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L'évolution des parasites microbiens implique une contre-réaction entre la sélection naturelle, qui entraîne l'amélioration des parasites, et la dérive génétique, qui entraîne la perte de gènes des parasites et l'accumulation de mutations délétères.Ici, afin de comprendre comment cette contre-action se produit à l'échelle d'une seule macromolécule, nous décrivons la structure cryo-EM du ribosome d'Encephalitozoon cuniculi, un organisme eucaryote avec l'un des plus petits génomes de la nature.La réduction extrême de l'ARNr dans les ribosomes d'E. cuniculi s'accompagne de changements structurels sans précédent, tels que l'évolution de lieurs d'ARNr fusionnés jusqu'alors inconnus et d'ARNr sans renflements.De plus, le ribosome d'E. cuniculi a survécu à la perte de fragments d'ARNr et de protéines en développant la capacité d'utiliser de petites molécules comme imitateurs structurels de fragments d'ARNr et de protéines dégradés.Dans l'ensemble, nous montrons que les structures moléculaires longtemps considérées comme réduites, dégénérées et sujettes à des mutations débilitantes ont un certain nombre de mécanismes compensatoires qui les maintiennent actives malgré des contractions moléculaires extrêmes.
Étant donné que la plupart des groupes de parasites microbiens disposent d'outils moléculaires uniques pour exploiter leurs hôtes, nous devons souvent développer différentes thérapies pour différents groupes de parasites1,2.Cependant, de nouvelles preuves suggèrent que certains aspects de l'évolution des parasites sont convergents et largement prévisibles, indiquant une base potentielle pour de larges interventions thérapeutiques sur les parasites microbiens3,4,5,6,7,8,9.
Des travaux antérieurs ont identifié une tendance évolutive commune chez les parasites microbiens appelée réduction du génome ou décomposition du génome10,11,12,13.Les recherches actuelles montrent que lorsque les micro-organismes abandonnent leur mode de vie libre et deviennent des parasites intracellulaires (ou endosymbiontes), leurs génomes subissent des métamorphoses lentes mais étonnantes sur des millions d'années9,11.Dans un processus connu sous le nom de décomposition du génome, les parasites microbiens accumulent des mutations délétères qui transforment de nombreux gènes auparavant importants en pseudogènes, entraînant une perte progressive de gènes et un effondrement mutationnel14,15.Cet effondrement peut détruire jusqu'à 95% des gènes des organismes intracellulaires les plus anciens par rapport aux espèces libres étroitement apparentées.Ainsi, l'évolution des parasites intracellulaires est un bras de fer entre deux forces opposées : la sélection naturelle darwinienne, conduisant à l'amélioration des parasites, et l'effondrement du génome, jetant les parasites dans l'oubli.Comment le parasite a réussi à sortir de ce bras de fer et à conserver l'activité de sa structure moléculaire reste incertain.
Bien que le mécanisme de la dégradation du génome ne soit pas entièrement compris, il semble se produire principalement en raison d'une dérive génétique fréquente.Parce que les parasites vivent dans de petites populations asexuées et génétiquement limitées, ils ne peuvent pas éliminer efficacement les mutations délétères qui se produisent parfois lors de la réplication de l'ADN.Cela conduit à une accumulation irréversible de mutations nuisibles et à une réduction du génome du parasite.De ce fait, le parasite ne perd pas seulement des gènes qui ne sont plus nécessaires à sa survie dans le milieu intracellulaire.C'est l'incapacité des populations de parasites à éliminer efficacement les mutations délétères sporadiques qui provoque l'accumulation de ces mutations dans tout le génome, y compris leurs gènes les plus importants.
Une grande partie de notre compréhension actuelle de la réduction du génome est basée uniquement sur des comparaisons de séquences génomiques, avec moins d'attention aux changements dans les molécules réelles qui remplissent des fonctions d'entretien et servent de cibles potentielles pour les médicaments.Des études comparatives ont montré que le fardeau des mutations microbiennes intracellulaires délétères semble prédisposer les protéines et les acides nucléiques à se replier et à s'agréger, les rendant plus dépendants des chaperons et hypersensibles à la chaleur19,20,21,22,23.De plus, divers parasites - évolution indépendante parfois séparée par pas moins de 2,5 milliards d'années - ont connu une perte similaire de centres de contrôle de la qualité dans leurs mécanismes de synthèse protéique5,6 et de réparation de l'ADN24.Cependant, on sait peu de choses sur l'impact du mode de vie intracellulaire sur toutes les autres propriétés des macromolécules cellulaires, y compris l'adaptation moléculaire à un fardeau croissant de mutations délétères.
Dans ce travail, afin de mieux comprendre l'évolution des protéines et des acides nucléiques des microorganismes intracellulaires, nous avons déterminé la structure des ribosomes du parasite intracellulaire Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi est un organisme ressemblant à un champignon appartenant à un groupe de microsporidies parasites qui ont des génomes eucaryotes inhabituellement petits et sont donc utilisés comme organismes modèles pour étudier la dégradation du génome25,26,27,28,29,30.Récemment, la structure du ribosome cryo-EM a été déterminée pour des génomes modérément réduits de Microsporidia, Paranosema locustae et Vairimorpha necatrix31,32 (génome ~ 3,2 Mb).Ces structures suggèrent qu'une certaine perte d'amplification de l'ARNr est compensée par le développement de nouveaux contacts entre protéines ribosomiques voisines ou l'acquisition de nouvelles protéines ribosomiques msL131,32.Les espèces Encephalitozoon (génome ~ 2,5 millions de pb), ainsi que leur plus proche parent Ordospora, démontrent le degré ultime de réduction du génome chez les eucaryotes - ils ont moins de 2000 gènes codant pour les protéines, et on s'attend à ce que leurs ribosomes ne soient pas seulement dépourvus de fragments d'expansion d'ARNr (fragments d'ARNr qui distinguent les ribosomes eucaryotes des ribosomes bactériens) ont également quatre protéines ribosomiques en raison de leur manque d'homologues dans le génome d'E. cuniculi26,27,28.Par conséquent, nous avons conclu que le ribosome d'E. cuniculi peut révéler des stratégies jusque-là inconnues d'adaptation moléculaire à la dégradation du génome.
Notre structure cryo-EM représente le plus petit ribosome cytoplasmique eucaryote à caractériser et donne un aperçu de la façon dont le degré ultime de réduction du génome affecte la structure, l'assemblage et l'évolution de la machinerie moléculaire qui fait partie intégrante de la cellule.Nous avons constaté que le ribosome d'E. cuniculi viole bon nombre des principes largement conservés du repliement de l'ARN et de l'assemblage des ribosomes, et avons découvert une nouvelle protéine ribosomale jusque-là inconnue.De manière tout à fait inattendue, nous montrons que les ribosomes de microsporidies ont développé la capacité de se lier à de petites molécules et émettons l'hypothèse que les troncatures de l'ARNr et des protéines déclenchent des innovations évolutives qui pourraient finalement conférer des qualités utiles au ribosome.
Pour améliorer notre compréhension de l'évolution des protéines et des acides nucléiques dans les organismes intracellulaires, nous avons décidé d'isoler des spores d'E. cuniculi à partir de cultures de cellules de mammifères infectées afin de purifier leurs ribosomes et de déterminer la structure de ces ribosomes.Il est difficile d'obtenir un grand nombre de microsporidies parasites car les microsporidies ne peuvent pas être cultivées en milieu nutritif.Au lieu de cela, ils se développent et se reproduisent uniquement à l'intérieur de la cellule hôte.Par conséquent, pour obtenir la biomasse d'E. cuniculi pour la purification des ribosomes, nous avons infecté la lignée cellulaire rénale de mammifère RK13 avec des spores d'E. cuniculi et cultivé ces cellules infectées pendant plusieurs semaines pour permettre à E. cuniculi de se développer et de se multiplier.En utilisant une monocouche de cellules infectées d'environ un demi-mètre carré, nous avons pu purifier environ 300 mg de spores de Microsporidia et les utiliser pour isoler des ribosomes.Nous avons ensuite rompu les spores purifiées avec des billes de verre et isolé les ribosomes bruts en utilisant un fractionnement par étapes du polyéthylène glycol des lysats.Cela nous a permis d'obtenir environ 300 µg de ribosomes bruts d'E. cuniculi pour l'analyse structurale.
Nous avons ensuite collecté des images cryo-EM à l'aide des échantillons de ribosomes résultants et traité ces images à l'aide de masques correspondant à la grande sous-unité ribosomale, à la tête de la petite sous-unité et à la petite sous-unité.Au cours de ce processus, nous avons collecté des images d'environ 108 000 particules ribosomiques et calculé des images cryo-EM avec une résolution de 2,7 Å (Figures supplémentaires 1-3).Nous avons ensuite utilisé des images cryoEM pour modéliser l'ARNr, la protéine ribosomique et le facteur d'hibernation Mdf1 associés aux ribosomes d'E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Structure du ribosome d'E. cuniculi en complexe avec le facteur d'hibernation Mdf1 (pdb id 7QEP).b Carte du facteur d'hibernation Mdf1 associé au ribosome d'E. cuniculi.c Carte de structure secondaire comparant l'ARNr récupéré chez les espèces microsporidiennes aux structures ribosomiques connues.Les panneaux montrent l'emplacement des fragments d'ARNr amplifiés (ES) et des sites actifs du ribosome, y compris le site de décodage (DC), la boucle de la sarcinicine (SRL) et le centre de la peptidyl transférase (PTC).d La densité électronique correspondant au centre peptidyl transférase du ribosome d'E. cuniculi suggère que ce site catalytique a la même structure chez le parasite E. cuniculi et ses hôtes, dont H. sapiens.e, f La densité électronique correspondante du centre de décodage (e) et la structure schématique du centre de décodage (f) indiquent que E. cuniculi a des résidus U1491 au lieu de A1491 (numérotation E. coli) chez de nombreux autres eucaryotes.Ce changement suggère qu'E. cuniculi pourrait être sensible aux antibiotiques qui ciblent ce site actif.
Contrairement aux structures précédemment établies des ribosomes de V. necatrix et P. locustae (les deux structures représentent la même famille de microsporidies Nosematidae et sont très similaires les unes aux autres), 31,32 les ribosomes d'E. cuniculi subissent de nombreux processus de fragmentation de l'ARNr et des protéines.Dénaturation supplémentaire (Figures supplémentaires 4-6).Dans l'ARNr, les changements les plus frappants comprenaient la perte complète du fragment d'ARNr 25S amplifié ES12L et la dégénérescence partielle des hélices h39, h41 et H18 (Fig. 1c, Fig. 4 supplémentaire).Parmi les protéines ribosomiques, les changements les plus frappants comprenaient la perte complète de la protéine eS30 et le raccourcissement des protéines eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 et eS7 (Figures supplémentaires 4, 5).
Ainsi, la réduction extrême des génomes des espèces d'Encephalotozoon/Ordospora se reflète dans leur structure ribosomique : les ribosomes d'E. cuniculi subissent la perte la plus spectaculaire de contenu en protéines dans les ribosomes cytoplasmiques eucaryotes soumis à la caractérisation structurelle, et ils n'ont même pas ces ARNr et fragments de protéines qui sont largement conservés non seulement chez les eucaryotes, mais aussi dans les trois domaines de la vie.La structure du ribosome d'E. cuniculi fournit le premier modèle moléculaire de ces changements et révèle des événements évolutifs qui ont été négligés à la fois par la génomique comparative et les études de la structure biomoléculaire intracellulaire (Fig. 7 supplémentaire).Ci-dessous, nous décrivons chacun de ces événements ainsi que leurs origines évolutives probables et leur impact potentiel sur la fonction des ribosomes.
Nous avons ensuite découvert qu'en plus des grandes troncatures d'ARNr, les ribosomes d'E. cuniculi présentaient des variations d'ARNr sur l'un de leurs sites actifs.Bien que le centre peptidyl transférase du ribosome d'E. cuniculi ait la même structure que les autres ribosomes eucaryotes (Fig. 1d), le centre de décodage diffère en raison de la variation de séquence au niveau du nucléotide 1491 (numérotation d'E. coli, Fig. 1e, f).Cette observation est importante car le site de décodage des ribosomes eucaryotes contient typiquement les résidus G1408 et A1491 par rapport aux résidus de type bactérien A1408 et G1491.Cette variation sous-tend la sensibilité différente des ribosomes bactériens et eucaryotes à la famille des aminoglycosides d'antibiotiques ribosomiques et d'autres petites molécules qui ciblent le site de décodage.Au site de décodage du ribosome d'E. cuniculi, le résidu A1491 a été remplacé par U1491, créant potentiellement une interface de liaison unique pour les petites molécules ciblant ce site actif.Le même variant A14901 est également présent dans d'autres microsporidies telles que P. locustae et V. necatrix, ce qui suggère qu'il est répandu parmi les espèces de microsporidies (Fig. 1f).
Étant donné que nos échantillons de ribosomes d'E. cuniculi ont été isolés à partir de spores métaboliquement inactives, nous avons testé la carte cryo-EM d'E. cuniculi pour la liaison des ribosomes précédemment décrite dans des conditions de stress ou de famine.Facteurs d'hibernation 31,32,36,37, 38. Nous avons fait correspondre la structure précédemment établie du ribosome hibernant avec la carte cryo-EM du ribosome d'E. cuniculi.Pour l'amarrage, des ribosomes de S. cerevisiae ont été utilisés en complexe avec le facteur d'hibernation Stm138, des ribosomes de criquet en complexe avec le facteur Lso232 et des ribosomes de V. necatrix en complexe avec les facteurs Mdf1 et Mdf231.Dans le même temps, nous avons trouvé la densité cryo-EM correspondant au facteur de repos Mdf1.Semblable à la liaison de Mdf1 au ribosome de V. necatrix, Mdf1 se lie également au ribosome de E. cuniculi, où il bloque le site E du ribosome, aidant peut-être à rendre les ribosomes disponibles lorsque les spores du parasite deviennent métaboliquement inactives lors de l'inactivation du corps (Figure 2).).
Mdf1 bloque le site E du ribosome, ce qui semble aider à inactiver le ribosome lorsque les spores du parasite deviennent métaboliquement inactives.Dans la structure du ribosome d'E. cuniculi, nous avons constaté que Mdf1 forme un contact jusque-là inconnu avec la tige du ribosome L1, la partie du ribosome qui facilite la libération d'ARNt désacylé du ribosome lors de la synthèse des protéines.Ces contacts suggèrent que Mdf1 se dissocie du ribosome en utilisant le même mécanisme que l'ARNt désacétylé, fournissant une explication possible de la façon dont le ribosome élimine Mdf1 pour réactiver la synthèse des protéines.
Cependant, notre structure a révélé un contact inconnu entre Mdf1 et la jambe du ribosome L1 (la partie du ribosome qui aide à libérer l'ARNt désacylé du ribosome lors de la synthèse des protéines).En particulier, Mdf1 utilise les mêmes contacts que le segment coudé de la molécule d'ARNt désacylé (Fig. 2).Cette modélisation moléculaire jusqu'alors inconnue a montré que Mdf1 se dissocie du ribosome en utilisant le même mécanisme que l'ARNt désacétylé, ce qui explique comment le ribosome supprime ce facteur d'hibernation pour réactiver la synthèse des protéines.
Lors de la construction du modèle d'ARNr, nous avons constaté que le ribosome d'E. cuniculi avait des fragments d'ARNr anormalement repliés, que nous avons appelés ARNr fusionnés (Fig. 3).Dans les ribosomes qui couvrent les trois domaines de la vie, l'ARNr se replie en structures dans lesquelles la plupart des bases de l'ARNr s'apparient et se replient les unes avec les autres ou interagissent avec les protéines ribosomales38,39,40.Cependant, dans les ribosomes d' E. cuniculi , les ARNr semblent violer ce principe de repliement en convertissant certaines de leurs hélices en régions d'ARNr non repliées.
Structure de l'hélice d'ARNr H18 25S chez S. cerevisiae, V. necatrix et E. cuniculi.Typiquement, dans les ribosomes couvrant les trois domaines de la vie, ce lieur s'enroule dans une hélice d'ARN qui contient 24 à 34 résidus.Dans Microsporidia, en revanche, ce lieur d'ARNr est progressivement réduit à deux lieurs riches en uridine simple brin contenant seulement 12 résidus.La plupart de ces résidus sont exposés aux solvants.La figure montre que les microsporidies parasites semblent violer les principes généraux du repliement de l'ARNr, où les bases de l'ARNr sont généralement couplées à d'autres bases ou impliquées dans les interactions ARNr-protéine.Dans les microsporidies, certains fragments d'ARNr prennent un pli défavorable, dans lequel l'ancienne hélice d'ARNr devient un fragment simple brin allongé presque en ligne droite.La présence de ces régions inhabituelles permet à l'ARNr des microsporidies de se lier à des fragments d'ARNr distants en utilisant un nombre minimal de bases d'ARN.
L'exemple le plus frappant de cette transition évolutive peut être observé dans l'hélice d'ARNr H18 25S (Fig. 3).Dans les espèces d'E. coli à l'homme, les bases de cette hélice d'ARNr contiennent 24 à 32 nucléotides, formant une hélice légèrement irrégulière.Dans les structures ribosomiques précédemment identifiées de V. necatrix et P. locustae,31,32 les bases de l'hélice H18 sont partiellement déroulées, mais l'appariement des bases nucléotidiques est préservé.Cependant, dans E. cuniculi, ce fragment d'ARNr devient les lieurs les plus courts 228UUUGU232 et 301UUUUUUUUU307.Contrairement aux fragments d'ARNr typiques, ces lieurs riches en uridine ne s'enroulent pas ou n'établissent pas de contact étendu avec les protéines ribosomiques.Au lieu de cela, ils adoptent des structures ouvertes au solvant et entièrement dépliées dans lesquelles les brins d'ARNr sont étendus presque directement.Cette conformation étirée explique comment E. cuniculi n'utilise que 12 bases d'ARN pour combler l'écart de 33 Å entre les hélices d'ARNr H16 et H18, tandis que d'autres espèces nécessitent au moins deux fois plus de bases d'ARNr pour combler l'écart.
Ainsi, nous pouvons démontrer que, grâce à un repliement énergétiquement défavorable, les microsporidies parasites ont développé une stratégie pour contracter même les segments d'ARNr qui restent largement conservés à travers les espèces dans les trois domaines de la vie.Apparemment, en accumulant des mutations qui transforment les hélices d'ARNr en de courts lieurs poly-U, E. cuniculi peut former des fragments d'ARNr inhabituels contenant le moins de nucléotides possible pour la ligature de fragments d'ARNr distaux.Cela aide à expliquer comment les microsporidies ont obtenu une réduction spectaculaire de leur structure moléculaire de base sans perdre leur intégrité structurelle et fonctionnelle.
Une autre caractéristique inhabituelle de l'ARNr d'E. cuniculi est l'apparition d'ARNr sans épaississement (Fig. 4).Les renflements sont des nucléotides sans paires de bases qui sortent de l'hélice d'ARN au lieu de s'y cacher.La plupart des saillies d'ARNr agissent comme des adhésifs moléculaires, aidant à lier les protéines ribosomiques adjacentes ou d'autres fragments d'ARNr.Certains des renflements agissent comme des charnières, permettant à l'hélice d'ARNr de fléchir et de se replier de manière optimale pour une synthèse protéique productive 41 .
a Une saillie d'ARNr (numérotation de S. cerevisiae) est absente de la structure ribosomale d'E. cuniculi, mais présente chez la plupart des autres eucaryotes b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens et E. cuniculi ribosomes internes.les parasites manquent de nombreux renflements d'ARNr anciens et hautement conservés.Ces épaississements stabilisent la structure du ribosome ;par conséquent, leur absence dans les microsporidies indique une stabilité réduite du repliement de l'ARNr chez les parasites microsporidies.La comparaison avec les tiges P (tiges L7/L12 chez les bactéries) montre que la perte de bosses d'ARNr coïncide parfois avec l'apparition de nouvelles bosses à côté des bosses perdues.L'hélice H42 dans l'ARNr 23S/28S a un renflement ancien (U1206 dans Saccharomyces cerevisiae) estimé à au moins 3,5 milliards d'années en raison de sa protection dans trois domaines de la vie.Dans les microsporidies, ce renflement est éliminé.Cependant, un nouveau renflement est apparu à côté du renflement perdu (A1306 chez E. cuniculi).
De manière frappante, nous avons constaté que les ribosomes d'E. cuniculi sont dépourvus de la plupart des renflements d'ARNr trouvés chez d'autres espèces, y compris plus de 30 renflements conservés chez d'autres eucaryotes (Fig. 4a).Cette perte élimine de nombreux contacts entre les sous-unités ribosomiques et les hélices d'ARNr adjacentes, créant parfois de grands vides creux dans le ribosome, rendant le ribosome d'E. cuniculi plus poreux par rapport aux ribosomes plus traditionnels (Fig. 4b).Notamment, nous avons constaté que la plupart de ces renflements étaient également perdus dans les structures ribosomiques de V. necatrix et P. locustae précédemment identifiées, qui avaient été négligées par les analyses structurelles précédentes31,32.
Parfois, la perte de renflements d'ARNr s'accompagne du développement de nouveaux renflements à côté du renflement perdu.Par exemple, la tige P ribosomique contient un renflement U1208 (chez Saccharomyces cerevisiae) qui a survécu d'E. coli à l'homme et est donc estimé à 3,5 milliards d'années.Au cours de la synthèse des protéines, ce renflement aide la tige P à se déplacer entre les conformations ouvertes et fermées afin que le ribosome puisse recruter des facteurs de traduction et les délivrer au site actif.Dans les ribosomes d'E. cuniculi, cet épaississement est absent ;cependant, un nouvel épaississement (G883) localisé uniquement dans trois paires de bases peut contribuer à la restauration de la flexibilité optimale de la tige P (Fig. 4c).
Nos données sur l'ARNr sans renflements suggèrent que la minimisation de l'ARNr ne se limite pas à la perte d'éléments d'ARNr à la surface du ribosome, mais peut également impliquer le noyau du ribosome, créant un défaut moléculaire spécifique au parasite qui n'a pas été décrit dans les cellules libres.espèces vivantes sont observées.
Après avoir modélisé les protéines ribosomiques canoniques et l'ARNr, nous avons constaté que les composants ribosomiques conventionnels ne peuvent pas expliquer les trois parties de l'image cryo-EM.Deux de ces fragments sont de petites molécules (Fig. 5, Fig. 8 supplémentaire).Le premier segment est pris en sandwich entre les protéines ribosomales uL15 et eL18 dans une position habituellement occupée par l'extrémité C-terminale de eL18, qui est raccourcie chez E. cuniculi.Bien que nous ne puissions déterminer l'identité de cette molécule, la taille et la forme de cet îlot de densité s'expliquent bien par la présence de molécules de spermidine.Sa liaison au ribosome est stabilisée par des mutations spécifiques aux microsporidies dans les protéines uL15 (Asp51 et Arg56), qui semblent augmenter l'affinité du ribosome pour cette petite molécule, car elles permettent à uL15 d'envelopper la petite molécule dans une structure ribosomique.Figure supplémentaire 2).8, données complémentaires 1, 2).
Imagerie Cryo-EM montrant la présence de nucléotides à l'extérieur du ribose liés au ribosome d'E. cuniculi.Dans le ribosome d'E. cuniculi, ce nucléotide occupe la même place que le nucléotide A3186 de l'ARNr 25S (numérotation de Saccharomyces cerevisiae) dans la plupart des autres ribosomes eucaryotes.b Dans la structure ribosomale d'E. cuniculi, ce nucléotide se situe entre les protéines ribosomiques uL9 et eL20, stabilisant ainsi le contact entre les deux protéines.analyse de la conservation de la séquence cd eL20 parmi les espèces de microsporidies.L'arbre phylogénétique des espèces de Microsporidies (c) et l'alignement de séquences multiples de la protéine eL20 (d) montrent que les résidus de liaison aux nucléotides F170 et K172 sont conservés dans la plupart des Microsporidies typiques, à l'exception de S. lophii, à l'exception des Microsporidies à ramification précoce, qui ont conservé l'extension d'ARNr ES39L.e Cette figure montre que les résidus de liaison aux nucléotides F170 et K172 ne sont présents que dans eL20 du génome de microsporidies hautement réduit, mais pas chez les autres eucaryotes.Dans l'ensemble, ces données suggèrent que les ribosomes microsporidiens ont développé un site de liaison nucléotidique qui semble lier les molécules d'AMP et les utiliser pour stabiliser les interactions protéine-protéine dans la structure ribosomique.La conservation élevée de ce site de liaison chez Microsporidia et son absence chez d'autres eucaryotes suggèrent que ce site peut fournir un avantage de survie sélectif pour Microsporidia.Ainsi, la poche de liaison aux nucléotides dans le ribosome des microsporidies ne semble pas être une caractéristique dégénérée ou une forme finale de dégradation de l'ARNr comme décrit précédemment, mais plutôt une innovation évolutive utile qui permet au ribosome des microsporidies de se lier directement à de petites molécules, en les utilisant comme blocs de construction moléculaires.blocs de construction pour les ribosomes.Cette découverte fait du ribosome des microsporidies le seul ribosome connu à utiliser un seul nucléotide comme bloc de construction structurel.f Voie évolutive hypothétique dérivée de la liaison des nucléotides.
La deuxième densité de faible poids moléculaire est située à l'interface entre les protéines ribosomiques uL9 et eL30 (Fig. 5a).Cette interface a été précédemment décrite dans la structure du ribosome de Saccharomyces cerevisiae en tant que site de liaison pour le nucléotide 25S de l'ARNr A3186 (partie de l'extension de l'ARNr ES39L)38.Il a été montré que dans les ribosomes dégénérés de P. locustae ES39L, cette interface se lie à un seul nucléotide inconnu 31, et on suppose que ce nucléotide est une forme finale réduite d'ARNr, dans laquelle la longueur de l'ARNr est d'environ 130 à 230 bases.ES39L est réduit à un seul nucléotide 32.43.Nos images cryo-EM soutiennent l'idée que la densité peut être expliquée par les nucléotides.Cependant, la résolution plus élevée de notre structure a montré que ce nucléotide est une molécule extraribosomique, peut-être AMP (Fig. 5a, b).
Nous avons ensuite demandé si le site de liaison des nucléotides apparaissait dans le ribosome d'E. cuniculi ou s'il existait auparavant.Étant donné que la liaison des nucléotides est principalement médiée par les résidus Phe170 et Lys172 dans la protéine ribosomale eL30, nous avons évalué la conservation de ces résidus chez 4396 eucaryotes représentatifs.Comme dans le cas de uL15 ci-dessus, nous avons constaté que les résidus Phe170 et Lys172 sont hautement conservés uniquement dans les Microsporidia typiques, mais absents chez d'autres eucaryotes, y compris les Microsporidia atypiques Mitosporidium et Amphiamblys, dans lesquels le fragment d'ARNr ES39L n'est pas réduit 44, 45, 46 (Fig. 5c).-e).
Prises ensemble, ces données soutiennent l'idée que E. cuniculi et peut-être d'autres microsporidies canoniques ont développé la capacité de capturer efficacement un grand nombre de petits métabolites dans la structure du ribosome pour compenser la baisse des niveaux d'ARNr et de protéines.Ce faisant, ils ont développé une capacité unique à lier des nucléotides à l'extérieur du ribosome, montrant que les structures moléculaires parasites compensent en capturant de petits métabolites abondants et en les utilisant comme imitateurs structurels d'ARN dégradé et de fragments de protéines..
La troisième partie non simulée de notre carte cryo-EM, trouvée dans la grande sous-unité ribosomique.La résolution relativement élevée (2,6 Å) de notre carte suggère que cette densité appartient à des protéines avec des combinaisons uniques de grands résidus de chaînes latérales, ce qui nous a permis d'identifier cette densité comme une protéine ribosomique jusque-là inconnue que nous avons identifiée sous le nom de msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (méthodes, figure 6).Notre recherche d'homologie a montré que msL2 est conservé dans le clade Microsporidia du genre Encephaliter et Orosporidium, mais absent chez d'autres espèces, y compris d'autres Microsporidia.Dans la structure ribosomale, msL2 occupe un espace formé par la perte de l'ARNr ES31L étendu.Dans ce vide, msL2 aide à stabiliser le repliement de l'ARNr et peut compenser la perte d'ES31L (Figure 6).
a Densité électronique et modèle de la protéine ribosomale msL2 spécifique aux microsporidies trouvée dans les ribosomes d'E. cuniculi.b La plupart des ribosomes eucaryotes, y compris le ribosome 80S de Saccharomyces cerevisiae, ont perdu l'amplification de l'ARNr ES19L chez la plupart des espèces de Microsporidies.La structure précédemment établie du ribosome de V. necatrix microsporidia suggère que la perte d'ES19L chez ces parasites est compensée par l'évolution de la nouvelle protéine ribosomique msL1.Dans cette étude, nous avons constaté que le ribosome d'E. cuniculi développait également une protéine imitant l'ARN ribosomique supplémentaire comme compensation apparente de la perte d'ES19L.Cependant, msL2 (actuellement annotée comme la protéine hypothétique ECU06_1135) et msL1 ont des origines structurelles et évolutives différentes.c Cette découverte de la génération de protéines ribosomiques msL1 et msL2 sans rapport avec l'évolution suggère que si les ribosomes accumulent des mutations nuisibles dans leur ARNr, ils peuvent atteindre des niveaux sans précédent de diversité de composition même dans un petit sous-ensemble d'espèces étroitement apparentées.Cette découverte pourrait aider à clarifier l'origine et l'évolution du ribosome mitochondrial, qui est connu pour son ARNr très réduit et sa variabilité anormale dans la composition des protéines d'une espèce à l'autre.
Nous avons ensuite comparé la protéine msL2 avec la protéine msL1 décrite précédemment, la seule protéine ribosomique connue spécifique aux microsporidies trouvée dans le ribosome de V. necatrix.Nous voulions tester si msL1 et msL2 sont évolutivement liés.Notre analyse a montré que msL1 et msL2 occupent la même cavité dans la structure ribosomale, mais ont des structures primaires et tertiaires différentes, ce qui indique leur origine évolutive indépendante (Fig. 6).Ainsi, notre découverte de msL2 fournit la preuve que des groupes d'espèces eucaryotes compactes peuvent développer indépendamment des protéines ribosomiques structurellement distinctes pour compenser la perte de fragments d'ARNr.Cette découverte est remarquable en ce que la plupart des ribosomes eucaryotes cytoplasmiques contiennent une protéine invariante, y compris la même famille de 81 protéines ribosomiques.L'apparition de msL1 et msL2 dans divers clades de microsporidies en réponse à la perte de segments d'ARNr étendus suggère que la dégradation de l'architecture moléculaire du parasite amène les parasites à rechercher des mutations compensatoires, ce qui peut éventuellement conduire à leur acquisition dans différentes populations de parasites.structures.
Enfin, une fois notre modèle terminé, nous avons comparé la composition du ribosome d'E. cuniculi avec celle prédite à partir de la séquence du génome.Plusieurs protéines ribosomales, notamment eL14, eL38, eL41 et eS30, étaient auparavant considérées comme manquantes dans le génome d'E. cuniculi en raison de l'absence apparente de leurs homologues dans le génome d'E. cuniculi.La perte de nombreuses protéines ribosomales est également prédite chez la plupart des autres parasites intracellulaires et endosymbiontes hautement réduits.Par exemple, bien que la plupart des bactéries libres contiennent la même famille de 54 protéines ribosomiques, seules 11 de ces familles de protéines ont des homologues détectables dans chaque génome analysé de bactéries à hôte restreint.À l'appui de cette notion, une perte de protéines ribosomales a été expérimentalement observée dans les microsporidies V. necatrix et P. locustae, qui manquent des protéines eL38 et eL4131,32.
Cependant, nos structures montrent que seuls eL38, eL41 et eS30 sont réellement perdus dans le ribosome d'E. cuniculi.La protéine eL14 a été conservée et notre structure a montré pourquoi cette protéine n'a pas pu être trouvée dans la recherche d'homologie (Fig. 7).Dans les ribosomes d' E. cuniculi , la majeure partie du site de liaison eL14 est perdue en raison de la dégradation de l'ES39L amplifié par l'ARNr.En l'absence d'ES39L, eL14 a perdu la majeure partie de sa structure secondaire et seulement 18 % de la séquence eL14 était identique chez E. cuniculi et S. cerevisiae.Cette mauvaise conservation des séquences est remarquable car même Saccharomyces cerevisiae et Homo sapiens - des organismes qui ont évolué à 1,5 milliard d'années d'intervalle - partagent plus de 51 % des mêmes résidus dans eL14.Cette perte anormale de conservation explique pourquoi E. cuniculi eL14 est actuellement annotée comme la protéine putative M970_061160 et non comme la protéine ribosomique eL1427.
et Le ribosome de Microsporidia a perdu l'extension d'ARNr ES39L, ce qui a partiellement éliminé le site de liaison de la protéine ribosomale eL14.En l'absence d'ES39L, la protéine microspore eL14 subit une perte de structure secondaire, dans laquelle l'ancienne hélice α de liaison à l'ARNr dégénère en une boucle de longueur minimale.b L'alignement de séquences multiples montre que la protéine eL14 est hautement conservée chez les espèces eucaryotes (57 % d'identité de séquence entre la levure et les homologues humains), mais mal conservée et divergente dans les microsporidies (dans lesquelles pas plus de 24 % des résidus sont identiques à l'homologue eL14).de S. cerevisiae ou H. sapiens).Cette mauvaise conservation de la séquence et la variabilité de la structure secondaire expliquent pourquoi l'homologue eL14 n'a jamais été trouvé chez E. cuniculi et pourquoi on pense que cette protéine a été perdue chez E. cuniculi.En revanche, E. cuniculi eL14 était précédemment annotée comme protéine putative M970_061160.Cette observation suggère que la diversité du génome des microsporidies est actuellement surestimée : certains gènes que l'on pense actuellement perdus dans les microsporidies sont en fait conservés, quoique sous des formes très différenciées ;au lieu de cela, on pense que certains codent pour des gènes de microsporidies pour des protéines spécifiques de vers (par exemple, la protéine hypothétique M970_061160) codent en fait pour les protéines très diverses trouvées chez d'autres eucaryotes.
Cette découverte suggère que la dénaturation de l'ARNr peut entraîner une perte dramatique de la conservation de la séquence dans les protéines ribosomiques adjacentes, rendant ces protéines indétectables pour les recherches d'homologie.Ainsi, nous pouvons surestimer le degré réel de dégradation moléculaire dans les organismes à petit génome, puisque certaines protéines que l'on croyait perdues persistent en fait, bien que sous des formes très altérées.
Comment les parasites peuvent-ils conserver la fonction de leurs machines moléculaires dans des conditions de réduction extrême du génome ?Notre étude répond à cette question en décrivant la structure moléculaire complexe (ribosome) d'E. cuniculi, un organisme possédant l'un des plus petits génomes eucaryotes.
On sait depuis près de deux décennies que les molécules de protéines et d'ARN des parasites microbiens diffèrent souvent de leurs molécules homologues chez les espèces libres car elles manquent de centres de contrôle de la qualité, sont réduites à 50 % de leur taille chez les microbes libres, etc. .de nombreuses mutations débilitantes qui altèrent le pliage et la fonction.Par exemple, les ribosomes d'organismes à petit génome, y compris de nombreux parasites intracellulaires et endosymbiontes, devraient manquer de plusieurs protéines ribosomales et jusqu'à un tiers des nucléotides d'ARNr par rapport aux espèces libres 27, 29, 30, 49. Cependant, la façon dont ces molécules fonctionnent dans le parasite reste en grande partie un mystère, étudié principalement par la génomique comparative.
Notre étude montre que la structure des macromolécules peut révéler de nombreux aspects de l'évolution difficiles à extraire des études génomiques comparatives traditionnelles des parasites intracellulaires et d'autres organismes à hôte restreint (Fig. 7 supplémentaire).Par exemple, l'exemple de la protéine eL14 montre que l'on peut surestimer le degré réel de dégradation de l'appareil moléculaire chez les espèces parasitaires.On pense maintenant que les parasites encéphalitiques possèdent des centaines de gènes spécifiques aux microsporidies.Cependant, nos résultats montrent que certains de ces gènes apparemment spécifiques ne sont en réalité que des variantes très différentes de gènes communs à d'autres eucaryotes.De plus, l'exemple de la protéine msL2 montre comment nous négligeons de nouvelles protéines ribosomiques et sous-estimons le contenu des machines moléculaires parasites.L'exemple des petites molécules montre comment on peut passer à côté des innovations les plus ingénieuses dans les structures moléculaires parasites qui peuvent leur conférer une nouvelle activité biologique.
Pris ensemble, ces résultats améliorent notre compréhension des différences entre les structures moléculaires des organismes à hôte restreint et leurs homologues dans les organismes vivant en liberté.Nous montrons que les machines moléculaires, longtemps considérées comme réduites, dégénérées et sujettes à diverses mutations débilitantes, ont plutôt un ensemble de caractéristiques structurelles inhabituelles systématiquement ignorées.
D'autre part, les fragments d'ARNr non volumineux et les fragments fusionnés que nous avons trouvés dans les ribosomes d'E. cuniculi suggèrent que la réduction du génome peut modifier même les parties de la machinerie moléculaire de base qui sont préservées dans les trois domaines de la vie - après près de 3,5 milliards d'années.évolution indépendante des espèces.
Les fragments d'ARNr sans renflement et fusionnés dans les ribosomes d'E. cuniculi présentent un intérêt particulier à la lumière d'études antérieures sur les molécules d'ARN chez les bactéries endosymbiotiques.Par exemple, chez l'endosymbionte puceron Buchnera aphidicola, il a été démontré que les molécules d'ARNr et d'ARNt avaient des structures sensibles à la température en raison du biais de composition A + T et d'une forte proportion de paires de bases non canoniques.On pense maintenant que ces changements dans l'ARN, ainsi que les changements dans les molécules de protéines, sont responsables de la dépendance excessive des endosymbiontes vis-à-vis des partenaires et de l'incapacité des endosymbiontes à transférer de la chaleur 21, 23 .Bien que l'ARNr des microsporidies parasites ait des changements structurellement distincts, la nature de ces changements suggère qu'une stabilité thermique réduite et une dépendance plus élevée aux protéines chaperonnes peuvent être des caractéristiques communes des molécules d'ARN dans les organismes à génomes réduits.
D'autre part, nos structures montrent que les microsporidies parasites ont développé une capacité unique à résister à l'ARNr et aux fragments de protéines largement conservés, développant la capacité d'utiliser de petits métabolites abondants et facilement disponibles comme imitateurs structurels d'ARNr dégénérés et de fragments de protéines.Dégradation de la structure moléculaire..Cette opinion est étayée par le fait que de petites molécules qui compensent la perte de fragments protéiques dans l'ARNr et les ribosomes d'E. cuniculi se lient à des résidus spécifiques aux microsporidies dans les protéines uL15 et eL30.Cela suggère que la liaison de petites molécules aux ribosomes peut être le produit d'une sélection positive, dans laquelle des mutations spécifiques aux microsporidies dans les protéines ribosomiques ont été sélectionnées pour leur capacité à augmenter l'affinité des ribosomes pour les petites molécules, ce qui peut conduire à des organismes ribosomiques plus efficaces.La découverte révèle une innovation intelligente dans la structure moléculaire des parasites microbiens et nous permet de mieux comprendre comment les structures moléculaires des parasites maintiennent leur fonction malgré l'évolution réductrice.
A l'heure actuelle, l'identification de ces petites molécules reste floue.On ne sait pas pourquoi l'apparence de ces petites molécules dans la structure ribosomale diffère entre les espèces de microsporidies.En particulier, on ne sait pas pourquoi la liaison des nucléotides est observée dans les ribosomes de E. cuniculi et P. locustae, et non dans les ribosomes de V. necatrix, malgré la présence du résidu F170 dans les protéines eL20 et K172 de V. necatrix.Cette délétion peut être causée par le résidu 43 uL6 (situé à côté de la poche de liaison des nucléotides), qui est la tyrosine chez V. necatrix et non la thréonine chez E. cuniculi et P. locustae.La chaîne latérale aromatique volumineuse de Tyr43 peut interférer avec la liaison des nucléotides en raison du chevauchement stérique.Alternativement, la suppression apparente des nucléotides peut être due à la faible résolution de l'imagerie cryo-EM, qui entrave la modélisation des fragments ribosomiques de V. necatrix.
D'autre part, nos travaux suggèrent que le processus de décomposition du génome pourrait être une force inventive.En particulier, la structure du ribosome d'E. cuniculi suggère que la perte d'ARNr et de fragments de protéines dans le ribosome des microsporidies crée une pression évolutive qui favorise les modifications de la structure du ribosome.Ces variantes se produisent loin du site actif du ribosome et semblent aider à maintenir (ou à restaurer) un assemblage optimal du ribosome qui serait autrement perturbé par un ARNr réduit.Cela suggère qu'une innovation majeure du ribosome des microsporidies semble avoir évolué vers un besoin de tamponner la dérive des gènes.
Ceci est peut-être mieux illustré par la liaison des nucléotides, qui n'a jamais été observée dans d'autres organismes jusqu'à présent.Le fait que des résidus de liaison aux nucléotides soient présents dans les microsporidies typiques, mais pas chez les autres eucaryotes, suggère que les sites de liaison aux nucléotides ne sont pas simplement des reliques attendant de disparaître, ou le site final pour que l'ARNr soit restauré sous la forme de nucléotides individuels.Au lieu de cela, ce site semble être une fonctionnalité utile qui aurait pu évoluer au cours de plusieurs cycles de sélection positive.Les sites de liaison des nucléotides peuvent être un sous-produit de la sélection naturelle : une fois ES39L dégradé, les microsporidies sont obligées de chercher une compensation pour restaurer une biogenèse optimale des ribosomes en l'absence d'ES39L.Étant donné que ce nucléotide peut imiter les contacts moléculaires du nucléotide A3186 dans ES39L, la molécule nucléotidique devient un bloc de construction du ribosome, dont la liaison est encore améliorée par mutation de la séquence eL30.
En ce qui concerne l'évolution moléculaire des parasites intracellulaires, notre étude montre que les forces de la sélection naturelle darwinienne et de la dérive génétique de la dégradation du génome n'opèrent pas en parallèle, mais oscillent.Premièrement, la dérive génétique élimine des caractéristiques importantes des biomolécules, ce qui rend la compensation absolument nécessaire.Ce n'est que lorsque les parasites satisferont ce besoin grâce à la sélection naturelle darwinienne que leurs macromolécules auront une chance de développer leurs traits les plus impressionnants et les plus innovants.Il est important de noter que l'évolution des sites de liaison des nucléotides dans le ribosome d'E. cuniculi suggère que ce schéma d'évolution moléculaire perte-gain non seulement amortit les mutations délétères, mais confère parfois des fonctions entièrement nouvelles aux macromolécules parasites.
Cette idée est cohérente avec la théorie de l'équilibre mobile de Sewell Wright, qui stipule qu'un système strict de sélection naturelle limite la capacité des organismes à innover51,52,53.Cependant, si la dérive génétique perturbe la sélection naturelle, ces dérives peuvent produire des changements qui ne sont pas en eux-mêmes adaptatifs (ou même préjudiciables) mais conduisent à d'autres changements qui fournissent une meilleure forme physique ou une nouvelle activité biologique.Notre cadre soutient cette idée en illustrant que le même type de mutation qui réduit le pli et la fonction d'une biomolécule semble être le principal déclencheur de son amélioration.Conformément au modèle évolutif gagnant-gagnant, notre étude montre que la dégradation du génome, traditionnellement considérée comme un processus dégénératif, est également un moteur majeur d'innovation, permettant parfois et peut-être même souvent aux macromolécules d'acquérir de nouvelles activités parasitaires.peut les utiliser.