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La fertilité des oiseaux dépend de leur capacité à stocker suffisamment de sperme viable pendant une période prolongée dans les tubules de stockage du sperme (SST).Le mécanisme exact par lequel les spermatozoïdes entrent, résident et quittent la SST reste controversé.Le sperme des poules sharkasi a montré une forte tendance à l'agglutination, formant des faisceaux filamenteux mobiles contenant de nombreuses cellules.En raison de la difficulté d'observer la motilité et le comportement des spermatozoïdes dans une trompe de Fallope opaque, nous avons utilisé un dispositif microfluidique avec une section de microcanal similaire à celle des spermatozoïdes pour étudier l'agglutination et la motilité des spermatozoïdes.Cette étude explique comment les faisceaux de spermatozoïdes se forment, comment ils se déplacent et leur rôle possible dans l'extension de la résidence des spermatozoïdes dans la SST.Nous avons étudié la vitesse des spermatozoïdes et le comportement rhéologique lorsque le flux de fluide a été généré dans un canal microfluidique par pression hydrostatique (débit = 33 µm/s).Les spermatozoïdes ont tendance à nager à contre-courant (rhéologie positive) et la vitesse du faisceau de spermatozoïdes est considérablement réduite par rapport aux spermatozoïdes simples.On a observé que les faisceaux de spermatozoïdes se déplaçaient en spirale et augmentaient en longueur et en épaisseur à mesure que de plus en plus de spermatozoïdes uniques étaient recrutés. Des faisceaux de sperme ont été observés s'approchant et adhérant aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être balayés avec une vitesse d'écoulement de fluide > 33 m/s. Des faisceaux de sperme ont été observés s'approchant et adhérant aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être balayés avec une vitesse d'écoulement de fluide > 33 m/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенк ам микрофлюидных каналов, plus de 33 м км / с. On a observé que les faisceaux de sperme s'approchent et adhèrent aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être emportés à des débits de fluide > 33 m/s.33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенк ам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. On a observé que les faisceaux de spermatozoïdes s'approchent et adhèrent aux parois latérales du canal microfluidique pour éviter d'être emportés par un écoulement de fluide à > 33 m/s.La microscopie électronique à balayage et à transmission a révélé que les faisceaux de sperme étaient soutenus par un matériau dense et abondant.Les données obtenues démontrent la mobilité unique des spermatozoïdes de poulet Sharkazi, ainsi que la capacité des spermatozoïdes à s'agglutiner et à former des faisceaux mobiles, ce qui contribue à une meilleure compréhension du stockage à long terme des spermatozoïdes en SMT.
Pour réaliser la fécondation chez les humains et la plupart des animaux, les spermatozoïdes et les ovules doivent arriver au site de fécondation au bon moment.Par conséquent, l'accouplement doit avoir lieu avant ou au moment de l'ovulation.D'autre part, certains mammifères, tels que les chiens, ainsi que des espèces non mammifères, telles que les insectes, les poissons, les reptiles et les oiseaux, stockent le sperme dans leurs organes reproducteurs pendant une période prolongée jusqu'à ce que leurs œufs soient prêts pour la fécondation (fécondation asynchrone 1 ).Les oiseaux sont capables de maintenir la viabilité des spermatozoïdes capables de féconder les œufs pendant 2 à 10 semaines2.
Il s'agit d'une caractéristique unique qui distingue les oiseaux des autres animaux, car elle offre une forte probabilité de fécondation après une seule insémination pendant plusieurs semaines sans accouplement ni ovulation simultanés.Le principal organe de stockage du sperme, appelé tubule de stockage du sperme (SST), est situé dans les plis muqueux internes à la jonction utéro-vaginale.À ce jour, les mécanismes par lesquels les spermatozoïdes entrent, résident et sortent de la banque de sperme ne sont pas entièrement compris.Sur la base d'études antérieures, de nombreuses hypothèses ont été avancées, mais aucune d'entre elles n'a été confirmée.
Forman4 a émis l'hypothèse que les spermatozoïdes maintiennent leur résidence dans la cavité SST par un mouvement oscillatoire continu contre la direction de l'écoulement du fluide à travers les canaux protéiques situés sur les cellules épithéliales SST (rhéologie).L'ATP est épuisé en raison de l'activité flagellaire constante nécessaire pour maintenir les spermatozoïdes dans la lumière SST et la motilité finit par décliner jusqu'à ce que les spermatozoïdes soient évacués de la banque de sperme par un écoulement de fluide et commencent un nouveau voyage dans la trompe de Fallope ascendante pour féconder les spermatozoïdes.Oeuf (Forman4).Ce modèle de stockage du sperme est étayé par la détection par immunocytochimie des aquaporines 2, 3 et 9 présentes dans les cellules épithéliales SST.À ce jour, les études sur la rhéologie du sperme de poulet et son rôle dans le stockage de la SST, la sélection vaginale des spermatozoïdes et la compétition des spermatozoïdes font défaut.Chez les poulets, le sperme pénètre dans le vagin après l'accouplement naturel, mais plus de 80 % des spermatozoïdes sont éjectés du vagin peu de temps après l'accouplement.Cela suggère que le vagin est le principal site de sélection des spermatozoïdes chez les oiseaux.De plus, il a été rapporté que moins de 1% des spermatozoïdes fécondés dans le vagin se retrouvent dans des SST2.Dans l'insémination artificielle des poussins dans le vagin, le nombre de spermatozoïdes atteignant la SST a tendance à augmenter 24 heures après l'insémination.Jusqu'à présent, le mécanisme de sélection des spermatozoïdes au cours de ce processus n'est pas clair et la motilité des spermatozoïdes peut jouer un rôle important dans l'absorption des spermatozoïdes SST.En raison des parois épaisses et opaques des trompes de Fallope, il est difficile de surveiller directement la motilité des spermatozoïdes dans les trompes de Fallope des oiseaux.Par conséquent, nous manquons de connaissances de base sur la transition des spermatozoïdes vers la SST après la fécondation.
La rhéologie a récemment été reconnue comme un facteur important contrôlant le transport des spermatozoïdes dans les organes génitaux des mammifères.Sur la base de la capacité des spermatozoïdes mobiles à migrer à contre-courant, Zaferani et al8 ont utilisé un système microfluidique corra pour isoler passivement les spermatozoïdes mobiles à partir d'échantillons de sperme enclos.Ce type de tri du sperme est essentiel pour le traitement médical de l'infertilité et la recherche clinique, et est préféré aux méthodes traditionnelles qui demandent beaucoup de temps et de main-d'œuvre et peuvent compromettre la morphologie et l'intégrité structurelle des spermatozoïdes.Cependant, à ce jour, aucune étude n'a été menée sur l'effet des sécrétions des organes génitaux des poulets sur la motilité des spermatozoïdes.
Indépendamment du mécanisme qui maintient le sperme stocké dans le SST, de nombreux chercheurs ont observé que les spermatozoïdes résidents s'agglutinent tête à tête dans le SST des poulets 9, 10, des cailles 2 et des dindes 11 pour former des faisceaux de sperme agglutinés.Les auteurs suggèrent qu'il existe un lien entre cette agglutination et le stockage à long terme des spermatozoïdes dans la SST.
Tingari et Lake12 ont rapporté une forte association entre les spermatozoïdes dans la glande réceptrice de sperme du poulet et se sont demandé si les spermatozoïdes aviaires s'agglutinaient de la même manière que les spermatozoïdes de mammifères.Ils croient que les connexions profondes entre les spermatozoïdes dans le canal déférent peuvent être dues au stress causé par la présence d'un grand nombre de spermatozoïdes dans un petit espace.
Lors de l'évaluation du comportement des spermatozoïdes sur des lames de verre suspendues fraîches, des signes transitoires d'agglutination peuvent être observés, en particulier sur les bords des gouttelettes de sperme.Cependant, l'agglutination était souvent perturbée par l'action de rotation associée au mouvement continu, ce qui explique le caractère transitoire de ce phénomène.Les chercheurs ont également remarqué que lorsque le diluant était ajouté au sperme, des agrégats cellulaires allongés « en forme de fil » apparaissaient.
Les premières tentatives pour imiter un spermatozoïde ont été faites en retirant un fil fin d'une goutte pendante, ce qui a abouti à une vésicule allongée ressemblant à un spermatozoïde dépassant de la goutte de sperme.Les spermatozoïdes se sont immédiatement alignés de manière parallèle dans la vésicule, mais l'ensemble de l'unité a rapidement disparu en raison de la limitation 3D.Par conséquent, pour étudier l'agglutination des spermatozoïdes, il est nécessaire d'observer la motilité et le comportement des spermatozoïdes directement dans des tubules de stockage de sperme isolés, ce qui est difficile à réaliser.Par conséquent, il est nécessaire de développer un instrument qui imite les spermatozoïdes pour soutenir les études sur la motilité des spermatozoïdes et le comportement d'agglutination.Brillard et al13 ont rapporté que la longueur moyenne des tubules de stockage du sperme chez les poussins adultes est de 400 à 600 µm, mais certaines SST peuvent atteindre 2 000 µm.Mero et Ogasawara14 ont divisé les glandes séminifères en tubules de stockage de sperme élargis et non élargis, qui avaient tous deux la même longueur (~ 500 µm) et la même largeur de cou (~ 38 µm), mais le diamètre moyen de la lumière des tubules était de 56,6 et 56,6 µm.., respectivement 11,2 μm, respectivement.Dans la présente étude, nous avons utilisé un dispositif microfluidique avec une taille de canal de 200 µm × 20 µm (W × H), dont la section transversale est quelque peu proche de celle de la SST amplifiée.En outre, nous avons examiné la motilité des spermatozoïdes et le comportement d'agglutination dans le fluide en circulation, ce qui est cohérent avec l'hypothèse de Foreman selon laquelle le fluide produit par les cellules épithéliales SST maintient les spermatozoïdes dans la lumière dans une direction à contre-courant (rhéologique).
Le but de cette étude était de surmonter les problèmes d'observation de la motilité des spermatozoïdes dans la trompe de Fallope et d'éviter les difficultés d'étudier la rhéologie et le comportement des spermatozoïdes dans un environnement dynamique.Un dispositif microfluidique a été utilisé qui crée une pression hydrostatique pour simuler la motilité des spermatozoïdes dans les organes génitaux d'un poulet.
Lorsqu'une goutte d'un échantillon de sperme dilué (1:40) a été chargée dans le dispositif à microcanaux, deux types de motilité des spermatozoïdes ont pu être identifiés (spermatozoïdes isolés et spermatozoïdes liés).De plus, les spermatozoïdes avaient tendance à nager à contre-courant (rhéologie positive ; vidéo 1, 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes solitaires (p <0, 001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p <0, 001; tableau 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes solitaires (p <0, 001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p <0, 001; tableau 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозои дов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный рео таксис (p < 0,001 ; таблица 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes uniques (p <0, 001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p <0, 001; tableau 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,0 01), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Bien que la vitesse des faisceaux de spermatozoïdes soit inférieure à celle des spermatozoïdes simples (p < 0,001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes à rhéologie positive (p < 0,001 ; tableau 2).La rhéologie positive pour les spermatozoïdes simples et les touffes est estimée à environ 53 % et 85 %, respectivement.
Il a été observé que les spermatozoïdes des poulets sharkasi immédiatement après l'éjaculation forment des faisceaux linéaires, constitués de dizaines d'individus.Ces touffes augmentent en longueur et en épaisseur avec le temps et peuvent rester plusieurs heures in vitro avant de se dissiper (vidéo 3).Ces faisceaux filamenteux ont la forme de spermatozoïdes d'échidné qui se forment à l'extrémité de l'épididyme.Le sperme de poule Sharkashi s'est avéré avoir une forte tendance à s'agglutiner et à former un faisceau réticulé en moins d'une minute après la collecte.Ces faisceaux sont dynamiques et capables de coller à tous les murs ou objets statiques à proximité.Bien que les faisceaux de spermatozoïdes réduisent la vitesse des spermatozoïdes, il est clair que macroscopiquement ils augmentent leur linéarité.La longueur des faisceaux varie en fonction du nombre de spermatozoïdes collectés en faisceaux.Deux parties du faisceau ont été isolées : la partie initiale, comprenant la tête libre du sperme agglutiné, et la partie terminale, comprenant la queue et toute l'extrémité distale du sperme.À l'aide d'une caméra à haute vitesse (950 fps), des têtes libres de spermatozoïdes agglutinés ont été observées dans la partie initiale du faisceau, responsables du mouvement du faisceau en raison de leur mouvement oscillatoire, entraînant les autres dans le faisceau avec un mouvement hélicoïdal (Vidéo 4).Cependant, dans les longues touffes, il a été observé que certaines têtes de spermatozoïdes libres adhéraient au corps et la partie terminale de la touffe agissait comme des aubes pour aider à propulser la touffe.
Alors qu'ils sont dans un flux de liquide lent, les faisceaux de sperme se déplacent parallèlement les uns aux autres, cependant, ils commencent à se chevaucher et à coller à tout ce qui est immobile, afin de ne pas être emportés par le flux de courant à mesure que la vitesse d'écoulement augmente.Les faisceaux se forment lorsqu'une poignée de spermatozoïdes s'approchent les uns des autres, ils commencent à se déplacer de manière synchrone et à s'enrouler les uns autour des autres, puis adhèrent à une substance collante.Les figures 1 et 2 montrent comment les spermatozoïdes se rapprochent, formant une jonction lorsque les queues s'enroulent l'une autour de l'autre.
Les chercheurs ont appliqué une pression hydrostatique pour créer un flux de fluide dans un microcanal afin d'étudier la rhéologie des spermatozoïdes.Un microcanal d'une taille de 200 µm × 20 µm (L × H) et d'une longueur de 3,6 µm a été utilisé.Utiliser des microcanaux entre les conteneurs avec des seringues montées aux extrémités.Le colorant alimentaire a été utilisé pour rendre les canaux plus visibles.
Attachez les câbles d'interconnexion et les accessoires au mur.La vidéo a été prise avec un microscope à contraste de phase.Avec chaque image, des images de microscopie à contraste de phase et de cartographie sont présentées.(A) La connexion entre deux flux résiste à l'écoulement dû au mouvement hélicoïdal (flèche rouge).(B) La connexion entre le faisceau de tubes et la paroi du canal (flèches rouges), en même temps, ils sont connectés à deux autres faisceaux (flèches jaunes).(C) Les faisceaux de sperme dans le canal microfluidique commencent à se connecter les uns aux autres (flèches rouges), formant un maillage de faisceaux de sperme.(D) Formation d'un réseau de faisceaux de sperme.
Lorsqu'une goutte de sperme dilué a été chargée dans le dispositif microfluidique et qu'un flux a été créé, on a observé que le faisceau de sperme se déplaçait dans le sens contraire du flux.Les faisceaux s'ajustent parfaitement contre les parois des microcanaux, et les têtes libres dans la partie initiale des faisceaux s'ajustent parfaitement contre eux (vidéo 5).Ils adhèrent également à toutes les particules stationnaires sur leur chemin, comme les débris, pour résister à être emportés par le courant.Au fil du temps, ces touffes deviennent de longs filaments emprisonnant d'autres spermatozoïdes simples et des touffes plus courtes (Vidéo 6).Lorsque le flux commence à ralentir, de longues lignes de sperme commencent à former un réseau de lignes de sperme (Vidéo 7 ; Figure 2).
À une vitesse d'écoulement élevée (V > 33 µm/s), les mouvements en spirale des fils sont augmentés pour tenter d'attraper de nombreux faisceaux de formation de spermatozoïdes individuels qui résistent mieux à la force de dérive du flux. À une vitesse d'écoulement élevée (V > 33 µm/s), les mouvements en spirale des fils sont augmentés pour tenter d'attraper de nombreux faisceaux de formation de spermatozoïdes individuels qui résistent mieux à la force de dérive du flux. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, кольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки , лучше противостоят дрейфующей силе потока. À des débits élevés (V > 33 µm/s), les mouvements hélicoïdaux des brins augmentent alors qu'ils tentent d'attraper de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux mieux à même de résister à la force de dérive du flux.在高流速(V > 33 µm/s) 在高流速(V > 33 µm/s)地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而 更地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) образующих пучки, чтобы лу чше сопротивляться силам дрейфа потока. À des débits élevés (V > 33 µm/s), le mouvement hélicoïdal des filaments augmente dans une tentative de capturer de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux pour mieux résister aux forces de dérive du flux.Ils ont également essayé de fixer des microcanaux aux parois latérales.
Les faisceaux de spermatozoïdes ont été identifiés comme des grappes de têtes de spermatozoïdes et de queues de curling à l'aide de la microscopie optique (LM).Des faisceaux de sperme avec divers agrégats ont également été identifiés comme des têtes tordues et des agrégats flagellaires, plusieurs queues de sperme fusionnées, des têtes de sperme attachées à une queue et des têtes de sperme avec des noyaux courbés comme plusieurs noyaux fusionnés.microscopie électronique à transmission (MET).La microscopie électronique à balayage (SEM) a montré que les faisceaux de sperme étaient des agrégats gainés de têtes de sperme et que les agrégats de sperme montraient un réseau attaché de queues enveloppées.
La morphologie et l'ultrastructure des spermatozoïdes, la formation des faisceaux de spermatozoïdes ont été étudiées par microscopie optique (demi-coupe), microscopie électronique à balayage (SEM) et microscopie électronique à transmission (TEM), les frottis de sperme ont été colorés à l'orange d'acridine et examinés par microscopie à épifluorescence.
La coloration des frottis de sperme à l'orange d'acridine (Fig. 3B) a montré que les têtes de sperme étaient collées ensemble et recouvertes de matériel sécrétoire, ce qui a conduit à la formation de grosses touffes (Fig. 3D).Les faisceaux de sperme consistaient en des agrégats de sperme avec un réseau de queues attachées (Fig. 4A-C).Les faisceaux de spermatozoïdes sont composés des queues de nombreux spermatozoïdes collées ensemble (Fig. 4D).Les secrets (Fig. 4E,F) couvraient les têtes des faisceaux de spermatozoïdes.
Formation du faisceau de spermatozoïdes L'utilisation d'une microscopie à contraste de phase et de frottis de sperme colorés à l'orange d'acridine a montré que les têtes de spermatozoïdes collent ensemble.(A) La formation précoce de touffes de spermatozoïdes commence par un spermatozoïde (cercle blanc) et trois spermatozoïdes (cercle jaune), la spirale commençant à la queue et se terminant à la tête.(B) Photomicrographie d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant des têtes de spermatozoïdes adhérentes (flèches).La décharge couvre la ou les têtes.Grossissement × 1000. (C) Développement d'un grand faisceau transporté par flux dans un canal microfluidique (à l'aide d'une caméra haute vitesse à 950 fps).(D) Micrographie d'un frottis de sperme coloré à l'acridine orange montrant de grandes touffes (flèches).Grossissement : ×200.
Micrographie électronique à balayage d'un faisceau de sperme et d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine.(A, B, D, E) sont des micrographies électroniques à balayage couleur numérique de spermatozoïdes, et C et F sont des micrographies de frottis de sperme colorés à l'acridine orange montrant l'attachement de plusieurs spermatozoïdes enveloppant la toile caudale.(AC) Les agrégats de sperme sont représentés par un réseau de queues attachées (flèches).(D) Adhérence de plusieurs spermatozoïdes (avec substance adhésive, contour rose, flèche) enroulés autour de la queue.(E et F) Agrégats de tête de sperme (pointeurs) recouverts de matériau adhésif (pointeurs).Les spermatozoïdes formaient des faisceaux avec plusieurs structures en forme de vortex (F).Grossissements (C) ×400 et (F) ×200.
En utilisant la microscopie électronique à transmission, nous avons constaté que les faisceaux de sperme avaient des queues attachées (Fig. 6A, C), des têtes attachées aux queues (Fig. 6B) ou des têtes attachées aux queues (Fig. 6D).Les têtes des spermatozoïdes du faisceau sont courbées, présentant en coupe deux régions nucléaires (Fig. 6D).Dans le faisceau d'incision, les spermatozoïdes avaient une tête tordue avec deux régions nucléaires et plusieurs régions flagellaires (Fig. 5A).
Micrographie électronique couleur numérique montrant les queues de connexion dans le faisceau de spermatozoïdes et le matériau agglutinant reliant les têtes de spermatozoïdes.(A) Queue attachée d'un grand nombre de spermatozoïdes.Remarquez à quoi ressemble la queue dans les projections portrait (flèche) et paysage (flèche).(B) La tête (flèche) du sperme est reliée à la queue (flèche).(C) Plusieurs queues de spermatozoïdes (flèches) sont attachées.(D) Le matériel d'agglutination (AS, bleu) relie quatre têtes de sperme (violet).
La microscopie électronique à balayage a été utilisée pour détecter les têtes de sperme dans les faisceaux de sperme recouverts de sécrétions ou de membranes (figure 6B), indiquant que les faisceaux de sperme étaient ancrés par du matériel extracellulaire.Le matériel agglutiné a été concentré dans la tête de sperme (assemblage en forme de tête de méduse; Fig. 5B) et s'est étendu distalement, donnant un aspect jaune brillant sous microscopie à fluorescence lorsqu'il est coloré avec de l'orange d'acridine (Fig. 6C).Cette substance est clairement visible au microscope à balayage et est considérée comme un liant.Des coupes semi-minces (Fig. 5C) et des frottis de sperme colorés à l'orange d'acridine ont montré des faisceaux de sperme contenant des têtes densément emballées et des queues recourbées (Fig. 5D).
Diverses photomicrographies montrant l'agrégation des têtes de spermatozoïdes et des queues repliées à l'aide de diverses méthodes.(A) Micrographie électronique à transmission couleur numérique en coupe d'un faisceau de spermatozoïdes montrant une tête de spermatozoïde enroulée avec un noyau en deux parties (bleu) et plusieurs parties flagellaires (vert).(B) Micrographie électronique à balayage couleur numérique montrant un groupe de têtes de spermatozoïdes ressemblant à des méduses (flèches) qui semblent être couvertes.(C) Section semi-mince montrant les têtes de sperme agrégées (flèches) et les queues enroulées (flèches).(D) Micrographie d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant des agrégats de têtes de spermatozoïdes (flèches) et des queues adhérentes enroulées (flèches).A noter qu'une substance collante (S) recouvre la tête du spermatozoïde.(D) grossissement × 1000.
En utilisant la microscopie électronique à transmission (Fig. 7A), il a également été noté que les têtes des spermatozoïdes étaient tordues et que les noyaux avaient une forme en spirale, comme le confirment les frottis de sperme colorés à l'orange d'acridine et examinés par microscopie à fluorescence (Fig. 7B).
(A) Micrographie électronique à transmission couleur numérique et (B) frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant les têtes enroulées et la fixation des têtes et des queues de sperme (flèches).(B) grossissement × 1000.
Une découverte intéressante est que le sperme de Sharkazi s'agrège pour former des faisceaux filamenteux mobiles.Les propriétés de ces faisceaux nous permettent de comprendre leur rôle éventuel dans l'absorption et le stockage des spermatozoïdes dans la SST.
Après l'accouplement, les spermatozoïdes pénètrent dans le vagin et subissent un processus de sélection intense, ce qui entraîne l'entrée d'un nombre limité de spermatozoïdes dans le SST15,16.À ce jour, les mécanismes par lesquels les spermatozoïdes entrent et sortent de la SST ne sont pas clairs.Chez les volailles, les spermatozoïdes sont conservés dans le SST pour une durée prolongée de 2 à 10 semaines selon les espèces6.La controverse demeure sur l'état de la semence pendant le stockage dans le SST.Sont-ils en mouvement ou au repos ?En d'autres termes, comment les spermatozoïdes maintiennent-ils leur position dans la SST pendant si longtemps ?
Forman4 a suggéré que la résidence et l'éjection de SST pourraient être expliquées en termes de motilité des spermatozoïdes.Les auteurs émettent l'hypothèse que les spermatozoïdes maintiennent leur position en nageant contre le flux de fluide créé par l'épithélium SST et que les spermatozoïdes sont éjectés du SST lorsque leur vitesse tombe en dessous du point auquel ils commencent à reculer en raison d'un manque d'énergie.Zaniboni5 a confirmé la présence d'aquaporines 2, 3 et 9 dans la partie apicale des cellules épithéliales SST, ce qui peut indirectement soutenir le modèle de stockage du sperme de Foreman.Dans l'étude actuelle, nous avons constaté que près de la moitié des spermatozoïdes de Sharkashi présentent une rhéologie positive dans le fluide qui s'écoule, et que les faisceaux de spermatozoïdes agglutinés augmentent le nombre de spermatozoïdes présentant une rhéologie positive, bien que l'agglutination les ralentisse.La façon dont les spermatozoïdes remontent la trompe de Fallope de l'oiseau jusqu'au site de fécondation n'est pas entièrement comprise.Chez les mammifères, le liquide folliculaire chimioattire les spermatozoïdes.Cependant, on pense que les chimioattractants dirigent les spermatozoïdes vers de longues distances7.Par conséquent, d'autres mécanismes sont responsables du transport des spermatozoïdes.La capacité des spermatozoïdes à s'orienter et à s'écouler contre le liquide des trompes de Fallope libéré après l'accouplement a été signalée comme étant un facteur majeur dans le ciblage des spermatozoïdes chez la souris.Parker 17 a suggéré que les spermatozoïdes traversent les oviductes en nageant à contre-courant du courant ciliaire chez les oiseaux et les reptiles.Bien que cela n'ait pas été démontré expérimentalement chez les oiseaux, Adolphi18 a été le premier à découvrir que le sperme aviaire donne des résultats positifs lorsqu'une fine couche de liquide entre une lamelle et une lame est créée avec une bande de papier filtre.Rhéologie.Hino et Yanagimachi [19] ont placé un complexe ovaire-tubaire-utérin de souris dans un anneau de perfusion et ont injecté 1 µl d'encre dans l'isthme pour visualiser l'écoulement de liquide dans les trompes de Fallope.Ils ont remarqué un mouvement très actif de contraction et de relaxation dans la trompe de Fallope, dans lequel toutes les boules d'encre se déplaçaient régulièrement vers l'ampoule de la trompe de Fallope.Les auteurs soulignent l'importance de l'écoulement du liquide tubaire des trompes de Fallope inférieures vers les trompes de Fallope supérieures pour le soulèvement des spermatozoïdes et la fécondation.Brillard20 a rapporté que chez les poulets et les dindes, les spermatozoïdes migrent par un mouvement actif de l'entrée vaginale, où ils sont stockés, vers la jonction utéro-vaginale, où ils sont stockés.Cependant, ce mouvement n'est pas nécessaire entre la jonction utéro-vaginale et l'infundibulum car les spermatozoïdes sont transportés par déplacement passif.Connaissant ces recommandations précédentes et les résultats obtenus dans la présente étude, on peut supposer que la capacité des spermatozoïdes à se déplacer vers l'amont (rhéologie) est l'une des propriétés sur lesquelles repose le processus de sélection.Cela détermine le passage des spermatozoïdes à travers le vagin et leur entrée dans le CCT pour le stockage.Comme l'a suggéré Forman4, cela peut également faciliter le processus d'entrée des spermatozoïdes dans la SST et son habitat pendant un certain temps, puis en sortir lorsque leur vitesse commence à ralentir.
D'autre part, Matsuzaki et Sasanami 21 ont suggéré que les spermatozoïdes aviaires subissent des changements de motilité de la dormance à la motilité dans les voies reproductives mâles et femelles.L'inhibition de la motilité des spermatozoïdes résidents dans la SST a été proposée pour expliquer la longue durée de stockage des spermatozoïdes, puis le rajeunissement après avoir quitté la SST.Dans des conditions hypoxiques, Matsuzaki et al.1 ont signalé une production et une libération élevées de lactate dans la SST, ce qui peut entraîner une inhibition de la motilité des spermatozoïdes résidents.Dans ce cas, l'importance de la rhéologie des spermatozoïdes se reflète dans la sélection et l'absorption des spermatozoïdes, et non dans leur stockage.
Le schéma d'agglutination des spermatozoïdes est considéré comme une explication plausible de la longue période de stockage des spermatozoïdes dans le SST, car il s'agit d'un schéma courant de rétention des spermatozoïdes chez les volailles2,22,23.Bakst et al.2 ont observé que la plupart des spermatozoïdes adhéraient les uns aux autres, formant des agrégats fasciculaires, et des spermatozoïdes uniques étaient rarement trouvés dans le CCM de caille.En revanche, Wen et al.24 ont observé plus de spermatozoïdes dispersés et moins de touffes de spermatozoïdes dans la lumière SST chez les poulets.Sur la base de ces observations, on peut supposer que la propension à l'agglutination des spermatozoïdes diffère entre les oiseaux et entre les spermatozoïdes dans le même éjaculat.De plus, Van Krey et al.9 ont suggéré que la dissociation aléatoire des spermatozoïdes agglutinés est responsable de la pénétration progressive des spermatozoïdes dans la lumière de la trompe de Fallope.Selon cette hypothèse, les spermatozoïdes ayant une capacité d'agglutination plus faible devraient être expulsés du SST en premier.Dans ce contexte, la capacité des spermatozoïdes à s'agglutiner peut être un facteur influençant le résultat de la compétition spermatique chez les oiseaux sales.De plus, plus le sperme agglutiné se dissocie longtemps, plus la fertilité est maintenue longtemps.
Bien que l'agrégation des spermatozoïdes et l'agrégation en faisceaux aient été observées dans plusieurs études2,22,24, elles n'ont pas été décrites en détail en raison de la complexité de leur observation cinématique au sein du SST.Plusieurs tentatives ont été faites pour étudier l'agglutination des spermatozoïdes in vitro.Une agrégation étendue mais transitoire a été observée lorsque le fil mince a été retiré de la goutte de graines pendante.Cela conduit au fait qu'une bulle allongée dépasse de la goutte, imitant la glande séminale.En raison des limitations 3D et des temps de séchage au goutte-à-goutte courts, l'ensemble du bloc est rapidement tombé en ruine9.Dans l'étude actuelle, en utilisant des poulets Sharkashi et des puces microfluidiques, nous avons pu décrire comment ces touffes se forment et comment elles se déplacent.Les faisceaux de sperme se sont formés immédiatement après la collecte de sperme et se sont avérés se déplacer en spirale, montrant une rhéologie positive lorsqu'ils étaient présents dans le flux.De plus, lorsqu'ils sont vus macroscopiquement, il a été observé que les faisceaux de spermatozoïdes augmentent la linéarité de la motilité par rapport aux spermatozoïdes isolés.Cela suggère que l'agglutination des spermatozoïdes peut se produire avant la pénétration de la SST et que la production de spermatozoïdes n'est pas limitée à une petite zone en raison du stress, comme suggéré précédemment (Tingari et Lake12).Pendant la formation de la touffe, les spermatozoïdes nagent en synchronie jusqu'à ce qu'ils forment une jonction, puis leurs queues s'enroulent l'une autour de l'autre et la tête du spermatozoïde reste libre, mais la queue et la partie distale du spermatozoïde se collent avec une substance collante.Par conséquent, la tête libre du ligament est responsable du mouvement, entraînant le reste du ligament.La microscopie électronique à balayage des faisceaux de spermatozoïdes a montré des têtes de spermatozoïdes attachées recouvertes de beaucoup de matière collante, ce qui suggère que les têtes de spermatozoïdes étaient attachées dans des faisceaux au repos, ce qui peut s'être produit après avoir atteint le site de stockage (SST).
Lorsqu'un frottis de sperme est coloré avec de l'orange d'acridine, un matériau adhésif extracellulaire autour des spermatozoïdes peut être vu au microscope à fluorescence.Cette substance permet aux faisceaux de sperme d'adhérer et de s'accrocher à toutes les surfaces ou particules environnantes afin qu'ils ne dérivent pas avec le flux environnant.Ainsi, nos observations montrent le rôle de l'adhésion des spermatozoïdes sous forme de faisceaux mobiles.Leur capacité à nager à contre-courant et à coller aux surfaces proches permet aux spermatozoïdes de rester plus longtemps dans la SST.
Rothschild25 a utilisé une caméra d'hémocytométrie pour étudier la distribution flottante de semence bovine dans une goutte de suspension, en prenant des photomicrographies à travers une caméra avec un axe optique à la fois vertical et horizontal du microscope.Les résultats ont montré que les spermatozoïdes étaient attirés à la surface de la chambre.Les auteurs suggèrent qu'il peut y avoir des interactions hydrodynamiques entre le sperme et la surface.En tenant compte de cela, ainsi que de la capacité du sperme de poussin Sharkashi à former des touffes collantes, cela peut augmenter la probabilité que le sperme adhère à la paroi SST et soit stocké pendant de longues périodes.
Bccetti et Afzeliu26 ont rapporté que le glycocalyx du sperme est nécessaire à la reconnaissance et à l'agglutination des gamètes.Forman10 a observé que l'hydrolyse des liaisons α-glycosidiques dans les revêtements glycoprotéine-glycolipide en traitant le sperme aviaire avec de la neuraminidase entraînait une réduction de la fertilité sans affecter la motilité des spermatozoïdes.Les auteurs suggèrent que l'effet de la neuraminidase sur le glycocalyx altère la séquestration des spermatozoïdes à la jonction utéro-vaginale, réduisant ainsi la fertilité.Leurs observations ne peuvent ignorer la possibilité que le traitement à la neuraminidase puisse réduire la reconnaissance des spermatozoïdes et des ovocytes.Forman et Engel10 ont découvert que la fertilité était réduite lorsque les poules étaient inséminées par voie intravaginale avec de la semence traitée à la neuraminidase.Cependant, la FIV avec du sperme traité à la neuraminidase n'a pas affecté la fertilité par rapport aux poulets témoins.Les auteurs ont conclu que des changements dans le revêtement glycoprotéine-glycolipide autour de la membrane spermatique réduisaient la capacité des spermatozoïdes à féconder en altérant la séquestration des spermatozoïdes à la jonction utéro-vaginale, ce qui à son tour augmentait la perte de spermatozoïdes en raison de la vitesse de la jonction utéro-vaginale, mais n'affecte pas la reconnaissance des spermatozoïdes et des ovules.
Chez les dindes, Bakst et Bauchan 11 ont trouvé de petites vésicules et des fragments de membrane dans la lumière de la SST et ont observé que certains de ces granules avaient fusionné avec la membrane du sperme.Les auteurs suggèrent que ces relations peuvent contribuer au stockage à long terme des spermatozoïdes en SST.Cependant, les chercheurs n'ont pas précisé la source de ces particules, si elles sont sécrétées par les cellules épithéliales CCT, produites et sécrétées par le système reproducteur masculin, ou produites par le sperme lui-même.De plus, ces particules sont responsables de l'agglutination.Grützner et al27 ont rapporté que les cellules épithéliales épididymaires produisent et sécrètent une protéine spécifique nécessaire à la formation de voies séminales à pore unique.Les auteurs rapportent également que la dispersion de ces faisceaux dépend de l'interaction des protéines épididymaires.Nixon et al28 ont découvert que les annexes sécrètent une protéine, l'ostéonectine acide riche en cystéine ;SPARC est impliqué dans la formation de touffes de sperme chez les échidnés et les ornithorynques à bec court.La diffusion de ces faisceaux est associée à la perte de cette protéine.
Dans la présente étude, l'analyse ultrastructurale par microscopie électronique a montré que les spermatozoïdes adhéraient à une grande quantité de matériau dense.On pense que ces substances sont responsables de l'agglutination qui se condense entre et autour des têtes adhérentes, mais à des concentrations plus faibles dans la région de la queue.Nous supposons que cette substance agglutinante est excrétée par le système reproducteur masculin (épididyme ou canal déférent) avec le sperme, car nous observons souvent que le sperme se sépare de la lymphe et du plasma séminal lors de l'éjaculation.Il a été rapporté que lorsque les spermatozoïdes aviaires traversent l'épididyme et le canal déférent, ils subissent des changements liés à la maturation qui soutiennent leur capacité à se lier aux protéines et à acquérir des glycoprotéines associées aux lemmes plasmatiques.La persistance de ces protéines sur les membranes spermatiques résidentes dans la SST suggère que ces protéines peuvent influencer l'acquisition de la stabilité des membranes spermatiques 30 et déterminer leur fertilité 31 .Ahammad et al32 ont rapporté que les spermatozoïdes obtenus à partir de diverses parties du système reproducteur masculin (des testicules au canal déférent distal) ont montré une augmentation progressive de la viabilité dans des conditions de stockage liquide, quelle que soit la température de stockage, et la viabilité chez les poulets augmente également dans les trompes de Fallope après insémination artificielle.
Les touffes de sperme de poulet Sharkashi ont des caractéristiques et des fonctions différentes de celles d'autres espèces telles que les échidnés, les ornithorynques, les souris des bois, les rats sylvestres et les cobayes.Chez les poulets sharkasi, la formation de faisceaux de spermatozoïdes a réduit leur vitesse de nage par rapport aux spermatozoïdes uniques.Cependant, ces faisceaux ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes rhéologiquement positifs et augmenté la capacité des spermatozoïdes à se stabiliser dans un environnement dynamique.Ainsi, nos résultats confirment la suggestion précédente selon laquelle l'agglutination des spermatozoïdes dans la SST est associée au stockage à long terme des spermatozoïdes.Nous émettons également l'hypothèse que la propension des spermatozoïdes à former des touffes peut contrôler le taux de perte de spermatozoïdes dans la SST, ce qui peut modifier le résultat de la compétition des spermatozoïdes.Selon cette hypothèse, les spermatozoïdes à faible capacité d'agglutination libèrent la SST en premier, tandis que les spermatozoïdes à forte capacité d'agglutination produisent la majeure partie de la progéniture.La formation de faisceaux de spermatozoïdes à pore unique est bénéfique et affecte le rapport parent-enfant, mais utilise un mécanisme différent.Chez les échidnés et les ornithorynques, les spermatozoïdes sont disposés parallèlement les uns aux autres pour augmenter la vitesse d'avancement du faisceau.Les faisceaux d'échidnés se déplacent environ trois fois plus vite que les spermatozoïdes isolés.On pense que la formation de telles touffes de sperme chez les échidnés est une adaptation évolutive pour maintenir la dominance, car les femelles sont promiscuité et s'accouplent généralement avec plusieurs mâles.Par conséquent, les spermatozoïdes de différents éjaculats se disputent férocement la fécondation de l'ovule.
Les spermatozoïdes agglutinés de poulets sharkasi sont faciles à visualiser en utilisant la microscopie à contraste de phase, ce qui est considéré comme avantageux car il permet une étude facile du comportement des spermatozoïdes in vitro.Le mécanisme par lequel la formation de touffes de spermatozoïdes favorise la reproduction chez les poulets sharkasi est également différent de celui observé chez certains mammifères placentaires représentant un comportement coopératif des spermatozoïdes tels que les souris des bois, où certains spermatozoïdes atteignent les œufs, aidant d'autres individus apparentés à atteindre et à endommager leurs œufs.faire ses preuves.comportement altruiste.Autofécondation 34. Un autre exemple de comportement coopératif chez les spermatozoïdes a été trouvé chez les souris sylvestres, où les spermatozoïdes ont pu identifier et se combiner avec les spermatozoïdes les plus génétiquement apparentés et former des groupes coopératifs pour augmenter leur vitesse par rapport aux spermatozoïdes non apparentés35.
Les résultats obtenus dans cette étude ne contredisent pas la théorie de Foman sur le stockage à long terme des spermatozoïdes dans SWS.Les chercheurs rapportent que les spermatozoïdes continuent de se déplacer dans le flux de cellules épithéliales tapissant la SST pendant une période prolongée, et après un certain temps, les réserves d'énergie des spermatozoïdes sont épuisées, ce qui entraîne une diminution de la vitesse, ce qui permet l'expulsion de substances de faible poids moléculaire.énergie des spermatozoïdes avec le flux de fluide de la lumière de la SST La cavité de la trompe de Fallope.Dans l'étude actuelle, nous avons observé que la moitié des spermatozoïdes individuels montraient la capacité de nager contre les fluides en circulation, et leur adhérence dans le faisceau augmentait leur capacité à montrer une rhéologie positive.De plus, nos données sont cohérentes avec celles de Matsuzaki et al.1 qui ont rapporté que l'augmentation de la sécrétion de lactate dans la SST peut inhiber la motilité des spermatozoïdes résidents.Cependant, nos résultats décrivent la formation des ligaments mobiles des spermatozoïdes et leur comportement rhéologique en présence d'un environnement dynamique au sein d'un microcanal dans le but d'élucider leur comportement dans la SST.Les recherches futures pourraient se concentrer sur la détermination de la composition chimique et de l'origine de l'agent agglutinant, ce qui aidera sans aucun doute les chercheurs à développer de nouvelles façons de stocker le sperme liquide et d'augmenter la durée de la fertilité.
Quinze sharkasi mâles à cou nu âgés de 30 semaines (homozygote dominant; Na Na) ont été sélectionnés comme donneurs de sperme dans l'étude.Les oiseaux ont été élevés à la ferme avicole de recherche de la faculté d'agriculture de l'université d'Ashit, dans le gouvernorat d'Ashit, en Égypte.Les oiseaux ont été logés dans des cages individuelles (30 x 40 x 40 cm), soumis à un programme lumineux (16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité) et nourris avec un régime contenant 160 g de protéines brutes, 2800 kcal d'énergie métabolisable, 35 g de calcium chacun.5 grammes de phosphore assimilable par kilogramme d'alimentation.
Selon les données 36, 37, le sperme a été prélevé sur des mâles par massage abdominal.Au total, 45 échantillons de sperme ont été prélevés sur 15 hommes pendant 3 jours.Le sperme (n = 15/jour) a été immédiatement dilué à 1:1 (v:v) avec le diluant de sperme de volaille Belsville, qui contient du diphosphate de potassium (1,27 g), du glutamate monosodique monohydraté (0,867 g), du fructose (0,5 j) de sodium anhydre.acétate (0,43 g), tris(hydroxyméthyl)aminométhane (0,195 g), citrate de potassium monohydraté (0,064 g), monophosphate de potassium (0,065 g), chlorure de magnésium (0,034 g) et H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarité 333 mOsm/kg38.Les échantillons de sperme dilué ont d'abord été examinés au microscope optique pour s'assurer de la bonne qualité du sperme (humidité), puis stockés dans un bain-marie à 37 ° C jusqu'à utilisation dans la demi-heure suivant le prélèvement.
La cinématique et la rhéologie des spermatozoïdes sont décrites à l'aide d'un système de dispositifs microfluidiques.Les échantillons de sperme ont été encore dilués à 1:40 dans le diluant de sperme aviaire Beltsville, chargés dans un dispositif microfluidique (voir ci-dessous), et les paramètres cinétiques ont été déterminés à l'aide d'un système d'analyse informatisée du sperme (CASA) précédemment développé pour la caractérisation microfluidique.sur la mobilité des spermatozoïdes en milieu liquide (Département de Génie Mécanique, Faculté d'Ingénierie, Université d'Assiut, Egypte).Le plugin peut être téléchargé sur : http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.La vitesse de courbe (VCL, μm/s), la vitesse linéaire (VSL, μm/s) et la vitesse de trajectoire moyenne (VAP, μm/s) ont été mesurées.Des vidéos de spermatozoïdes ont été prises à l'aide d'un microscope à contraste de phase Optika XDS-3 inversé (avec objectif 40x) connecté à une caméra Tucson ISH1000 à 30 ips pendant 3 s.Utilisez le logiciel CASA pour étudier au moins trois zones et 500 trajectoires de sperme par échantillon.La vidéo enregistrée a été traitée à l'aide d'un CASA fait maison.La définition de la motilité dans le plug-in CASA est basée sur la vitesse de nage du sperme par rapport au débit et n'inclut pas d'autres paramètres tels que le mouvement latéral, car cela s'est avéré plus fiable dans le flux de fluide.Le mouvement rhéologique est décrit comme le mouvement des spermatozoïdes dans le sens contraire de l'écoulement du fluide.Les spermatozoïdes ayant des propriétés rhéologiques ont été divisés par le nombre de spermatozoïdes mobiles ;les spermatozoïdes au repos et les spermatozoïdes en mouvement convectif ont été exclus du comptage.
Tous les produits chimiques utilisés ont été obtenus auprès d'Elgomhoria Pharmaceuticals (Le Caire, Égypte), sauf indication contraire.Le dispositif a été fabriqué comme décrit par El-sherry et al.40 avec quelques modifications.Les matériaux utilisés pour fabriquer les microcanaux comprenaient des plaques de verre (Howard Glass, Worcester, MA), du résist négatif SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), de l'alcool diacétonique (Sigma Aldrich, Steinheim, Allemagne) et du polyacétone.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Les microcanaux sont fabriqués par lithographie douce.Tout d'abord, un masque facial de protection transparent avec la conception de microcanaux souhaitée a été imprimé sur une imprimante haute résolution (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON).Les masters ont été réalisés en utilisant des plaques de verre comme substrats.Les plaques ont été nettoyées dans de l'acétone, de l'isopropanol et de l'eau désionisée, puis recouvertes d'une couche de 20 µm de SU8-25 par centrifugation (3000 tr/min, 1 min).Les couches de SU-8 ont ensuite été séchées doucement (65°C, 2 min et 95°C, 10 min) et exposées au rayonnement UV pendant 50 s.Cuisson post-exposition à 65°C et 95°C pendant 1 min et 4 min pour réticuler les couches de SU-8 exposées, suivie d'un développement dans de l'alcool diacétonique pendant 6,5 min.Dur cuire les gaufres (200 ° C pendant 15 min) pour solidifier davantage la couche SU-8.
Le PDMS a été préparé en mélangeant le monomère et le durcisseur dans un rapport pondéral de 10:1, puis dégazé dans un dessiccateur à vide et versé sur le châssis principal SU-8.Le PDMS a été cuit dans un four (120°C, 30 min), puis les canaux ont été découpés, séparés du maître et perforés pour permettre la fixation des tubes à l'entrée et à la sortie du microcanal.Enfin, des microcanaux PDMS ont été fixés en permanence à des lames de microscope à l'aide d'un processeur corona portable (Electro-Technic Products, Chicago, IL) comme décrit ailleurs.Le microcanal utilisé dans cette étude mesure 200 µm × 20 µm (L × H) et mesure 3,6 cm de long.
L'écoulement de fluide induit par la pression hydrostatique à l'intérieur du microcanal est obtenu en maintenant le niveau de fluide dans le réservoir d'entrée au-dessus de la différence de hauteur Δh39 dans le réservoir de sortie (Fig. 1).
où f est le coefficient de frottement, défini comme f = C/Re pour un écoulement laminaire dans un canal rectangulaire, où C est une constante dépendant du rapport d'aspect du canal, L est la longueur du microcanal, Vav est la vitesse moyenne à l'intérieur du microcanal, Dh est le diamètre hydraulique du canal, g - accélération de la gravité.À l'aide de cette équation, la vitesse moyenne du canal peut être calculée à l'aide de l'équation suivante :