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L'évolution des parasites microbiens implique une opposition entre la sélection naturelle, qui favorise l'amélioration des parasites, et la dérive génétique, qui entraîne la perte de gènes et l'accumulation de mutations délétères. Afin de comprendre comment cette opposition se produit à l'échelle d'une seule macromolécule, nous décrivons ici la structure cryo-EM du ribosome d'Encephalitozoon cuniculi, un organisme eucaryote doté de l'un des plus petits génomes naturels. La réduction extrême de l'ARNr dans les ribosomes d'E. cuniculi s'accompagne de modifications structurelles sans précédent, telles que l'apparition de lieurs fusionnés d'ARNr jusqu'alors inconnus et d'ARNr sans renflements. De plus, le ribosome d'E. cuniculi a survécu à la perte de fragments d'ARNr et de protéines en développant la capacité d'utiliser de petites molécules comme imitations structurelles de fragments d'ARNr et de protéines dégradés. Globalement, nous montrons que des structures moléculaires longtemps considérées comme réduites, dégénérées et sujettes à des mutations invalidantes possèdent plusieurs mécanismes compensatoires qui les maintiennent actives malgré des contractions moléculaires extrêmes.
La plupart des groupes de parasites microbiens possédant des outils moléculaires uniques pour exploiter leurs hôtes, nous devons souvent développer des thérapies différentes pour chaque groupe de parasites1,2. Cependant, de nouvelles données suggèrent que certains aspects de l'évolution des parasites sont convergents et largement prévisibles, ce qui ouvre la voie à des interventions thérapeutiques à grande échelle contre les parasites microbiens3,4,5,6,7,8,9.
Des travaux antérieurs ont identifié une tendance évolutive commune aux parasites microbiens appelée réduction ou dégradation du génome10,11,12,13. Les recherches actuelles montrent que lorsque les micro-organismes abandonnent leur mode de vie libre et deviennent des parasites intracellulaires (ou endosymbiotes), leurs génomes subissent des métamorphoses lentes mais étonnantes sur des millions d'années9,11. Dans un processus connu sous le nom de dégradation du génome, les parasites microbiens accumulent des mutations délétères qui transforment de nombreux gènes auparavant importants en pseudogènes, entraînant une perte progressive de gènes et un effondrement mutationnel14,15. Cet effondrement peut détruire jusqu'à 95 % des gènes des organismes intracellulaires les plus anciens, par rapport aux espèces libres étroitement apparentées. Ainsi, l'évolution des parasites intracellulaires est un bras de fer entre deux forces opposées : la sélection naturelle darwinienne, conduisant à l'amélioration des parasites, et l'effondrement du génome, jetant les parasites dans l'oubli. On ne sait toujours pas comment le parasite a réussi à sortir de ce bras de fer et à conserver l’activité de sa structure moléculaire.
Bien que le mécanisme de dégradation du génome ne soit pas entièrement compris, il semble que celui-ci soit principalement dû à une dérive génétique fréquente. Comme les parasites vivent en petites populations asexuées et génétiquement limitées, ils ne peuvent éliminer efficacement les mutations délétères qui surviennent parfois lors de la réplication de l'ADN. Cela entraîne une accumulation irréversible de mutations nocives et une réduction du génome parasitaire. Par conséquent, le parasite perd non seulement des gènes devenus inutiles à sa survie dans l'environnement intracellulaire, mais c'est l'incapacité des populations parasitaires à éliminer efficacement les mutations délétères sporadiques qui entraîne leur accumulation dans tout le génome, y compris dans leurs gènes les plus importants.
Une grande partie de notre compréhension actuelle de la réduction du génome repose uniquement sur la comparaison des séquences génomiques, accordant moins d'attention aux modifications des molécules qui assurent des fonctions de maintenance et servent de cibles thérapeutiques potentielles. Des études comparatives ont montré que la charge de mutations microbiennes intracellulaires délétères semble prédisposer les protéines et les acides nucléiques à un mauvais repliement et à une agrégation, les rendant plus dépendants des chaperons et hypersensibles à la chaleur19,20,21,22,23. De plus, divers parasites – dont l'évolution est indépendante et parfois séparée par jusqu'à 2,5 milliards d'années – ont subi une perte similaire de centres de contrôle de la qualité dans leurs mécanismes de synthèse protéique5,6 et de réparation de l'ADN24. Cependant, on sait peu de choses sur l'impact du mode de vie intracellulaire sur toutes les autres propriétés des macromolécules cellulaires, y compris l'adaptation moléculaire à une charge croissante de mutations délétères.
Français Dans ce travail, afin de mieux comprendre l'évolution des protéines et des acides nucléiques des micro-organismes intracellulaires, nous avons déterminé la structure des ribosomes du parasite intracellulaire Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi est un organisme de type fongique appartenant à un groupe de microsporidies parasites qui ont des génomes eucaryotes inhabituellement petits et sont donc utilisés comme organismes modèles pour étudier la dégradation du génome25,26,27,28,29,30. Récemment, la structure des ribosomes par cryo-EM a été déterminée pour des génomes modérément réduits de Microsporidia, Paranosema locustae et Vairimorpha necatrix31,32 (génome d'environ 3,2 Mb). Ces structures suggèrent qu'une certaine perte d'amplification de l'ARNr est compensée par le développement de nouveaux contacts entre protéines ribosomiques voisines ou l'acquisition de nouvelles protéines ribosomiques msL131,32. Français L'espèce Encephalitozoon (génome ~2,5 millions de pb), ainsi que son plus proche parent Ordospora, démontrent le degré ultime de réduction du génome chez les eucaryotes - ils ont moins de 2000 gènes codant pour des protéines, et on s'attend à ce que leurs ribosomes soient non seulement dépourvus de fragments d'expansion d'ARNr (fragments d'ARNr qui distinguent les ribosomes eucaryotes des ribosomes bactériens) mais aussi qu'ils aient quatre protéines ribosomiques en raison de leur absence d'homologues dans le génome d'E. cuniculi26,27,28. Par conséquent, nous avons conclu que le ribosome d'E. cuniculi peut révéler des stratégies jusqu'alors inconnues d'adaptation moléculaire à la dégradation du génome.
Notre structure cryo-EM représente le plus petit ribosome cytoplasmique eucaryote jamais caractérisé et permet de mieux comprendre comment le degré ultime de réduction du génome affecte la structure, l'assemblage et l'évolution de la machinerie moléculaire essentielle à la cellule. Nous avons constaté que le ribosome d'E. cuniculi viole de nombreux principes largement conservés du repliement de l'ARN et de l'assemblage des ribosomes, et avons découvert une nouvelle protéine ribosomique jusqu'alors inconnue. De manière assez inattendue, nous démontrons que les ribosomes des microsporidies ont développé la capacité de se lier à de petites molécules, et nous émettons l'hypothèse que les troncatures de l'ARNr et des protéines déclenchent des innovations évolutives susceptibles de conférer au ribosome des propriétés utiles.
Afin d'améliorer notre compréhension de l'évolution des protéines et des acides nucléiques dans les organismes intracellulaires, nous avons décidé d'isoler des spores d'E. cuniculi à partir de cultures de cellules de mammifères infectées afin de purifier leurs ribosomes et d'en déterminer la structure. Il est difficile d'obtenir un grand nombre de microsporidies parasitaires, car elles ne peuvent pas être cultivées en milieu nutritif. Elles se développent et se reproduisent uniquement à l'intérieur de la cellule hôte. Par conséquent, pour obtenir la biomasse d'E. cuniculi nécessaire à la purification des ribosomes, nous avons infecté la lignée cellulaire rénale de mammifère RK13 avec des spores d'E. cuniculi et cultivé ces cellules infectées pendant plusieurs semaines pour permettre à E. cuniculi de croître et de se multiplier. À l'aide d'une monocouche de cellules infectées d'environ un demi-mètre carré, nous avons pu purifier environ 300 mg de spores de Microsporidies et les utiliser pour isoler les ribosomes. Nous avons ensuite désintégré les spores purifiées avec des billes de verre et isolé les ribosomes bruts par fractionnement progressif des lysats au polyéthylène glycol. Cela nous a permis d’obtenir environ 300 µg de ribosomes bruts d’E. cuniculi pour une analyse structurelle.
Nous avons ensuite collecté des images cryo-EM à partir des échantillons de ribosomes obtenus et les avons traitées à l'aide de masques correspondant à la grande sous-unité ribosomique, à la tête de la petite sous-unité et à la petite sous-unité. Au cours de ce processus, nous avons collecté des images d'environ 108 000 particules ribosomiques et calculé des images cryo-EM avec une résolution de 2,7 Å (Figures supplémentaires 1 à 3). Nous avons ensuite utilisé les images cryo-EM pour modéliser l'ARNr, la protéine ribosomique et le facteur d'hibernation Mdf1 associés aux ribosomes d'E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Structure du ribosome d'E. cuniculi en complexe avec le facteur d'hibernation Mdf1 (pdb id 7QEP). b Carte du facteur d'hibernation Mdf1 associé au ribosome d'E. cuniculi. c Carte de structure secondaire comparant l'ARNr récupéré chez les espèces de Microsporidiens aux structures ribosomales connues. Les panneaux montrent l'emplacement des fragments d'ARNr amplifiés (ES) et des sites actifs du ribosome, y compris le site de décodage (DC), la boucle de sarcinicine (SRL) et le centre de peptidyltransférase (PTC). d La densité électronique correspondant au centre de peptidyltransférase du ribosome d'E. cuniculi suggère que ce site catalytique a la même structure chez le parasite E. cuniculi et ses hôtes, y compris H. sapiens. e, f La densité électronique correspondante du centre de décodage (e) et la structure schématique du centre de décodage (f) indiquent qu'E. cuniculi possède des résidus U1491 au lieu de A1491 (numérotation d'E. coli) chez de nombreux autres eucaryotes. Ce changement suggère qu'E. cuniculi pourrait être sensible aux antibiotiques qui ciblent ce site actif.
Français Contrairement aux structures précédemment établies des ribosomes de V. necatrix et de P. locustae (les deux structures représentent la même famille de microsporidies Nosematidae et sont très similaires l'une à l'autre), 31,32 les ribosomes d'E. cuniculi subissent de nombreux processus de fragmentation de l'ARNr et des protéines. Une dénaturation supplémentaire (Figures supplémentaires 4 à 6). Dans l'ARNr, les changements les plus frappants comprenaient la perte complète du fragment d'ARNr 25S amplifié ES12L et la dégénérescence partielle des hélices h39, h41 et H18 (Fig. 1c, Fig. supplémentaire 4). Parmi les protéines ribosomiques, les changements les plus frappants comprenaient la perte complète de la protéine eS30 et le raccourcissement des protéines eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 et eS7 (figures supplémentaires 4, 5).
Français Ainsi, la réduction extrême des génomes des espèces d'Encephalotozoon/Ordospora se reflète dans leur structure ribosomique : les ribosomes d'E. cuniculi subissent la perte de contenu protéique la plus spectaculaire parmi les ribosomes cytoplasmiques eucaryotes soumis à caractérisation structurale, et ils ne possèdent même pas les fragments d'ARNr et de protéines largement conservés non seulement chez les eucaryotes, mais aussi dans les trois domaines du vivant. La structure du ribosome d'E. cuniculi fournit le premier modèle moléculaire de ces changements et révèle des événements évolutifs qui ont été négligés par la génomique comparative et les études de structure biomoléculaire intracellulaire (Fig. supplémentaire 7). Ci-dessous, nous décrivons chacun de ces événements ainsi que leurs origines évolutives probables et leur impact potentiel sur la fonction ribosomique.
Nous avons ensuite découvert qu'en plus des grandes troncatures d'ARNr, les ribosomes d'E. cuniculi présentent des variations d'ARNr sur l'un de leurs sites actifs. Bien que le centre peptidyltransférase du ribosome d'E. cuniculi ait la même structure que les autres ribosomes eucaryotes (Fig. 1d), le centre de décodage diffère en raison d'une variation de séquence au nucléotide 1491 (numérotation d'E. coli, Fig. 1e, f). Cette observation est importante car le site de décodage des ribosomes eucaryotes contient généralement les résidus G1408 et A1491, contrairement aux résidus de type bactérien A1408 et G1491. Cette variation explique la sensibilité différente des ribosomes bactériens et eucaryotes à la famille des aminosides, des antibiotiques ribosomiques, et à d'autres petites molécules qui ciblent le site de décodage. Au niveau du site de décodage du ribosome d'E. cuniculi, le résidu A1491 a été remplacé par U1491, créant potentiellement une interface de liaison unique pour les petites molécules ciblant ce site actif. Le même variant A14901 est également présent chez d'autres microsporidies telles que P. locustae et V. necatrix, ce qui suggère qu'il est répandu parmi les espèces de microsporidies (Fig. 1f).
Étant donné que nos échantillons de ribosomes d'E. cuniculi ont été isolés de spores métaboliquement inactives, nous avons testé la carte cryo-EM d'E. cuniculi pour la liaison des ribosomes précédemment décrite dans des conditions de stress ou de famine. Facteurs d'hibernation 31, 32, 36, 37, 38. Nous avons fait correspondre la structure précédemment établie du ribosome hibernant avec la carte cryo-EM du ribosome d'E. cuniculi. Pour l'amarrage, des ribosomes de S. cerevisiae ont été utilisés en complexe avec le facteur d'hibernation Stm138, des ribosomes de criquet en complexe avec le facteur Lso232 et des ribosomes de V. necatrix en complexe avec les facteurs Mdf1 et Mdf231. En même temps, nous avons trouvé la densité cryo-EM correspondant au facteur de repos Mdf1. Similairement à la liaison de Mdf1 au ribosome de V. necatrix, Mdf1 se lie également au ribosome d'E. cuniculi, où il bloque le site E du ribosome, contribuant peut-être à rendre les ribosomes disponibles lorsque les spores du parasite deviennent métaboliquement inactives lors de l'inactivation du corps (Figure 2).
Mdf1 bloque le site E du ribosome, ce qui semble contribuer à l'inactivation de ce dernier lorsque les spores du parasite deviennent métaboliquement inactives. Dans la structure du ribosome d'E. cuniculi, nous avons découvert que Mdf1 forme un contact jusqu'alors inconnu avec la tige ribosomique L1, la partie du ribosome qui facilite la libération de l'ARNt désacylé du ribosome lors de la synthèse protéique. Ces contacts suggèrent que Mdf1 se dissocie du ribosome par le même mécanisme que l'ARNt désacétylé, ce qui pourrait expliquer comment le ribosome élimine Mdf1 pour réactiver la synthèse protéique.
Cependant, notre structure a révélé un contact inconnu entre Mdf1 et la jambe L1 du ribosome (la partie du ribosome qui contribue à la libération de l'ARNt désacylé du ribosome lors de la synthèse protéique). En particulier, Mdf1 utilise les mêmes contacts que le segment coudé de la molécule d'ARNt désacylé (Fig. 2). Cette modélisation moléculaire jusqu'alors inconnue a montré que Mdf1 se dissocie du ribosome en utilisant le même mécanisme que l'ARNt désacétylé, ce qui explique comment le ribosome supprime ce facteur d'hibernation pour réactiver la synthèse protéique.
Lors de la construction du modèle d'ARNr, nous avons découvert que le ribosome d'E. cuniculi présente des fragments d'ARNr anormalement repliés, que nous avons appelés ARNr fusionnés (Fig. 3). Dans les ribosomes qui couvrent les trois domaines du vivant, l'ARNr se replie en structures dans lesquelles la plupart des bases d'ARNr s'apparient et se replient entre elles ou interagissent avec des protéines ribosomiques38,39,40. Cependant, dans les ribosomes d'E. cuniculi, les ARNr semblent violer ce principe de repliement en convertissant certaines de leurs hélices en régions d'ARNr dépliées.
Structure de l'hélice d'ARNr H18 25S chez S. cerevisiae, V. necatrix et E. cuniculi. Typiquement, dans les ribosomes couvrant les trois domaines vitaux, ce lieur s'enroule en une hélice d'ARN contenant 24 à 34 résidus. Chez les microsporidies, en revanche, ce lieur d'ARNr est progressivement réduit à deux lieurs simple brin riches en uridine ne contenant que 12 résidus. La plupart de ces résidus sont exposés aux solvants. La figure montre que les microsporidies parasitaires semblent violer les principes généraux du repliement de l'ARNr, où les bases de l'ARNr sont généralement couplées à d'autres bases ou impliquées dans les interactions ARNr-protéines. Chez les microsporidies, certains fragments d'ARNr adoptent un repliement défavorable, l'ancienne hélice d'ARNr devenant un fragment simple brin allongé presque en ligne droite. La présence de ces régions inhabituelles permet à l'ARNr des microsporidies de se lier à des fragments d'ARNr distants en utilisant un nombre minimal de bases d'ARN.
L'exemple le plus frappant de cette transition évolutive peut être observé dans l'hélice d'ARNr H18 25S (Fig. 3). Chez les espèces, d'E. coli à l'homme, les bases de cette hélice d'ARNr contiennent 24 à 32 nucléotides, formant une hélice légèrement irrégulière. Dans les structures ribosomiques précédemment identifiées chez V. necatrix et P. locustae,31,32 les bases de l'hélice H18 sont partiellement déroulées, mais l'appariement des bases nucléotidiques est préservé. Cependant, chez E. cuniculi, ce fragment d'ARNr devient les lieurs les plus courts 228UUUGU232 et 301UUUUUUUUU307. Contrairement aux fragments d'ARNr typiques, ces lieurs riches en uridine ne s'enroulent pas et n'entrent pas en contact étendu avec les protéines ribosomiques. Au lieu de cela, ils adoptent des structures ouvertes au solvant et entièrement dépliées dans lesquelles les brins d'ARNr sont étendus presque droit. Cette conformation étirée explique comment E. cuniculi utilise seulement 12 bases d'ARN pour combler l'espace de 33 Å entre les hélices d'ARNr H16 et H18, tandis que d'autres espèces nécessitent au moins deux fois plus de bases d'ARNr pour combler l'espace.
Ainsi, nous pouvons démontrer que, par repliement énergétiquement défavorable, les microsporidies parasites ont développé une stratégie pour contracter même les segments d'ARNr largement conservés entre les espèces dans les trois domaines du vivant. Apparemment, en accumulant des mutations transformant les hélices d'ARNr en courts lieurs poly-U, E. cuniculi peut former des fragments d'ARNr inhabituels contenant le moins de nucléotides possible pour la ligature des fragments distaux d'ARNr. Cela contribue à expliquer comment les microsporidies ont obtenu une réduction spectaculaire de leur structure moléculaire de base sans perdre leur intégrité structurelle et fonctionnelle.
Une autre caractéristique inhabituelle de l'ARNr d'E. cuniculi est son aspect sans épaississement (Fig. 4). Les protubérances sont des nucléotides sans paires de bases qui se déforment hors de l'hélice d'ARN au lieu de s'y cacher. La plupart des protubérances d'ARNr agissent comme des adhésifs moléculaires, facilitant la liaison des protéines ribosomiques adjacentes ou d'autres fragments d'ARNr. Certaines protubérances agissent comme des charnières, permettant à l'hélice d'ARNr de se fléchir et de se replier de manière optimale pour une synthèse protéique productive 41 .
a Une protrusion d'ARNr (numérotation de S. cerevisiae) est absente de la structure du ribosome d'E. cuniculi, mais présente chez la plupart des autres eucaryotes. b Les ribosomes internes d'E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens et E. cuniculi. Les parasites sont dépourvus de nombreux renflements d'ARNr anciens et hautement conservés. Ces épaississements stabilisent la structure du ribosome ; par conséquent, leur absence dans les microsporidies indique une stabilité réduite du repliement de l'ARNr chez les parasites microsporidies. La comparaison avec les tiges P (tiges L7/L12 chez les bactéries) montre que la perte de bosses d'ARNr coïncide parfois avec l'apparition de nouvelles bosses à côté des bosses perdues. L'hélice H42 dans l'ARNr 23S/28S possède un renflement ancien (U1206 chez Saccharomyces cerevisiae) estimé à au moins 3,5 milliards d'années en raison de sa protection dans trois domaines de la vie. Chez les microsporidies, ce renflement est éliminé. Cependant, un nouveau renflement est apparu à côté du renflement perdu (A1306 chez E. cuniculi).
De manière frappante, nous avons constaté que les ribosomes d'E. cuniculi sont dépourvus de la plupart des renflements d'ARNr présents chez d'autres espèces, dont plus de 30 conservés chez d'autres eucaryotes (Fig. 4a). Cette perte élimine de nombreux contacts entre les sous-unités ribosomiques et les hélices d'ARNr adjacentes, créant parfois de grands vides au sein du ribosome, rendant le ribosome d'E. cuniculi plus poreux que les ribosomes plus traditionnels (Fig. 4b). Nous avons notamment constaté que la plupart de ces renflements étaient également perdus dans les structures ribosomiques précédemment identifiées de V. necatrix et de P. locustae, qui avaient été négligées par les analyses structurales antérieures31,32.
Parfois, la perte des renflements d'ARNr s'accompagne du développement de nouveaux renflements à proximité du renflement perdu. Par exemple, la tige P ribosomique contient un renflement U1208 (chez Saccharomyces cerevisiae) qui a survécu d'E. coli à l'homme et dont l'âge est donc estimé à 3,5 milliards d'années. Lors de la synthèse protéique, ce renflement permet à la tige P de passer d'une conformation ouverte à une conformation fermée, permettant ainsi au ribosome de recruter des facteurs de traduction et de les acheminer vers le site actif. Chez les ribosomes d'E. cuniculi, cet épaississement est absent ; cependant, un nouvel épaississement (G883), localisé uniquement sur trois paires de bases, peut contribuer à restaurer la flexibilité optimale de la tige P (Fig. 4c).
Nos données sur l'ARNr sans renflements suggèrent que la minimisation de l'ARNr ne se limite pas à la perte d'éléments d'ARNr à la surface du ribosome, mais peut également impliquer le noyau du ribosome, créant un défaut moléculaire spécifique au parasite qui n'a pas été décrit dans les cellules libres. espèces vivantes sont observées.
Après avoir modélisé les protéines ribosomiques canoniques et l'ARNr, nous avons constaté que les composants ribosomiques conventionnels ne peuvent expliquer les trois parties de l'image cryo-EM. Deux de ces fragments sont de petites molécules (Fig. 5, Fig. 8 supplémentaire). Le premier segment est pris en sandwich entre les protéines ribosomiques uL15 et eL18, à une position habituellement occupée par l'extrémité C-terminale d'eL18, qui est raccourcie chez E. cuniculi. Bien que nous ne puissions pas déterminer l'identité de cette molécule, la taille et la forme de cet îlot de densité s'expliquent bien par la présence de molécules de spermidine. Sa liaison au ribosome est stabilisée par des mutations spécifiques des protéines uL15 (Asp51 et Arg56) aux microsporidies, qui semblent augmenter l'affinité du ribosome pour cette petite molécule, car elles permettent à uL15 d'envelopper la petite molécule dans une structure ribosomique. Figure 2 supplémentaire). 8, données complémentaires 1, 2).
Imagerie cryo-EM montrant la présence de nucléotides à l'extérieur du ribose lié au ribosome d'E. cuniculi. Dans le ribosome d'E. cuniculi, ce nucléotide occupe la même place que le nucléotide A3186 de l'ARNr 25S (numérotation de Saccharomyces cerevisiae) dans la plupart des autres ribosomes eucaryotes. b Dans la structure ribosomique d'E. cuniculi, ce nucléotide est situé entre les protéines ribosomiques uL9 et eL20, stabilisant ainsi le contact entre les deux protéines. cd Analyse de la conservation de la séquence eL20 parmi les espèces de microsporidies. Français L'arbre phylogénétique des espèces de Microsporidia (c) et l'alignement de séquences multiples de la protéine eL20 (d) montrent que les résidus de liaison aux nucléotides F170 et K172 sont conservés dans la plupart des Microsporidia typiques, à l'exception de S. lophii, à l'exception des Microsporidia à ramification précoce, qui ont conservé l'extension d'ARNr ES39L. e Cette figure montre que les résidus de liaison aux nucléotides F170 et K172 ne sont présents que dans eL20 du génome hautement réduit des microsporidies, mais pas chez les autres eucaryotes. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que les ribosomes des Microsporidies ont développé un site de liaison aux nucléotides qui semble se lier aux molécules d'AMP et les utiliser pour stabiliser les interactions protéine-protéine dans la structure ribosomique. La forte conservation de ce site de liaison chez les Microsporidia et son absence chez les autres eucaryotes suggèrent que ce site peut fournir un avantage de survie sélectif pour les Microsporidia. Français Ainsi, la poche de liaison aux nucléotides dans le ribosome des microsporidies ne semble pas être une caractéristique dégénérée ou une forme finale de dégradation de l'ARNr comme décrit précédemment, mais plutôt une innovation évolutive utile qui permet au ribosome des microsporidies de se lier directement à de petites molécules, les utilisant comme éléments de base moléculaires. éléments de base des ribosomes. Cette découverte fait du ribosome des microsporidies le seul ribosome connu à utiliser un seul nucléotide comme élément de base structurel. f Voie évolutive hypothétique dérivée de la liaison aux nucléotides.
Français La deuxième densité de faible poids moléculaire est située à l'interface entre les protéines ribosomiques uL9 et eL30 (Fig. 5a). Cette interface a été précédemment décrite dans la structure du ribosome de Saccharomyces cerevisiae comme un site de liaison pour le nucléotide 25S de l'ARNr A3186 (une partie de l'extension de l'ARNr ES39L)38. Il a été montré que dans les ribosomes ES39L dégénérés de P. locustae, cette interface se lie à un seul nucléotide inconnu 31, et on suppose que ce nucléotide est une forme finale réduite de l'ARNr, dans laquelle la longueur de l'ARNr est d'environ 130-230 bases. ES39L est réduit à un seul nucléotide 32.43. Nos images cryo-EM soutiennent l'idée que la densité peut être expliquée par les nucléotides. Cependant, la résolution plus élevée de notre structure a montré que ce nucléotide est une molécule extraribosomique, peut-être l'AMP (Fig. 5a, b).
Nous avons ensuite cherché à savoir si le site de liaison des nucléotides apparaissait dans le ribosome d'E. cuniculi ou s'il existait auparavant. La liaison des nucléotides étant principalement médiée par les résidus Phe170 et Lys172 de la protéine ribosomique eL30, nous avons évalué la conservation de ces résidus chez 4 396 eucaryotes représentatifs. Comme dans le cas de uL15 ci-dessus, nous avons constaté que les résidus Phe170 et Lys172 sont hautement conservés uniquement chez les microsporidies typiques, mais absents chez d'autres eucaryotes, notamment les microsporidies atypiques Mitosporidium et Amphiamblys, chez lesquelles le fragment d'ARNr ES39L n'est pas réduit 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Prises ensemble, ces données étayent l'idée qu'E. cuniculi et peut-être d'autres microsporidies canoniques ont développé la capacité de capturer efficacement un grand nombre de petits métabolites dans la structure du ribosome afin de compenser la baisse des niveaux d'ARNr et de protéines. Ce faisant, elles ont développé une capacité unique à lier les nucléotides hors du ribosome, montrant que les structures moléculaires parasitaires compensent en capturant de nombreux petits métabolites et en les utilisant comme imitations structurelles de fragments d'ARN et de protéines dégradés.
La troisième partie non simulée de notre carte cryo-EM, trouvée dans la grande sous-unité ribosomique. La résolution relativement élevée (2,6 Å) de notre carte suggère que cette densité appartient à des protéines avec des combinaisons uniques de grands résidus de chaîne latérale, ce qui nous a permis d'identifier cette densité comme une protéine ribosomique jusqu'alors inconnue que nous avons identifiée comme elle a été nommée msL2 (protéine L2 spécifique aux Microsporidies) (méthodes, figure 6). Notre recherche d'homologie a montré que msL2 est conservée dans le clade Microsporidia des genres Encephaliter et Orosporidium, mais absente chez d'autres espèces, y compris d'autres Microsporidia. Dans la structure ribosomique, msL2 occupe un espace vide formé par la perte de l'ARNr étendu ES31L. Dans ce vide, msL2 contribue à stabiliser le repliement de l'ARNr et peut compenser la perte d'ES31L (figure 6).
a Densité électronique et modèle de la protéine ribosomique msL2 spécifique aux microsporidies trouvée dans les ribosomes d'E. cuniculi. b La plupart des ribosomes eucaryotes, y compris le ribosome 80S de Saccharomyces cerevisiae, ont une amplification de l'ARNr ES19L perdue dans la plupart des espèces de microsporidies. La structure précédemment établie du ribosome des microsporidies de V. necatrix suggère que la perte d'ES19L chez ces parasites est compensée par l'évolution de la nouvelle protéine ribosomique msL1. Dans cette étude, nous avons constaté que le ribosome d'E. cuniculi a également développé une protéine mimétique d'ARN ribosomique supplémentaire comme compensation apparente à la perte d'ES19L. Cependant, msL2 (actuellement annotée comme la protéine hypothétique ECU06_1135) et msL1 ont des origines structurelles et évolutives différentes. Cette découverte de la génération de protéines ribosomiques msL1 et msL2, sans lien de parenté évolutif, suggère que si les ribosomes accumulent des mutations néfastes dans leur ARNr, ils peuvent atteindre des niveaux de diversité compositionnelle sans précédent, même chez un petit sous-ensemble d'espèces étroitement apparentées. Cette découverte pourrait contribuer à clarifier l'origine et l'évolution du ribosome mitochondrial, connu pour son ARNr fortement réduit et la variabilité anormale de sa composition protéique selon les espèces.
Nous avons ensuite comparé la protéine msL2 à la protéine msL1, précédemment décrite, seule protéine ribosomique connue spécifique aux microsporidies et présente dans le ribosome de V. necatrix. Nous souhaitions vérifier si msL1 et msL2 sont liées évolutivement. Notre analyse a montré que msL1 et msL2 occupent la même cavité dans la structure ribosomique, mais présentent des structures primaires et tertiaires différentes, ce qui indique leur origine évolutive indépendante (Fig. 6). Ainsi, notre découverte de msL2 prouve que des groupes d'espèces eucaryotes compactes peuvent développer indépendamment des protéines ribosomiques structurellement distinctes pour compenser la perte de fragments d'ARNr. Cette découverte est remarquable dans la mesure où la plupart des ribosomes eucaryotes cytoplasmiques contiennent une protéine invariante, incluant la même famille de 81 protéines ribosomiques. L'apparition de msL1 et msL2 dans divers clades de microsporidies en réponse à la perte de segments d'ARNr étendus suggère que la dégradation de l'architecture moléculaire du parasite amène les parasites à rechercher des mutations compensatoires, ce qui peut éventuellement conduire à leur acquisition dans différentes populations de parasites. structures.
Enfin, une fois notre modèle terminé, nous avons comparé la composition du ribosome d'E. cuniculi à celle prédite par la séquence du génome. On pensait auparavant que plusieurs protéines ribosomiques, dont eL14, eL38, eL41 et eS30, manquaient au génome d'E. cuniculi en raison de l'absence apparente de leurs homologues. La perte de nombreuses protéines ribosomiques est également prédite chez la plupart des autres parasites intracellulaires et endosymbiotes hautement réduits. Par exemple, bien que la plupart des bactéries libres contiennent la même famille de 54 protéines ribosomiques, seules 11 de ces familles de protéines ont des homologues détectables dans chaque génome analysé de bactéries restreintes à l'hôte. À l'appui de cette hypothèse, une perte de protéines ribosomiques a été observée expérimentalement chez les microsporidies de V. necatrix et P. locustae, dépourvues des protéines eL38 et eL4131,32.
Cependant, nos structures montrent que seuls eL38, eL41 et eS30 sont réellement perdus dans le ribosome d'E. cuniculi. La protéine eL14 a été conservée et notre structure a montré pourquoi cette protéine n'a pas pu être trouvée dans la recherche d'homologie (Fig. 7). Dans les ribosomes d'E. cuniculi, la majeure partie du site de liaison d'eL14 est perdue en raison de la dégradation de l'ES39L amplifié par l'ARNr. En l'absence d'ES39L, eL14 a perdu la majeure partie de sa structure secondaire, et seulement 18 % de la séquence d'eL14 était identique chez E. cuniculi et S. cerevisiae. Cette faible préservation de la séquence est remarquable car même Saccharomyces cerevisiae et Homo sapiens, des organismes qui ont évolué à 1,5 milliard d'années d'intervalle, partagent plus de 51 % des mêmes résidus dans eL14. Cette perte anormale de conservation explique pourquoi E. cuniculi eL14 est actuellement annotée comme la protéine putative M970_061160 et non comme la protéine ribosomique eL1427.
Français et Le ribosome de Microsporidia a perdu l'extension d'ARNr ES39L, ce qui a partiellement éliminé le site de liaison de la protéine ribosomique eL14. En l'absence d'ES39L, la protéine de microspore eL14 subit une perte de structure secondaire, dans laquelle l'ancienne hélice α de liaison à l'ARNr dégénère en une boucle de longueur minimale. b L'alignement de séquences multiples montre que la protéine eL14 est hautement conservée dans les espèces eucaryotes (57 % d'identité de séquence entre la levure et les homologues humains), mais faiblement conservée et divergente dans les microsporidies (dans lesquelles pas plus de 24 % des résidus sont identiques à l'homologue eL14). de S. cerevisiae ou H. sapiens). Cette faible conservation de séquence et cette variabilité de la structure secondaire expliquent pourquoi l'homologue eL14 n'a jamais été trouvé chez E. cuniculi et pourquoi on pense que cette protéine a été perdue chez E. cuniculi. En revanche, E. cuniculi eL14 était précédemment annotée comme une protéine putative M970_061160. Cette observation suggère que la diversité du génome des microsporidies est actuellement surestimée : certains gènes que l'on croyait perdus chez les microsporidies sont en fait préservés, bien que sous des formes très différenciées ; au contraire, certains sont censés coder pour des gènes de microsporidies de protéines spécifiques aux vers (par exemple, la protéine hypothétique M970_061160) qui code en réalité pour des protéines très diverses trouvées chez d'autres eucaryotes.
Cette découverte suggère que la dénaturation de l'ARNr peut entraîner une perte importante de conservation de séquence dans les protéines ribosomiques adjacentes, rendant ces protéines indétectables pour les recherches d'homologie. Ainsi, nous pourrions surestimer le degré réel de dégradation moléculaire chez les organismes à petit génome, puisque certaines protéines que l'on croyait perdues persistent en réalité, bien que sous des formes fortement altérées.
Comment les parasites peuvent-ils conserver la fonction de leurs machines moléculaires dans des conditions de réduction extrême du génome ? Notre étude répond à cette question en décrivant la structure moléculaire complexe (ribosome) d'E. cuniculi, un organisme doté de l'un des plus petits génomes eucaryotes.
On sait depuis près de deux décennies que les protéines et les molécules d'ARN des parasites microbiens diffèrent souvent de leurs molécules homologues chez les espèces libres : absence de centres de contrôle de la qualité, taille réduite à 50 % chez les microbes libres, etc., et nombreuses sont les mutations invalidantes qui altèrent le repliement et la fonction. Par exemple, on s'attend à ce que les ribosomes des organismes à petit génome, dont de nombreux parasites intracellulaires et endosymbiotes, soient dépourvus de plusieurs protéines ribosomiques et d'un tiers des nucléotides d'ARNr par rapport aux espèces libres 27, 29, 30, 49. Cependant, le fonctionnement de ces molécules chez les parasites reste largement un mystère, étudié principalement par la génomique comparative.
Notre étude montre que la structure des macromolécules peut révéler de nombreux aspects de l'évolution difficiles à extraire des études génomiques comparatives traditionnelles des parasites intracellulaires et d'autres organismes restreints à un hôte (Figure supplémentaire 7). Par exemple, l'exemple de la protéine eL14 montre que nous pouvons surestimer le degré réel de dégradation de l'appareil moléculaire chez les espèces parasitaires. On pense aujourd'hui que les parasites encéphalitiques possèdent des centaines de gènes spécifiques aux microsporidies. Cependant, nos résultats montrent que certains de ces gènes apparemment spécifiques ne sont en réalité que des variantes très différentes de gènes communs à d'autres eucaryotes. De plus, l'exemple de la protéine msL2 montre comment nous négligeons les nouvelles protéines ribosomiques et sous-estimons le contenu des machines moléculaires parasitaires. L'exemple des petites molécules montre comment nous pouvons négliger les innovations les plus ingénieuses dans les structures moléculaires parasitaires, susceptibles de leur conférer une nouvelle activité biologique.
Pris ensemble, ces résultats améliorent notre compréhension des différences entre les structures moléculaires des organismes restreints à leur hôte et celles de leurs homologues des organismes libres. Nous montrons que les machines moléculaires, longtemps considérées comme réduites, dégénérées et sujettes à diverses mutations invalidantes, présentent en réalité un ensemble de caractéristiques structurelles inhabituelles systématiquement négligées.
D'autre part, les fragments d'ARNr non volumineux et les fragments fusionnés que nous avons trouvés dans les ribosomes d'E. cuniculi suggèrent que la réduction du génome peut modifier même les parties de la machinerie moléculaire de base qui sont préservées dans les trois domaines de la vie - après presque 3,5 milliards d'années d'évolution indépendante des espèces.
Français Les fragments d'ARNr sans renflement et fusionnés dans les ribosomes d'E. cuniculi présentent un intérêt particulier à la lumière d'études antérieures sur les molécules d'ARN chez les bactéries endosymbiotiques. Par exemple, chez l'endosymbiote du puceron Buchnera aphidicola, il a été démontré que les molécules d'ARNr et d'ARNt ont des structures sensibles à la température en raison d'un biais de composition A+T et d'une forte proportion de paires de bases non canoniques20,50. Ces changements dans l'ARN, ainsi que les changements dans les molécules de protéines, sont maintenant considérés comme responsables de la dépendance excessive des endosymbiotes à leurs partenaires et de l'incapacité des endosymbiotes à transférer la chaleur21, 23. Bien que l'ARNr des microsporidies parasitaires présente des changements structurels distincts, la nature de ces changements suggère qu'une stabilité thermique réduite et une dépendance accrue aux protéines chaperonnes pourraient être des caractéristiques communes des molécules d'ARN dans les organismes à génomes réduits.
D'autre part, nos structures montrent que les microsporidies parasites ont développé une capacité unique à résister aux fragments d'ARNr et de protéines largement conservés, développant la capacité d'utiliser de petits métabolites abondants et facilement disponibles comme imitateurs structuraux d'ARNr et de fragments de protéines dégénérés. Dégradation de la structure moléculaire. . Cette opinion est étayée par le fait que les petites molécules qui compensent la perte de fragments de protéines dans l'ARNr et les ribosomes d'E. cuniculi se lient à des résidus spécifiques des microsporidies dans les protéines uL15 et eL30. Cela suggère que la liaison de petites molécules aux ribosomes pourrait être le produit d'une sélection positive, dans laquelle des mutations spécifiques des microsporidies dans les protéines ribosomiques ont été sélectionnées pour leur capacité à augmenter l'affinité des ribosomes pour les petites molécules, ce qui pourrait conduire à des organismes ribosomiques plus efficaces. Cette découverte révèle une innovation intelligente dans la structure moléculaire des parasites microbiens et nous permet de mieux comprendre comment les structures moléculaires des parasites maintiennent leur fonction malgré l'évolution réductrice.
À l'heure actuelle, l'identification de ces petites molécules reste floue. On ne sait pas clairement pourquoi l'apparence de ces petites molécules dans la structure ribosomique diffère selon les espèces de microsporidies. En particulier, on ne sait pas clairement pourquoi la liaison aux nucléotides est observée dans les ribosomes d'E. cuniculi et de P. locustae, et pas dans ceux de V. necatrix, malgré la présence du résidu F170 dans les protéines eL20 et K172 de V. necatrix. Cette délétion pourrait être causée par le résidu 43 uL6 (situé à côté de la poche de liaison aux nucléotides), qui est la tyrosine chez V. necatrix et non la thréonine chez E. cuniculi et P. locustae. La chaîne latérale aromatique volumineuse de Tyr43 peut interférer avec la liaison aux nucléotides en raison d'un chevauchement stérique. Alternativement, la suppression apparente des nucléotides peut être due à la faible résolution de l'imagerie cryo-EM, qui entrave la modélisation des fragments ribosomiques de V. necatrix.
D'autre part, nos travaux suggèrent que le processus de dégradation du génome pourrait être une force inventive. En particulier, la structure du ribosome d'E. cuniculi suggère que la perte d'ARNr et de fragments de protéines dans le ribosome des microsporidies crée une pression évolutive favorisant les modifications de la structure du ribosome. Ces variants se produisent loin du site actif du ribosome et semblent contribuer au maintien (ou à la restauration) d'un assemblage optimal du ribosome, qui serait autrement perturbé par une réduction de l'ARNr. Cela suggère qu'une innovation majeure du ribosome des microsporidies semble avoir évolué vers un besoin de limiter la dérive génétique.
Ceci est peut-être mieux illustré par la liaison nucléotidique, qui n'a jamais été observée chez d'autres organismes jusqu'à présent. La présence de résidus de liaison nucléotidique chez les microsporidies typiques, mais pas chez les autres eucaryotes, suggère que les sites de liaison nucléotidique ne sont pas de simples vestiges en attente de disparition, ni le site final de restauration de l'ARNr sous forme de nucléotides individuels. Ce site semble plutôt être une caractéristique utile qui pourrait avoir évolué au cours de plusieurs cycles de sélection positive. Les sites de liaison nucléotidique pourraient être un sous-produit de la sélection naturelle : une fois l'ES39L dégradée, les microsporidies sont contraintes de rechercher une compensation pour restaurer une biogenèse ribosomique optimale en l'absence d'ES39L. Puisque ce nucléotide peut imiter les contacts moléculaires du nucléotide A3186 dans l'ES39L, la molécule nucléotidique devient un élément constitutif du ribosome, dont la liaison est encore améliorée par la mutation de la séquence eL30.
Concernant l'évolution moléculaire des parasites intracellulaires, notre étude montre que les forces de la sélection naturelle darwinienne et de la dérive génétique induite par la dégradation du génome n'opèrent pas en parallèle, mais oscillent. Premièrement, la dérive génétique élimine des caractéristiques importantes des biomolécules, rendant la compensation indispensable. Ce n'est que lorsque les parasites satisferont ce besoin par la sélection naturelle darwinienne que leurs macromolécules auront la possibilité de développer leurs traits les plus impressionnants et innovants. Il est important de noter que l'évolution des sites de liaison des nucléotides dans le ribosome d'E. cuniculi suggère que ce modèle d'évolution moléculaire « perte-gain » non seulement amortit les mutations délétères, mais confère parfois des fonctions entièrement nouvelles aux macromolécules parasitaires.
Cette idée est cohérente avec la théorie de l'équilibre mobile de Sewell Wright, selon laquelle un système strict de sélection naturelle limite la capacité des organismes à innover51,52,53. Cependant, si la dérive génétique perturbe la sélection naturelle, ces dérives peuvent produire des changements qui ne sont pas en eux-mêmes adaptatifs (ni même préjudiciables), mais qui conduisent à d'autres changements qui améliorent la fitness ou initient une nouvelle activité biologique. Notre cadre appuie cette idée en illustrant que le même type de mutation qui réduit le repliement et la fonction d'une biomolécule semble être le principal déclencheur de son amélioration. Conformément au modèle évolutionniste gagnant-gagnant, notre étude montre que la dégradation du génome, traditionnellement considérée comme un processus dégénératif, est également un moteur majeur d'innovation, permettant parfois, et peut-être même souvent, aux macromolécules d'acquérir de nouvelles activités parasitaires. peuvent les utiliser.