellules épithéliales intestinales sur puces intestinales ou puces hybrides (étapes 6-9), (iv) induction d'une morphogenèse 3D in vitro (étape 10) et (v) ) pour caractériser la microstructure épithéliale 3D (étapes 11-24). contrôles temporels, conditionnels ou procéduraux.
Nous avons utilisé deux plates-formes de culture différentes : gut-on-a-chip avec des canaux droits ou des canaux convolutés non linéaires, ou des puces hybrides contenant des inserts Transwell (TW) dans un dispositif microfluidique, fabriqué comme décrit dans l'encadré 1, et l'étape 1 -5. La morphogenèse in vitro »montre les étapes globales au cours desquelles des cellules épithéliales dérivées de Caco-2 ou d'organoïdes sont cultivées sur une puce intestinale ou sur des inserts Transwell d'une puce hybride, suivies de l'induction d'une morphogenèse 3D et de la formation d'une structure épithéliale caractérisée. Le numéro d'étape du programme ou le numéro de case est affiché sous chaque flèche. les écosystèmes me et la modélisation des maladies.Images d'immunofluorescence dans la «différenciation cellulaire» montrant les noyaux, la F-actine et le MUC2 exprimés dans la couche épithéliale 3D Caco-2 générée sur la puce intestinale.La signalisation MUC2 est présente dans les cellules caliciformes et le mucus sécrété par les surfaces muqueuses. des images qui se chevauchent dans "Host-Microbe Co-Cultures" montrent des co-cultures hôte-microbiome représentatives dans l'intestin sur une puce. noyaux (bleu)vert). Des cellules Caco-2 ont été cultivées pour établir une couche épithéliale 3D. Barre d'échelle, 50 µm.Presse universitaire d'Oxford;Reproduit avec la permission de Ref.5.NAS ;"Host-Microbe Co-Culture" adapté avec la permission de la réf.3.NAS ;"Modélisation de la maladie" adapté avec la permission de reference.5.NAS.
Les puces gut-on-chip et hybrides ont été fabriquées à l'aide de répliques PDMS qui ont été démoulées à partir de moules en silicium par lithographie douce1,44 et modelées avec SU-8. sur une puce (Extended Data Fig. 1b) qui comprend une paire de microcanaux incurvés pour induire une augmentation du temps de séjour des fluides, des schémas d'écoulement non linéaires et une déformation multiaxiale des cellules cultivées (Fig. 2a – f) de croissance épithéliale par rapport à la Gut-Chip d'origine, quel que soit le type de cellule cultivée. Par conséquent, pour induire une morphogenèse 3D, les conceptions linéaires et complexes d'intestins sur puce sont interchangeables.2a). Pour fabriquer l'intestin sur une puce, la couche PDMS supérieure préparée a été liée séquentiellement à un film PDMS poreux, puis alignée avec la couche PDMS inférieure par liaison irréversible à l'aide d'un traitement corona (Fig. 2b – f). en traitant les surfaces de la réplique PDMS et du verre avec un plasma d'oxygène ou un traitement corona. Après la stérilisation du dispositif microfabriqué attaché au tube en silicone, la configuration du dispositif était prête à effectuer une morphogenèse 3D de l'épithélium intestinal (Figure 2g).
a, Illustration schématique de la préparation de pièces PDMS à partir de moules en silicone à motifs SU-8. La solution PDMS non durcie a été versée sur un moule en silicone (à gauche), durcie à 60 ° C (au milieu) et démoulée (à droite). Le PDMS démoulé a été coupé en morceaux et nettoyé pour une utilisation ultérieure. composants PDMS supérieurs et inférieurs et le dispositif intestinal sur puce assemblé. e, schéma de l'alignement des composants PDMS supérieur, membranaire et inférieur. Le dispositif à puce a été placé sur le couvercle d'une boîte de Petri de 150 mm pour le traitement. Le liant est utilisé pour fermer le tube en silicone. , 1 cm.h Reproduit avec la permission de reference.4.Elsevier.
Dans ce protocole, la lignée cellulaire Caco-2 et les organoïdes intestinaux ont été utilisés comme sources épithéliales (Fig. 3a) pour préparer des suspensions de cellules dissociées par du liquide de trypsinisation (boîte 2). Des organoïdes intestinaux humains provenant de biopsies intestinales ou de résections chirurgicales ont été cultivés dans des dômes d'échafaudage Matrigel dans des plaques à 24 puits pour soutenir le microenvironnement structurel. y les organoïdes cultivés sont récoltés et dissociés en cellules individuelles pour l'ensemencement sur l'intestin ou les inserts Transwell sur une puce (Encadré 5). ).Nous fournissons un protocole optimisé dans l'encadré 5 pour la culture d'organoïdes du côlon (coloïdes) qui nécessitent généralement des concentrations plus élevées de morphogènes que les petits organoïdes intestinaux.
a, Flux de travail pour l'induction de la morphogenèse intestinale dans la puce intestinale. L'épithélium intestinal humain Caco-2 et les organoïdes intestinaux sont utilisés dans ce protocole pour démontrer la morphogenèse 3D. 2 jours (flux, AP, J0-D2). Le flux basolatéral (BL) est également initié avec des mouvements d'étirement cycliques (étirement, flux, AP et BL) lorsqu'une monocouche 2D complète est formée. La morphogenèse 3D intestinale s'est produite spontanément après 5 jours de culture microfluidique (morphogenèse, J5). illustrant les cascades correspondantes de la morphogenèse intestinale (en haut à droite). Les flèches en pointillés dans le schéma représentent la direction de l'écoulement du fluide.b, image SEM montrant la topologie de surface de l'épithélium 3D Caco-2 établi (à gauche). membranes continues de bordure en brosse marquées F-actine (vert) et noyaux (bleu) Visualisation confocale par immunofluorescence des cellules épithéliales sur des puces intestinales. de l'image fournie.e, photomicrographie DIC de l'épithélium organoïde 3D établi dans l'intestin sur une tranche prise au jour 7.f, images d'immunofluorescence superposées montrant des marqueurs pour les cellules souches (LGR5 ;magenta), cellules caliciformes (MUC2 ; vert), F-actine (gris) et noyaux (cyan) cultivés sur des puces intestinales pendant 3 jours, respectivement (gauche) et organoïdes de 13 jours (milieu) sur la couche épithéliale. membrane avec le colorant CellMask (à droite) au jour 13 de la culture. La barre d'échelle est de 50 μm sauf indication contraire.b Reproduit avec la permission de reference.2.Presse universitaire d'Oxford;c Adapté avec la permission de Reference.2.Presse universitaire d'Oxford;e et f adaptés avec permission par référence.12 Sous licence Creative Commons CC BY 4.0.
Dans l'intestin sur une puce, il est nécessaire de modifier la surface hydrophobe de la membrane poreuse PDMS pour un revêtement ECM réussi. Dans ce protocole, nous appliquons deux méthodes différentes pour modifier l'hydrophobicité des membranes PDMS. fonctionnalisation de surface chimique pour obtenir un dépôt efficace des protéines ECM en appliquant séquentiellement du polyéthylèneimine (PEI) et du glutaraldéhyde aux microcanaux PDMS. Après modification de la surface, les protéines ECM ont été déposées pour couvrir la surface PDMS fonctionnalisée, puis introduites dans l'épithélium organoïde isolé. l'activation et le revêtement ECM permettent la fixation de l'épithélium organoïde pour induire une morphogenèse 3D sur la surface du PDMS.
Les cultures Transwell nécessitent également un revêtement ECM avant l'ensemencement cellulaire;cependant, les cultures Transwell ne nécessitent pas d'étapes de traitement préalable complexes pour activer la surface des inserts poreux. couche avec intégrité barrière. Les cultures Transwell sont réalisées dans des plaques 24 puits sans l'utilisation de puces hybrides.
La morphogenèse 3D in vitro peut être initiée en appliquant un flux de fluide à l'aspect basolatéral d'une couche épithéliale établie. Dans l'intestin sur une puce, la morphogenèse épithéliale a commencé lorsque le milieu a été perfusé dans les microcanaux supérieurs et inférieurs (Fig. 3a). al contrainte de cisaillement, nous appliquons généralement un double flux dans l'intestin sur une puce. Dans les puces hybrides, des inserts Transwell contenant des monocouches épithéliales ont été insérés dans les puces hybrides. Ensuite, le milieu a été appliqué sous le côté basolatéral de l'insert poreux Transwell à travers le microcanal. La morphogenèse intestinale s'est produite 3 à 5 jours après le début du flux basolatéral dans les deux plates-formes de culture.
Les caractéristiques morphologiques des couches épithéliales 3D microtechniques peuvent être analysées en appliquant diverses modalités d'imagerie, y compris la microscopie à contraste de phase, la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC), le SEM ou la microscopie confocale par immunofluorescence (Figures 3 et 4). Le contraste de phase ou l'imagerie DIC peuvent être facilement réalisés à tout moment pendant la culture pour surveiller la forme et la saillie des couches épithéliales 3D. Les plates-formes sur puce et hybrides peuvent fournir une imagerie in situ en temps réel sans qu'il soit nécessaire de sectionner ou de démonter l'appareil. Lors de l'imagerie par immunofluorescence (Figures 1, 3c, f et 4b, c), les cellules sont généralement fixées avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (wt/vol), suivi de Triton X-100 et d'albumine sérique bovine (BSA) à 2 % (wt/vol), dans l'ordre. Selon le type de cellule, différents fixateurs, des perméabilisants et des agents bloquants peuvent être utilisés. Des anticorps primaires ciblant des marqueurs de cellules ou de régions dépendant de la lignée sont utilisés pour mettre en évidence les cellules immobilisées in situ sur la puce, suivis d'anticorps secondaires avec un colorant de contre-coloration ciblant soit le noyau (par exemple, 4 ', 6-diamidino-2-phénylène) indole, DAPI) ou F-actine (par exemple, phalloïdine marquée par fluorescence). L'imagerie en direct basée sur la fluorescence peut également être réalisée in situ pour détecter la production de mucus (Fig .1, « Différenciation cellulaire » et « Physiologie intestinale »), la colonisation aléatoire de cellules microbiennes (Fig. 1, « Co-culture hôte-microbe »), le recrutement de cellules immunitaires (Fig. 1, « Modélisation de la maladie ») ou les contours de la morphologie épithéliale 3D (Fig. 3c,f et 4b,c). Fig. 2, la morphologie épithéliale 3D ainsi que les microvillosités sur la bordure en brosse apicale peuvent être visualisées par MEB (Fig. 3b). L'expression des marqueurs de différenciation peut être évaluée en effectuant une PCR5 quantitative ou un séquençage d'ARN unicellulaire. Dans ce cas, des couches 3D de cellules épithéliales cultivées dans des puces intestinales ou des puces hybrides sont récoltées par trypsinisation, puis utilisées pour une analyse moléculaire ou génétique.
a, flux de travail pour l'induction de la morphogenèse intestinale dans une puce hybride. Caco-2 et les organoïdes intestinaux sont utilisés dans ce protocole pour démontrer la morphogenèse 3D dans une plate-forme de puce hybride. contenant une monocouche 2D de cellules épithéliales a été intégré dans une puce hybride pour introduire un flux basolatéral (Flow, BL), ce qui a finalement conduit à la génération d'une couche épithéliale 3D (morphogénèse). Des micrographies en contraste de phase montrant les caractéristiques morphologiques des cellules épithéliales d'organes humains dérivées du côlon ascendant d'un donneur normal (lignée C103) à chaque étape ou point temporel expérimental. Les schémas dans les couches supérieures illustrent la configuration expérimentale pour chaque étape. D morphogenèse des cellules épithéliales organoïdes avec des vues de microscopie confocale de haut en bas prises à différentes positions Z (supérieure, moyenne et inférieure ;voir schéma de droite et lignes pointillées correspondantes).a montré des caractéristiques morphologiques évidentes.F-actine (cyan), noyau (gris).c, Micrographies confocales à fluorescence (vue en angle 3D) de cellules épithéliales dérivées d'organoïdes cultivées dans un transwell statique (TW; encart dans une boîte en pointillés blancs) par rapport à une puce hybride (plus grand plan complet) comparant la morphologie 2D et 3D, respectivement. Caractéristiques D et 3D. Barre d'échelle, 100 µm.c Reproduit avec la permission de la référence.4.Elsevier.
Les contrôles peuvent être préparés en cultivant les mêmes cellules (Caco-2 ou cellules épithéliales organoïdes intestinales) en monocouches bidimensionnelles dans des conditions de culture statique conventionnelles. Notamment, l'épuisement des nutriments peut résulter en raison de la capacité volumique limitée des microcanaux (c'est-à-dire ~ 4 µL dans le canal supérieur sur la conception originale de la puce intestinale).
Le processus de lithographie douce doit être effectué dans une salle blanche. Pour chaque couche de la puce (couches supérieure et inférieure et membranes) et des puces hybrides, différents photomasques ont été utilisés et fabriqués sur des tranches de silicium séparées car les hauteurs des microcanaux étaient différentes. Les hauteurs cibles des microcanaux supérieurs et inférieurs de l'intestin sur la puce sont respectivement de 500 µm et 200 µm.
Placer une plaquette de silicium de 3 pouces dans un plat avec de l'acétone. Agiter doucement la plaque pendant 30 secondes, puis sécher la plaquette à l'air. Transférer la plaquette sur une plaque avec de l'IPA, puis faire tourner la plaque pendant 30 s pour la nettoyer.
Une solution de piranha (mélange de peroxyde d'hydrogène et d'acide sulfurique concentré, 1:3 (vol/vol)) peut éventuellement être utilisée pour maximiser l'élimination des résidus organiques de la surface de la plaquette de silicium.
La solution Piranha est extrêmement corrosive et génère de la chaleur.Des mesures de sécurité supplémentaires sont nécessaires.Pour l'élimination des déchets, laissez la solution refroidir et transférez-la dans un conteneur à déchets propre et sec.Utilisez des conteneurs secondaires et étiquetez correctement les conteneurs à déchets.Veuillez suivre les consignes de sécurité de l'établissement pour des procédures plus détaillées.
Déshydrater les plaquettes en les plaçant sur une plaque chauffante à 200 ° C pendant 10 min. Après déshydratation, la plaquette a été secouée cinq fois à l'air pour refroidir.
Verser ~ 10 g de résine photosensible SU-8 2100 sur le centre de la plaquette de silicium nettoyée. Utilisez une pince à épiler pour étaler la résine photosensible uniformément sur la plaquette. Placez occasionnellement la plaquette sur une plaque chauffante à 65 ° C pour rendre la résine photosensible moins collante et plus facile à étaler. Ne placez pas la plaquette directement sur la plaque chauffante.
Le SU-8 a été uniformément réparti sur la plaquette en exécutant un revêtement par centrifugation. Programmez une rotation entrante du SU-8 pendant 5 à 10 s pour qu'il se propage à 500 tr/min à une accélération de 100 tr/min/s. de 300 tr/min/s 30 secondes à 1 200 tr/min.
La vitesse de rotation principale peut être ajustée en fonction de l'épaisseur cible du motif SU-8 sur la plaquette de silicium.
Pour fabriquer des motifs SU-8 de 500 µm de hauteur pour la couche supérieure de l'intestin sur la puce, les étapes de revêtement par centrifugation et de cuisson douce de cette boîte (étapes 7 et 8) ont été répétées séquentiellement (voir étape 9) pour produire deux couches de 250 µm Une couche épaisse de SU-8, qui peut être superposée et jointe par exposition aux UV à l'étape 12 de cette boîte, faisant une couche de 500 µm de haut.
Cuire au four doux les gaufrettes recouvertes de SU-8 en plaçant soigneusement les gaufrettes sur une plaque chauffante à 65 oC pendant 5 min, puis passer le réglage à 95 oC et incuber pendant 40 min supplémentaires.
Pour obtenir une hauteur de 500 m du motif SU-8 dans le microcanal supérieur, répétez les étapes 7 et 8 pour générer deux couches de SU-8 de 250 m d'épaisseur.
À l'aide de l'alignement de masque UV, effectuez un test de lampe selon les instructions du fabricant pour calculer le temps d'exposition de la plaquette. (temps d'exposition, ms) = (dose d'exposition, mJ/cm2)/(puissance de la lampe, mW/cm2).
Après avoir déterminé le temps d'exposition, placez le photomasque sur le porte-masque de l'aligneur de masque UV et placez le photomasque sur la plaquette revêtue de SU-8.
Placez la surface imprimée du photomasque directement sur le côté recouvert de SU-8 de la plaquette de silicium pour minimiser la dispersion UV.
Exposez la plaquette enduite de SU-8 et le photomasque verticalement à 260 mJ/cm2 de lumière UV pendant le temps d'exposition prédéterminé (voir l'étape 10 de cette boîte).
Après exposition aux UV, des plaquettes de silicium recouvertes de SU-8 ont été cuites à 65 ° C pendant 5 min et à 95 ° C pendant 15 min sur chaque plaque chauffante pour fabriquer des motifs d'une hauteur de 200 μm. Prolonger le temps de post-cuisson à 95 ° C à 30 min pour fabriquer des motifs d'une hauteur de 500 μm.
Le développeur est versé dans un plat en verre et la plaquette cuite est placée dans le plat. Le volume de développeur SU-8 peut varier en fonction de la taille de la plaque de verre. Assurez-vous d'utiliser suffisamment de développeur SU-8 pour éliminer complètement le SU-8 non exposé.
Rincer le moule développé avec ~ 10 ml de développeur frais suivi d'IPA en pulvérisant la solution à l'aide d'une pipette.
Placer la plaquette dans un nettoyeur à plasma et exposer à un plasma d'oxygène (gaz atmosphérique, pression cible 1 × 10−5 Torr, puissance 125 W) pendant 1,5 min.
Placez la plaquette dans un dessiccateur à vide avec une lame de verre à l'intérieur. Les plaquettes et les lames peuvent être placées côte à côte. Si le dessiccateur à vide est divisé en plusieurs couches par une plaque, placez les lames dans la chambre inférieure et les plaquettes dans la chambre supérieure.
Décongeler un flacon de cellules Caco-2 congelées dans un bain-marie à 37 ° C, puis transférer les cellules décongelées dans un flacon T75 contenant 15 ml de milieu Caco-2 préchauffé à 37 ° C.
Pour passer les cellules Caco-2 à ~ 90 % de confluence, commencez par chauffer le milieu Caco-2, le PBS et 0,25 % de trypsine/1 mM EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
Aspirer le milieu par aspiration sous vide. Laver les cellules deux fois avec 5 ml de PBS chaud en répétant l'aspiration sous vide et en ajoutant du PBS frais.