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La barrière hémato-encéphalique et la barrière hémato-encéphalique empêchent les agents biothérapeutiques d'atteindre leurs cibles dans le système nerveux central, entravant ainsi un traitement efficace des maladies neurologiques.Pour découvrir de nouveaux transporteurs cérébraux in vivo, nous avons introduit une bibliothèque de peptides du phage T7 et collecté en série du sang et du liquide céphalo-rachidien (LCR) à l'aide d'un modèle de grande piscine conscient canulé de rats.Des clones de phages spécifiques ont été fortement enrichis en CSF après quatre cycles de sélection.Les tests de peptides candidats individuels ont révélé un enrichissement de plus de 1000 fois dans le LCR.La bioactivité de la délivrance médiée par le peptide au cerveau a été confirmée par une réduction de 40 % du niveau d'amyloïde-β dans le liquide céphalo-rachidien à l'aide d'un inhibiteur peptidique BACE1 lié au nouveau peptide de transit identifié.Ces résultats suggèrent que les peptides identifiés par des méthodes de sélection de phages in vivo peuvent être des véhicules utiles pour la délivrance systémique de macromolécules au cerveau avec un effet thérapeutique.
La recherche sur les thérapies ciblées sur le système nerveux central (SNC) s'est largement concentrée sur l'identification de médicaments et d'agents optimisés qui présentent des propriétés ciblant le SNC, avec moins d'efforts pour découvrir les mécanismes qui entraînent l'administration active de médicaments au cerveau.Cela commence à changer maintenant, car l'administration de médicaments, en particulier de grosses molécules, fait partie intégrante du développement de médicaments neuroscientifiques modernes.L'environnement du système nerveux central est bien protégé par le système de barrière cérébrovasculaire, composé de la barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​et de la barrière hémato-encéphalique (BCBB)1, ce qui rend difficile l'administration de médicaments au cerveau1,2.On estime que presque tous les médicaments à grosses molécules et plus de 98 % des médicaments à petites molécules sont éliminés du cerveau3.C'est pourquoi il est très important d'identifier de nouveaux systèmes de transport cérébral qui permettent une administration efficace et spécifique de médicaments thérapeutiques au SNC 4,5.Cependant, le BBB et le BCSFB présentent également une excellente opportunité pour l'administration de médicaments car ils pénètrent et pénètrent dans toutes les structures du cerveau à travers son système vasculaire étendu.Ainsi, les efforts actuels pour utiliser des méthodes non invasives de délivrance au cerveau sont largement basés sur le mécanisme de transport médié par les récepteurs (PMT) utilisant le récepteur BBB6 endogène.Malgré les progrès clés récents utilisant la voie du récepteur de la transferrine7,8, le développement de nouveaux systèmes d'administration avec des propriétés améliorées est nécessaire.À cette fin, notre objectif était d'identifier des peptides capables de médier le transport du LCR, car ils pourraient en principe être utilisés pour délivrer des macromolécules au SNC ou pour ouvrir de nouvelles voies réceptrices.En particulier, des récepteurs et des transporteurs spécifiques du système cérébrovasculaire (BBB et BSCFB) peuvent servir de cibles potentielles pour la délivrance active et spécifique de médicaments biothérapeutiques.Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un produit de sécrétion du plexus choroïde (CS) et est en contact direct avec le liquide interstitiel du cerveau à travers l'espace sous-arachnoïdien et l'espace ventriculaire4.Récemment, il a été montré que le liquide céphalo-rachidien sous-arachnoïdien diffuse excessivement dans l'interstitium du cerveau9.Nous espérons accéder à l'espace parenchymateux en utilisant cette voie d'afflux sous-arachnoïdienne ou directement par la BHE.Pour y parvenir, nous avons mis en place une stratégie robuste de sélection de phages in vivo qui identifie idéalement les peptides transportés par l'une ou l'autre de ces deux voies distinctes.
Nous décrivons maintenant une méthode de dépistage séquentielle in vivo par affichage de phages avec échantillonnage de LCR couplé à un séquençage à haut débit (HTS) pour surveiller les cycles de sélection initiaux avec la plus grande diversité de bibliothèques.Le dépistage a été effectué sur des rats conscients avec une canule de grande citerne (CM) implantée en permanence pour éviter la contamination du sang.Il est important de noter que cette approche sélectionne à la fois le ciblage cérébral et les peptides ayant une activité de transport à travers la barrière cérébrovasculaire.Nous avons utilisé des phages T7 en raison de leur petite taille (~ 60 nm) 10 et avons suggéré qu'ils conviennent au transport de vésicules permettant le franchissement transcellulaire de la barrière endothéliale et/ou épithéliale-médullaire.Après quatre cycles de panoramique, des populations de phages ont été isolées montrant un fort enrichissement in vivo du LCR et une association de microvaisseaux cérébraux.Surtout, nous avons pu confirmer nos découvertes en démontrant que les meilleurs peptides candidats préférés et synthétisés chimiquement sont capables de transporter la cargaison de protéines dans le liquide céphalo-rachidien.Premièrement, les effets pharmacodynamiques du SNC ont été établis en combinant un peptide de transit leader avec un inhibiteur du peptide BACE1.En plus de démontrer que les stratégies de criblage fonctionnel in vivo peuvent identifier de nouveaux peptides de transport cérébral en tant que transporteurs efficaces de protéines, nous nous attendons à ce que des approches de sélection fonctionnelle similaires deviennent également importantes pour identifier de nouvelles voies de transport cérébral.
Sur la base des unités formant plaque (PFU), après l'étape d'emballage du phage, une bibliothèque de peptides de phage T7 linéaires 12-mères aléatoires avec une diversité d'environ 109 a été conçue et créée (voir Matériels et méthodes).Il est important de noter que nous avons soigneusement analysé cette bibliothèque avant le panoramique in vivo.L'amplification par PCR d'échantillons de bibliothèque de phages à l'aide d'amorces modifiées a généré des amplicons directement applicables à HTS (Fig. 1a supplémentaire).En raison a) des erreurs de séquençage HTS11, b) de l'impact sur la qualité des amorces (NNK) 1-12 et c) de la présence de phages de type sauvage (wt) (inserts de squelette) dans la bibliothèque de secours, une procédure de filtrage de séquence a été mise en œuvre pour extraire uniquement les informations de séquence vérifiées (Fig. 1b supplémentaire).Ces étapes de filtrage s'appliquent à toutes les bibliothèques de séquençage HTS.Pour la bibliothèque standard, un total de 233 868 lectures ont été obtenues, dont 39 % ont satisfait aux critères de filtrage et ont été utilisées pour l'analyse de la bibliothèque et la sélection pour les cycles suivants (Figure supplémentaire 1c – e).Les lectures étaient principalement des multiples de 3 paires de bases de longueur avec un pic à 36 nucléotides (Fig. 1c supplémentaire), confirmant la conception de la bibliothèque (NNK) 1-12.Notamment, environ 11 % des membres de la bibliothèque contenaient un insert PAGISRELVDKL de squelette de type sauvage (wt) à 12 dimensions, et près de la moitié des séquences (49 %) contenaient des insertions ou des délétions.Le HTS de la bibliothèque de la bibliothèque a confirmé la grande diversité des peptides dans la bibliothèque : plus de 81 % des séquences peptidiques n'ont été trouvées qu'une seule fois et seulement 1,5 % se sont produites en ≥ 4 copies (Fig. 2a supplémentaire).Les fréquences des acides aminés (aa) aux 12 positions du répertoire étaient bien corrélées aux fréquences attendues pour le nombre de codons générés par le répertoire NKK dégénéré (Fig. 2b supplémentaire).La fréquence observée des résidus aa codés par ces inserts était bien corrélée à la fréquence calculée (r = 0, 893) (Fig. 2c supplémentaire).La préparation de bibliothèques de phages pour injection comprend les étapes d'amplification et d'élimination de l'endotoxine.Il a déjà été démontré que cela réduisait potentiellement la diversité des bibliothèques de phages12,13.Par conséquent, nous avons séquencé une bibliothèque de phages amplifiée sur plaque qui avait subi une élimination d'endotoxine et l'avons comparée à la bibliothèque d'origine pour estimer la fréquence des AA.Une forte corrélation (r = 0, 995) a été observée entre le pool d'origine et le pool amplifié et purifié (Fig. 2d supplémentaire), indiquant que la compétition entre les clones amplifiés sur des plaques à l'aide du phage T7 n'a pas provoqué de biais majeur.Cette comparaison est basée sur la fréquence des motifs tripeptidiques dans chaque bibliothèque, puisque la diversité des bibliothèques (~ 109) ne peut pas être entièrement capturée même avec HTS.L'analyse de fréquence de aa à chaque position a révélé un léger biais dépendant de la position dans les trois dernières positions du répertoire saisi (Fig. 2e supplémentaire).En conclusion, nous avons conclu que la qualité et la diversité de la bibliothèque étaient acceptables et que seuls des changements mineurs de diversité ont été observés en raison de l'amplification et de la préparation des bibliothèques de phages entre plusieurs cycles de sélection.
L'échantillonnage en série du liquide céphalo-rachidien peut être effectué en implantant chirurgicalement une canule dans le CM de rats conscients pour faciliter l'identification du phage T7 injecté par voie intraveineuse (iv) via la BBB et/ou la BCSFB (Fig. 1a-b).Nous avons utilisé deux bras de sélection indépendants (bras A et B) dans les trois premiers cycles de sélection in vivo (Fig. 1c).Nous avons progressivement augmenté la rigueur de la sélection en diminuant la quantité totale de phages introduits dans les trois premiers tours de sélection.Pour le quatrième cycle de panoramique, nous avons combiné les échantillons des branches A et B et effectué trois sélections indépendantes supplémentaires.Pour étudier les propriétés in vivo des particules de phage T7 dans ce modèle, un phage de type sauvage (insert maître PAGISRELVDKL) a été injecté à des rats via la veine caudale.La récupération des phages du liquide céphalo-rachidien et du sang à différents moments a montré que les phages icosaédriques T7 relativement petits avaient une phase de clairance initiale rapide du compartiment sanguin (Fig. 3 supplémentaire).Sur la base des titres administrés et du volume sanguin des rats, nous avons calculé que seulement environ 1 % en poids.le phage de la dose administrée a été détecté dans le sang 10 minutes après l'injection intraveineuse.Après ce déclin rapide initial, une clairance primaire plus lente a été mesurée avec une demi-vie de 27,7 minutes.Il est important de noter que seuls très peu de phages ont été extraits du compartiment CSF, ce qui indique un faible fond pour la migration des phages de type sauvage dans le compartiment CSF (Fig. 3 supplémentaire).En moyenne, seulement environ 1 x 10-3 % de titres de phage T7 dans le sang et 4 x 10-8 % de phages initialement infusés ont été détectés dans le liquide céphalo-rachidien sur toute la période d'échantillonnage (0-250 min).Notamment, la demi-vie (25,7 min) du phage de type sauvage dans le liquide céphalo-rachidien était similaire à celle observée dans le sang.Ces données démontrent que la barrière séparant le compartiment CSF du sang est intacte chez les rats canulés CM, permettant la sélection in vivo de bibliothèques de phages pour identifier les clones qui sont facilement transportés du sang dans le compartiment CSF.
(a) Mise en place d'une méthode de ré-échantillonnage du liquide céphalo-rachidien (LCR) à partir d'un grand bassin.(b) Schéma montrant l'emplacement cellulaire de la barrière du système nerveux central (SNC) et la stratégie de sélection utilisée pour identifier les peptides qui traversent la barrière hémato-encéphalique (BHE) et la barrière hémato-encéphalique.( c ) Organigramme de dépistage par affichage de phage in vivo.Dans chaque cycle de sélection, des phages (identifiants d'animaux à l'intérieur des flèches) ont été injectés par voie intraveineuse.Deux branches alternatives indépendantes (A, B) sont conservées séparément jusqu'au 4e tour de sélection.Pour les cycles de sélection 3 et 4, chaque clone de phage extrait du CSF a été séquencé manuellement.( d ) Cinétique du phage isolé du sang (cercles rouges) et du liquide céphalo-rachidien (triangles verts) lors du premier cycle de sélection chez deux rats canulés après injection intraveineuse de la bibliothèque de peptides T7 (2 x 1012 phages / animal).Les carrés bleus indiquent la concentration initiale moyenne de phage dans le sang, calculée à partir de la quantité de phage injectée, en tenant compte du volume sanguin total.Les carrés noirs indiquent le point d'intersection de la ligne y extrapolée à partir des concentrations de phages sanguins.(e, f) Présentez la fréquence relative et la distribution de tous les motifs tripeptidiques chevauchants possibles trouvés dans le peptide.Le nombre de motifs trouvés dans 1000 lectures est affiché.Significativement (p < 0,001) les motifs enrichis sont marqués de points rouges.( e ) Diagramme de dispersion de corrélation comparant la fréquence relative du motif tripeptidique de la bibliothèque injectée avec le phage dérivé du sang des animaux # 1.1 et # 1.2.( f ) Diagramme de dispersion de corrélation comparant les fréquences relatives des motifs tripeptidiques de phages animaux n ° 1.1 et n ° 1.2 isolés dans le sang et le liquide céphalo-rachidien.( g, h ) Représentation de la séquence ID du phage enrichi en sang ( g ) par rapport aux bibliothèques injectées et du phage enrichi en LCR ( h ) par rapport au sang après un cycle de sélection in vivo chez les deux animaux.La taille du code à une lettre indique la fréquence à laquelle cet acide aminé se produit à cette position.Vert = polaire, violet = neutre, bleu = basique, rouge = acide et noir = acides aminés hydrophobes.La figure 1a, b a été conçue et réalisée par Eduard Urich.
Nous avons injecté une bibliothèque de peptides phages dans deux rats instrumentaux CM (clades A et B) et isolé le phage du liquide céphalo-rachidien et du sang (Figure 1d).La clairance rapide initiale de la bibliothèque était moins prononcée par rapport au phage de type sauvage.La demi-vie moyenne de la bibliothèque injectée chez les deux animaux était de 24,8 minutes dans le sang, similaire au phage de type sauvage, et de 38,5 minutes dans le LCR.Des échantillons de phages de sang et de liquide céphalo-rachidien de chaque animal ont été soumis à HTS et tous les peptides identifiés ont été analysés pour la présence d'un court motif tripeptidique.Les motifs tripeptidiques ont été choisis car ils fournissent une base minimale pour la formation de la structure et les interactions peptide-protéine14,15.Nous avons trouvé une bonne corrélation dans la distribution des motifs entre la bibliothèque de phages injectée et les clones extraits du sang des deux animaux (Fig. 1e).Les données indiquent que la composition de la bibliothèque n'est que marginalement enrichie dans le compartiment sanguin.Les fréquences d'acides aminés et les séquences consensus ont été analysées plus en détail à chaque position à l'aide d'une adaptation du logiciel Weblogo16.Fait intéressant, nous avons trouvé un fort enrichissement en résidus de glycine sanguine (Fig. 1g).Lorsque le sang a été comparé à des clones sélectionnés à partir de CSF, une forte sélection et une certaine désélection de motifs ont été observées (Fig. 1f), et certains acides aminés étaient préférentiellement présents à des positions prédéterminées dans les 12 membres (Fig. 1h).Notamment, les animaux individuels différaient significativement dans le liquide céphalo-rachidien, alors qu'un enrichissement en glycine sanguine a été observé chez les deux animaux (Fig. 4a – j supplémentaires).Après un filtrage rigoureux des données de séquence dans le liquide céphalo-rachidien des animaux n ° 1.1 et n ° 1.2, un total de 964 et 420 peptides 12-mer uniques ont été obtenus (Fig. 1d – e supplémentaire).Les clones de phage isolés ont été amplifiés et soumis à un second cycle de sélection in vivo.Les phages extraits du deuxième cycle de sélection ont été soumis à HTS chez chaque animal et tous les peptides identifiés ont été utilisés comme entrée dans un programme de reconnaissance de motifs pour analyser l'apparition de motifs tripeptidiques (Fig. 2a, b, ef).Par rapport au premier cycle du phage récupéré à partir du LCR, nous avons observé une sélection et une désélection supplémentaires de nombreux motifs dans le LCR dans les branches A et B (Fig. 2).Un algorithme d'identification de réseau a été appliqué pour déterminer s'ils représentaient différents modèles de séquence cohérente.Une nette similitude a été observée entre les séquences à 12 dimensions récupérées par CSF dans le clade alternatif A (Fig. 2c, d) et le clade B (Fig. 2g, h).L'analyse groupée dans chaque branche a révélé différents profils de sélection pour les peptides 12-mères (Fig. 5c, d supplémentaires) et une augmentation du rapport titre CSF / sang au fil du temps pour les clones groupés après le deuxième tour de sélection par rapport au premier tour de sélection (Fig. 5e supplémentaire).).
Enrichissement de motifs et de peptides dans le liquide céphalo-rachidien par deux cycles successifs de sélection de phage display fonctionnel in vivo.
Tous les phages du liquide céphalo-rachidien récupérés du premier tour de chaque animal (animaux n ° 1.1 et n ° 1.2) ont été regroupés, amplifiés, séquencés par HT et réinjectés ensemble (2 x 1010 phages / animal) 2 rats canulés SM (# 1.1 → #).2.1 et 2.2, 1.2 → 2.3 et 2.4).( a, b, e, f ) Diagrammes de dispersion de corrélation comparant la fréquence relative des motifs tripeptidiques de tous les phages dérivés du CSF lors des premier et deuxième cycles de sélection.Fréquence relative et distribution des motifs représentant tous les tripeptides chevauchants possibles trouvés dans les peptides dans les deux orientations.Le nombre de motifs trouvés dans 1000 lectures est affiché.Les motifs qui ont été significativement (p < 0,001) sélectionnés ou exclus dans l'une des bibliothèques comparées sont mis en évidence par des points rouges.(c, d, g, h) Représentation du logo de la séquence de toutes les séquences longues de 12 acides aminés riches en CSF sur la base des cycles 2 et 1 de la sélection in vivo.La taille du code à une lettre indique la fréquence à laquelle cet acide aminé se produit à cette position.Pour représenter le logo, la fréquence des séquences de CSF extraites d'animaux individuels entre deux cycles de sélection est comparée et les séquences enrichies du deuxième cycle sont affichées : (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 et (h) #1.2–#2.4.Les acides aminés les plus enrichis à une position donnée dans (c, d) animaux no.2.1 et non.2.2 ou (g, h) chez les animaux no.2.3 et non.2.4 sont représentés en couleur.Vert = polaire, violet = neutre, bleu = basique, rouge = acide et noir = acides aminés hydrophobes.
Après le troisième tour de sélection, nous avons identifié 124 séquences peptidiques uniques (# 3.1 et # 3.2) à partir de 332 clones de phages reconstitués dans le CSF isolés de deux animaux (Fig. 6a supplémentaire).La séquence LGSVS (18,7 %) présentait la proportion relative la plus élevée, suivie des inserts de type sauvage PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TLFFSLG (2,2 %) et SARGSWREIVSLS (2,2 %).Au quatrième tour final, nous avons regroupé deux branches sélectionnées indépendamment à partir de trois animaux distincts (Fig. 1c).Sur les 925 clones de phages séquencés récupérés à partir de CSF, au quatrième tour, nous avons trouvé 64 séquences peptidiques uniques (Fig. 6b supplémentaire), parmi lesquelles la proportion relative de phages de type sauvage a chuté à 0, 8%.Les clones de LCR les plus courants au quatrième tour étaient LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) et RLSSVDSDLSGC (3, 2 %).»).La gamme de longueurs des peptides sélectionnés est due aux insertions/délétions de nucléotides ou aux codons d'arrêt prématurés dans les amorces de la bibliothèque lors de l'utilisation de codons dégénérés pour la conception de la bibliothèque NNK.Les codons stop prématurés génèrent des peptides plus courts et sont sélectionnés car ils contiennent le motif aa favorable.Des peptides plus longs peuvent résulter d'insertions/délétions dans les amorces des bibliothèques synthétiques.Cela positionne le codon d'arrêt conçu à l'extérieur du cadre et le lit jusqu'à ce qu'un nouveau codon d'arrêt apparaisse en aval.En général, nous avons calculé les facteurs d'enrichissement pour les quatre cycles de sélection en comparant les données d'entrée avec les données de sortie de l'échantillon.Pour le premier cycle de criblage, nous avons utilisé des titres de phages de type sauvage comme référence de fond non spécifique.Fait intéressant, la sélection négative des phages était très forte dans le premier cycle du LCR, mais pas dans le sang (Fig. 3a), ce qui peut être dû à la faible probabilité de diffusion passive de la plupart des membres de la bibliothèque de peptides dans le compartiment du LCR ou les phages relatifs ont tendance à être plus efficacement retenus ou éliminés de la circulation sanguine que les bactériophages.Cependant, lors du deuxième cycle de panoramique, une forte sélection de phages dans le LCR a été observée dans les deux clades, ce qui suggère que le cycle précédent était enrichi en phages présentant des peptides favorisant l'absorption du LCR (Fig. 3a).Encore une fois, sans enrichissement significatif du sang.Également dans les troisième et quatrième cycles, les clones de phages étaient significativement enrichis en CSF.En comparant la fréquence relative de chaque séquence peptidique unique entre les deux derniers cycles de sélection, nous avons constaté que les séquences étaient encore plus enrichies lors du quatrième cycle de sélection (Fig. 3b).Un total de 931 motifs tripeptidiques ont été extraits des 64 séquences peptidiques uniques en utilisant les deux orientations peptidiques.Les motifs les plus enrichis au quatrième tour ont été examinés de plus près pour leurs profils d'enrichissement à travers tous les tours par rapport à la bibliothèque injectée (seuil : 10 % d'enrichissement) (Fig. 6c supplémentaire).Les modèles généraux de sélection ont montré que la plupart des motifs étudiés ont été enrichis dans tous les cycles précédents des deux branches de sélection.Cependant, certains motifs (par exemple, SGL, VSG, LGS GSV) provenaient principalement du clade alternatif A, tandis que d'autres (par exemple, FGW, RTN, WGF, NTR) étaient enrichis dans le clade alternatif B.
Validation du transport dans le CSF de peptides présentés sur des phages enrichis en CSF et de peptides leaders biotinylés conjugués à des charges utiles de streptavidine.
( a ) Rapports d'enrichissement calculés dans les quatre cycles (R1-R4) sur la base des titres de phage injecté (entrée = I) (PFU) et des titres de phage CSF déterminés (sortie = O).Les facteurs d'enrichissement pour les trois derniers tours (R2-R4) ont été calculés par comparaison avec le tour précédent et le premier tour (R1) avec des données de poids.Les barres vides représentent le liquide céphalo-rachidien, les barres ombrées représentent le plasma.(***p<0,001, basé sur le test t de Student).( b ) Liste des peptides de phage les plus abondants, classés en fonction de leur proportion relative par rapport à tous les phages collectés dans le LCR après le tour 4 de sélection.Les six clones de phages les plus courants sont mis en évidence en couleur, numérotés ainsi que leurs facteurs d'enrichissement entre les tours 3 et 4 de sélection (encarts).( c, d ) Les six clones de phages les plus enrichis, les banques de phages vides et de peptides de phages parentaux du tour 4 ont été analysés individuellement dans un modèle d'échantillonnage de CSF.Des échantillons de LCR et de sang ont été prélevés aux moments indiqués.(c) Des quantités égales de 6 clones de phage candidats (2 x 1010 phages/animaux), de phages vides (#1779) (2 x 1010 phages/animaux) et de bibliothèques de peptides de phage stock (2 x 1012 phages/animaux) Injecter au moins 3 CM est administré à l'animal canulé séparément via la veine caudale.La pharmacocinétique CSF de chaque clone de phage injecté et bibliothèque de peptides de phage au fil du temps est montrée.(d) montre le rapport moyen CSF/sang pour tous les phages récupérés/mL au cours de la période d'échantillonnage.( e ) Quatre peptides leaders synthétiques et un témoin brouillé ont été liés à la biotine à la streptavidine par leur extrémité N-terminale (affichage tétramère) suivi d'une injection (veine caudale iv, 10 mg de streptavidine / kg).Au moins trois rats intubés (N = 3).).Des échantillons de LCR ont été prélevés aux moments indiqués et les concentrations de streptavidine ont été mesurées par ELISA anti-streptavidine dans le LCR (nd = non détecté).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basé sur le test ANOVA).( f ) Comparaison de la séquence d'acides aminés du clone de peptide de phage le plus enrichi # 2002 (violet) avec d'autres clones de peptide de phage sélectionnés du 4ème tour de sélection.Les fragments d'acides aminés identiques et similaires sont codés par couleur.
Parmi tous les phages enrichis au quatrième cycle (Fig. 3b), six clones candidats ont été sélectionnés pour une analyse individuelle plus approfondie dans le modèle d'échantillonnage du LCR.Des quantités égales de bibliothèques de six phages candidats, de phages vides (sans insert) et de peptides prophages ont été injectées dans trois animaux CM canulés, et la pharmacocinétique a été déterminée dans des analyses de LCR (Fig. 3c) et de sang (Fig. 7 supplémentaire).Tous les clones de phage testés ciblaient le compartiment CSF à un niveau 10 à 1000 fois supérieur à celui du phage témoin vide (#1779).Par exemple, les clones #2020 et #2077 avaient des titres de CSF environ 1000 fois plus élevés que le phage témoin.Le profil pharmacocinétique de chaque peptide sélectionné est différent, mais tous ont une capacité élevée de homing CSF.Nous avons observé une diminution constante dans le temps pour les clones #1903 et #2011, tandis que pour les clones #2077, #2002 et #2009, une augmentation au cours des 10 premières minutes pourrait indiquer un transport actif mais doit être vérifiée.Les clones #2020, #2002 et #2077 se sont stabilisés à des niveaux élevés, tandis que la concentration dans le LCR du clone #2009 a lentement diminué après l'augmentation initiale.Nous avons ensuite comparé la fréquence relative de chaque candidat CSF avec sa concentration sanguine (Fig. 3d).La corrélation du titre moyen de chaque candidat CSF avec son titre sanguin à tous les temps d'échantillonnage a montré que trois des six candidats étaient significativement enrichis en CSF sanguin.Fait intéressant, le clone # 2077 a montré une stabilité sanguine plus élevée (Figure 7 supplémentaire).Pour confirmer que les peptides eux-mêmes sont capables de transporter activement des cargaisons autres que des particules de phage dans le compartiment du LCR, nous avons synthétisé quatre peptides leaders dérivés avec de la biotine à l'extrémité N-terminale où les peptides se fixent à la particule de phage.Des peptides biotinylés (nos 2002, 2009, 2020 et 2077) ont été conjugués avec de la streptavidine (SA) pour obtenir des formes multimériques imitant quelque peu la géométrie des phages.Ce format nous a également permis de mesurer l'exposition au SA dans le sang et le liquide céphalo-rachidien en tant que peptides protéiques transportant du fret.Il est important de noter que les données sur les phages pouvaient souvent être reproduites lorsque des peptides synthétiques étaient administrés dans ce format conjugué à SA (Fig. 3e).Les peptides brouillés avaient moins d'exposition initiale et une clairance plus rapide du LCR avec des niveaux indétectables dans les 48 heures.Pour mieux comprendre les voies de livraison de ces clones de phages peptidiques dans l'espace CSF, nous avons analysé la localisation des hits de peptides de phages individuels en utilisant l'immunohistochimie (IHC) pour détecter directement les particules de phage 1 heure après l'injection intraveineuse in vivo.Notamment, les clones #2002, #2077 et #2009 ont pu être détectés par une forte coloration dans les capillaires cérébraux, tandis que le phage témoin (#1779) et le clone #2020 n'ont pas été détectés (Figure 8 supplémentaire).Ceci suggère que ces peptides contribuent à l'effet sur le cerveau précisément en traversant la BHE.Une analyse plus détaillée est nécessaire pour tester cette hypothèse, car la voie BSCFB peut également être impliquée.Lors de la comparaison de la séquence d'acides aminés du clone le plus enrichi (# 2002) avec d'autres peptides sélectionnés, il a été noté que certains d'entre eux avaient des extensions d'acides aminés similaires, ce qui peut indiquer un mécanisme de transport similaire (Fig. 3f).
En raison de son profil plasmatique unique et de l'augmentation significative du CSF au fil du temps, le clone de phage display #2077 a été exploré plus en détail sur une période plus longue de 48 heures et a pu reproduire l'augmentation rapide du CSF observée en association avec des niveaux soutenus de SA (Fig. 4a).En ce qui concerne les autres clones de phages identifiés, # 2077 s'est fortement coloré pour les capillaires cérébraux et a montré une colocalisation significative avec la lectine marqueur capillaire lorsqu'il est vu à une résolution plus élevée et éventuellement une certaine coloration dans l'espace parenchymateux (Figure 4b).Pour déterminer si des effets pharmacologiques à médiation peptidique pouvaient être obtenus dans le SNC, nous avons réalisé une expérience dans laquelle des versions biotinylées de i) le peptide de transit #2077 et ii) le peptide inhibiteur de BACE1 ont été mélangées avec SA à deux rapports différents.Pour une combinaison, nous avons utilisé uniquement l'inhibiteur de peptide BACE1 et pour l'autre, nous avons utilisé un rapport de 1:3 d'inhibiteur de peptide BACE1 au peptide #2077.Les deux échantillons ont été administrés par voie intraveineuse et les taux sanguins et de liquide céphalo-rachidien du peptide bêta-amyloïde 40 (Abeta40) ont été mesurés au fil du temps.Abeta40 a été mesuré dans le LCR car il reflète l'inhibition de BACE1 dans le parenchyme cérébral.Comme prévu, les deux complexes ont considérablement réduit les taux sanguins d'Abeta40 (Fig. 4c, d).Cependant, seuls les échantillons contenant un mélange de peptide no.2077 et un inhibiteur du peptide BACE1 conjugué à SA ont provoqué une diminution significative d'Abeta40 dans le liquide céphalo-rachidien (Fig. 4c).Les données montrent que le peptide no.2077 est capable de transporter la protéine SA de 60 kDa dans le SNC et induit également des effets pharmacologiques avec des inhibiteurs SA-conjugués du peptide BACE1.
( a ) Injection clonale (2 × 10 phages / animal) de phage T7 montrant des profils pharmacocinétiques à long terme du peptide CSF # 2077 (RLSSVDSDLSGC) et du phage témoin non injecté (# 1779) chez au moins trois rats intubés en CM.( b ) Image microscopique confocale de microvaisseaux corticaux représentatifs chez des rats ayant reçu une injection de phage (2 × 10 10 phages / animal) montrant une contre-coloration du peptide # 2077 et des vaisseaux (lectine).Ces clones de phages ont été administrés à 3 rats et mis en circulation pendant 1 heure avant perfusion.Les cerveaux ont été sectionnés et colorés avec des anticorps polyclonaux marqués au FITC contre la capside du phage T7.Dix minutes avant la perfusion et la fixation ultérieure, la lectine marquée au DyLight594 a été administrée par voie intraveineuse.Images fluorescentes montrant une coloration à la lectine (rouge) du côté luminal des microvaisseaux et des phages (vert) dans la lumière des capillaires et du tissu cérébral périvasculaire.La barre d'échelle correspond à 10 µm.( c, d ) Le peptide inhibiteur de BACE1 biotinylé seul ou en combinaison avec le peptide de transit biotinylé # 2077 a été couplé à la streptavidine, suivi d'une injection intraveineuse d'au moins trois rats CM canulés (10 mg de streptavidine / kg).La réduction de l'Aβ40 médiée par l'inhibiteur du peptide BACE1 a été mesurée par ELISA Aβ1-40 dans le sang (rouge) et le liquide céphalo-rachidien (orange) aux moments indiqués.Pour plus de clarté, une ligne pointillée est tracée sur le graphique à une échelle de 100 %.( c ) Réduction en pourcentage de l'Aβ40 dans le sang (triangles rouges) et le liquide céphalo-rachidien (triangles orange) chez les rats traités avec de la streptavidine conjuguée au peptide de transit # 2077 et au peptide inhibiteur de BACE1 dans un rapport de 3: 1.( d ) Réduction en pourcentage de l'Aβ40 sanguin (cercles rouges) et du liquide céphalo-rachidien (cercles orange) de rats traités avec de la streptavidine couplée à un peptide inhibiteur de BACE1 uniquement.La concentration d'Aß dans le témoin était de 420 pg/ml (écart type = 101 pg/ml).
Le phage display a été appliqué avec succès dans plusieurs domaines de la recherche biomédicale17.Cette méthode a été utilisée pour des études de diversité vasculaire in vivo18,19 ainsi que des études ciblant les vaisseaux cérébraux20,21,22,23,24,25,26.Dans cette étude, nous avons étendu l'application de cette méthode de sélection non seulement à l'identification directe de peptides ciblant les vaisseaux cérébraux, mais également à la découverte de candidats aux propriétés de transport actif pour traverser la barrière hémato-encéphalique.Nous décrivons maintenant le développement d'une procédure de sélection in vivo chez des rats intubés CM et démontrons son potentiel pour identifier des peptides avec des propriétés de homing CSF.En utilisant le phage T7 affichant une bibliothèque de peptides aléatoires 12-mer, nous avons pu démontrer que le phage T7 est suffisamment petit (environ 60 nm de diamètre)10 pour être adapté à la barrière hémato-encéphalique, traversant ainsi directement la barrière hémato-encéphalique ou le plexus choroïde.Nous avons observé que la récolte de CSF à partir de rats CM canulés était une méthode de dépistage fonctionnel in vivo bien contrôlée et que le phage extrait non seulement se liait au système vasculaire, mais fonctionnait également comme un transporteur à travers la barrière hémato-encéphalique.De plus, en collectant du sang et en appliquant simultanément HTS au LCR et aux phages dérivés du sang, nous avons confirmé que notre choix de LCR n'était pas influencé par l'enrichissement sanguin ou l'aptitude à l'expansion entre les cycles de sélection.Cependant, le compartiment sanguin fait partie de la procédure de sélection, car les phages capables d'atteindre le compartiment du LCR doivent survivre et circuler dans la circulation sanguine suffisamment longtemps pour s'enrichir dans le cerveau.Afin d'extraire des informations de séquence fiables à partir de données HTS brutes, nous avons mis en place des filtres adaptés aux erreurs de séquençage spécifiques à la plate-forme dans le flux de travail d'analyse.En incorporant des paramètres cinétiques dans la méthode de dépistage, nous avons confirmé la pharmacocinétique rapide des phages T7 de type sauvage (t½ ~ 28 min) dans le sang24, 27, 28 et également déterminé leur demi-vie dans le liquide céphalo-rachidien (t½ ~ 26 min) par minute).Malgré des profils pharmacocinétiques similaires dans le sang et le LCR, seulement 0,001 % de la concentration sanguine de phage a pu être détectée dans le LCR, indiquant une faible mobilité de fond du phage T7 de type sauvage à travers la barrière hémato-encéphalique.Ce travail met en évidence l'importance du premier cycle de sélection lors de l'utilisation de stratégies de panoramique in vivo, en particulier pour les systèmes de phages qui sont rapidement éliminés de la circulation, car peu de clones sont capables d'atteindre le compartiment du SNC.Ainsi, au premier tour, la réduction de la diversité de la bibliothèque était très importante, car seul un nombre limité de clones a finalement été collecté dans ce modèle de CSF très strict.Cette stratégie de panning in vivo comprenait plusieurs étapes de sélection telles que l'accumulation active dans le compartiment CSF, la survie des clones dans le compartiment sanguin et l'élimination rapide des clones de phages T7 du sang dans les 10 premières minutes (Fig. 1d et Fig. 4M supplémentaire).).Ainsi, après le premier cycle, différents clones de phages ont été identifiés dans le LCR, bien que le même pool initial ait été utilisé pour les animaux individuels.Cela suggère que plusieurs étapes de sélection strictes pour les bibliothèques sources avec un grand nombre de membres de la bibliothèque entraînent une réduction significative de la diversité.Par conséquent, les événements aléatoires feront partie intégrante du processus de sélection initial, influençant grandement le résultat.Il est probable que de nombreux clones de la banque d'origine avaient une propension à l'enrichissement en CSF très similaire.Cependant, même dans les mêmes conditions expérimentales, les résultats de la sélection peuvent différer en raison du petit nombre de chaque clone particulier dans le pool initial.
Les motifs enrichis dans le LCR diffèrent de ceux du sang.Fait intéressant, nous avons noté le premier changement vers des peptides riches en glycine dans le sang d'animaux individuels.(Fig. 1g, Fig. supplémentaires 4e, 4f).Les phages contenant des peptides de glycine peuvent être plus stables et moins susceptibles d'être retirés de la circulation.Cependant, ces peptides riches en glycine n'ont pas été détectés dans les échantillons de liquide céphalo-rachidien, ce qui suggère que les bibliothèques conservées sont passées par deux étapes de sélection différentes : une dans le sang et une autre autorisée à s'accumuler dans le liquide céphalo-rachidien.Les clones enrichis en LCR résultant du quatrième cycle de sélection ont été largement testés.Presque tous les clones testés individuellement ont été confirmés comme étant enrichis en CSF par rapport au phage témoin blanc.Un hit de peptide (#2077) a été examiné plus en détail.Il a montré une demi-vie plasmatique plus longue par rapport aux autres hits (Figure 3d et Figure supplémentaire 7) et, fait intéressant, ce peptide contenait un résidu de cystéine à l'extrémité C-terminale.Il a récemment été montré que l'ajout de cystéine aux peptides peut améliorer leurs propriétés pharmacocinétiques en se liant à l'albumine 29 .Ceci est actuellement inconnu pour le peptide #2077 et nécessite une étude plus approfondie.Certains peptides ont montré une dépendance à la valence dans l'enrichissement du LCR (données non présentées), qui peut être liée à la géométrie de surface affichée de la capside T7.Le système T7 que nous avons utilisé a montré 5 à 15 copies de chaque peptide par particule de phage.L'IHC a été réalisée sur des clones de phages candidats injectés par voie intraveineuse dans le cortex cérébral de rats (Fig. 8 supplémentaire).Les données ont montré qu'au moins trois clones (n° 2002, n° 2009 et n° 2077) interagissaient avec la BHE.Il reste à déterminer si cette interaction BBB entraîne l'accumulation de CSF ou le mouvement de ces clones directement vers le BCSFB.Fait important, nous montrons que les peptides sélectionnés conservent leur capacité de transport dans le LCR lorsqu'ils sont synthétisés et liés à la cargaison protéique.La liaison des peptides biotinylés N-terminaux à SA répète essentiellement les résultats obtenus avec leurs clones de phages respectifs dans le sang et le liquide céphalo-rachidien (Fig. 3e).Enfin, nous montrons que le peptide principal #2077 est capable de favoriser l'action cérébrale d'un inhibiteur peptidique biotinylé de BACE1 conjugué à SA, provoquant des effets pharmacodynamiques prononcés dans le SNC en réduisant significativement les niveaux d'Abeta40 dans le LCR (Fig. 4).Nous n'avons pu identifier aucun homologue dans la base de données en effectuant une recherche d'homologie de séquence peptidique de tous les résultats.Il est important de noter que la taille de la bibliothèque T7 est d'environ 109, tandis que la taille théorique de la bibliothèque pour les 12-mers est de 4 x 1015. Par conséquent, nous n'avons sélectionné qu'une petite fraction de l'espace de diversité de la bibliothèque de peptides 12-mer, ce qui peut signifier que des peptides plus optimisés peuvent être identifiés en évaluant l'espace de séquence adjacent de ces hits identifiés.Hypothétiquement, l'une des raisons pour lesquelles nous n'avons pas trouvé d'homologues naturels de ces peptides pourrait être la désélection au cours de l'évolution pour empêcher l'entrée incontrôlée de certains motifs peptidiques dans le cerveau.
Pris ensemble, nos résultats fournissent une base pour les travaux futurs visant à identifier et caractériser plus en détail les systèmes de transport de la barrière cérébrovasculaire in vivo.La configuration de base de cette méthode est basée sur une stratégie de sélection fonctionnelle qui non seulement identifie les clones avec des propriétés de liaison vasculaire cérébrale, mais comprend également une étape critique dans laquelle les clones réussis ont une activité intrinsèque pour traverser les barrières biologiques in vivo dans le compartiment du SNC.est d'élucider le mécanisme de transport de ces peptides et leur préférence pour se lier à la microvascularisation spécifique de la région cérébrale.Cela pourrait conduire à la découverte de nouvelles voies pour le transport de la BHE et des récepteurs.Nous nous attendons à ce que les peptides identifiés puissent se lier directement aux récepteurs cérébrovasculaires ou aux ligands circulants transportés par la BBB ou la BCSFB.Les vecteurs peptidiques avec une activité de transport CSF découverts dans ce travail seront étudiés plus avant.Nous étudions actuellement la spécificité cérébrale de ces peptides pour leur capacité à traverser la BBB et/ou la BCSFB.Ces nouveaux peptides seront des outils extrêmement précieux pour la découverte potentielle de nouveaux récepteurs ou voies et pour le développement de nouvelles plateformes hautement efficaces pour la livraison de macromolécules, telles que des produits biologiques, au cerveau.
Canuler la grande citerne (CM) en utilisant une modification de la méthode décrite précédemment.Des rats Wistar anesthésiés (200-350 g) ont été montés sur un appareil stéréotaxique et une incision médiane a été pratiquée sur le cuir chevelu rasé et préparé aseptiquement pour exposer le crâne.Percez deux trous dans la zone du châssis supérieur et fixez les vis de fixation dans les trous.Un trou supplémentaire a été percé dans la crête occipitale latérale pour le guidage stéréotaxique d'une canule en acier inoxydable dans le CM.Appliquer du ciment dentaire autour de la canule et fixer avec des vis.Après photopolymérisation et durcissement au ciment, la plaie cutanée a été fermée avec une suture supramide 4/0.Le placement correct de la canule est confirmé par une fuite spontanée de liquide céphalo-rachidien (LCR).Retirez le rat de l'appareil stéréotaxique, recevez des soins postopératoires appropriés et une gestion de la douleur, et laissez-le récupérer pendant au moins une semaine jusqu'à ce que des signes de sang soient observés dans le liquide céphalo-rachidien.Des rats Wistar (Crl:WI/Han) ont été obtenus auprès de Charles River (France).Tous les rats ont été maintenus dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes.Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par l'Office vétérinaire de la ville de Bâle, en Suisse, et ont été réalisées conformément à la licence animale n° 2474 (évaluation du transport actif du cerveau par la mesure des niveaux de candidats thérapeutiques dans le liquide céphalo-rachidien et le cerveau du rat).
Gardez doucement le rat conscient avec la canule CM à la main.Retirer Datura de la canule et recueillir 10 pi de liquide céphalo-rachidien qui coule spontanément.Étant donné que la perméabilité de la canule a finalement été compromise, seuls des échantillons clairs de liquide céphalo-rachidien sans signe de contamination ou de décoloration du sang ont été inclus dans cette étude.En parallèle, environ 10 à 20 μl de sang ont été prélevés d'une petite incision à l'extrémité de la queue dans des tubes avec de l'héparine (Sigma-Aldrich).Le LCR et le sang ont été prélevés à différents moments après l'injection intraveineuse de phage T7.Environ 5 à 10 μl de liquide ont été jetés avant le prélèvement de chaque échantillon de LCR, ce qui correspond au volume mort du cathéter.
Des bibliothèques ont été générées en utilisant le vecteur T7Select 10-3b comme décrit dans le manuel du système T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).En bref, un insert d'ADN 12-mer aléatoire a été synthétisé dans le format suivant :
Le codon NNK a été utilisé pour éviter les doubles codons d'arrêt et la surexpression des acides aminés dans l'insert.N est un rapport équimolaire mélangé manuellement de chaque nucléotide, et K est un rapport équimolaire mélangé manuellement des nucléotides d'adénine et de cytosine.Les régions simple brin ont été converties en ADN double brin par une incubation supplémentaire avec du dNTP (Novagen) et l'enzyme de Klenow (New England Biolabs) dans du tampon de Klenow (New England Biolabs) pendant 3 heures à 37°C.Après la réaction, l'ADN double brin a été récupéré par précipitation à l'EtOH.L'ADN résultant a été digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et HindIII (toutes deux de Roche).L'insert clivé et purifié (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) a ensuite été ligaturé dans le cadre dans un vecteur T7 pré-clivé après l'acide aminé 348 du gène de capside 10B.Les réactions de ligature ont été incubées à 16°C pendant 18 heures avant conditionnement in vitro.L'emballage du phage in vitro a été réalisé conformément aux instructions fournies avec le kit de clonage T7Select 10-3b (Novagen) et la solution d'emballage a été amplifiée une fois pour la lyse en utilisant Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Les lysats ont été centrifugés, titrés et congelés à -80°C sous forme de solution mère de glycérol.
Amplification par PCR directe des régions variables du phage amplifiées dans un bouillon ou une plaque à l'aide d'amorces de fusion propriétaires 454/Roche-amplicon.L'amorce de fusion directe contient des séquences flanquant la région variable (NNK) 12 (spécifique au modèle), l'adaptateur A en titane GS FLX et une séquence clé de bibliothèque à quatre bases (TCAG) (Figure supplémentaire 1a):
L'amorce de fusion inverse contient également de la biotine attachée aux billes de capture et l'adaptateur en titane GS FLX B requis pour l'amplification clonale pendant la PCR en émulsion :
Les amplicons ont ensuite été soumis à un pyroséquençage 454/Roche selon le protocole 454 GS-FLX Titanium.Pour le séquençage Sanger manuel (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), l'ADN du phage T7 a été amplifié par PCR et séquencé avec les paires d'amorces suivantes :
Les inserts des plaques individuelles ont été soumis à une amplification par PCR à l'aide du kit Roche Fast Start DNA Polymerase (selon les instructions du fabricant).Effectuer un démarrage à chaud (10 min à 95 ° C) et 35 cycles de boost (50 s à 95 ° C, 1 min à 50 ° C et 1 min à 72 ° C).
Des phages provenant de bibliothèques, des phages de type sauvage, des phages récupérés du LCR et du sang, ou des clones individuels ont été amplifiés dans Escherichia coli BL5615 dans un bouillon TB (Sigma Aldrich) ou dans des boîtes de 500 cm2 (Thermo Scientific) pendant 4 h à 37°C.Les phages ont été extraits des plaques en rinçant les plaques avec du tampon Tris-EDTA (Fluka Analytical) ou en recueillant les plaques avec des pointes de pipettes stériles.Les phages ont été isolés du surnageant de culture ou du tampon d'extraction avec un cycle de précipitation au polyéthylène glycol (PEG 8000) (Promega) et remis en suspension dans du tampon Tris-EDTA.
Le phage amplifié a été soumis à 2-3 cycles d'élimination d'endotoxines en utilisant des billes d'élimination d'endotoxines (Miltenyi Biotec) avant l'injection intraveineuse (IV) (500 ul/animal).Au premier tour, 2 x 1012 phages ont été introduits ;dans le second, 2 x 1010 phages ;dans les troisième et quatrième tours de sélection, 2 x 109 phages par animal.La teneur en phages dans le LCR et les échantillons de sang prélevés aux points temporels indiqués ont été déterminés par comptage de plaque conformément aux instructions du fabricant (manuel du système T7Select).La sélection des phages a été effectuée par injection intraveineuse de bibliothèques purifiées dans la veine caudale ou par réinjection de phages extraits du LCR du cycle de sélection précédent, et les récoltes suivantes ont été effectuées à 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min et 240 min respectivement des échantillons de LCR et de sang.Au total, quatre cycles de panoramique in vivo ont été effectués au cours desquels les deux branches sélectionnées ont été stockées séparément et analysées au cours des trois premiers cycles de sélection.Tous les inserts de phage extraits du CSF des deux premiers cycles de sélection ont été soumis à un pyroséquençage 454/Roche, tandis que tous les clones extraits du CSF des deux derniers cycles de sélection ont été séquencés manuellement.Tous les phages sanguins du premier cycle de sélection ont également été soumis à un pyroséquençage 454/Roche.Pour l'injection de clones de phages, les phages sélectionnés ont été amplifiés dans E. coli (BL5615) sur des plaques de 500 cm2 à 37°C pendant 4 heures.Des clones sélectionnés individuellement et séquencés manuellement ont été propagés dans du milieu TB.Après extraction des phages, purification et élimination de l'endotoxine (comme décrit ci-dessus), 2 x 1010 phages/animal dans 300 ul ont été injectés par voie intraveineuse dans une veine caudale.
Prétraitement et filtrage qualitatif des données de séquence.Les données brutes 454/Roche ont été converties d'un format de carte de flux standard binaire (sff) en un format lisible par l'homme Pearson (fasta) à l'aide du logiciel du fournisseur.Un traitement supplémentaire de la séquence nucléotidique a été effectué à l'aide de programmes et de scripts C propriétaires (progiciel non publié) comme décrit ci-dessous.L'analyse des données primaires comprend des procédures strictes de filtrage en plusieurs étapes.Pour filtrer les lectures qui ne contenaient pas de séquence d'ADN d'insert 12mer valide, les lectures ont été alignées séquentiellement sur l'étiquette de départ (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), l'étiquette d'arrêt (TAAGCTTGCCGGCCGCACTCGAGTA) et l'insert d'arrière-plan (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) à l'aide du test global de Needleman-Wunsch.alignement permettant jusqu'à 2 incohérences par alignement31.Par conséquent, les lectures sans balises de démarrage et d'arrêt et les lectures contenant des insertions d'arrière-plan, c'est-à-dire des alignements qui dépassent le nombre autorisé de discordances, ont été supprimées de la bibliothèque.En ce qui concerne les lectures restantes, la séquence d'ADN N-mer s'étendant de la marque de départ et se terminant avant la marque d'arrêt a été excisée de la séquence de lecture d'origine et traitée ultérieurement (ci-après dénommée "insert").Après traduction de l'insert, la portion après le premier codon stop à l'extrémité 5' de l'amorce est retirée de l'insert.De plus, les nucléotides conduisant à des codons incomplets à l'extrémité 3' de l'amorce ont également été éliminés.Pour exclure les inserts contenant uniquement des séquences d'arrière-plan, les inserts traduits commençant par le motif d'acides aminés « PAG » ont également été supprimés.Les peptides ayant une longueur post-traductionnelle inférieure à 3 acides aminés ont été retirés de la banque.Enfin, supprimez la redondance dans le pool d'insertions et déterminez la fréquence de chaque insertion unique.Les résultats de cette analyse comprenaient une liste de séquences de nucléotides (inserts) et leurs fréquences (de lecture) (Figures supplémentaires 1c et 2).
Regrouper les inserts d'ADN N-mer par similarité de séquence : pour éliminer les erreurs de séquençage spécifiques à 454/Roche (telles que les problèmes de séquençage des extensions homopolymères) et supprimer les redondances moins importantes, les inserts de séquence d'ADN N-mer préalablement filtrés (inserts) sont triés par similarité.insertions (jusqu'à 2 bases non concordantes autorisées) à l'aide d'un algorithme itératif défini comme suit : les insertions sont d'abord triées par leur fréquence (de la plus élevée à la plus faible), et si elles sont identiques, par leur tri secondaire par longueur (de la plus longue à la plus courte) ).Ainsi, les insertions les plus fréquentes et les plus longues définissent le premier « groupe ».La fréquence de groupe est réglée sur la fréquence clé.Ensuite, chaque insertion restant dans la liste triée a été tentée d'être ajoutée au groupe par alignement Needleman-Wunsch par paires.Si le nombre de discordances, d'insertions ou de suppressions dans un alignement ne dépasse pas un seuil de 2, une insertion est ajoutée au groupe et la fréquence globale du groupe est augmentée de la fréquence à laquelle l'insertion a été ajoutée.Les encarts ajoutés à un groupe sont marqués comme utilisés et exclus du traitement ultérieur.Si la séquence d'insertion ne peut pas être ajoutée à un groupe déjà existant, la séquence d'insertion est utilisée pour créer un nouveau groupe avec la fréquence d'insertion appropriée et marquée comme utilisée.L'itération se termine lorsque chaque séquence d'insertion a soit été utilisée pour former un nouveau groupe, soit peut être incluse dans un groupe déjà existant.Après tout, les inserts groupés constitués de nucléotides sont finalement traduits en séquences peptidiques (bibliothèques de peptides).Le résultat de cette analyse est un ensemble d'insertions et leurs fréquences correspondantes qui composent le nombre de lectures consécutives (Fig. 2 supplémentaire).
Génération de motifs : sur la base d'une liste de peptides uniques, une bibliothèque a été créée contenant tous les modèles d'acides aminés possibles (aa) comme indiqué ci-dessous.Chaque motif possible de longueur 3 a été extrait du peptide et son motif inverse a été ajouté avec une bibliothèque de motifs communs contenant tous les motifs (tripeptides).Des bibliothèques de motifs hautement répétitifs ont été séquencées et la redondance supprimée.Ensuite, pour chaque tripeptide de la bibliothèque de motifs, nous avons vérifié sa présence dans la bibliothèque à l'aide d'outils informatiques.Dans ce cas, la fréquence du peptide contenant le tripeptide motif trouvé est ajoutée et attribuée au motif dans la bibliothèque de motifs ("nombre de motifs").Le résultat de la génération de motifs est un tableau bidimensionnel contenant toutes les occurrences de tripeptides (motifs) et leurs valeurs respectives, qui sont le nombre de lectures de séquençage qui aboutissent au motif correspondant lorsque les lectures sont filtrées, regroupées et traduites.Métriques décrites en détail ci-dessus.
Normalisation du nombre de motifs et nuages ​​de points correspondants : Le nombre de motifs pour chaque échantillon a été normalisé à l'aide de
où ni est le nombre de lectures contenant le sujet i.Ainsi, vi représente la fréquence en pourcentage des lectures (ou peptides) contenant le motif i dans l'échantillon.Les valeurs P pour le nombre non normalisé de motifs ont été calculées à l'aide du test exact de Fisher.Concernant les corrélogrammes du nombre de motifs, les corrélations de Spearman ont été calculées en utilisant le nombre normalisé de motifs avec R.
Pour visualiser le contenu des acides aminés à chaque position dans la bibliothèque de peptides, des logogrammes Web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ont été créés.Tout d'abord, la teneur en acides aminés à chaque position du peptide 12-mer est stockée dans une matrice 20x12.Ensuite, un ensemble de 1000 peptides contenant la même teneur relative en acides aminés à chaque position est généré au format fasta-séquence et fourni en entrée au logo Web 3, qui génère une représentation graphique de la teneur relative en acides aminés à chaque position.pour une banque de peptides donnée.Pour visualiser des ensembles de données multidimensionnels, des cartes thermiques ont été créées à l'aide d'un outil développé en interne dans R (biosHeatmap, un package R encore à paraître).Les dendrogrammes présentés dans les cartes thermiques ont été calculés à l'aide de la méthode de regroupement hiérarchique de Ward avec la métrique de distance euclidienne.Pour l'analyse statistique des données de notation des motifs, les valeurs P pour la notation non normalisée ont été calculées à l'aide du test exact de Fisher.Les valeurs P pour d'autres ensembles de données ont été calculées dans R à l'aide du test t de Student ou de l'ANOVA.
Des clones de phages sélectionnés et des phages sans inserts ont été injectés par voie intraveineuse via la veine caudale (2 x 1010 phages/animal dans 300 μl de PBS).Dix minutes avant la perfusion et la fixation ultérieure, les mêmes animaux ont reçu une injection intraveineuse de 100 ul de lectine marquée au DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minutes après l'injection de phage, les rats ont été perfusés par le cœur avec 50 ml de PBS suivis de 50 ml de PFA/PBS à 4 %.Des échantillons de cerveau ont en outre été fixés pendant une nuit dans du PFA/PBS à 4 % et trempés dans du saccharose à 30 % pendant une nuit à 4 °C.Les échantillons sont congelés instantanément dans le mélange OCT.L'analyse immunohistochimique des échantillons congelés a été réalisée à température ambiante sur des cryosections de 30 µm bloquées avec 1 % de BSA et incubées avec des anticorps polyclonaux marqués au FITC contre le phage T7 (Novus NB 600-376A) à 4 °C.Incuber pendant la nuit.Enfin, les coupes ont été lavées 3 fois avec du PBS et examinées avec un microscope laser confocal (Leica TCS SP5).
Tous les peptides d'une pureté minimale de 98% ont été synthétisés par GenScript USA, biotinylés et lyophilisés.La biotine est liée via un espaceur triple glycine supplémentaire à l'extrémité N-terminale.Vérifiez tous les peptides à l'aide de la spectrométrie de masse.
La streptavidine (Sigma S0677) a été mélangée avec un excès équimolaire de 5 fois de peptide biotinylé, de peptide inhibiteur de BACE1 biotinylé ou d'une combinaison (rapport 3:1) de peptide inhibiteur de BACE1 biotinylé et de peptide inhibiteur de BACE1 dans 5 à 10 % de DMSO/incubé dans du PBS.1 heure à température ambiante avant injection.Des peptides conjugués à la streptavidine ont été injectés par voie intraveineuse à la dose de 10 mg/kg dans l'une des veines caudales de rats à cavité cérébrale.
La concentration des complexes streptavidine-peptide a été évaluée par ELISA.Des plaques de microtitration Nunc Maxisorp (Sigma) ont été revêtues pendant une nuit à 4°C avec 1,5 μg/ml d'anticorps anti-streptavidine de souris (Thermo, MA1-20011).Après blocage (tampon de blocage : 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gélatine, 1 % BSA) à température ambiante pendant 2 heures, laver la plaque avec 0,05 % Tween-20/PBS (tampon de lavage) pendant 3 secondes, des échantillons de CSF et de plasma ont été ajoutés aux puits dilués avec du tampon de blocage (plasma 1:10 000, CSF 1:11 5).La plaque a ensuite été incubée pendant une nuit à 4°C avec un anticorps de détection (1 μg/ml, anti-streptavidine-HRP, Novus NB120-7239).Après trois étapes de lavage, la streptavidine a été détectée par incubation dans une solution de substrat TMB (Roche) pendant jusqu'à 20 min.Après avoir arrêté le développement de la couleur avec 1M H2SO4, mesurer l'absorbance à 450 nm.
La fonction du complexe streptavidine-peptide-inhibiteur de BACE1 a été évaluée par Aβ(1-40) ELISA selon le protocole du fabricant (Wako, 294-64701).En bref, les échantillons de LCR ont été dilués dans un diluant standard (1:23) et incubés pendant une nuit à 4°C dans des plaques à 96 puits recouvertes d'anticorps de capture BNT77.Après cinq étapes de lavage, l'anticorps BA27 conjugué à la HRP a été ajouté et incubé pendant 2 heures à 4°C, suivi de cinq étapes de lavage.Aβ (1–40) a été détecté par incubation dans une solution de TMB pendant 30 minutes à température ambiante.Une fois le développement de la couleur arrêté avec la solution d'arrêt, mesurer l'absorbance à 450 nm.Les échantillons de plasma ont été soumis à une extraction en phase solide avant Aβ(1–40) ELISA.Du plasma a été ajouté à 0,2 % de DEA (Sigma) dans des plaques à 96 puits et incubé à température ambiante pendant 30 minutes.Après avoir successivement lavé les plaques SPE (Oasis, 186000679) avec de l'eau et du méthanol à 100 %, des échantillons de plasma ont été ajoutés aux plaques SPE et tout le liquide a été éliminé.Les échantillons ont été lavés (d'abord avec 5 % de méthanol puis 30 % de méthanol) et élués avec 2 % de NH4OH/90 % de méthanol.Après séchage de l'éluat à 55 ° C pendant 99 min à courant N2 constant, les échantillons ont été réduits dans des diluants standard et Aβ (1–40) a été mesuré comme décrit ci-dessus.
Comment citer cet article : Urich, E. et al.Livraison de cargaison au cerveau à l'aide de peptides de transit identifiés in vivo.la science.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
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