Certains sujets de dépannage LC ne sont jamais obsolètes, car il existe des problèmes dans la pratique LC, même si la technologie de l'instrument s'améliore au fil du temps. Il existe de nombreuses façons dont les problèmes peuvent survenir dans un système LC et se retrouver avec une forme de pic médiocre. Lorsque des problèmes liés à la forme des pics surviennent, une courte liste des causes possibles de ces résultats aide à simplifier notre expérience de dépannage.
C'était amusant d'écrire cette rubrique "Dépannage LC" et de réfléchir à des sujets chaque mois, car certains sujets ne se démodent jamais. Alors que dans le domaine de la recherche en chromatographie, certains sujets ou idées deviennent obsolètes car ils sont remplacés par de nouvelles et meilleures idées, dans le domaine du dépannage, depuis le premier article de dépannage paru dans ce journal (le LC Journal à l'époque) car certains sujets sont toujours d'actualité) en 1983(1). LC) (par exemple, la comparaison relative de notre compréhension de l'effet de la pression sur la rétention [2] Nouvelles avancées) Notre interprétation des résultats LC et comment résoudre les problèmes avec les instruments LC modernes. Pour la troisième partie de cette série, j'ai choisi de me concentrer sur les problèmes liés à la forme ou aux caractéristiques des pics.
Je me retrouve de plus en plus à répondre aux questions de dépannage par "tout est possible". Cette réponse peut sembler facile lorsque l'on considère des observations difficiles à interpréter, mais je la trouve souvent appropriée.Avec de nombreuses causes possibles de mauvaise forme de pic, il est important de garder l'esprit ouvert lorsque l'on considère ce que le problème pourrait être, et d'être en mesure de hiérarchiser les causes potentielles pour commencer nos efforts de dépannage, en se concentrant sur les possibilités les plus courantes, ce point est très important.possible.
Reconnaître qu'il y a un problème signifie souvent reconnaître que ce qui arrive à l'outil est différent de nos attentes, qui sont façonnées par la théorie, les connaissances empiriques et l'expérience (5). La théorie (6) soutient bien l'attente des manuels selon laquelle, dans la plupart des cas, les pics chromatographiques doivent être symétriques et conformes à la forme d'une distribution gaussienne, comme le montre la figure 1a. discuter de quelques exemples spécifiques de situations qui peuvent conduire à ces types de formes.
Parfois, les pics ne sont pas du tout observés dans le chromatogramme où ils sont censés être élués. Le tableau mural ci-dessus indique que l'absence de pic (en supposant que l'échantillon contient réellement l'analyte cible à une concentration qui devrait rendre la réponse du détecteur suffisante pour le voir au-dessus du bruit) est généralement liée à un problème d'instrument ou à des conditions de phase mobile incorrectes (le cas échéant).pics, généralement trop "faibles"). Une courte liste de problèmes potentiels et de solutions dans cette catégorie peut être trouvée dans le tableau I.
Comme mentionné ci-dessus, la question de savoir dans quelle mesure l'élargissement du pic doit être toléré avant d'y prêter attention et d'essayer de le résoudre est un sujet complexe dont je parlerai dans un prochain article. D'après mon expérience, un élargissement significatif du pic s'accompagne souvent d'un changement significatif de la forme du pic, et la traînée des pics est plus fréquente que le pré-pic ou le fractionnement. Cependant, les pics nominalement symétriques sont également élargis, ce qui peut être causé par plusieurs raisons différentes :
Chacun de ces problèmes a été abordé en détail dans les numéros précédents de Dépannage LC, et les lecteurs intéressés par ces sujets peuvent se référer à ces articles précédents pour obtenir des informations sur les causes profondes et les solutions potentielles à ces problèmes.Plus de détails.
La traînée de pics, le frontage de pics et le fractionnement peuvent tous être causés par des phénomènes chimiques ou physiques, et la liste des solutions potentielles à ces problèmes varie considérablement, selon qu'il s'agit d'un problème chimique ou physique. Souvent, en comparant les différents pics d'un chromatogramme, vous pouvez trouver des indices importants sur le coupable. Si tous les pics d'un chromatogramme présentent des formes similaires, la cause n'est probablement pas physique.
Les causes chimiques de la traînée de pic sont trop complexes pour être discutées brièvement ici. Le lecteur intéressé est renvoyé au numéro récent de "Dépannage LC" pour une discussion plus approfondie (10). Cependant, une chose facile à essayer est de réduire la masse de l'analyte injecté et de voir si la forme du pic s'améliore. Si c'est le cas, alors c'est un bon indice que le problème est une "surcharge de masse". même avec des masses plus importantes injectées.
Les lecteurs intéressés par une discussion détaillée des possibilités sont également renvoyés à un autre numéro récent de "Dépannage LC" (11). L'une des causes physiques les plus courantes de la traînée de pic est une mauvaise connexion à un point entre l'injecteur et le détecteur (12). moulé sur un capillaire en acier inoxydable. Après quelques expériences de dépannage initiales, nous avons réalisé que la profondeur de l'orifice dans le stator de la vanne d'injection était beaucoup plus profonde que celle à laquelle nous étions habitués, ce qui entraînait un volume mort important au bas de l'orifice. Ce problème est facilement résolu en remplaçant la boucle d'injection par un autre tube, nous pouvons ajuster la virole à la bonne position pour éliminer le volume mort au bas de l'orifice.
Les fronts de pic tels que ceux illustrés à la Figure 1e peuvent également être causés par des problèmes physiques ou chimiques. Une cause physique courante du bord d'attaque est que le lit de particules de la colonne n'est pas bien tassé ou que les particules se sont réorganisées au fil du temps. retenu par la phase stationnaire (par conséquent, le facteur de rétention) est lié linéairement à la concentration de l'analyte dans la colonne. Chromatographiquement, cela signifie que lorsque la masse d'analyte injectée dans la colonne augmente, le pic devient plus grand, mais pas plus large. provoque une traînée de pic (10), l'avance de pic causée par une rétention non linéaire peut également être diagnostiquée en réduisant la masse d'analyte injectée. Si la forme du pic s'améliore, la méthode doit être modifiée pour ne pas dépasser la qualité d'injection qui provoque le bord d'attaque, ou les conditions chromatographiques doivent être modifiées pour minimiser ce comportement.
Parfois, nous observons ce qui semble être un pic « fractionné », comme illustré à la figure 1f. avec la colonne elle-même. Souvent, l'indice le plus important pour cette décision est de savoir si tous les pics du chromatogramme présentent des formes fractionnées, ou juste un ou deux. S'il n'y en a qu'un ou deux, c'est probablement un problème de co-élution ;si tous les pics sont divisés, il s'agit probablement d'un problème physique, probablement lié à la colonne elle-même.
Les pics divisés liés aux propriétés physiques de la colonne elle-même sont généralement dus à des frittes d'entrée ou de sortie partiellement bloquées, ou à une réorganisation des particules dans la colonne, permettant à la phase mobile de s'écouler plus rapidement que la phase mobile dans certaines zones de la formation du canal de la colonne. dans d'autres régions (11). Une fritte partiellement bouchée peut parfois être éliminée en inversant le flux à travers la colonne ;cependant, d'après mon expérience, il s'agit généralement d'une solution à court terme plutôt qu'à long terme. Ceci est souvent fatal avec les colonnes modernes si les particules se recombinent dans la colonne. À ce stade, il est préférable de remplacer la colonne et de continuer.
Le pic de la figure 1g, également d'un exemple récent dans mon propre laboratoire, indique généralement que le signal est si élevé qu'il a atteint l'extrémité supérieure de la plage de réponse. », rendant le signal très « flou » en apparence et indépendant de la concentration en analyte.Lorsque cela se produit, le problème peut souvent être facilement résolu en réduisant le volume d'injection de l'analyte, en réduisant le volume d'injection, en diluant l'échantillon ou les deux.
À l'école de chromatographie, nous utilisons le signal du détecteur (c'est-à-dire l'axe y du chromatogramme) comme indicateur de la concentration de l'analyte dans l'échantillon. Il semble donc étrange de voir un chromatogramme avec un signal inférieur à zéro, car l'interprétation simple est que cela indique une concentration négative de l'analyte - ce qui n'est bien sûr pas physiquement possible. D'après mon expérience, les pics négatifs sont le plus souvent observés lors de l'utilisation de détecteurs d'absorbance optique (par exemple, UV-vis).
Dans ce cas, un pic négatif signifie simplement que les molécules éluées de la colonne absorbent moins de lumière que la phase mobile elle-même immédiatement avant et après le pic. Cela peut se produire, par exemple, lors de l'utilisation de longueurs d'onde de détection relativement faibles (<230 nm) et d'additifs de phase mobile qui absorbent la majeure partie de la lumière à ces longueurs d'onde. Ces additifs peuvent être des composants solvants de phase mobile tels que le méthanol ou des composants tampons tels que l'acétate ou le formate. pour les éviter en soi (cette méthode est parfois appelée "détection UV indirecte") (13). Cependant, si nous voulons vraiment éviter complètement les pics négatifs, dans le cas de la détection d'absorbance, la meilleure solution est d'utiliser une longueur d'onde de détection différente afin que l'analyte absorbe plus que la phase mobile, ou de modifier la composition de la phase mobile afin qu'ils absorbent moins de lumière que les analytes.
Des pics négatifs peuvent également apparaître lors de l'utilisation de la détection de l'indice de réfraction (RI) lorsque l'indice de réfraction des composants autres que l'analyte dans l'échantillon, comme la matrice de solvant, est différent de l'indice de réfraction de la phase mobile. Cela se produit également avec la détection UV-vis, mais cet effet a tendance à être atténué par rapport à la détection RI. Dans les deux cas, les pics négatifs peuvent être minimisés en faisant correspondre plus étroitement la composition de la matrice de l'échantillon à celle de la phase mobile.
Dans la troisième partie sur le sujet de base du dépannage LC, j'ai discuté des situations dans lesquelles la forme de pic observée diffère de la forme de pic attendue ou normale. Le dépannage efficace de tels problèmes commence par la connaissance des formes de pic attendues (basées sur la théorie ou l'expérience antérieure avec les méthodes existantes), donc les écarts par rapport à ces attentes sont évidents. Les problèmes de forme de pic ont de nombreuses causes potentielles différentes (trop large, queue, bord d'attaque, etc.). ' t saisir toutes les possibilités. Les lecteurs intéressés par une liste plus détaillée des causes et des solutions peuvent se référer au tableau mural « Guide de dépannage LC » du LCGC.
(4) Tableau mural « LC Troubleshooting Guide » du LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF et Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.