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La fertilité des oiseaux dépend de leur capacité à stocker suffisamment de spermatozoïdes viables pendant une période prolongée dans les tubules de stockage du sperme (TSS). Le mécanisme exact par lequel les spermatozoïdes entrent, séjournent et quittent les TSS reste controversé. Le sperme des poules sharkasi présentait une forte tendance à l'agglutination, formant des faisceaux filamenteux mobiles contenant de nombreuses cellules. Face à la difficulté d'observer la motilité et le comportement des spermatozoïdes dans une trompe de Fallope opaque, nous avons utilisé un dispositif microfluidique doté d'un microcanal de section similaire à celui des spermatozoïdes pour étudier l'agglutination et la motilité des spermatozoïdes. Cette étude examine la formation et le déplacement des faisceaux de spermatozoïdes, ainsi que leur rôle potentiel dans la prolongation de leur séjour dans les TSS. Nous avons étudié la vitesse et le comportement rhéologique des spermatozoïdes lorsqu'un écoulement de fluide était généré dans un canal microfluidique par pression hydrostatique (débit = 33 µm/s). Les spermatozoïdes ont tendance à nager à contre-courant (rhéologie positive) et la vitesse du faisceau de spermatozoïdes est significativement réduite par rapport à celle des spermatozoïdes isolés. On a observé que les faisceaux de spermatozoïdes se déplacent en spirale et augmentent en longueur et en épaisseur à mesure que davantage de spermatozoïdes isolés sont recrutés. Des faisceaux de spermatozoïdes ont été observés s'approchant et adhérant aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être balayés par une vitesse d'écoulement du fluide > 33 µm/s. Des faisceaux de spermatozoïdes ont été observés s'approchant et adhérant aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être balayés par une vitesse d'écoulement du fluide > 33 µm/s. Il est prévu que les spermatozoïdes s'utilisent et se propagent dans les canaux microscopiques pour permettre l'alimentation. со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Il a été observé que les faisceaux de spermatozoïdes s'approchent et adhèrent aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être emportés à des débits de fluide > 33 µm/s.33 µm/s 扫过。33 µm/s. Il est important de noter que les spermatozoïdes peuvent être utilisés et appliqués aux canaux microscopiques que vous devez utiliser. сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Il a été observé que les faisceaux de spermatozoïdes s'approchent et adhèrent aux parois latérales du canal microfluidique pour éviter d'être emportés par le flux de fluide à > 33 µm/s.La microscopie électronique à balayage et à transmission a révélé que les faisceaux de spermatozoïdes étaient soutenus par un matériau dense et abondant. Les données obtenues démontrent la mobilité unique des spermatozoïdes de poulet Sharkazi, ainsi que leur capacité à s'agglutiner et à former des faisceaux mobiles, ce qui contribue à une meilleure compréhension du stockage à long terme des spermatozoïdes dans le SMT.
Pour que la fécondation soit possible chez l'homme et la plupart des animaux, les spermatozoïdes et les ovules doivent arriver au site de fécondation au moment opportun. L'accouplement doit donc avoir lieu avant ou au moment de l'ovulation. En revanche, certains mammifères, comme les chiens, ainsi que des espèces non mammifères, comme les insectes, les poissons, les reptiles et les oiseaux, stockent les spermatozoïdes dans leurs organes reproducteurs pendant une période prolongée jusqu'à ce que leurs ovules soient prêts à être fécondés (fécondation asynchrone 1 ). Les oiseaux sont capables de maintenir la viabilité des spermatozoïdes capables de féconder les ovules pendant 2 à 10 semaines 2.
Il s'agit d'une caractéristique unique qui distingue les oiseaux des autres animaux, car elle offre une forte probabilité de fécondation après une seule insémination pendant plusieurs semaines, sans accouplement ni ovulation simultanés. Le principal organe de stockage des spermatozoïdes, appelé tubule de stockage des spermatozoïdes (TSS), est situé dans les replis muqueux internes, à la jonction utéro-vaginale. À ce jour, les mécanismes par lesquels les spermatozoïdes entrent, séjournent et sortent de la banque de sperme ne sont pas entièrement compris. De nombreuses hypothèses ont été avancées lors d'études antérieures, mais aucune n'a été confirmée.
Forman4 a émis l'hypothèse que les spermatozoïdes maintiennent leur résidence dans la cavité SST grâce à un mouvement oscillatoire continu contre la direction du flux de fluide à travers les canaux protéiques situés sur les cellules épithéliales SST (rhéologie). L'ATP est épuisée en raison de l'activité flagellaire constante nécessaire au maintien des spermatozoïdes dans la lumière SST et la motilité finit par diminuer jusqu'à ce que les spermatozoïdes soient transportés hors de la banque de sperme par le flux de fluide et entament un nouveau voyage le long de la trompe de Fallope ascendante pour féconder les spermatozoïdes. Ovule (Forman4). Ce modèle de stockage des spermatozoïdes est étayé par la détection par immunocytochimie des aquaporines 2, 3 et 9 présentes dans les cellules épithéliales SST. À ce jour, les études sur la rhéologie du sperme de poulet et son rôle dans le stockage SST, la sélection vaginale des spermatozoïdes et la compétition spermatique font défaut. Chez les poulets, les spermatozoïdes pénètrent dans le vagin après l'accouplement naturel, mais plus de 80 % des spermatozoïdes sont éjectés du vagin peu après l'accouplement. Cela suggère que le vagin est le principal site de sélection des spermatozoïdes chez les oiseaux. De plus, il a été rapporté que moins de 1 % des spermatozoïdes fécondés dans le vagin finissent en SST2. Lors de l'insémination artificielle des poussins par voie vaginale, le nombre de spermatozoïdes atteignant la SST a tendance à augmenter 24 heures après l'insémination. Jusqu'à présent, le mécanisme de sélection des spermatozoïdes au cours de ce processus n'est pas clair, et la motilité des spermatozoïdes pourrait jouer un rôle important dans l'absorption des spermatozoïdes en SST. En raison des parois épaisses et opaques des trompes de Fallope, il est difficile de surveiller directement la motilité des spermatozoïdes dans les trompes de Fallope des oiseaux. Par conséquent, nous manquons de connaissances de base sur la manière dont les spermatozoïdes passent en SST après la fécondation.
La rhéologie a récemment été reconnue comme un facteur important contrôlant le transport des spermatozoïdes dans les organes génitaux des mammifères. Se basant sur la capacité des spermatozoïdes mobiles à migrer à contre-courant, Zaferani et al.8 ont utilisé un système microfluidique Corra pour isoler passivement les spermatozoïdes mobiles à partir d'échantillons de sperme en cage. Ce type de tri du sperme est essentiel pour le traitement médical de l'infertilité et la recherche clinique, et est préféré aux méthodes traditionnelles, chronophages et laborieuses, qui peuvent compromettre la morphologie et l'intégrité structurelle des spermatozoïdes. Cependant, à ce jour, aucune étude n'a été menée sur l'effet des sécrétions des organes génitaux des poulets sur la motilité des spermatozoïdes.
Quel que soit le mécanisme de stockage des spermatozoïdes dans la SST, de nombreux chercheurs ont observé que les spermatozoïdes résidents s'agglutinent tête-à-tête dans la SST des poulets 9, 10, des cailles 2 et des dindes 11 pour former des faisceaux de spermatozoïdes agglutinés. Les auteurs suggèrent un lien entre cette agglutination et le stockage à long terme des spermatozoïdes dans la SST.
Tingari et Lake12 ont signalé une forte association entre les spermatozoïdes dans la glande réceptrice du poulet et se sont demandé si les spermatozoïdes aviaires s'agglutinaient de la même manière que les spermatozoïdes de mammifères. Ils pensent que les connexions profondes entre les spermatozoïdes dans le canal déférent pourraient être dues au stress causé par la présence d'un grand nombre de spermatozoïdes dans un espace restreint.
Lors de l'évaluation du comportement des spermatozoïdes sur des lames de verre fraîches suspendues, des signes transitoires d'agglutination peuvent être observés, notamment sur les bords des gouttelettes de sperme. Cependant, l'agglutination était souvent perturbée par l'action rotationnelle associée au mouvement continu, ce qui explique le caractère transitoire de ce phénomène. Les chercheurs ont également constaté l'apparition d'agrégats cellulaires allongés, ressemblant à des filaments, lors de l'ajout du diluant au sperme.
Les premières tentatives d'imitation d'un spermatozoïde ont été réalisées en retirant un fil fin d'une goutte pendante, ce qui a donné naissance à une vésicule allongée ressemblant à un spermatozoïde, dépassant de la goutte de sperme. Les spermatozoïdes se sont immédiatement alignés parallèlement à l'intérieur de la vésicule, mais l'unité entière a rapidement disparu en raison de la limitation 3D. Par conséquent, pour étudier l'agglutination des spermatozoïdes, il est nécessaire d'observer leur motilité et leur comportement directement dans des tubules de stockage de spermatozoïdes isolés, ce qui est difficile à réaliser. Il est donc nécessaire de développer un instrument qui imite les spermatozoïdes pour étayer les études sur la motilité des spermatozoïdes et leur comportement d'agglutination. Brillard et al.13 ont rapporté que la longueur moyenne des tubules de stockage de spermatozoïdes chez les poussins adultes est de 400 à 600 µm, mais que certains SST peuvent atteindre 2 000 µm. Français Mero et Ogasawara14 ont divisé les glandes séminifères en tubules de stockage des spermatozoïdes élargis et non élargis, tous deux de même longueur (~ 500 µm) et de même largeur de col (~ 38 µm), mais le diamètre moyen de la lumière des tubules était de 56,6 et 56,6 µm. . , respectivement 11,2 µm, respectivement. Dans la présente étude, nous avons utilisé un dispositif microfluidique avec une taille de canal de 200 µm × 20 µm (L × H), dont la section transversale est assez proche de celle du SST amplifié. De plus, nous avons examiné la motilité des spermatozoïdes et le comportement d'agglutination dans le liquide en écoulement, ce qui est cohérent avec l'hypothèse de Foreman selon laquelle le liquide produit par les cellules épithéliales du SST maintient les spermatozoïdes dans la lumière dans une direction à contre-courant (rhéologique).
L'objectif de cette étude était de surmonter les difficultés d'observation de la motilité des spermatozoïdes dans la trompe de Fallope et d'éviter les difficultés liées à l'étude de la rhéologie et du comportement des spermatozoïdes en milieu dynamique. Un dispositif microfluidique a été utilisé pour créer une pression hydrostatique afin de simuler la motilité des spermatozoïdes dans les organes génitaux d'un poulet.
Lorsqu'une goutte d'échantillon de sperme dilué (1:40) a été déposée dans le dispositif à microcanaux, deux types de motilité spermatique ont pu être identifiés (spermatozoïdes isolés et spermatozoïdes liés). De plus, les spermatozoïdes avaient tendance à nager à contre-courant (rhéologie positive ; vidéos 1 et 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes solitaires (p < 0,001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p < 0,001 ; tableau 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes solitaires (p < 0,001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p < 0,001 ; tableau 2). Les spermatozoïdes ont une plus grande proportion de spermatozoïdes (p < 0,001), dont le pourcentage est remarquable. сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001 ; tableau 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes individuels (p < 0,001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p < 0,001 ; Tableau 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Le taux de spermatozoïdes est faible, c'est-à-dire que vous avez une forte proportion de spermatozoïdes (p < 0,001), dont la proportion de spermatozoïdes est très élevée. положительной реологией (p < 0,001 ; tableau 2). Bien que la vitesse des faisceaux de spermatozoïdes soit inférieure à celle des spermatozoïdes individuels (p < 0,001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes avec une rhéologie positive (p < 0,001 ; Tableau 2).La rhéologie positive pour les spermatozoïdes simples et les touffes est estimée à environ 53 % et 85 %, respectivement.
Il a été observé que les spermatozoïdes des poules sharkasi forment, immédiatement après l'éjaculation, des faisceaux linéaires, composés de dizaines d'individus. Ces touffes augmentent en longueur et en épaisseur avec le temps et peuvent rester in vitro plusieurs heures avant de se dissiper (vidéo 3). Ces faisceaux filamenteux ont la forme des spermatozoïdes d'échidné qui se forment à l'extrémité de l'épididyme. Le sperme de poule sharkasi a une forte tendance à s'agglutiner et à former un faisceau réticulé moins d'une minute après sa collecte. Ces faisceaux sont dynamiques et peuvent adhérer à toute paroi ou objet statique à proximité. Bien que les faisceaux de spermatozoïdes réduisent la vitesse des spermatozoïdes, il est clair qu'à l'échelle macroscopique, ils augmentent leur linéarité. La longueur des faisceaux varie en fonction du nombre de spermatozoïdes collectés dans les faisceaux. Deux parties du faisceau ont été isolées : la partie initiale, comprenant la tête libre du spermatozoïde agglutiné, et la partie terminale, comprenant la queue et toute l'extrémité distale du spermatozoïde. À l'aide d'une caméra haute vitesse (950 ips), des têtes libres de spermatozoïdes agglutinés ont été observées dans la partie initiale du faisceau. Leur mouvement oscillatoire entrainait les spermatozoïdes restants dans le faisceau par un mouvement hélicoïdal (Vidéo 4). Cependant, dans les longues touffes, on a observé que certaines têtes libres de spermatozoïdes adhéraient au corps et que la partie terminale de la touffe agissait comme des ailettes pour propulser la touffe.
Dans un flux lent de liquide, les faisceaux de spermatozoïdes se déplacent parallèlement les uns aux autres. Cependant, ils commencent à se chevaucher et à se coller à tout ce qui est immobile, afin de ne pas être emportés par le courant lorsque la vitesse augmente. Les faisceaux se forment lorsqu'une poignée de spermatozoïdes se rapprochent les uns des autres ; ils se déplacent alors de manière synchrone et s'enroulent les uns autour des autres, puis se collent à une substance collante. Les figures 1 et 2 montrent comment les spermatozoïdes se rapprochent les uns des autres, formant une jonction lorsque les queues s'enroulent l'une autour de l'autre.
Les chercheurs ont appliqué une pression hydrostatique pour créer un écoulement de fluide dans un microcanal afin d'étudier la rhéologie des spermatozoïdes. Un microcanal de 200 µm × 20 µm (l × H) et de 3,6 µm de longueur a été utilisé. Des microcanaux ont été placés entre les récipients, munis de seringues à leurs extrémités. Du colorant alimentaire a été utilisé pour rendre les canaux plus visibles.
Fixez les câbles d'interconnexion et les accessoires au mur. La vidéo a été prise avec un microscope à contraste de phase. Chaque image présente des images de microscopie à contraste de phase et de cartographie. (A) La connexion entre deux flux résiste à l'écoulement en raison d'un mouvement hélicoïdal (flèche rouge). (B) La connexion entre le faisceau de tubes et la paroi du canal (flèches rouges) est simultanément connectée à deux autres faisceaux (flèches jaunes). (C) Les faisceaux de spermatozoïdes dans le canal microfluidique commencent à se connecter les uns aux autres (flèches rouges), formant un maillage de faisceaux de spermatozoïdes. (D) Formation d'un réseau de faisceaux de spermatozoïdes.
Lorsqu'une goutte de sperme dilué était introduite dans le dispositif microfluidique et qu'un flux était créé, on observait que le faisceau de spermatozoïdes se déplaçait à contre-sens du flux. Les faisceaux s'ajustent parfaitement aux parois des microcanaux, et les têtes libres de la partie initiale des faisceaux s'y ajustent également parfaitement (vidéo 5). Ils adhèrent également aux particules stationnaires sur leur passage, comme les débris, pour résister au courant. Au fil du temps, ces touffes se transforment en longs filaments piégeant d'autres spermatozoïdes isolés et des touffes plus courtes (vidéo 6). Lorsque le flux ralentit, de longues lignes de spermatozoïdes forment un réseau de lignes spermatiques (vidéo 7 ; figure 2).
À une vitesse d'écoulement élevée (V > 33 µm/s), les mouvements en spirale des fils sont augmentés pour tenter d'attraper de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux qui résistent mieux à la force de dérive de l'écoulement. À une vitesse d'écoulement élevée (V > 33 µm/s), les mouvements en spirale des fils sont augmentés pour tenter d'attraper de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux qui résistent mieux à la force de dérive de l'écoulement. Si votre puissance est élevée (V > 33 mcm/s), la vitesse d'utilisation de la spirale est supérieure à 33 mcm/s. D'autres spermatozoïdes, des poches ouvertes, dont les activités se déroulent à un moment donné. À des débits élevés (V > 33 µm/s), les mouvements hélicoïdaux des brins augmentent alors qu'ils tentent d'attraper de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux mieux à même de résister à la force de dérive du flux.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而 更地 抵抗 的 漂移力。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Lors de votre consommation de puissance (V > 33 µm/s), une légère poussée en spirale s'applique à la plupart des autres utilisateurs. les spermatozoïdes, les poches qui s'occupent de la peau. À des débits élevés (V > 33 µm/s), le mouvement hélicoïdal des filaments augmente pour tenter de capturer de nombreux spermatozoïdes individuels formant des faisceaux afin de mieux résister aux forces de dérive du flux.Ils ont également essayé de fixer des microcanaux sur les parois latérales.
Les faisceaux de spermatozoïdes ont été identifiés comme des amas de têtes et de queues enroulées par microscopie optique (MO). Les faisceaux de spermatozoïdes avec divers agrégats ont également été identifiés comme des têtes torsadées et des agrégats flagellaires, des queues multiples fusionnées, des têtes de spermatozoïdes attachées à une queue et des têtes de spermatozoïdes avec des noyaux courbés comme des noyaux multiples fusionnés. microscopie électronique à transmission (MET). La microscopie électronique à balayage (MEB) a montré que les faisceaux de spermatozoïdes étaient des agrégats gainés de têtes de spermatozoïdes et que les agrégats de spermatozoïdes présentaient un réseau attaché de queues enroulées.
La morphologie et l'ultrastructure des spermatozoïdes, la formation des faisceaux de spermatozoïdes ont été étudiées à l'aide de la microscopie optique (demi-section), de la microscopie électronique à balayage (MEB) et de la microscopie électronique à transmission (MET), les frottis de sperme ont été colorés à l'orange d'acridine et examinés à l'aide de la microscopie à épifluorescence.
La coloration du frottis de sperme à l'orange d'acridine (Fig. 3B) a montré que les têtes des spermatozoïdes étaient collées les unes aux autres et recouvertes de sécrétions, ce qui a conduit à la formation de larges touffes (Fig. 3D). Les faisceaux de spermatozoïdes étaient constitués d'agrégats de spermatozoïdes avec un réseau de queues attachées (Fig. 4A-C). Les faisceaux de spermatozoïdes sont composés des queues de nombreux spermatozoïdes collées les unes aux autres (Fig. 4D). Des sécrétions (Fig. 4E,F) recouvraient les têtes des faisceaux de spermatozoïdes.
Formation du faisceau de spermatozoïdes En utilisant la microscopie à contraste de phase et des frottis de sperme colorés à l'orange d'acridine, il a été montré que les têtes des spermatozoïdes se collent les unes aux autres. (A) La formation précoce de la touffe de spermatozoïdes commence avec un spermatozoïde (cercle blanc) et trois spermatozoïdes (cercle jaune), la spirale commençant à la queue et se terminant à la tête. (B) Microphotographie d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant des têtes de spermatozoïdes adhérentes (flèches). L'écoulement recouvre la ou les têtes. Grossissement × 1000. (C) Développement d'un large faisceau transporté par écoulement dans un canal microfluidique (en utilisant une caméra à grande vitesse à 950 ips). (D) Micrographie d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant de grandes touffes (flèches). Grossissement : × 200.
Micrographie électronique à balayage d'un faisceau de spermatozoïdes et d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine. (A, B, D, E) sont des micrographies électroniques à balayage couleur numériques de spermatozoïdes, et C et F sont des micrographies de frottis de sperme colorés à l'orange d'acridine montrant l'attachement de plusieurs spermatozoïdes enveloppant la membrane caudale. (AC) Les agrégats de spermatozoïdes sont représentés par un réseau de queues attachées (flèches). (D) Adhésion de plusieurs spermatozoïdes (avec substance adhésive, contour rose, flèche) s'enroulant autour de la queue. (E et F) Agrégats de têtes de spermatozoïdes (pointeurs) recouverts de matière adhésive (pointeurs). Les spermatozoïdes formaient des faisceaux avec plusieurs structures en forme de vortex (F). (C) Grossissements ×400 et (F) ×200.
En utilisant la microscopie électronique à transmission, nous avons constaté que les faisceaux de spermatozoïdes avaient des queues attachées (Fig. 6A, C), des têtes attachées à des queues (Fig. 6B) ou des têtes attachées à des queues (Fig. 6D). Les têtes des spermatozoïdes du faisceau sont courbées, présentant en coupe deux régions nucléaires (Fig. 6D). Dans le faisceau incisé, les spermatozoïdes présentaient une tête torsadée avec deux régions nucléaires et plusieurs régions flagellaires (Fig. 5A).
Micrographie électronique couleur numérique montrant les queues de connexion du faisceau de spermatozoïdes et le matériel d'agglutination reliant les têtes des spermatozoïdes. (A) Queue attachée d'un grand nombre de spermatozoïdes. Observez l'aspect de la queue en projection portrait (flèche) et paysage (flèche). (B) La tête (flèche) du spermatozoïde est connectée à la queue (flèche). (C) Plusieurs queues de spermatozoïdes (flèches) sont attachées. (D) Le matériel d'agglutination (AS, bleu) relie quatre têtes de spermatozoïdes (violet).
La microscopie électronique à balayage a permis de détecter les têtes de spermatozoïdes dans les faisceaux spermatiques recouverts de sécrétions ou de membranes (figure 6B), indiquant que ces faisceaux étaient ancrés par du matériel extracellulaire. Le matériel agglutiné était concentré dans la tête du spermatozoïde (assemblage en forme de tête de méduse ; figure 5B) et s'est dilaté distalement, donnant un aspect jaune brillant en microscopie à fluorescence après coloration à l'orange d'acridine (figure 6C). Cette substance est clairement visible au microscope à balayage et est considérée comme un liant. Des coupes semi-fines (figure 5C) et des frottis de sperme colorés à l'orange d'acridine ont montré des faisceaux spermatiques contenant des têtes denses et des queues recourbées (figure 5D).
Diverses microphotographies montrant l'agrégation des têtes et des queues repliées des spermatozoïdes par diverses méthodes. (A) Micrographie électronique à transmission couleur numérique en coupe transversale d'un faisceau de spermatozoïdes montrant une tête enroulée avec un noyau en deux parties (bleu) et plusieurs parties flagellaires (vert). (B) Micrographie électronique à balayage couleur numérique montrant un amas de têtes de spermatozoïdes ressemblant à des méduses (flèches) qui semblent recouvertes. (C) Coupe semi-fine montrant des têtes de spermatozoïdes agrégées (flèches) et des queues recourbées (flèches). (D) Micrographie d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant des agrégats de têtes de spermatozoïdes (flèches) et des queues adhérentes recourbées (flèches). Notez qu'une substance collante (S) recouvre la tête du spermatozoïde. (D) Grossissement × 1000.
En utilisant la microscopie électronique à transmission (Fig. 7A), il a également été noté que les têtes des spermatozoïdes étaient tordues et que les noyaux avaient une forme en spirale, comme le confirment les frottis de sperme colorés à l'orange d'acridine et examinés à l'aide d'une microscopie à fluorescence (Fig. 7B).
(A) Micrographie électronique à transmission couleur numérique et (B) Frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant des têtes enroulées et la fixation des têtes et des queues de spermatozoïdes (flèches). (B) Grossissement × 1000.
Une découverte intéressante est que les spermatozoïdes de Sharkazi s'agrègent pour former des faisceaux filamenteux mobiles. Les propriétés de ces faisceaux nous permettent de comprendre leur rôle potentiel dans l'absorption et le stockage des spermatozoïdes dans la SST.
Après l'accouplement, les spermatozoïdes pénètrent dans le vagin et subissent un processus de sélection intense, ce qui fait qu'un nombre limité de spermatozoïdes pénètrent dans la SST15,16. À ce jour, les mécanismes d'entrée et de sortie des spermatozoïdes dans la SST ne sont pas clairs. Chez les volailles, les spermatozoïdes sont stockés dans la SST pendant une période prolongée de 2 à 10 semaines, selon l'espèce6. La controverse persiste quant à l'état du sperme pendant son stockage dans la SST. Sont-ils en mouvement ou au repos ? Autrement dit, comment les spermatozoïdes maintiennent-ils leur position dans la SST aussi longtemps ?
Forman4 a suggéré que la résidence et l'éjection dans la SST pourraient s'expliquer par la motilité des spermatozoïdes. Les auteurs émettent l'hypothèse que les spermatozoïdes maintiennent leur position en nageant à contre-courant du flux de fluide créé par l'épithélium de la SST et qu'ils sont éjectés de la SST lorsque leur vitesse chute en dessous du point où ils commencent à reculer par manque d'énergie. Zaniboni5 a confirmé la présence des aquaporines 2, 3 et 9 dans la partie apicale des cellules épithéliales de la SST, ce qui pourrait indirectement étayer le modèle de stockage des spermatozoïdes de Foreman. Dans la présente étude, nous avons constaté que près de la moitié des spermatozoïdes de Sharkashi présentent une rhéologie positive dans le fluide en écoulement, et que les faisceaux de spermatozoïdes agglutinés augmentent le nombre de spermatozoïdes présentant une rhéologie positive, bien que l'agglutination les ralentisse. Le mode de déplacement des spermatozoïdes dans la trompe de Fallope des oiseaux jusqu'au site de fécondation n'est pas entièrement compris. Chez les mammifères, le liquide folliculaire chimio-attire les spermatozoïdes. Cependant, on pense que les chimioattractants dirigent les spermatozoïdes vers de longues distances7. Par conséquent, d'autres mécanismes sont responsables du transport des spermatozoïdes. La capacité des spermatozoïdes à s'orienter et à s'écouler contre le liquide des trompes de Fallope libéré après l'accouplement a été rapportée comme étant un facteur majeur dans le ciblage des spermatozoïdes chez la souris. Parker 17 a suggéré que les spermatozoïdes traversent les oviductes en nageant à contre-courant ciliaire chez les oiseaux et les reptiles. Bien que cela n'ait pas été démontré expérimentalement chez les oiseaux, Adolphi18 a été le premier à découvrir que le sperme aviaire donne des résultats positifs lorsqu'une fine couche de liquide entre une lamelle et une lame est créée avec une bande de papier filtre. Rhéologie. Hino et Yanagimachi [19] ont placé un complexe ovaire-tubaire-utérin de souris dans un anneau de perfusion et ont injecté 1 µl d'encre dans l'isthme pour visualiser l'écoulement du liquide dans les trompes de Fallope. Ils ont observé un mouvement très actif de contraction et de relaxation dans la trompe de Fallope, dans lequel toutes les boules d'encre se déplaçaient régulièrement vers l'ampoule de la trompe de Fallope. Les auteurs soulignent l'importance du flux de liquide tubaire des trompes de Fallope inférieures vers les trompes de Fallope supérieures pour la remontée des spermatozoïdes et la fécondation. Brillard20 a rapporté que chez les poulets et les dindes, les spermatozoïdes migrent par mouvement actif de l'entrée vaginale, où ils sont stockés, vers la jonction utéro-vaginale, où ils sont stockés. Cependant, ce mouvement n'est pas nécessaire entre la jonction utéro-vaginale et l'infundibulum, car les spermatozoïdes sont transportés par déplacement passif. Compte tenu de ces recommandations antérieures et des résultats obtenus dans la présente étude, on peut supposer que la capacité des spermatozoïdes à remonter le flux (rhéologie) est l'une des propriétés sur lesquelles repose le processus de sélection. Ceci détermine le passage des spermatozoïdes dans le vagin et leur entrée dans le CCT pour y être stockés. Comme l'a suggéré Forman4, cela pourrait également faciliter le processus d'entrée des spermatozoïdes dans la SST et son habitat pendant un certain temps, puis leur sortie lorsque leur vitesse commence à ralentir.
D'autre part, Matsuzaki et Sasanami 21 ont suggéré que les spermatozoïdes aviaires subissent des changements de motilité de la dormance à la motilité dans les voies reproductives mâles et femelles. L'inhibition de la motilité des spermatozoïdes résidents dans le SST a été proposée pour expliquer la longue durée de stockage des spermatozoïdes puis leur rajeunissement après avoir quitté le SST. Dans des conditions hypoxiques, Matsuzaki et al. 1 ont signalé une production et une libération élevées de lactate dans le SST, ce qui peut conduire à une inhibition de la motilité des spermatozoïdes résidents. Dans ce cas, l'importance de la rhéologie des spermatozoïdes se reflète dans la sélection et l'absorption des spermatozoïdes, et non dans leur stockage.
Français Le modèle d'agglutination des spermatozoïdes est considéré comme une explication plausible de la longue période de stockage des spermatozoïdes dans la SST, car il s'agit d'un modèle courant de rétention des spermatozoïdes chez les volailles2,22,23. Bakst et al. 2 ont observé que la plupart des spermatozoïdes adhéraient les uns aux autres, formant des agrégats fasciculaires, et que les spermatozoïdes individuels étaient rarement trouvés dans le CCM de la caille. D'autre part, Wen et al. 24 ont observé des spermatozoïdes plus dispersés et moins de touffes de spermatozoïdes dans la lumière de la SST chez les poulets. Sur la base de ces observations, on peut supposer que la propension à l'agglutination des spermatozoïdes diffère entre les oiseaux et entre les spermatozoïdes dans le même éjaculat. De plus, Van Krey et al. 9 ont suggéré que la dissociation aléatoire des spermatozoïdes agglutinés est responsable de la pénétration progressive des spermatozoïdes dans la lumière de la trompe de Fallope. Selon cette hypothèse, les spermatozoïdes ayant une capacité d'agglutination plus faible devraient être expulsés de la SST en premier. Dans ce contexte, la capacité des spermatozoïdes à s'agglutiner pourrait être un facteur influençant l'issue de la compétition spermatique chez les oiseaux pollués. De plus, plus la dissociation des spermatozoïdes agglutinés est longue, plus la fertilité est maintenue.
Bien que l'agrégation des spermatozoïdes et leur agrégation en faisceaux aient été observées dans plusieurs études2,22,24, elles n'ont pas été décrites en détail en raison de la complexité de leur observation cinématique au sein du SST. Plusieurs tentatives ont été faites pour étudier l'agglutination des spermatozoïdes in vitro. Une agrégation étendue mais transitoire a été observée lorsque le fil fin a été retiré de la goutte de graines pendante. Cela conduit au fait qu'une bulle allongée dépasse de la goutte, imitant la glande séminale. En raison des limitations 3D et des courts temps de séchage par égouttage, l'ensemble du bloc est rapidement tombé en désuétude9. Dans la présente étude, en utilisant des poulets Sharkashi et des puces microfluidiques, nous avons pu décrire la formation et le mouvement de ces touffes. Les faisceaux de spermatozoïdes se sont formés immédiatement après la collecte de sperme et se sont déplacés en spirale, présentant une rhéologie positive lorsqu'ils étaient présents dans le flux. De plus, lorsqu'ils sont observés macroscopiquement, il a été observé que les faisceaux de spermatozoïdes augmentent la linéarité de la motilité par rapport aux spermatozoïdes isolés. Français Cela suggère que l'agglutination des spermatozoïdes peut se produire avant la pénétration du SST et que la production de spermatozoïdes n'est pas limitée à une petite zone en raison du stress comme suggéré précédemment (Tingari et Lake12). Pendant la formation de la touffe, les spermatozoïdes nagent de manière synchrone jusqu'à former une jonction, puis leurs queues s'enroulent l'une autour de l'autre et la tête du spermatozoïde reste libre, mais la queue et la partie distale du spermatozoïde se collent ensemble avec une substance collante. Par conséquent, la tête libre du ligament est responsable du mouvement, entraînant le reste du ligament. La microscopie électronique à balayage des faisceaux de spermatozoïdes a montré des têtes de spermatozoïdes attachées recouvertes d'une importante matière collante, suggérant que les têtes de spermatozoïdes étaient attachées dans des faisceaux de repos, ce qui pourrait s'être produit après avoir atteint le site de stockage (SST).
Lorsqu'un frottis de sperme est coloré à l'orange d'acridine, une substance adhésive extracellulaire autour des spermatozoïdes est visible au microscope à fluorescence. Cette substance permet aux spermatozoïdes d'adhérer et de se fixer aux surfaces ou particules environnantes, les empêchant ainsi de dériver avec le flux environnant. Nos observations démontrent ainsi le rôle de l'adhésion des spermatozoïdes sous forme de faisceaux mobiles. Leur capacité à nager à contre-courant et à se fixer aux surfaces proches permet aux spermatozoïdes de rester plus longtemps dans la SST.
Rothschild25 a utilisé une caméra d'hémocytométrie pour étudier la distribution flottante de sperme bovin dans une goutte de suspension, en prenant des photomicrographies à l'aide d'une caméra à axes optiques vertical et horizontal. Les résultats ont montré que les spermatozoïdes étaient attirés par la surface de la chambre. Les auteurs suggèrent l'existence d'interactions hydrodynamiques entre les spermatozoïdes et la surface. Compte tenu de ce phénomène, ainsi que de la capacité du sperme de poussin Sharkashi à former des touffes collantes, cela pourrait augmenter la probabilité que le sperme adhère à la paroi de la SST et soit conservé pendant de longues périodes.
Bccetti et Afzeliu26 ont rapporté que le glycocalyx du sperme est nécessaire à la reconnaissance et à l'agglutination des gamètes. Forman10 a observé que l'hydrolyse des liaisons α-glycosidiques dans les revêtements glycoprotéine-glycolipide par traitement du sperme aviaire à la neuraminidase entraînait une réduction de la fertilité sans affecter la motilité des spermatozoïdes. Les auteurs suggèrent que l'effet de la neuraminidase sur le glycocalyx altère la séquestration des spermatozoïdes à la jonction utéro-vaginale, réduisant ainsi la fertilité. Leurs observations ne peuvent ignorer la possibilité que le traitement à la neuraminidase puisse réduire la reconnaissance des spermatozoïdes et des ovocytes. Forman et Engel10 ont constaté que la fertilité était réduite lorsque les poules étaient inséminées par voie intravaginale avec du sperme traité à la neuraminidase. Cependant, la FIV avec du sperme traité à la neuraminidase n'a pas affecté la fertilité par rapport aux poulets témoins. Les auteurs ont conclu que les changements dans le revêtement glycoprotéine-glycolipide autour de la membrane du sperme réduisaient la capacité des spermatozoïdes à féconder en altérant la séquestration des spermatozoïdes à la jonction utéro-vaginale, ce qui à son tour augmentait la perte de spermatozoïdes en raison de la vitesse de la jonction utéro-vaginale, mais n'affectait pas la reconnaissance des spermatozoïdes et des ovules.
Français Chez les dindes, Bakst et Bauchan 11 ont trouvé de petites vésicules et des fragments de membrane dans la lumière du SST et ont observé que certains de ces granules avaient fusionné avec la membrane du sperme. Les auteurs suggèrent que ces relations pourraient contribuer au stockage à long terme des spermatozoïdes dans le SST. Cependant, les chercheurs n'ont pas précisé la source de ces particules, si elles sont sécrétées par les cellules épithéliales du CCT, produites et sécrétées par l'appareil reproducteur mâle, ou produites par le sperme lui-même. De plus, ces particules sont responsables de l'agglutination. Grützner et al27 ont rapporté que les cellules épithéliales épididymaires produisent et sécrètent une protéine spécifique qui est nécessaire à la formation de voies séminales à pores uniques. Les auteurs rapportent également que la dispersion de ces faisceaux dépend de l'interaction des protéines épididymaires. Nixon et al28 ont constaté que les annexes sécrètent une protéine, l'ostéonectine acide riche en cystéine ; SPARC est impliquée dans la formation des touffes de spermatozoïdes chez les échidnés à bec court et les ornithorynques. La diffusion de ces faisceaux est associée à la perte de cette protéine.
Dans la présente étude, une analyse ultrastructurale par microscopie électronique a montré que les spermatozoïdes adhéraient à une grande quantité de matière dense. Ces substances seraient responsables de l'agglutination qui se condense entre et autour des têtes adhérentes, mais à des concentrations plus faibles dans la région de la queue. Nous supposons que cette substance agglutinante est excrétée par l'appareil reproducteur mâle (épididyme ou canal déférent) avec le sperme, car nous observons souvent le sperme se séparer de la lymphe et du plasma séminal lors de l'éjaculation. Il a été rapporté que lorsque les spermatozoïdes aviaires traversent l'épididyme et le canal déférent, ils subissent des modifications liées à la maturation qui favorisent leur capacité à se lier aux protéines et à acquérir des glycoprotéines associées au lemme plasmatique. La persistance de ces protéines sur les membranes spermatiques résidentes dans la SST suggère que ces protéines pourraient influencer l'acquisition de la stabilité membranaire des spermatozoïdes 30 et déterminer leur fertilité 31 . Ahammad et al32 ont rapporté que les spermatozoïdes obtenus à partir de diverses parties du système reproducteur mâle (des testicules au canal déférent distal) ont montré une augmentation progressive de la viabilité dans des conditions de stockage liquide, quelle que soit la température de stockage, et la viabilité chez les poulets augmente également dans les trompes de Fallope après insémination artificielle.
Les touffes de spermatozoïdes des poules sharkasi présentent des caractéristiques et des fonctions différentes de celles d'autres espèces telles que les échidnés, les ornithorynques, les mulots, les rats sylvestres et les cobayes. Chez les poules sharkasi, la formation de faisceaux de spermatozoïdes réduit leur vitesse de nage par rapport aux spermatozoïdes isolés. Cependant, ces faisceaux augmentent le pourcentage de spermatozoïdes rhéologiquement positifs et renforcent leur capacité à se stabiliser dans un environnement dynamique. Nos résultats confirment ainsi l'hypothèse précédente selon laquelle l'agglutination des spermatozoïdes en SST est associée à une conservation à long terme des spermatozoïdes. Nous émettons également l'hypothèse que la propension des spermatozoïdes à former des touffes pourrait contrôler le taux de perte de spermatozoïdes en SST, ce qui pourrait modifier l'issue de la compétition spermatique. Selon cette hypothèse, les spermatozoïdes à faible capacité d'agglutination libèrent la SST en premier, tandis que les spermatozoïdes à forte capacité d'agglutination produisent la majeure partie de la descendance. La formation de faisceaux de spermatozoïdes à pore unique est bénéfique et affecte le ratio parents-enfants, mais utilise un mécanisme différent. Chez les échidnés et les ornithorynques, les spermatozoïdes sont disposés parallèlement les uns aux autres afin d'augmenter la vitesse de déplacement du faisceau. Les faisceaux d'échidnés se déplacent environ trois fois plus vite que les spermatozoïdes isolés. On pense que la formation de telles touffes de spermatozoïdes chez les échidnés est une adaptation évolutive visant à maintenir la dominance, car les femelles sont volages et s'accouplent généralement avec plusieurs mâles. Par conséquent, les spermatozoïdes issus de différents éjaculats se livrent une concurrence acharnée pour la fécondation de l'ovule.
Les spermatozoïdes agglutinés des poulets sharkasi sont faciles à visualiser grâce à la microscopie à contraste de phase, considérée comme avantageuse car elle permet une étude aisée du comportement des spermatozoïdes in vitro. Le mécanisme par lequel la formation de touffes de spermatozoïdes favorise la reproduction chez les poulets sharkasi est également différent de celui observé chez certains mammifères placentaires représentant un comportement coopératif des spermatozoïdes, comme les souris des bois, où certains spermatozoïdes atteignent les ovules, aidant d'autres individus apparentés à atteindre et à endommager leurs ovules. pour faire vos preuves. comportement altruiste. Autofécondation 34. Un autre exemple de comportement coopératif des spermatozoïdes a été trouvé chez les souris sylvestres, où les spermatozoïdes étaient capables d'identifier et de se combiner avec les spermatozoïdes les plus génétiquement apparentés et de former des groupes coopératifs pour augmenter leur vitesse par rapport aux spermatozoïdes non apparentés 35.
Français Les résultats obtenus dans cette étude ne contredisent pas la théorie de Foman sur le stockage à long terme des spermatozoïdes dans les SWS. Les chercheurs rapportent que les spermatozoïdes continuent de se déplacer dans le flux de cellules épithéliales tapissant la SST pendant une période de temps prolongée, et après une certaine période, les réserves d'énergie des spermatozoïdes sont épuisées, ce qui entraîne une diminution de la vitesse, ce qui permet l'expulsion de substances de faible poids moléculaire. énergie des spermatozoïdes avec le flux de liquide de la lumière de la SST La cavité de la trompe de Fallope. Dans la présente étude, nous avons observé que la moitié des spermatozoïdes individuels ont montré la capacité de nager contre les fluides en écoulement, et leur adhésion dans le faisceau a augmenté leur capacité à montrer une rhéologie positive. De plus, nos données sont cohérentes avec celles de Matsuzaki et al. 1 qui ont rapporté qu'une sécrétion accrue de lactate dans la SST peut inhiber la motilité des spermatozoïdes résidents. Cependant, nos résultats décrivent la formation des ligaments mobiles des spermatozoïdes et leur comportement rhéologique en présence d'un environnement dynamique au sein d'un microcanal, afin d'élucider leur comportement en SST. Les recherches futures pourraient se concentrer sur la détermination de la composition chimique et de l'origine de l'agent agglutinant, ce qui aidera sans aucun doute les chercheurs à développer de nouvelles méthodes de conservation du sperme liquide et à prolonger la fertilité.
Quinze mâles sharkasi à cou nu âgés de 30 semaines (homozygote dominant ; Na Na) ont été sélectionnés comme donneurs de sperme pour l'étude. Les oiseaux ont été élevés à la ferme avicole de recherche de la faculté d'agriculture de l'université d'Ashit, dans le gouvernorat d'Ashit, en Égypte. Les oiseaux étaient logés dans des cages individuelles (30 x 40 x 40 cm), soumis à un programme d'éclairage (16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité) et nourris avec un aliment contenant 160 g de protéines brutes, 2 800 kcal d'énergie métabolisable, 35 g de calcium chacun et 5 grammes de phosphore disponible par kilogramme d'aliment.
Français Selon les données 36, ​​37, le sperme a été collecté chez les mâles par massage abdominal. Au total, 45 échantillons de sperme ont été collectés chez 15 hommes sur 3 jours. Le sperme (n = 15/jour) a été immédiatement dilué 1:1 (v:v) avec du diluant pour sperme de volaille Belsville, qui contient du diphosphate de potassium (1,27 g), du glutamate monosodique monohydraté (0,867 g), du fructose (0,5 d) de sodium anhydre. acétate (0,43 g), tris(hydroxyméthyl)aminométhane (0,195 g), citrate de potassium monohydraté (0,064 g), monophosphate de potassium (0,065 g), chlorure de magnésium (0,034 g) et H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarité 333 mOsm/kg38. Les échantillons de sperme dilués ont d'abord été examinés au microscope optique pour garantir une bonne qualité du sperme (humidité), puis stockés dans un bain-marie à 37°C jusqu'à leur utilisation dans la demi-heure suivant la collecte.
La cinématique et la rhéologie des spermatozoïdes sont décrites à l'aide d'un système de dispositifs microfluidiques. Les échantillons de sperme ont été dilués à 1:40 dans du diluant pour sperme aviaire Beltsville, chargés dans un dispositif microfluidique (voir ci-dessous), et les paramètres cinétiques ont été déterminés à l'aide d'un système d'analyse informatisée du sperme (CASA) précédemment développé pour la caractérisation microfluidique. sur la mobilité des spermatozoïdes en milieu liquide (Département de génie mécanique, Faculté de génie, Université d'Assiout, Égypte). Le plugin peut être téléchargé à l'adresse : http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. La vitesse de courbe (VCL, μm/s), la vitesse linéaire (VSL, μm/s) et la vitesse de trajectoire moyenne (VAP, μm/s) ont été mesurées. Les vidéos des spermatozoïdes ont été prises à l'aide d'un microscope inversé à contraste de phase Optika XDS-3 (avec objectif 40x) connecté à une caméra Tucson ISH1000 à 30 ips pendant 3 s. Utilisez le logiciel CASA pour étudier au moins trois zones et 500 trajectoires de spermatozoïdes par échantillon. La vidéo enregistrée a été traitée avec un logiciel CASA maison. La définition de la motilité dans le plug-in CASA est basée sur la vitesse de nage des spermatozoïdes comparée au débit, et n'inclut pas d'autres paramètres tels que le mouvement latéral, car celui-ci s'est avéré plus fiable dans l'écoulement des fluides. Le mouvement rhéologique est décrit comme le mouvement des spermatozoïdes dans le sens inverse de l'écoulement des fluides. Les spermatozoïdes présentant des propriétés rhéologiques ont été divisés par le nombre de spermatozoïdes mobiles ; les spermatozoïdes au repos et ceux se déplaçant par convection ont été exclus du comptage.
Tous les produits chimiques utilisés proviennent d'Elgomhoria Pharmaceuticals (Le Caire, Égypte), sauf indication contraire. Le dispositif a été fabriqué conformément à la description d'El-sherry et al. 40, avec quelques modifications. Les matériaux utilisés pour fabriquer les microcanaux comprenaient des plaques de verre (Howard Glass, Worcester, MA), une résine négative SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), de l'alcool diacétonique (Sigma Aldrich, Steinheim, Allemagne) et du polyacétone. -184, Dow Corning, Midland, Michigan. Les microcanaux sont fabriqués par lithographie douce. Un masque de protection transparent avec le motif de microcanal souhaité a d'abord été imprimé sur une imprimante haute résolution (Prismatic, Le Caire, Égypte et Pacific Arts and Design, Markham, ON). Les masters ont été réalisés en utilisant des plaques de verre comme substrats. Les plaques ont été nettoyées à l'acétone, à l'isopropanol et à l'eau déionisée, puis recouvertes d'une couche de 20 µm de SU8-25 par centrifugation (3 000 tr/min, 1 min). Les couches de SU-8 ont ensuite été séchées délicatement (65 °C, 2 min et 95 °C, 10 min) et exposées aux UV pendant 50 s. Après exposition, elles ont été cuites à 65 °C et 95 °C pendant 1 min et 4 min pour réticuler les couches de SU-8 exposées, puis développées dans de l'alcool diacétonique pendant 6,5 min. Les gaufres ont été cuites à 200 °C pendant 15 min pour solidifier davantage la couche de SU-8.
Le PDMS a été préparé en mélangeant le monomère et le durcisseur dans un rapport pondéral de 10:1, puis dégazé dans un dessiccateur sous vide et versé sur le cadre principal du SU-8. Le PDMS a été polymérisé dans une étuve (120 °C, 30 min), puis les canaux ont été découpés, séparés du support et perforés pour permettre la fixation de tubes à l'entrée et à la sortie du microcanal. Enfin, les microcanaux en PDMS ont été fixés de manière permanente aux lames de microscope à l'aide d'un processeur corona portable (Electro-Technic Products, Chicago, IL), comme décrit ailleurs. Le microcanal utilisé dans cette étude mesure 200 µm × 20 µm (l × H) et 3,6 cm de long.
L'écoulement du fluide induit par la pression hydrostatique à l'intérieur du microcanal est obtenu en maintenant le niveau du fluide dans le réservoir d'entrée au-dessus de la différence de hauteur Δh39 dans le réservoir de sortie (Fig. 1).
Où f est le coefficient de frottement, défini par f = C/Re pour un écoulement laminaire dans un canal rectangulaire, où C est une constante dépendant du rapport d'aspect du canal, L est la longueur du microcanal, Vav est la vitesse moyenne à l'intérieur du microcanal, Dh est le diamètre hydraulique du canal, g est l'accélération de la pesanteur. À partir de cette équation, la vitesse moyenne du canal peut être calculée à l'aide de l'équation suivante :