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Les saignements incontrôlés sont l'une des principales causes de décès.L'obtention d'une hémostase rapide assure la survie du sujet en tant que premiers secours lors de combats, d'accidents de la circulation et d'opérations de réduction de la mortalité.L'échafaudage composite renforcé de fibres nanoporeuses (NFRCS) dérivé d'une simple composition filmogène hémostatique (HFFC) en tant que phase continue peut déclencher et améliorer l'hémostase.Le développement du NFRCS est basé sur la conception de l'aile de la libellule.La structure des ailes de libellule se compose d'ailes transversales et longitudinales, et les membranes des ailes sont reliées les unes aux autres pour maintenir l'intégrité de la microstructure.Le HFFC recouvre uniformément la surface de la fibre d'un film d'épaisseur nanométrique et relie l'épaisseur de coton distribuée de manière aléatoire (Ct) (phase dispersée) pour former une structure nanoporeuse.La combinaison des phases continue et dispersée réduit le coût du produit par dix par rapport aux produits disponibles dans le commerce.Le NFRCS modifié (tampons ou bracelets) peut être utilisé dans une variété d'applications biomédicales.Des études in vivo ont conclu que le Cp NFRCS développé déclenche et améliore le processus de coagulation au site d'application.Le NFRCS peut moduler le microenvironnement et agir au niveau cellulaire en raison de sa structure nanoporeuse entraînant une meilleure cicatrisation des plaies dans le modèle de plaie par excision.
Les saignements incontrôlés pendant les situations de combat, peropératoires et d'urgence peuvent constituer une grave menace pour la vie des blessés1.Ces conditions conduisent en outre à une augmentation globale de la résistance vasculaire périphérique, conduisant à un choc hémorragique.Les mesures appropriées pour contrôler les saignements pendant et après la chirurgie sont considérées comme potentiellement mortelles2,3.Les dommages aux gros vaisseaux entraînent une perte de sang massive, entraînant un taux de mortalité ≤ 50 % au combat et 31 % pendant la chirurgie1.Une perte de sang massive entraîne une diminution du volume corporel, ce qui réduit le débit cardiaque.Une augmentation de la résistance vasculaire périphérique totale et une altération progressive de la microcirculation entraînent une hypoxie des organes vitaux.Un choc hémorragique peut survenir si la condition persiste sans intervention efficace1,4,5.D'autres complications comprennent la progression de l'hypothermie et de l'acidose métabolique, ainsi qu'un trouble de la coagulation qui entrave le processus de coagulation.Un choc hémorragique sévère est associé à un risque de décès plus élevé6,7,8.Dans le choc de grade III (progressif), la transfusion sanguine est essentielle à la survie du patient pendant la morbi-mortalité peropératoire et postopératoire.Pour surmonter toutes les situations potentiellement mortelles ci-dessus, nous avons développé un échafaudage composite renforcé de fibres nanoporeuses (NFRCS) qui utilise une concentration minimale de polymère (0,5 %) en utilisant une combinaison de polymères hémostatiques solubles dans l'eau.
Grâce à l'utilisation de fibres de renforcement, des produits rentables peuvent être développés.Les fibres disposées au hasard ressemblent à la structure de l'aile d'une libellule, équilibrée par les rayures horizontales et verticales sur les ailes.Les veines transversales et longitudinales de l'aile communiquent avec la membrane alaire (Fig. 1).Le NFRCS consiste en Ct renforcé en tant que système d'échafaudage avec une meilleure résistance physique et mécanique (Figure 1).En raison de leur prix abordable et de leur savoir-faire, les chirurgiens préfèrent utiliser des jauges de fil de coton (Ct) pendant les opérations et les pansements. Par conséquent, compte tenu de ses multiples avantages, y compris > 90 % de cellulose cristalline (contribue à l'amélioration de l'activité hémostatique), le Ct a été utilisé comme système squelettique du NFRCS9,10. Par conséquent, compte tenu de ses multiples avantages, y compris > 90 % de cellulose cristalline (contribue à l'amélioration de l'activité hémostatique), le Ct a été utilisé comme système squelettique du NFRCS9,10. Следовательно, учитывая кристаллич Ct использовали в к ачестве скелетной системы NFRCS9,10. Par conséquent, compte tenu de ses nombreux avantages, y compris > 90 % de cellulose cristalline (impliquée dans une activité hémostatique accrue), le Ct a été utilisé comme système squelettique du NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用作NFRCS9 ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Par conséquent, compte tenu de ses nombreux avantages, dont plus de 90 % de cellulose cristalline (aide à améliorer l'activité hémostatique), le Ct a été utilisé comme échafaudage pour le NFRCS9,10.Ct a été recouvert superficiellement (la formation d'un film nano-épais a été observée) et interconnecté avec une composition filmogène hémostatique (HFFC).HFFC agit comme un matrigel, tenant ensemble des Ct placés au hasard.La conception développée transmet les contraintes au sein de la phase dispersée (fibres de renfort).Il est difficile d'obtenir des structures nanoporeuses avec une bonne résistance mécanique en utilisant des concentrations minimales de polymère.De plus, il n'est pas facile de personnaliser différents moules pour différentes applications biomédicales.
La figure montre un diagramme de la conception NFRCS basée sur la structure de l'aile de libellule (A).Cette image montre une analogie comparative de la structure de l'aile d'une libellule (les nervures transversales et longitudinales de l'aile sont interconnectées) et une photomicrographie en coupe transversale de Cp NFRCS (B).Représentation schématique du NFRCS.
Les NFRC ont été développés en utilisant HFFC comme une phase continue pour répondre aux limitations ci-dessus.Le HFFC est composé de divers polymères hémostatiques filmogènes dont le chitosane (comme principal polymère hémostatique) avec la méthylcellulose (MC), l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC 50 cp) et l'alcool polyvinylique (PVA)) (125 kDa) comme polymère support qui favorise la formation de thrombus.formation.L'ajout de polyvinylpyrrolidine K30 (PVP K30) a amélioré la capacité d'absorption d'humidité du NFRCS.Du polyéthylène glycol 400 (PEG 400) a été ajouté pour améliorer la réticulation du polymère dans les mélanges de polymères liés.Trois compositions hémostatiques HFFC différentes (Cm HFFC, Ch HFFC et Cp HFFC), à savoir le chitosan avec MC (Cm), le chitosan avec HPMC (Ch) et le chitosan avec PVA (Cp), ont été appliquées à Ct.Diverses études de caractérisation in vitro et in vivo ont confirmé l'activité hémostatique et cicatrisante du NFRCS.Les matériaux composites proposés par le NFRCS peuvent être utilisés pour personnaliser diverses formes d'échafaudages afin de répondre à des besoins spécifiques.
De plus, le NFRCS peut être modifié sous forme de bandage ou de rouleau pour couvrir toute la zone de blessure des membres inférieurs et d'autres parties du corps.Spécifiquement pour les blessures aux membres de combat, la conception NFRCS conçue peut être modifiée en demi-bras ou jambe complète (Figure supplémentaire S11).Le NFRCS peut être transformé en un bracelet avec de la colle tissulaire, qui peut être utilisé pour arrêter les saignements dus à de graves blessures suicidaires au poignet.Notre objectif principal est de développer un NFRCS avec le moins de polymère possible qui puisse être distribué à une large population (sous le seuil de pauvreté) et qui puisse être placé dans une trousse de premiers soins.De conception simple, efficace et économique, le NFRCS profite aux communautés locales et peut avoir un impact mondial.
Le chitosane (poids moléculaire 80 kDa) et l'amarante ont été achetés chez Merck, Inde.L'hydroxypropylméthylcellulose 50 Cp, le polyéthylèneglycol 400 et la méthylcellulose ont été achetés chez Loba Chemie Pvt.LLC, Bombay.L'alcool polyvinylique (poids moléculaire 125 kDa) (hydrolysé à 87-90 %) a été acheté auprès de National Chemicals, Gujarat.La polyvinylpyrrolidine K30 a été achetée chez Molychem, Mumbai, des écouvillons stériles ont été achetés chez Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, avec de l'eau Milli Q (système de purification d'eau Direct-Q3, Merck, Inde) comme support.
NFRCS a été développé en utilisant une méthode de lyophilisation11,12.Toutes les compositions HFFC (tableau 1) ont été préparées à l'aide d'un agitateur mécanique.Préparer une solution à 0,5 % de chitosane en utilisant de l'acide acétique à 1 % dans de l'eau en agitant en continu à 800 tr/min sur un agitateur mécanique.Le poids exact du polymère chargé indiqué dans le tableau 1 a été ajouté à la solution de chitosane et agité jusqu'à ce qu'une solution de polymère limpide soit obtenue.Du PVP K30 et du PEG 400 ont été ajoutés au mélange résultant dans les quantités indiquées dans le tableau 1, et l'agitation a été poursuivie jusqu'à ce qu'une solution de polymère visqueuse limpide soit obtenue.Le bain résultant de solution de polymère a été soniqué pendant 60 minutes pour éliminer les bulles d'air piégées du mélange de polymères.Comme le montre la figure supplémentaire S1 (b), le Ct était uniformément réparti dans chaque puits d'une plaque à 6 puits (moule) complétée par 5 ml de HFFC.
La plaque à six puits a été soniquée pendant 60 min pour obtenir un mouillage et une distribution uniformes de HFFC dans le réseau Ct.Congeler ensuite la plaque à six puits à -20°C pendant 8 à 12 heures.Les plaques de congélation ont été lyophilisées pendant 48 heures pour obtenir diverses formulations de NFRCS.La même procédure est utilisée pour produire différentes formes et structures, telles que des tampons ou des tampons cylindriques, ou toute autre forme pour différentes applications.
Du chitosane (80 kDa) (3 %) pesé avec précision est dissous dans de l'acide acétique à 1 % à l'aide d'un agitateur magnétique.A la solution résultante de chitosane, on a ajouté 1 % de PEG 400 et on a agité pendant 30 minutes.Verser la solution obtenue dans un récipient carré ou rectangulaire et congeler à -80°C pendant 12 heures.Les échantillons congelés ont été lyophilisés pendant 48 heures pour obtenir du Cs13 poreux.
Le NFRCS développé a été soumis à des expériences utilisant la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japon) pour confirmer la compatibilité chimique du chitosane avec d'autres polymères14,15.Les spectres FTIR (largeur de la gamme spectrale de 400 à 4000 cm-1) de tous les échantillons testés ont été obtenus en effectuant 32 balayages.
Le taux d'absorption sanguine (BAR) pour toutes les formulations a été évalué en utilisant la méthode décrite par Chen et al.16 avec de légères modifications.Les NFRK développés de toutes les compositions ont été séchés dans une étuve à vide à 105°C pendant une nuit pour éliminer le solvant résiduel.30 mg de NFRCS (poids initial de l'échantillon - W0) et 30 mg de Ct (témoin positif) ont été placés dans des boîtes séparées contenant un prémélange de citrate de sodium à 3,8 %.A des intervalles de temps prédéterminés, c'est-à-dire 5, 10, 20, 30, 40 et 60 secondes, les NFRCS ont été retirés et leurs surfaces nettoyées du sang non absorbé en plaçant les échantillons sur Ct pendant 30 secondes.Le poids final de sang absorbé par NFRCS 16 a été pris en compte (W1) à chaque instant.Calculez le pourcentage BAR en utilisant la formule suivante :
Le temps de coagulation sanguine (BCT) a été déterminé comme indiqué par Wang et al.17 .Le temps nécessaire pour que le sang total (sang de rat prémélangé avec 3,8 % de citrate de sodium) coagule en présence de NFRCS a été calculé comme le BCT de l'échantillon de test.Les différents composants du NFRCS (30 mg) ont été placés dans des flacons à bouchon vissé de 10 ml et incubés à 37°C.Du sang (0,5 ml) a été ajouté au flacon et 0,3 ml de CaCl2 0,2 ​​M a été ajouté pour activer la coagulation du sang.Enfin, retournez le flacon toutes les 15 secondes (jusqu'à 180°) jusqu'à la formation d'un caillot ferme.Le BCT de l'échantillon est estimé par le nombre de flips vails17,18.Sur la base de BCT, deux compositions optimales de NFRCS Cm, Ch et Cp ont été sélectionnées pour d'autres études de caractérisation.
Le BCT des compositions Ch NFRCS et Cp NFRCS a été déterminé en mettant en oeuvre la méthode décrite par Li et al.19 .Placer 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS et Cs (contrôle positif) dans des boîtes de Petri séparées (37 oC).Du sang contenant 3,8 % de citrate de sodium a été mélangé avec du CaCl2 0,2 ​​M dans un rapport volumique de 10:1 pour démarrer le processus de coagulation du sang.20 µl de mélange de sang de rat CaCl2 0,2 ​​M ont été appliqués sur la surface de l'échantillon et placés dans une boîte de Pétri vide.Le témoin était du sang versé dans des boîtes de Petri vides sans Ct.À intervalles fixes de 0, 3 et 5 minutes, arrêter la coagulation en ajoutant 10 ml d'eau déionisée (DI) à l'échantillon contenant le plat sans perturber le caillot.Les érythrocytes non coagulés (érythrocytes) subissent une hémolyse en présence d'eau déminéralisée et libèrent de l'hémoglobine.L'hémoglobine à différents moments (HA(t)) a été mesurée à 540 nm (hémoglobine λmax) à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis.L'absorption absolue de l'hémoglobine (AH(0)) en 0 min de 20 µl de sang dans 10 ml d'eau déminéralisée a été prise comme étalon de référence.L'absorption relative d'hémoglobine (RHA) du sang coagulé a été calculée à partir du rapport HA(t)/HA(0) en utilisant le même lot de sang.
À l'aide d'un analyseur de texture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, États-Unis), les propriétés adhésives du NFRK aux tissus endommagés ont été déterminées.Presser un plat cylindrique à fond ouvert contre l'intérieur de la peau de porc (sans la couche de gras).Des échantillons (Ch NFRCS et Cp NFRCS) ont été appliqués via une canule dans des moules cylindriques pour créer une adhérence à la peau du porc.Après une incubation de 3 minutes à température ambiante (TA) (25°C), la force d'adhérence NFRCS a été enregistrée à une vitesse constante de 0,5 mm/sec.
La principale caractéristique des scellants chirurgicaux est d'augmenter la coagulation du sang tout en réduisant la perte de sang.La coagulation sans perte dans le NFRCS a été évaluée à l'aide d'une méthode précédemment publiée avec de légères modifications 19 .Faire un tube de microcentrifugeuse (2 ml) (diamètre intérieur 10 mm) avec un trou de 8 × 5 mm2 sur un côté du tube de centrifugeuse (représentant une plaie ouverte).NFRCS est utilisé pour fermer l'ouverture et du ruban adhésif est utilisé pour sceller les bords extérieurs.Ajouter 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M dans le tube de microcentrifugeuse contenant le prémélange de citrate de sodium à 3,8 %.Après 10 minutes, les tubes de microcentrifugeuse ont été retirés des boîtes et l'augmentation de la masse des boîtes a été déterminée en raison de l'écoulement de sang du NFRK (n = 3).Les pertes sanguines Ch NFRCS et Cp NFRCS ont été comparées à Cs.
L'intégrité humide du NFRCS a été déterminée sur la base de la méthode décrite par Mishra et Chaudhary21 avec des modifications mineures.Placer le NFRCS dans un flacon Erlenmeyer de 100 ml avec 50 ml d'eau et agiter pendant 60 s sans former de haut.Inspection visuelle et hiérarchisation des échantillons pour l'intégrité physique en fonction de la collecte.
La force de liaison de HFFC à Ct a été étudiée en utilisant des méthodes publiées précédemment avec des modifications mineures.L'intégrité du revêtement de surface a été évaluée en exposant le NFRK à des ondes acoustiques (stimulus externe) en présence d'eau milliQ (Ct).Les NFRCS Ch NFRCS et Cp NFRCS développés ont été placés dans un bécher rempli d'eau et soniqués pendant 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 et 30 min, respectivement.Après séchage, la différence en pourcentage entre le poids initial et le poids final du NFRCS a été utilisée pour calculer le pourcentage de perte de matière (HFFC).Le BCT in vitro a également soutenu la force de liaison ou la perte de matériaux de surface.L'efficacité de la liaison du HFFC au Ct assure la coagulation du sang et un revêtement élastique à la surface du Ct22.
L'homogénéité du NFRCS développé a été déterminée par le BCT d'échantillons (30 mg) prélevés à partir d'emplacements généraux sélectionnés au hasard du NFRCS.Suivez la procédure BCT mentionnée précédemment pour déterminer la conformité NFRCS.La proximité entre les cinq échantillons assure une couverture de surface uniforme et un dépôt de HFFC dans le maillage Ct.
La zone nominale de contact avec le sang (NBCA) a été déterminée comme indiqué précédemment avec quelques modifications.Coaguler le sang en serrant 20 µl de sang entre les deux surfaces de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS et Cs.Après 1 heure, les deux parties du stent ont été séparées et mesurées manuellement la surface du caillot.La valeur moyenne de trois répétitions a été considérée comme NBCA NFRCS19.
L'analyse Dynamic Vapor Sorption (DVS) a été utilisée pour évaluer l'efficacité du NFRCS à absorber l'eau de l'environnement externe ou du site de la blessure responsable de l'initiation de la coagulation.Le DVS évalue ou enregistre l'absorption et la perte de vapeur dans un échantillon par gravimétrie à l'aide d'une balance ultra-sensible avec une résolution de masse de ± 0,1 µg.Une pression de vapeur partielle (humidité relative) est générée par un régulateur de débit massique électronique autour de l'échantillon en mélangeant des gaz porteurs saturés et secs. Conformément aux directives de la Pharmacopée européenne, sur la base du pourcentage d'absorption d'humidité par les échantillons, les échantillons ont été classés en 4 catégories (0–0,012 % p/p − non hygroscopique, 0,2–2 % p/p légèrement hygroscopique, 2–15 % modérément hygroscopique et > 15 % très hygroscopique)23. Conformément aux directives de la Pharmacopée européenne, sur la base du pourcentage d'absorption d'humidité par les échantillons, les échantillons ont été classés en 4 catégories (0–0,012 % p/p − non hygroscopique, 0,2–2 % p/p légèrement hygroscopique, 2–15 % modérément hygroscopique et > 15 % très hygroscopique)23.Conformément aux recommandations de la Pharmacopée Européenne, en fonction du pourcentage d'absorption d'humidité par les échantillons, les échantillons ont été divisés en 4 catégories (0–0,012 % p/p – non hygroscopique, 0,2–2 % p/p légèrement hygroscopique, 2– quinze %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % modérément hygroscopique et > 15 % très hygroscopique)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w/w- 非吸湿性、0.2-2% w /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。Conformément aux recommandations de la Pharmacopée Européenne, les échantillons sont divisés en 4 classes en fonction du pourcentage d'humidité absorbée par l'échantillon (0-0,012 % en poids – non hygroscopique, 0,2-2 % en poids légèrement hygroscopique, 2-15 % en poids).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % modérément hygroscopique, > 15% très hygroscopique) 23.L'efficacité hygroscopique de NFCS X NFCS et TsN NFCS a été déterminée sur un analyseur DVS TA TGA Q5000 SA.Au cours de ce processus, le temps d'exécution, l'humidité relative (HR) et le poids de l'échantillon en temps réel à 25°C24 ont été obtenus.La teneur en humidité est calculée par une analyse de masse NFRCS précise à l'aide de l'équation suivante :
MC est l'humidité NFRCS.m1 – poids sec des AINS.m2 est la masse NFRCS en temps réel à une HR donnée.
La surface totale a été estimée à l'aide d'une expérience d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après avoir vidé les échantillons à 25 °C pendant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). La surface totale a été estimée à l'aide d'une expérience d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après avoir vidé les échantillons à 25 °C pendant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жид ким азотом после опорожнения образцов при 25 °С à 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). La surface totale a été estimée à l'aide d'une expérience d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après avoir vidé les échantillons à 25 °C pendant 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。在 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции аз à 10 °C à 25 °C (< 7 × 10-3 °C). La surface totale a été estimée à l'aide d'expériences d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après que les échantillons aient été vidés pendant 10 heures à 25°C (< 7 x 10-3 torr).La surface totale, le volume des pores et la taille des pores NFRCS ont été déterminés avec un Quantachrome de NOVA 1000e, Autriche en utilisant le logiciel RS 232.
Préparer 5 % de globules rouges (solution saline comme diluant) à partir de sang total.Transférer ensuite une aliquote de HFFC (0,25 ml) dans une plaque à 96 puits et 5 % de masse RBC (0,1 ml).Incuber le mélange à 37°C pendant 40 minutes.Un mélange de globules rouges et de sérum a été considéré comme un contrôle positif, et un mélange de sérum physiologique et de globules rouges comme un contrôle négatif.L'hémagglutination a été déterminée selon l'échelle de Stajitzky.Les barèmes proposés sont les suivants : + + + + granulats granulaires denses ;+ + + coussinets inférieurs lisses à bords incurvés;++ coussinets inférieurs lisses avec bords déchirés ;+ anneaux rouges étroits sur les bords des coussinets lisses ;– (négatif) discret bouton rouge 12 au centre du puits inférieur.
L'hémocompatibilité du NFRCS a été étudiée selon la méthode de l'Organisation internationale de normalisation (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.La méthode gravimétrique décrite par Singh et al.Des modifications mineures ont été apportées pour évaluer la formation de thrombus en présence ou à la surface de NFRCS.500 mg de Cs, Ch NFRCS et Cp NFRCS ont été incubés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 24 heures à 37°C.Après 24 heures, le PBS a été éliminé et le NFRCS a été traité avec 2 ml de sang contenant 3,8 % de citrate de sodium.Sur la surface du NFRCS, ajouter 0,04 ml de CaCl2 0,1 M aux échantillons incubés.Après 45 minutes, 5 ml d'eau distillée ont été ajoutés pour arrêter la coagulation.Le sang coagulé à la surface du NFRK a été traité avec une solution de formaldéhyde à 36-38 %.Les caillots fixés avec du formaldéhyde ont été séchés et pesés.Le pourcentage de thrombose a été estimé en calculant le poids du verre sans sang et échantillon (témoin négatif) et du verre avec sang (témoin positif).
Comme confirmation initiale, les échantillons ont été visualisés au microscope optique pour comprendre la capacité du revêtement de surface HFFC, du Ct interconnecté et du réseau Ct à former des pores.Des sections minces de Ch et Cp de NFRCS ont été taillées avec une lame de scalpel.La section résultante a été placée sur une lame de verre, recouverte d'une lamelle, et les bords ont été fixés avec de la colle.Les lames préparées ont été visualisées au microscope optique et des photographies ont été prises à différents grossissements.
Le dépôt de polymère dans les réseaux Ct a été visualisé en utilisant la microscopie à fluorescence basée sur la méthode décrite par Rice et al.29. La composition HFFC utilisée pour la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (amarante) et des NFRCS (Ch & Cp) ont été préparés selon la méthode mentionnée précédemment. La composition HFFC utilisée pour la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (amarante) et des NFRCS (Ch & Cp) ont été préparés selon la méthode mentionnée précédemment.La composition HFFC utilisée pour la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (amarante) et le NFRCS (Ch et Cp) a été obtenu selon la méthode mentionnée précédemment.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。La composition HFFC utilisée dans la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (Amarante) et a reçu du NFRCS (Ch et Cp), comme mentionné précédemment.Des sections minces de NFRK ont été découpées à partir des échantillons obtenus, placées sur des lames de verre et recouvertes de lamelles.Observer les lames préparées au microscope à fluorescence à l'aide d'un filtre vert (310-380 nm).Des images ont été prises à un grossissement de 4x pour comprendre les relations Ct et le dépôt de polymère en excès dans le réseau Ct.
La topographie de surface de NFRCS Ch et Cp a été déterminée à l'aide d'un microscope à force atomique (AFM) avec un porte-à-faux TESP ultra-pointu en mode tapping : 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.La rugosité de surface a été déterminée par racine carrée moyenne (RMS) à l'aide d'un logiciel (Scanning Probe Image Processor).Divers emplacements NFRCS ont été rendus sur des images 3D pour vérifier l'uniformité de la surface.L'écart type du score pour une zone donnée est défini comme la rugosité de la surface.L'équation RMS a été utilisée pour quantifier la rugosité de surface de NFRCS31.
Des études basées sur FESEM ont été réalisées à l'aide de FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, pour comprendre la morphologie de surface de Ch NFRCS et Cp NFRCS, qui ont montré un meilleur BCT que Cm NFRCS.L'étude FESEM a été réalisée selon la méthode décrite par Zhao et al.32 avec des modifications mineures.NFRCS 20 à 30 mg de Ch NFRCS et Cp NFRCS ont été prémélangés avec 20 pl de citrate de sodium à 3,8 % prémélangés avec du sang de rat.20 μl de CaCl2 0,2 ​​M ont été ajoutés aux échantillons traités au sang pour initier la coagulation et les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 10 minutes.De plus, les érythrocytes en excès ont été éliminés de la surface du NFRCS par rinçage avec une solution saline.
Les échantillons suivants ont été traités avec du glutaraldéhyde à 0,1 % puis séchés dans un four à air chaud à 37 °C pour éliminer l'humidité.Les échantillons séchés ont été enduits et analysés 32 .D'autres images obtenues au cours de l'analyse étaient la formation de caillots à la surface des fibres de coton individuelles, le dépôt de polymère entre Ct, la morphologie des érythrocytes (forme), l'intégrité du caillot et la morphologie des érythrocytes en présence de NFRCS.Les zones NFRCS non traitées et les zones NFRCS traitées au Ch et au Cp incubées avec du sang ont été scannées pour les ions élémentaires (sodium, potassium, azote, calcium, magnésium, zinc, cuivre et sélénium)33.Comparez les pourcentages d'ions élémentaires entre les échantillons traités et non traités pour comprendre l'accumulation d'ions élémentaires pendant la formation du caillot et l'homogénéité du caillot.
L'épaisseur du revêtement de surface Cp HFFC sur la surface Ct a été déterminée à l'aide de FESEM.Les coupes transversales de Cp NFRCS ont été coupées du cadre et recouvertes par pulvérisation.Les échantillons de revêtement de pulvérisation résultants ont été observés par FESEM et l'épaisseur du revêtement de surface a été mesurée 34 , 35 , 36 .
Le micro-CT à rayons X fournit une imagerie non destructive 3D haute résolution et vous permet d'étudier l'arrangement structurel interne du NFRK.Le micro-CT utilise un faisceau de rayons X traversant l'échantillon pour enregistrer le coefficient d'atténuation linéaire local des rayons X dans l'échantillon, ce qui permet d'obtenir des informations morphologiques.L'emplacement interne de Ct dans Cp NFRCS et Cp NFRCS traité avec du sang a été examiné par micro-CT pour comprendre l'efficacité d'absorption et la coagulation du sang en présence de NFRCS37,38,39.Les structures 3D d'échantillons Cp NFRCS traités avec du sang et non traités ont été reconstruites à l'aide d'un micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Allemagne).À l'aide du logiciel VG STUDIO-MAX version 2.2, plusieurs images radiographiques ont été prises sous différents angles (idéalement une couverture à 360°) pour développer des images 3D pour NFRCS.Les données de projection collectées ont été reconstruites en images volumétriques 3D à l'aide du logiciel 3D ScanIP Academic simple correspondant.
De plus, pour comprendre la distribution du caillot, 20 ul de sang citraté prémélangé et 20 ul de CaCl2 0,2 ​​M ont été ajoutés au NFRCS pour initier la coagulation du sang.Les échantillons préparés sont laissés à durcir.La surface NFRK a été traitée avec 0,5% de glutaraldéhyde et séchée dans un four à air chaud à 30-40°C pendant 30 min.Le caillot sanguin formé sur le NFRCS a été scanné, reconstruit et une image 3D du caillot sanguin a été visualisée.
Des dosages antibactériens ont été effectués sur Cp NFRCS (meilleur par rapport à Ch NFRCS) en utilisant la méthode décrite précédemment avec des modifications mineures.L'activité antibactérienne de Cp NFRCS et Cp HFFC a été déterminée à l'aide de trois micro-organismes tests différents [S.aureus (bactéries gram-positives), E.coli (bactéries gram-négatives) et Candida blanc (C.albicans)] cultivés sur gélose dans des boîtes de Pétri dans un incubateur.Ensemencer uniformément 50 ml de la suspension de culture bactérienne diluée à une concentration de 105-106 UFC ml-1 sur le milieu gélosé.Verser le milieu dans une boîte de Petri et laisser solidifier.Des puits ont été réalisés à la surface de la plaque de gélose pour remplir de HFFC (3 puits pour le HFFC et 1 pour le contrôle négatif).Ajouter 200 µl de HFFC à 3 puits et 200 µl de PBS pH 7,4 au 4ème puits.De l'autre côté de la boîte de Pétri, placer un disque Cp NFRCS de 12 mm sur l'agar solidifié et humidifier avec du PBS (pH 7,4).Les comprimés de ciprofloxacine, d'ampicilline et de fluconazole sont considérés comme des étalons de référence pour Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Candida albicans.Mesurez manuellement la zone d'inhibition et prenez une image numérique de la zone d'inhibition.
Après approbation éthique institutionnelle, l'étude a été menée au Kasturba Medical College of Education and Research à Manipal, Karnataka, dans le sud de l'Inde.Le protocole expérimental TEG in vitro a été examiné et approuvé par le comité d'éthique institutionnel du Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (CEI : 674/2020).Les sujets ont été recrutés parmi les donneurs de sang volontaires (âgés de 18 à 55 ans) de la banque de sang de l'hôpital.De plus, un formulaire de consentement éclairé a été obtenu des volontaires pour le prélèvement d'échantillons sanguins.Le TEG natif (N-TEG) ​​​​a été utilisé pour étudier l'effet de la formulation Cp HFFC sur le sang total prémélangé avec du citrate de sodium.Le N-TEG est largement reconnu pour son rôle dans la réanimation au point de service, ce qui crée des problèmes pour les cliniciens en raison du potentiel de retard cliniquement significatif des résultats (tests de coagulation de routine).L'analyse N-TEG a été réalisée sur du sang total.Un consentement éclairé et des antécédents médicaux détaillés ont été obtenus de tous les participants.L'étude n'a pas inclus de participants présentant des complications hémostatiques ou thrombotiques telles que la grossesse/le post-partum ou une maladie du foie.Les sujets prenant des médicaments qui affectent la cascade de la coagulation ont également été exclus de l'étude.Des tests de laboratoire de base (hémoglobine, temps de prothrombine, thromboplastine activée et numération plaquettaire) ont été effectués sur tous les participants selon les procédures standard.Le N-TEG détermine la viscoélasticité du caillot sanguin, la structure initiale du caillot, l'interaction des particules, le renforcement du caillot et la lyse du caillot.L'analyse N-TEG fournit des données graphiques et numériques sur les effets collectifs de plusieurs éléments cellulaires et du plasma.L'analyse N-TEG a été réalisée sur deux volumes différents de Cp HFFC (10 µl et 50 µl).En conséquence, 1 ml de sang total avec de l'acide citrique a été ajouté à 10 ul de Cp HFFC.Ajouter 1 ml (Cp HFFC + sang citraté), 340 pi de sang mélangé à 20 pi 0,2 M CaCl2 contenant TEG plat.Par la suite, les boîtes TEG ont été chargées dans le TEG® 5000, US pour mesurer R, K, angle alpha, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % des échantillons de sang en présence de Cp HFFC41.
Le protocole d'étude in vivo a été examiné et approuvé par le Comité institutionnel d'éthique animale (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux recommandations du Comité de contrôle et de surveillance de l'expérimentation animale (CPCSEA).Toutes les études NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) ont été réalisées sur des rats Wistar femelles (pesant de 200 à 250 g).Tous les animaux ont été acclimatés à une température de 24-26°C, les animaux avaient libre accès à la nourriture standard et à l'eau ad libitum.Tous les animaux ont été divisés au hasard en différents groupes, chaque groupe était composé de trois animaux.Toutes les études ont été réalisées conformément à Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 .Avant l'étude, les animaux ont été anesthésiés par administration intrapéritonéale (ip) d'un mélange de 20 à 50 mg de kétamine (pour 1 kg de poids corporel) et de 2 à 10 mg de xylazine (pour 1 kg de poids corporel).Après l'étude, le volume de saignement a été calculé en évaluant la différence entre le poids initial et final des échantillons, la valeur moyenne obtenue à partir des trois tests a été prise comme volume de saignement de l'échantillon.
Le modèle d'amputation de queue de rat a été mis en œuvre pour comprendre le potentiel du NFRCS à moduler les saignements lors d'un traumatisme, d'un combat ou d'un accident de la circulation (modèle de blessure).Couper 50 % de la queue avec une lame de scalpel et placer dans l'air pendant 15 s pour assurer un saignement normal.De plus, des échantillons de test ont été placés sur la queue d'un rat en appliquant une pression (Ct, Cs, Ch NFRCS et Cp NFRCS).Des saignements et PCT ont été signalés pour les échantillons testés (n = 3)17,45.
L'efficacité du contrôle de la pression NFRCS au combat a été étudiée sur un modèle de l'artère fémorale superficielle.L'artère fémorale est exposée, ponctionnée avec un trocart 24G et saignée dans les 15 secondes.Après observation d'un saignement incontrôlé, le spécimen d'essai est placé au site de ponction avec une pression appliquée.Immédiatement après l'application de l'échantillon d'essai, le temps de coagulation a été enregistré et l'efficacité hémostatique a été observée pendant les 5 minutes suivantes.La même procédure a été répétée avec Cs et Ct46.
Dowling et al.47 ont proposé un modèle de lésion hépatique pour évaluer le potentiel hémostatique des matériaux hémostatiques dans le contexte d'un saignement peropératoire.Le BCT a été enregistré pour les échantillons Ct (témoin négatif), le cadre Cs (témoin positif), les échantillons Ch NFRCS et les échantillons Cp NFRCS.La veine cave sus-hépatique du rat a été exposée en réalisant une laparotomie médiane.Après cela, la partie distale du lobe gauche a été découpée avec des ciseaux.Faire une incision dans le foie avec une lame de scalpel et laisser saigner pendant quelques secondes.Des échantillons de test Ch NFRCS et Cp NFRCS pesés avec précision ont été placés sur la surface endommagée sans aucune pression positive et le BCT a été enregistré.Le groupe témoin (Ct) a ensuite appliqué une pression suivie de Cs 30 s47 sans casser la blessure.
Des tests de cicatrisation in vivo ont été effectués à l'aide d'un modèle de plaie par excision pour évaluer les propriétés de cicatrisation des NFRCS développés à base de polymères.Des modèles de plaies d'excision ont été sélectionnés et réalisés selon des méthodes précédemment publiées avec des modifications mineures19,32,48.Tous les animaux ont été anesthésiés comme décrit précédemment.Utilisez un poinçon de biopsie (12 mm) pour faire une incision circulaire profonde dans la peau du dos.Les sites de plaie préparés ont été pansés avec Cs (témoin positif), Ct (reconnaissant que les tampons de coton interfèrent avec la cicatrisation), Ch NFRCS et Cp NFRCS (groupe expérimental) et un contrôle négatif sans aucun traitement.Chaque jour de l'étude, la surface de la plaie a été mesurée chez tous les rats.Utilisez un appareil photo numérique pour prendre une photo de la zone de la plaie et mettez un nouveau pansement.Le pourcentage de fermeture de la plaie a été mesuré par la formule suivante :
Sur la base du pourcentage de fermeture de la plaie au 12ème jour de l'étude, la peau de rat du meilleur groupe a été excisée ((Cp NFRCS) et le groupe témoin) et étudiée par coloration H&E et coloration trichrome de Masson. Sur la base du pourcentage de fermeture de la plaie au 12ème jour de l'étude, la peau de rat du meilleur groupe a été excisée ((Cp NFRCS) et le groupe témoin) et étudiée par coloration H&E et coloration trichrome de Masson.Sur la base du pourcentage de fermeture de la plaie au 12e jour de l'étude, la peau des rats du meilleur groupe ((Cp NFRCS) et du groupe témoin) a été excisée et examinée par coloration à l'hématoxyline-éosine et au trichrome de Masson.Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Les rats du meilleur groupe ((Cp NFRCS) et groupes témoins) ont été excisés pour la coloration à l'hématoxyline-éosine et la coloration au trichrome de Masson en fonction du pourcentage de fermeture de la plaie au jour 12 de l'étude.La procédure de coloration mise en œuvre a été réalisée selon les méthodes décrites précédemment49,50.Brièvement, après fixation dans du formol à 10 %, les échantillons ont été déshydratés à l'aide d'une série d'alcools gradués.Utilisez un microtome pour obtenir des sections minces (5 m d'épaisseur) du tissu excisé.Des coupes en série minces de témoins et de Cp NFRCS ont été traitées avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour étudier les changements histopathologiques.La coloration au trichrome de Masson a été utilisée pour détecter la formation de fibrilles de collagène.Les résultats obtenus ont été étudiés à l'aveugle par des pathologistes.
La stabilité des échantillons Cp NFRCS a été étudiée à température ambiante (25°C ± 2°C/60% HR ± 5%) pendant 12 mois51.Cp NFRCS (décoloration de surface et croissance microbienne) a été inspecté visuellement et testé pour la résistance à l'usure par pli et BCT selon les méthodes ci-dessus décrites dans la section Matériels et méthodes.
L'évolutivité et la reproductibilité de Cp NFRCS ont été examinées en préparant Cp NFRCS avec une taille de 15 × 15 cm2.De plus, des échantillons de 30 mg (n = 5) ont été excisés de diverses fractions Cp NFRCS et le BCT des échantillons étudiés a été évalué comme décrit précédemment dans la section Méthodes.
Nous avons tenté de développer diverses formes et structures en utilisant des compositions Cp NFRCS pour diverses applications biomédicales.De telles formes ou configurations comprennent des écouvillons coniques pour les saignements de nez, des interventions dentaires et des écouvillons cylindriques pour les saignements vaginaux.
Tous les ensembles de données sont exprimés en moyenne ± écart type et ont été analysés par ANOVA à l'aide de Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) suivi du test de comparaisons multiples de Bonferroni (* p <0,05).
Toutes les procédures effectuées dans les études humaines étaient conformes aux normes de l'Institut et du Conseil national de la recherche, ainsi qu'à la Déclaration d'Helsinki de 1964 et ses modifications ultérieures, ou à des normes éthiques similaires.Tous les participants ont été informés des caractéristiques de l'étude et de son caractère volontaire.Les données des participants restent confidentielles une fois collectées.Le protocole expérimental TEG in vitro a été examiné et approuvé par le comité d'éthique institutionnel du Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (CEI : 674/2020).Les volontaires ont signé un consentement éclairé pour prélever des échantillons de sang.
Toutes les procédures effectuées dans les études animales ont été effectuées conformément à la Faculté de médecine de Kastuba, Institut d'enseignement supérieur de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Toutes les expérimentations animales conçues ont été menées conformément aux directives du Comité de contrôle et de surveillance de l'expérimentation animale (CPCSEA).Tous les auteurs suivent les directives ARRIVE.
Les spectres FTIR de tous les NFRCS ont été analysés et comparés au spectre de chitosane illustré à la figure 2A.Pics spectraux caractéristiques du chitosane (enregistrés) à 3437 cm-1 (étirement OH et NH, chevauchement), 2945 et 2897 cm-1 (étirement CH), 1660 cm-1 (souche NH2), 1589 cm-1 (flexion N–H), 1157 cm-1 (étirement pont O-), 1067 cm-1 (étirement C–O, hydroxyle secondaire), 993 cm -1 (étirer CO, Bo-OH) 52.53.54.Le tableau supplémentaire S1 montre les valeurs du spectre d'absorption FTIR NFRCS pour le chitosane (rapporteur), le chitosane pur, Cm, Ch et Cp.Les spectres FTIR de tous les NFRCS (Cm, Ch et Cp) ont montré les mêmes bandes d'absorption caractéristiques que le chitosane pur sans aucun changement significatif (Fig. 2A).Les résultats FTIR ont confirmé l'absence d'interactions chimiques ou physiques entre les polymères utilisés pour développer le NFRCS, indiquant que les polymères utilisés sont inertes.
Caractérisation in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS et Cs.(A) représente les spectres FTIR combinés des compositions de chitosane et Cm NFRCS, Ch NFRCS et Cp NFRCS sous compression.(B) a) Taux d'absorption dans le sang total de NFRCS Cm, Ch, Cp et Cg (n = 3);Les échantillons Ct ont montré une BAR plus élevée car le coton-tige a une efficacité d'absorption plus élevée ;b) Sang après absorption du sang Illustration de l'échantillon absorbé.Représentation graphique du BCT de l'échantillon de test C (Cp NFRCS avait le meilleur BCT (15 s, n = 3)). Les données en C, D, E et G ont été présentées sous forme de moyenne ± SD, et les barres d'erreur représentent SD, ***p < 0,0001. Les données en C, D, E et G ont été présentées sous forme de moyenne ± SD, et les barres d'erreur représentent SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей п редставляют стандартное отклонение, ***p <0,0001. Les données en C, D, E et G sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, et les barres d'erreur représentent l'écart-type, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей par exemple, ***p <0,0001. Les données en C, D, E et G sont affichées sous forme de moyenne ± écart type, les barres d'erreur représentent l'écart type, ***p<0,0001.