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Les saignements incontrôlés sont l'une des principales causes de décès. Une hémostase rapide assure la survie du patient, ce qui constitue une première mesure de secours lors des combats, des accidents de la route et des opérations de réduction de la mortalité. Un échafaudage composite renforcé de fibres nanoporeuses (NFRCS), dérivé d'une composition filmogène hémostatique simple (HFFC) en phase continue, peut déclencher et améliorer l'hémostase. Le développement du NFRCS s'inspire de la conception de l'aile de la libellule. La structure de l'aile de la libellule est composée d'ailes transversales et longitudinales, dont les membranes sont reliées entre elles pour maintenir l'intégrité de la microstructure. Le HFFC recouvre uniformément la surface de la fibre d'un film d'épaisseur nanométrique et relie l'épaisseur de coton (Ct) répartie aléatoirement (phase dispersée) pour former une structure nanoporeuse. La combinaison des phases continue et dispersée réduit le coût du produit de dix fois par rapport aux produits disponibles sur le marché. Les NFRCS modifiés (tampons ou bracelets) peuvent être utilisés dans diverses applications biomédicales. Des études in vivo ont conclu que le Cp NFRCS développé déclenche et améliore le processus de coagulation au site d'application. Grâce à sa structure nanoporeuse, le NFRCS peut moduler le microenvironnement et agir au niveau cellulaire, ce qui améliore la cicatrisation des plaies d'excision.
Les saignements incontrôlés au combat, en peropératoire et en situation d'urgence peuvent constituer une menace sérieuse pour la vie des blessés1. Ces conditions entraînent en outre une augmentation globale des résistances vasculaires périphériques, conduisant à un choc hémorragique. Des mesures appropriées pour contrôler les saignements pendant et après une intervention chirurgicale sont considérées comme potentiellement mortelles2,3. Les lésions des gros vaisseaux entraînent une perte sanguine massive, entraînant un taux de mortalité ≤ 50 % au combat et 31 % pendant une intervention chirurgicale1. Une perte sanguine massive entraîne une diminution du volume corporel, ce qui réduit le débit cardiaque. Une augmentation de la résistance vasculaire périphérique totale et une altération progressive de la microcirculation entraînent une hypoxie des organes de survie. Un choc hémorragique peut survenir si l'état persiste sans intervention efficace1,4,5. D'autres complications incluent la progression de l'hypothermie et de l'acidose métabolique, ainsi qu'un trouble de la coagulation qui entrave le processus de coagulation. Un choc hémorragique sévère est associé à un risque accru de décès6,7,8. En cas de choc de grade III (progressif), la transfusion sanguine est essentielle à la survie du patient, compte tenu de la morbidité et de la mortalité peropératoires et postopératoires. Pour pallier ces situations potentiellement mortelles, nous avons développé un composite nanoporeux renforcé de fibres (NFRCS) utilisant une concentration minimale de polymère (0,5 %) et une combinaison de polymères hémostatiques hydrosolubles.
L'utilisation de fibres de renforcement permet de développer des produits économiques. La disposition aléatoire des fibres rappelle la structure de l'aile d'une libellule, équilibrée par les rayures horizontales et verticales des ailes. Les nervures transversales et longitudinales de l'aile communiquent avec la membrane alaire (Fig. 1). Le NFRCS est constitué de Ct renforcé, constituant un système d'échafaudage offrant une meilleure résistance physique et mécanique (Figure 1). En raison de son prix abordable et de sa qualité de fabrication, les chirurgiens privilégient l'utilisation de fils de coton (Ct) pour les opérations et les pansements. Par conséquent, compte tenu de ses multiples avantages, notamment > 90 % de cellulose cristalline (contribue à l'amélioration de l'activité hémostatique), le Ct a été utilisé comme système squelettique du NFRCS9,10. Par conséquent, compte tenu de ses multiples avantages, notamment > 90 % de cellulose cristalline (contribue à l'amélioration de l'activité hémostatique), le Ct a été utilisé comme système squelettique du NFRCS9,10. Il est vrai que j'ai beaucoup de primes, dans un total de plus de 90 % de cellulite cristallisé (révélé dans le temps) гемостатической активности), Ct utilisé dans le système de squelette NFRCS9,10. Par conséquent, compte tenu de ses nombreux avantages, notamment la présence de > 90 % de cellulose cristalline (impliquée dans une activité hémostatique accrue), le Ct a été utilisé comme système squelettique du NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Par conséquent, compte tenu de ses nombreux avantages, notamment sa teneur en cellulose cristalline supérieure à 90 % (qui contribue à améliorer l’activité hémostatique), le Ct a été utilisé comme échafaudage pour le NFRCS9,10.Le Ct a été enduit superficiellement (formation d'un film nano-épais observée) et interconnecté avec une composition filmogène hémostatique (HFFC). Cette dernière agit comme un matrigel, maintenant ensemble le Ct disposé de manière aléatoire. La conception développée transmet les contraintes au sein de la phase dispersée (fibres de renforcement). Il est difficile d'obtenir des structures nanoporeuses présentant une bonne résistance mécanique avec des concentrations minimales de polymères. De plus, il est complexe de personnaliser différents moules pour différentes applications biomédicales.
La figure présente un schéma de la conception du NFRCS basé sur la structure de l'aile d'une libellule (A). Cette image présente une analogie comparative de la structure de l'aile d'une libellule (les nervures croisées et longitudinales de l'aile sont interconnectées) et une microphotographie en coupe transversale du NFRCS Cp (B). Représentation schématique du NFRCS.
Français Les NFRC ont été développés en utilisant HFFC comme phase continue pour répondre aux limitations ci-dessus. HFFC est composé de divers polymères hémostatiques filmogènes, dont le chitosane (comme polymère hémostatique principal) avec de la méthylcellulose (MC), de l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC 50 cp) et de l'alcool polyvinylique (PVA) (125 kDa) comme polymère de support qui favorise la formation de thrombus. formation. L'ajout de polyvinylpyrrolidine K30 (PVP K30) a amélioré la capacité d'absorption d'humidité du NFRCS. Du polyéthylène glycol 400 (PEG 400) a été ajouté pour améliorer la réticulation du polymère dans les mélanges de polymères liés. Trois compositions hémostatiques HFFC différentes (Cm HFFC, Ch HFFC et Cp HFFC), à savoir le chitosane avec MC (Cm), le chitosane avec HPMC (Ch) et le chitosane avec PVA (Cp), ont été appliquées à Ct. Diverses études de caractérisation in vitro et in vivo ont confirmé l'activité hémostatique et cicatrisante du NFRCS. Les matériaux composites proposés par le NFRCS permettent de personnaliser différentes formes d'échafaudages afin de répondre à des besoins spécifiques.
De plus, le NFRCS peut être transformé en bandage ou en rouleau pour couvrir toute la zone blessée des membres inférieurs et d'autres parties du corps. Spécialement conçu pour les blessures aux membres lors de combats, le NFRCS peut être adapté à un demi-bras ou à une jambe entière (Figure supplémentaire S11). Le NFRCS peut être transformé en bracelet avec de la colle tissulaire, ce qui permet d'arrêter les saignements en cas de blessures graves au poignet suicidaires. Notre objectif principal est de développer un NFRCS contenant le moins de polymère possible, pouvant être distribué à une large population (en dessous du seuil de pauvreté) et pouvant être placé dans une trousse de premiers secours. Simple, efficace et économique, le NFRCS bénéficie aux communautés locales et peut avoir un impact mondial.
Le chitosane (poids moléculaire 80 kDa) et l'amarante ont été achetés auprès de Merck, Inde. L'hydroxypropylméthylcellulose 50 Cp, le polyéthylène glycol 400 et la méthylcellulose ont été achetés auprès de Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. L'alcool polyvinylique (poids moléculaire 125 kDa) (hydrolysé à 87-90 %) a été acheté auprès de National Chemicals, Gujarat. La polyvinylpyrrolidine K30 a été achetée auprès de Molychem, Mumbai, les écouvillons stériles ont été achetés auprès de Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, avec l'eau Milli Q (système de purification d'eau Direct-Q3, Merck, Inde) comme vecteur.
Le NFRCS a été développé par lyophilisation11,12. Toutes les compositions de HFFC (tableau 1) ont été préparées à l'aide d'un agitateur mécanique. Une solution de chitosane à 0,5 % a été préparée en utilisant de l'acide acétique à 1 % dans l'eau, en agitant continuellement à 800 tr/min sur un agitateur mécanique. Le poids exact du polymère chargé indiqué dans le tableau 1 a été ajouté à la solution de chitosane et agité jusqu'à l'obtention d'une solution de polymère limpide. Du PVP K30 et du PEG 400 ont été ajoutés au mélange obtenu dans les quantités indiquées dans le tableau 1, et l'agitation a été poursuivie jusqu'à l'obtention d'une solution de polymère limpide et visqueuse. Le bain de solution de polymère résultant a été soniqué pendant 60 minutes pour éliminer les bulles d'air emprisonnées dans le mélange de polymères. Comme le montre la figure supplémentaire S1(b), le Ct était réparti uniformément dans chaque puits d'une plaque à 6 puits (moule) additionnée de 5 ml de HFFC.
La plaque à six puits a été soniquée pendant 60 minutes afin d'obtenir un mouillage et une distribution uniformes du HFFC dans le réseau Ct. La plaque à six puits a ensuite été congelée à -20 °C pendant 8 à 12 heures. Les plaques congelées ont ensuite été lyophilisées pendant 48 heures afin d'obtenir différentes formulations de NFRCS. La même procédure est utilisée pour produire différentes formes et structures, telles que des tampons, des tampons cylindriques ou toute autre forme pour différentes applications.
Du chitosane (80 kDa) (3 %), pesé avec précision, est dissous dans de l'acide acétique à 1 % à l'aide d'un agitateur magnétique. À la solution de chitosane obtenue, on ajoute 1 % de PEG 400 et on agite pendant 30 minutes. Verser la solution obtenue dans un récipient carré ou rectangulaire et congeler à -80 °C pendant 12 heures. Les échantillons congelés sont lyophilisés pendant 48 heures pour obtenir du Cs13 poreux.
Le NFRCS développé a été soumis à des expériences utilisant la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japon) pour confirmer la compatibilité chimique du chitosane avec d'autres polymères14,15. Les spectres FTIR (largeur de la gamme spectrale de 400 à 4000 cm-1) de tous les échantillons testés ont été obtenus en effectuant 32 balayages.
Le taux d'absorption sanguine (TAS) de toutes les formulations a été évalué selon la méthode décrite par Chen et al. 16, légèrement modifiée. Les NFRK développés pour toutes les compositions ont été séchés dans une étuve à vide à 105 °C pendant une nuit afin d'éliminer le solvant résiduel. 30 mg de NFRCS (poids initial de l'échantillon – W0) et 30 mg de Ct (témoin positif) ont été placés dans des boîtes séparées contenant un prémélange de citrate de sodium à 3,8 %. À intervalles de temps prédéterminés, soit 5, 10, 20, 30, 40 et 60 secondes, les NFRCS ont été retirés et leur surface a été nettoyée du sang non absorbé en plaçant les échantillons sur Ct pendant 30 secondes. Le poids final de sang absorbé par le NFRCS 16 a été pris en compte (W1) à chaque point temporel. Calculer le pourcentage de TAS à l'aide de la formule suivante :
Français Le temps de coagulation sanguine (BCT) a été déterminé comme rapporté par Wang et al. 17 . Le temps nécessaire à la coagulation du sang total (sang de rat prémélangé avec 3,8 % de citrate de sodium) en présence de NFRCS a été calculé comme le BCT de l'échantillon d'essai. Les différents composants du NFRCS (30 mg) ont été placés dans des flacons à bouchon à vis de 10 ml et incubés à 37 °C. Du sang (0,5 ml) a été ajouté au flacon et 0,3 ml de 0,2 M CaCl2 a été ajouté pour activer la coagulation sanguine. Enfin, retournez le flacon toutes les 15 secondes (jusqu'à 180°) jusqu'à la formation d'un caillot ferme. Le BCT de l'échantillon est estimé par le nombre de retournements de flacons17,18. Sur la base du BCT, deux compositions optimales de NFRCS Cm, Ch et Cp ont été sélectionnées pour des études de caractérisation plus poussées.
Français Le BCT des compositions de Ch NFRCS et Cp NFRCS a été déterminé en mettant en œuvre la méthode décrite par Li et al. 19 . Placer 15 x 15 mm2 de Ch NFRCS, Cp NFRCS et Cs (témoin positif) dans des boîtes de Petri séparées (37 °C). Du sang contenant 3,8 % de citrate de sodium a été mélangé avec 0,2 M de CaCl2 dans un rapport volumique de 10:1 pour démarrer le processus de coagulation sanguine. 20 µl d'un mélange de sang de rat 0,2 M de CaCl2 ont été appliqués sur la surface de l'échantillon et placés dans une boîte de Petri vide. Le témoin était du sang versé dans des boîtes de Petri vides sans Ct. À intervalles fixes de 0, 3 et 5 minutes, arrêter la coagulation en ajoutant 10 ml d'eau déionisée (DI) à l'échantillon contenant la boîte sans perturber le caillot. Les érythrocytes non coagulés (érythrocytes) subissent une hémolyse en présence d'eau déionisée et libèrent de l'hémoglobine. L'hémoglobine à différents moments (HA(t)) a été mesurée à 540 nm (hémoglobine λmax) à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis. L'absorption absolue d'hémoglobine (AH(0)) en 0 min de 20 µl de sang dans 10 ml d'eau déionisée a servi de référence. L'absorption relative d'hémoglobine (RHA) du sang coagulé a été calculée à partir du rapport HA(t)/HA(0) en utilisant le même lot de sang.
À l'aide d'un analyseur de texture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, États-Unis), les propriétés adhésives du NFRK aux tissus endommagés ont été déterminées. Une coupelle cylindrique à fond ouvert a été pressée contre l'intérieur de la peau de porc (sans la couche de gras). Les échantillons (NFRCS Ch et NFRCS Cp) ont été appliqués à l'aide d'une canule dans des moules cylindriques pour créer une adhérence à la peau du porc. Après une incubation de 3 minutes à température ambiante (25 °C), la force d'adhérence du NFRCS a été enregistrée à une vitesse constante de 0,5 mm/s.
Français La principale caractéristique des scellants chirurgicaux est d'augmenter la coagulation du sang tout en réduisant la perte de sang. La coagulation sans perte dans la NFRCS a été évaluée à l'aide d'une méthode publiée précédemment avec de légères modifications 19 . Fabriquez un microtube à centrifuger (2 ml) (diamètre intérieur 10 mm) avec un trou de 8 × 5 mm2 sur un côté du tube à centrifuger (représentant une plaie ouverte). Le NFRCS est utilisé pour fermer l'ouverture et du ruban adhésif est utilisé pour sceller les bords extérieurs. Ajoutez 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M au microtube à centrifuger contenant le prémélange de citrate de sodium à 3,8 %. Après 10 minutes, les microtubes à centrifuger ont été retirés des boîtes et l'augmentation de la masse des boîtes a été déterminée en raison de l'écoulement de sang du NFRK (n = 3). La perte de sang Ch NFRCS et Cp NFRCS ont été comparées à Cs.
L'intégrité humide du NFRCS a été déterminée selon la méthode décrite par Mishra et Chaudhary21, avec des modifications mineures. Placer le NFRCS dans un erlenmeyer de 100 ml avec 50 ml d'eau et agiter pendant 60 s sans former de bouchon. Inspection visuelle et priorisation des échantillons pour l'intégrité physique en fonction du prélèvement.
La force de liaison du HFFC au Ct a été étudiée à l'aide de méthodes publiées précédemment, avec des modifications mineures. L'intégrité du revêtement de surface a été évaluée en exposant le NFRK à des ondes acoustiques (stimulus externe) en présence d'eau milliQ (Ct). Les NFRCS Ch NFRCS et Cp NFRCS développés ont été placés dans un bécher rempli d'eau et soniqués pendant 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 et 30 minutes, respectivement. Après séchage, la différence de pourcentage entre le poids initial et final du NFRCS a été utilisée pour calculer le pourcentage de perte de matière (HFFC). La BCT in vitro a également confirmé la force de liaison ou la perte de matériaux de surface. L'efficacité de la liaison du HFFC au Ct assure la coagulation sanguine et un revêtement élastique à la surface du Ct22.
L'homogénéité du NFRCS développé a été déterminée par la méthode BCT d'échantillons (30 mg) prélevés à des emplacements généraux sélectionnés aléatoirement du NFRCS. Suivre la procédure BCT mentionnée précédemment pour déterminer la conformité du NFRCS. La proximité des cinq échantillons assure une couverture de surface uniforme et un dépôt de HFFC dans la maille Ct.
La surface nominale de contact sanguin (NBCA) a été déterminée comme indiqué précédemment, avec quelques modifications. Le sang a été coagulé en serrant 20 µl de sang entre les deux surfaces de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS et Cs. Après une heure, les deux parties du stent ont été séparées et la surface du caillot a été mesurée manuellement. La valeur moyenne de trois répétitions a été considérée comme NBCA NFRCS19.
L'analyse par sorption dynamique de vapeur (DVS) a été utilisée pour évaluer l'efficacité du NFRCS à absorber l'eau de l'environnement extérieur ou du site de la lésion responsable de l'initiation de la coagulation. La DVS évalue ou enregistre l'absorption et la perte de vapeur dans un échantillon par gravimétrie à l'aide d'une balance ultrasensible avec une résolution massique de ± 0,1 µg. Une pression de vapeur partielle (humidité relative) est générée par un régulateur électronique de débit massique autour de l'échantillon en mélangeant des gaz vecteurs saturés et secs. Conformément aux directives de la Pharmacopée européenne, en fonction du pourcentage d’absorption d’humidité par les échantillons, les échantillons ont été classés en 4 catégories (0–0,012 % p/p – non hygroscopique, 0,2–2 % p/p légèrement hygroscopique, 2–15 % modérément hygroscopique et > 15 % très hygroscopique)23. Conformément aux directives de la Pharmacopée européenne, en fonction du pourcentage d'absorption d'humidité par les échantillons, les échantillons ont été classés en 4 catégories (0–0,012 % p/p - non hygroscopique, 0,2–2 % p/p légèrement hygroscopique, 2–15 % modérément hygroscopique et > 15 % très hygroscopique)23.Conformément aux recommandations de la Pharmacopée européenne, en fonction du pourcentage d'absorption d'humidité par les échantillons, les échantillons ont été divisés en 4 catégories (0–0,012 % p/p – non hygroscopique, 0,2–2 % p/p légèrement hygroscopique, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % modérément hygroscopique et > 15 % très hygroscopique)23.0,2 à 2 % w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 , 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w-吸湿 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 % 非常吸湿）23.Conformément aux recommandations de la Pharmacopée européenne, les échantillons sont divisés en 4 classes en fonction du pourcentage d'humidité absorbé par l'échantillon (0-0,012 % en poids - non hygroscopique, 0,2-2 % en poids légèrement hygroscopique, 2-15 % en poids).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % modérément hygroscopique, > 15 % très hygroscopique) 23.L'efficacité hygroscopique des NFCS X NFCS et TsN NFCS a été déterminée sur un analyseur DVS TA TGA Q5000 SA. Au cours de ce processus, la durée d'analyse, l'humidité relative (HR) et le poids de l'échantillon en temps réel à 25 °C ont été mesurés. La teneur en humidité est calculée par analyse massique NFRCS précise à l'aide de l'équation suivante :
MC est l'humidité du NFRCS. m1 – poids sec des AINS. m2 est la masse du NFRCS en temps réel à une HR donnée.
La surface totale a été estimée à l'aide d'une expérience d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après avoir vidé les échantillons à 25 °C pendant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). La surface totale a été estimée à l'aide d'une expérience d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après avoir vidé les échantillons à 25 °C pendant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Il est prévu que les mesures de protection soient appliquées à l'absorption de l'azote après l'absorption de l'azote. 25 °С течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). La surface totale a été estimée à l'aide d'une expérience d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après que les échantillons ont été vidés à 25 °C pendant 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。à 25°C Les mesures de protection contre l'azote sont appliquées après l'absorption de l'azote. Pendant 10 heures à 25 °C (< 7 × 10-3 températures). La surface totale a été estimée à l'aide d'expériences d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après que les échantillons ont été vidés pendant 10 heures à 25 °C (< 7 x 10-3 torr).La surface totale, le volume des pores et la taille des pores NFRCS ont été déterminés avec un Quantachrome de NOVA 1000e, Autriche, à l'aide du logiciel RS 232.
Préparer 5 % de globules rouges (diluant salin) à partir de sang total. Transférer ensuite une aliquote de HFFC (0,25 ml) dans une plaque à 96 puits et 5 % de masse de globules rouges (0,1 ml). Incuber le mélange à 37 °C pendant 40 minutes. Un mélange de globules rouges et de sérum a été considéré comme un témoin positif, et un mélange de solution saline et de globules rouges comme un témoin négatif. L'hémagglutination a été déterminée selon l'échelle de Stajitzky. Les échelles proposées sont les suivantes : + + + + agrégats granulaires denses ; + + + tampons à fond lisse avec bords incurvés ; + + tampons à fond lisse avec bords déchirés ; + anneaux rouges étroits autour des bords des tampons lisses ; – (négatif) bouton rouge discret 12 au centre du puits inférieur.
Français L'hémocompatibilité du NFRCS a été étudiée selon la méthode de l'Organisation internationale de normalisation (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. La méthode gravimétrique décrite par Singh et al. Des modifications mineures ont été apportées pour évaluer la formation de thrombus en présence ou à la surface du NFRCS. 500 mg de Cs, Ch NFRCS et Cp NFRCS ont été incubés dans du tampon phosphate salin (PBS) pendant 24 heures à 37 °C. Après 24 heures, le PBS a été retiré et le NFRCS a été traité avec 2 ml de sang contenant 3,8 % de citrate de sodium. À la surface du NFRCS, ajouter 0,04 ml de CaCl2 0,1 M aux échantillons incubés. Après 45 minutes, 5 ml d'eau distillée ont été ajoutés pour arrêter la coagulation. Le sang coagulé à la surface du NFRK a été traité avec une solution de formaldéhyde à 36-38 %. Les caillots fixés au formaldéhyde ont été séchés et pesés. Le pourcentage de thrombose a été estimé en calculant le poids du verre sans sang ni échantillon (témoin négatif) et du verre avec sang (témoin positif).
Pour une première confirmation, les échantillons ont été visualisés au microscope optique afin de comprendre la capacité du revêtement de surface HFFC, du Ct interconnecté et du réseau de Ct à former des pores. De fines sections de Ch et de Cp provenant de NFRCS ont été découpées à l'aide d'une lame de scalpel. La section obtenue a été placée sur une lame de verre, recouverte d'une lamelle, et les bords ont été fixés avec de la colle. Les lames préparées ont été visualisées au microscope optique et des photographies ont été prises à différents grossissements.
Le dépôt de polymère dans les réseaux de Ct a été visualisé à l'aide d'une microscopie à fluorescence basée sur la méthode décrite par Rice et al.29. La composition HFFC utilisée pour la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (amarante) et les NFRCS (Ch et Cp) ont été préparés selon la méthode mentionnée précédemment. La composition HFFC utilisée pour la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (amarante) et les NFRCS (Ch et Cp) ont été préparés selon la méthode mentionnée précédemment.La composition HFFC utilisée pour la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (amarante) et le NFRCS (Ch et Cp) a été obtenu selon la méthode mentionnée précédemment.Le système HFFC est doté d'un système de gestion des émissions de gaz à effet de serre et d'un système de radiocommunication.Le système HFFC est doté d'un système de gestion des émissions de gaz à effet de serre et d'un système de radiocommunication.La composition HFFC utilisée dans la formulation a été mélangée à un colorant fluorescent (Amarante) et a reçu des NFRCS (Ch et Cp), comme mentionné précédemment.Des coupes fines de NFRK ont été réalisées à partir des échantillons obtenus, déposées sur des lames de verre et recouvertes de lamelles. Les lames préparées ont été observées au microscope à fluorescence avec un filtre vert (310-380 nm). Les images ont été prises à un grossissement de 4x afin de comprendre les relations entre le Ct et le dépôt excessif de polymère dans le réseau de Ct.
La topographie de surface des NFRCS Ch et Cp a été déterminée à l'aide d'un microscope à force atomique (AFM) équipé d'un cantilever TESP ultra-net en mode tapping : 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taïwan. La rugosité de surface a été déterminée par la valeur quadratique moyenne (RMS) à l'aide d'un logiciel (Scanning Probe Image Processor). Différents emplacements NFRCS ont été rendus sur des images 3D afin de vérifier l'uniformité de la surface. L'écart type du score pour une zone donnée est défini comme la rugosité de surface. L'équation RMS a été utilisée pour quantifier la rugosité de surface du NFRCS31.
Français Des études basées sur la FESEM ont été réalisées à l'aide de FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, pour comprendre la morphologie de surface du Ch NFRCS et du Cp NFRCS, qui ont montré une meilleure BCT que le Cm NFRCS. L'étude FESEM a été réalisée selon la méthode décrite par Zhao et al. 32 avec des modifications mineures. 20 à 30 mg de NFRCS Ch NFRCS et Cp NFRCS ont été prémélangés avec 20 µl de citrate de sodium à 3,8 % prémélangé avec du sang de rat. 20 µl de 0,2 M CaCl2 ont été ajoutés aux échantillons de sang traités pour initier la coagulation et les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 10 minutes. De plus, les érythrocytes en excès ont été éliminés de la surface du NFRCS par rinçage avec une solution saline.
Français Les échantillons suivants ont été traités avec 0,1 % de glutaraldéhyde, puis séchés dans un four à air chaud à 37 °C pour éliminer l'humidité. Les échantillons séchés ont été enduits et analysés 32 . D'autres images obtenues pendant l'analyse étaient la formation de caillots à la surface de fibres de coton individuelles, le dépôt de polymère entre Ct, la morphologie des érythrocytes (forme), l'intégrité du caillot et la morphologie des érythrocytes en présence de NFRCS. Les zones de NFRCS non traitées et les zones de NFRCS traitées au Ch et au Cp incubées avec du sang ont été scannées pour les ions élémentaires (sodium, potassium, azote, calcium, magnésium, zinc, cuivre et sélénium)33. Comparez les pourcentages d'ions élémentaires entre les échantillons traités et non traités pour comprendre l'accumulation d'ions élémentaires pendant la formation du caillot et l'homogénéité du caillot.
L'épaisseur du revêtement de surface Cp HFFC sur la surface Ct a été déterminée par FESEM. Des sections transversales de Cp NFRCS ont été découpées dans la structure et déposées par pulvérisation cathodique. Les échantillons de revêtement résultant ont été observés par FESEM et l'épaisseur du revêtement de surface a été mesurée 34, 35, 36.
La micro-TDM à rayons X fournit une imagerie 3D non destructive haute résolution et permet d'étudier la structure interne de la NFRK. La micro-TDM utilise un faisceau de rayons X traversant l'échantillon pour enregistrer le coefficient d'atténuation linéaire local des rayons X dans l'échantillon, ce qui permet d'obtenir des informations morphologiques. La localisation interne de Ct dans les NFRCS Cp et les NFRCS Cp traités au sang a été examinée par micro-TDM afin de comprendre l'efficacité d'absorption et la coagulation sanguine en présence de NFRCS37,38,39. Les structures 3D des échantillons de NFRCS Cp traités et non traités au sang ont été reconstruites par micro-TDM (V|tome|x S240, Phoenix, Allemagne). À l'aide du logiciel VG STUDIO-MAX version 2.2, plusieurs images radiographiques ont été prises sous différents angles (idéalement à 360°) afin de développer des images 3D pour la NFRCS. Les données de projection collectées ont été reconstruites en images volumétriques 3D à l'aide du logiciel 3D ScanIP Academic correspondant.
De plus, pour comprendre la distribution du caillot, 20 µl de sang citraté prémélangé et 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M ont été ajoutés au NFRCS pour initier la coagulation sanguine. Les échantillons préparés ont été laissés durcir. La surface du NFRK a été traitée avec 0,5 % de glutaraldéhyde et séchée dans une étuve à air chaud à 30–40 °C pendant 30 min. Le caillot sanguin formé sur le NFRCS a été scanné, reconstruit et une image 3D du caillot sanguin a été visualisée.
Des tests antibactériens ont été réalisés sur Cp NFRCS (meilleur que Ch NFRCS) en utilisant la méthode décrite précédemment avec des modifications mineures. L'activité antibactérienne de Cp NFRCS et Cp HFFC a été déterminée en utilisant trois micro-organismes tests différents [S.aureus (bactéries à Gram positif), E.coli (bactéries à Gram négatif) et Candida blanc (C.albicans)] se développant sur gélose dans des boîtes de Petri dans un incubateur. Inoculer uniformément 50 ml de la suspension de culture bactérienne diluée à une concentration de 105-106 UFC ml-1 sur le milieu gélosé. Verser le milieu dans une boîte de Petri et laisser solidifier. Des puits ont été réalisés à la surface de la plaque de gélose pour être remplis de HFFC (3 puits pour HFFC et 1 pour le témoin négatif). Ajouter 200 µl de HFFC dans 3 puits et 200 µl de PBS pH 7,4 dans le 4e puits. De l'autre côté de la boîte de Pétri, déposer un disque Cp NFRCS de 12 mm sur la gélose solidifiée et humidifier avec du PBS (pH 7,4). Les comprimés de ciprofloxacine, d'ampicilline et de fluconazole sont considérés comme des étalons de référence pour Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Candida albicans. Mesurer manuellement la zone d'inhibition et en prendre une image numérique.
Après approbation éthique institutionnelle, l'étude a été menée au Kasturba Medical College of Education and Research à Manipal, Karnataka, dans le sud de l'Inde. Le protocole expérimental TEG in vitro a été examiné et approuvé par le Comité d'éthique institutionnel du Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC : 674/2020). Les sujets ont été recrutés parmi des donneurs de sang volontaires (âgés de 18 à 55 ans) de la banque de sang de l'hôpital. De plus, un formulaire de consentement éclairé a été obtenu des volontaires pour le prélèvement d'échantillons sanguins. Le TEG natif (N-TEG) ​​a été utilisé pour étudier l'effet de la formulation Cp HFFC sur du sang total prémélangé avec du citrate de sodium. Le N-TEG est largement reconnu pour son rôle dans la réanimation au point de service, ce qui crée des problèmes pour les cliniciens en raison du potentiel de retard cliniquement significatif des résultats (tests de coagulation de routine). L'analyse N-TEG a été réalisée sur du sang total. Le consentement éclairé et les antécédents médicaux détaillés ont été obtenus de tous les participants. L'étude n'a pas inclus de participants présentant des complications hémostatiques ou thrombotiques telles qu'une grossesse/un post-partum ou une maladie hépatique. Les sujets prenant des médicaments affectant la cascade de coagulation ont également été exclus de l'étude. Des tests de laboratoire de base (hémoglobine, temps de prothrombine, thromboplastine activée et numération plaquettaire) ont été effectués sur tous les participants selon les procédures standard. Le N-TEG détermine la viscoélasticité du caillot sanguin, sa structure initiale, l'interaction entre les particules, le renforcement du caillot et sa lyse. L'analyse du N-TEG fournit des données graphiques et numériques sur les effets collectifs de plusieurs éléments cellulaires et du plasma. L'analyse du N-TEG a été réalisée sur deux volumes différents de Cp HFFC (10 µl et 50 µl). Par conséquent, 1 ml de sang total avec de l'acide citrique a été ajouté à 10 µl de Cp HFFC. Ajouter 1 ml (Cp HFFC + sang citraté), 340 µl de sang mélangé à 20 µl de boîte de TEG contenant 0,2 M de CaCl2. Par la suite, des boîtes TEG ont été chargées dans TEG® 5000, US pour mesurer R, K, l'angle alpha, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % des échantillons de sang en présence de Cp HFFC41.
Français Le protocole d'étude in vivo a été examiné et approuvé par le Comité institutionnel d'éthique animale (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux recommandations du Comité de contrôle et de supervision de l'expérimentation animale (CPCSEA). Toutes les études NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) ont été réalisées sur des rats Wistar femelles (pesant 200 à 250 g). Tous les animaux ont été acclimatés à une température de 24-26 °C, les animaux avaient libre accès à de la nourriture standard et à de l'eau ad libitum. Tous les animaux ont été répartis aléatoirement en différents groupes, chaque groupe étant composé de trois animaux. Toutes les études ont été réalisées conformément à Études animales : Rapport d'expériences in vivo 43 . Avant l'étude, les animaux ont été anesthésiés par administration intrapéritonéale (ip) d'un mélange de 20 à 50 mg de kétamine (pour 1 kg de poids corporel) et de 2 à 10 mg de xylazine (pour 1 kg de poids corporel). Après l'étude, le volume de saignement a été calculé en évaluant la différence entre le poids initial et le poids final des échantillons ; la valeur moyenne obtenue à partir des trois tests a été considérée comme le volume de saignement de l'échantillon.
Le modèle d'amputation de la queue du rat a été mis en œuvre pour comprendre le potentiel du NFRCS à moduler le saignement en cas de traumatisme, de combat ou d'accident de la circulation (modèle de blessure). Couper 50 % de la queue avec une lame de scalpel et la placer à l'air libre pendant 15 s pour assurer un saignement normal. De plus, des échantillons de test ont été placés sur la queue d'un rat en appliquant une pression (Ct, Cs, Ch NFRCS et Cp NFRCS). Le saignement et la PCT ont été rapportés pour les échantillons de test (n = 3)17,45.
L'efficacité du contrôle de pression par NFRCS au combat a été étudiée sur un modèle d'artère fémorale superficielle. L'artère fémorale est exposée, ponctionnée avec un trocart de 24 G et saignée en 15 secondes. Après observation d'un saignement incontrôlé, l'échantillon d'essai est placé au point de ponction sous pression. Immédiatement après l'application de l'échantillon d'essai, le temps de coagulation est enregistré et l'efficacité hémostatique est observée pendant les 5 minutes suivantes. La même procédure est répétée avec Cs et Ct46.
Français Dowling et al. 47 ont proposé un modèle de lésion hépatique pour évaluer le potentiel hémostatique des matériaux hémostatiques dans le contexte d'un saignement peropératoire. La BCT a été enregistrée pour les échantillons Ct (témoin négatif), la structure Cs (témoin positif), les échantillons Ch NFRCS et les échantillons Cp NFRCS. La veine cave sus-hépatique du rat a été exposée en effectuant une laparotomie médiane. Après cela, la partie distale du lobe gauche a été découpée aux ciseaux. Une incision dans le foie a été pratiquée avec une lame de scalpel et laissée saigner pendant quelques secondes. Des échantillons de test Ch NFRCS et Cp NFRCS pesés avec précision ont été placés sur la surface endommagée sans aucune pression positive et la BCT a été enregistrée. Le groupe témoin (Ct) a ensuite appliqué une pression suivie de Cs 30 s47 sans rompre la blessure.
Des tests de cicatrisation in vivo ont été réalisés à l'aide d'un modèle de plaie excisionnelle afin d'évaluer les propriétés cicatrisantes des NFRCS à base de polymères développés. Les modèles de plaies excisionnelles ont été sélectionnés et réalisés selon des méthodes publiées précédemment, avec des modifications mineures19,32,48. Tous les animaux ont été anesthésiés comme décrit précédemment. Une incision circulaire profonde dans la peau du dos a été pratiquée à l'aide d'un poinçon à biopsie (12 mm). Les plaies préparées ont été pansées avec des pansements Cs (témoin positif), Ct (compte tenu de l'interférence de coton avec la cicatrisation), Ch NFRCS et Cp NFRCS (groupe expérimental) et un témoin négatif sans aucun traitement. Chaque jour de l'étude, la surface de la plaie a été mesurée chez tous les rats. Un appareil photo numérique a permis de photographier la plaie et de mettre un nouveau pansement. Le pourcentage de fermeture de la plaie a été mesuré selon la formule suivante :
En fonction du pourcentage de fermeture de la plaie au 12e jour de l'étude, la peau du rat du meilleur groupe a été excisée ((Cp NFRCS) et du groupe témoin) et étudiée par coloration H&E et coloration au trichrome de Masson. En fonction du pourcentage de fermeture de la plaie au 12e jour de l'étude, la peau du rat du meilleur groupe a été excisée ((Cp NFRCS) et du groupe témoin) et étudiée par coloration H&E et coloration au trichrome de Masson.En fonction du pourcentage de fermeture de la plaie au 12e jour de l'étude, la peau des rats du meilleur groupe ((Cp NFRCS) et du groupe témoin) a été excisée et examinée par coloration à l'hématoxyline-éosine et au trichrome de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS) et Masson sont également concernés.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS) et les normes H&E)Les rats du meilleur groupe ((Cp NFRCS) et des groupes témoins) ont été excisés pour une coloration à l'hématoxyline-éosine et une coloration au trichrome de Masson en fonction du pourcentage de fermeture de la plaie au jour 12 de l'étude.La procédure de coloration mise en œuvre a été réalisée selon les méthodes décrites précédemment49,50. Brièvement, après fixation dans du formol à 10 %, les échantillons ont été déshydratés à l'aide d'une série d'alcools gradués. Utiliser un microtome pour obtenir des coupes fines (5 µm d'épaisseur) du tissu excisé. De fines coupes en série de témoins et de Cp NFRCS ont été traitées à l'hématoxyline et à l'éosine pour étudier les changements histopathologiques. La coloration au trichrome de Masson a été utilisée pour détecter la formation de fibrilles de collagène. Les résultats obtenus ont été étudiés en aveugle par des pathologistes.
Français La stabilité des échantillons de Cp NFRCS a été étudiée à température ambiante (25 °C ± 2 °C/60 % HR ± 5 %) pendant 12 mois51. Le Cp NFRCS (décoloration de surface et croissance microbienne) a été inspecté visuellement et testé pour la résistance à l'usure par pliage et le BCT selon les méthodes ci-dessus décrites dans la section Matériels et méthodes.
L'évolutivité et la reproductibilité du Cp NFRCS ont été examinées en préparant du Cp NFRCS de 15 × 15 cm². De plus, des échantillons de 30 mg (n = 5) ont été prélevés à partir de différentes fractions de Cp NFRCS et le BCT des échantillons étudiés a été évalué comme décrit précédemment dans la section Méthodes.
Nous avons tenté de développer diverses formes et structures à partir de compositions de Cp NFRCS pour diverses applications biomédicales. Ces formes ou configurations incluent des écouvillons coniques pour les saignements de nez et les interventions dentaires, et des écouvillons cylindriques pour les saignements vaginaux.
Tous les ensembles de données sont exprimés sous forme de moyenne ± écart type et ont été analysés par ANOVA à l'aide de Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) suivi du test de comparaisons multiples de Bonferroni (*p<0,05).
Toutes les procédures réalisées dans le cadre d'études sur l'homme étaient conformes aux normes de l'Institut et du Conseil national de la recherche, ainsi qu'à la Déclaration d'Helsinki de 1964 et à ses amendements ultérieurs, ou à des normes éthiques similaires. Tous les participants ont été informés des caractéristiques de l'étude et de son caractère volontaire. Les données des participants restent confidentielles une fois collectées. Le protocole expérimental TEG in vitro a été examiné et approuvé par le Comité d'éthique institutionnel du Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (CEI : 674/2020). Les volontaires ont signé un consentement éclairé pour le prélèvement d'échantillons sanguins.
Toutes les procédures réalisées dans le cadre d'études animales ont été réalisées conformément aux directives de la Faculté de médecine Kastuba, Institut d'enseignement supérieur de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Toutes les expériences animales conçues ont été menées conformément aux directives du Comité de contrôle et de supervision de l'expérimentation animale (CPCSEA). Tous les auteurs suivent les directives ARRIVE.
Français Les spectres FTIR de tous les NFRCS ont été analysés et comparés au spectre du chitosane présenté dans la Figure 2A. Pics spectraux caractéristiques du chitosane (enregistrés) à 3437 cm-1 (étirement OH et NH, chevauchement), 2945 et 2897 cm-1 (étirement CH), 1660 cm-1 (déformation NH2), 1589 cm-1 (flexion N–H), 1157 cm-1 (étirement du pont O-), 1067 cm-1 (étirement C–O, hydroxyle secondaire), 993 cm-1 (étirement CO, Bo-OH) 52,53,54. Le tableau supplémentaire S1 montre les valeurs du spectre d'absorption FTIR NFRCS pour le chitosane (rapporteur), le chitosane pur, Cm, Ch et Cp. Les spectres FTIR de tous les NFRCS (Cm, Ch et Cp) ont montré les mêmes bandes d'absorption caractéristiques que le chitosane pur, sans modification significative (Fig. 2A). Les résultats FTIR ont confirmé l'absence d'interactions chimiques ou physiques entre les polymères utilisés pour développer les NFRCS, indiquant que ces polymères sont inertes.
Caractérisation in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS et Cs. (A) représente les spectres FTIR combinés des compositions de chitosane et de Cm NFRCS, Ch NFRCS et Cp NFRCS sous compression. (B) a) Taux d'absorption du sang total de NFRCS Cm, Ch, Cp et Cg (n = 3) ; Les échantillons de Ct ont montré un BAR plus élevé car le coton-tige a une efficacité d'absorption plus élevée ; b) Sang après absorption de sang Illustration de l'échantillon absorbé. Représentation graphique du BCT de l'échantillon d'essai C (Cp NFRCS avait le meilleur BCT (15 s, n = 3)). Les données en C, D, E et G ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type, et les barres d’erreur représentent l’écart type, ***p < 0,0001. Les données en C, D, E et G ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type, et les barres d’erreur représentent l’écart type, ***p < 0,0001. Les valeurs C, D, E et G sont prévues pour l'ouverture standard ± p < 0,0001. Les données en C, D, E et G sont présentées sous forme de moyenne ± écart type, et les barres d’erreur représentent l’écart type, ***p<0,0001. C、D、E et G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E et G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Les dates en C, D, E et G correspondent à une ouverture standard, les plans sont prévus pour l'ouverture standard, ***p <0,0001. Les données en C, D, E et G sont présentées sous forme de moyenne ± écart type, les barres d'erreur représentent l'écart type, ***p<0,0001.