Merci d'avoir visité Nature.com.La version du navigateur que vous utilisez offre une prise en charge limitée de CSS.Pour une expérience optimale, nous vous recommandons d'utiliser un navigateur mis à jour (ou de désactiver le mode de compatibilité dans Internet Explorer).En attendant, pour assurer une prise en charge continue, nous afficherons le site sans styles ni JavaScript.
Des particules de silice poreuses ont été préparées par une méthode sol-gel avec quelques modifications pour obtenir des particules macroporeuses. Ces particules ont été dérivées par polymérisation par transfert de chaîne par addition réversible (RAFT) avec du N-phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate (PMI) et du styrène pour préparer l'intercalation de N-phénylmaléimide de la phase stationnaire de polystyrène (PMP). Séparation sur colonne MP d'un mélange de peptides composé de cinq peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enképhaline) performances chromatographiques) et digestion trypsique de l'albumine sérique humaine (HAS). colonne commerciale Ascentis Express RP-Amide, il a été observé que les performances de séparation de la colonne PMP étaient supérieures à la colonne commerciale en termes d'efficacité de séparation et de résolution.
Au cours des dernières années, l'industrie biopharmaceutique est devenue un marché mondial en expansion avec une augmentation substantielle de la part de marché. Avec la croissance explosive de l'industrie biopharmaceutique1,2,3, l'analyse des peptides et des protéines est fortement souhaitée. Bien que la spectrométrie de masse soit un outil efficace pour le séquençage des peptides et des protéines, si de tels échantillons sont injectés dans le spectromètre de masse en un seul passage, la séparation ne sera pas idéale. ) a considérablement progressé au cours de la dernière décennie et est devenue une technique populaire dans l'analyse protéomique7,8,9,10.
La chromatographie liquide en phase inversée (RP-LC) est largement utilisée pour la purification et la séparation de mélanges de peptides en utilisant de la silice modifiée par octadécyle (ODS) comme phase stationnaire11,12,13. Cependant, les phases stationnaires RP ne permettent pas une séparation satisfaisante des peptides et des protéines en raison de leur structure complexe et de leur nature amphiphile. ytes16. La chromatographie en mode mixte, qui fournit des interactions multimodales, peut être une alternative à la RP-LC pour la séparation des peptides, des protéines et d'autres mélanges complexes. Plusieurs phases stationnaires en mode mixte ont été préparées et des colonnes remplies de ces phases ont été utilisées pour les séparations de peptides et de protéines. s en raison de la présence de groupes polaires et non polaires22,23,24,25,26,27,28 .Interactions multimodales 29, 30, 31, 32. Récemment, Zhang et al.30 ont préparé une phase stationnaire de polyamine à terminaison dodécyle et ont réussi à séparer les hydrocarbures, les antidépresseurs, les flavonoïdes, les nucléosides, les œstrogènes et plusieurs autres analytes. Colonnes RP-Amide, mais ces colonnes sont utilisées pour l'analyse de l'amine 33 uniquement.
Dans la présente étude, une phase stationnaire polaire intégrée (polystyrène intégré au N-phénylmaléimide) a été préparée et évaluée pour la séparation des peptides et des digestions de trypsine de HSA. La phase stationnaire a été préparée en utilisant la stratégie suivante. ligand, isocyanate de phénylmaléimide-méthylvinyle, a été synthétisé et utilisé pour dériver des particules de silice afin de préparer une phase stationnaire intégrée polaire. La phase stationnaire résultante a été emballée dans une colonne en acier inoxydable (100 × 1,8 mm id) en utilisant le schéma d'emballage optimisé. L'emballage de la colonne est assisté par des vibrations mécaniques pour assurer la formation d'un lit homogène dans la colonne.(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enképhaline) et la digestion trypsique de l'albumine sérique humaine (HAS). Le mélange de peptides et la digestion trypsique de HSA ont été observés pour se séparer avec une bonne résolution et efficacité. Les performances de séparation de la colonne PMP ont été comparées à celles de la colonne Ascentis Express RP-Amide. sur la colonne PMP, qui était plus efficace que la colonne Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyéthylène glycol), urée, acide acétique, triméthoxy orthosilicate (TMOS), triméthyl chlorosilane (TMCS), trypsine, albumine sérique humaine (HSA), chlorure d'ammonium, urée, hexane méthyldisilazane (HMDS), chlorure de méthacryloyle (MC), styrène, 4-hydroxy-TEMPO, peroxyde de benzoyle (BPO), acétonitrile de qualité HPLC (ACN), méthanol, 2- Propanol et acétone Acheté chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Un mélange d'urée (8 g), de polyéthylèneglycol (8 g) et de 8 ml d'acide acétique 0,01 N a été agité pendant 10 minutes, puis 24 ml de TMOS y ont été ajoutés dans des conditions glacées. Le mélange réactionnel a été chauffé à 40 °C pendant 6 heures, puis à 120 °C pendant 8 heures dans un autoclave en acier inoxydable. La masse molle a été broyée lisse dans un four et calcinée à 550 °C pendant 12 heures. Trois lots ont été préparés et caractérisés pour examiner la reproductibilité de la taille des particules, de la taille des pores et de la surface.
Par modification de surface de particules de silice avec un ligand présynthétisé phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate (PCMP) suivie d'une polymérisation radiale avec du styrène, un composé contenant un groupe polaire a été préparé.Phase stationnaire pour granulats et chaînes de polystyrène. Le procédé de préparation est décrit ci-dessous.
Le N-phénylmaléimide (200 mg) et l'isocyanate de méthylvinyle (100 mg) ont été dissous dans du toluène sec, et 0,1 mL de 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) a été ajouté au ballon de réaction pour préparer le copolymère de phénylmaléimide et d'isocyanate de méthylvinyle (PMCP). Le mélange a été chauffé à 60 °C pendant 3 heures, filtré et séché dans une étuve à 40 °C pendant 3 heures.
Des particules de silice séchées (2 g) ont été dispersées dans du toluène sec (100 ml), agitées et soniquées dans un ballon à fond rond de 500 ml pendant 10 min. Le PMCP (10 mg) a été dissous dans du toluène et ajouté goutte à goutte au ballon de réaction via une ampoule à brome. Le mélange a été chauffé au reflux à 100 ° C pendant 8 heures, filtré et lavé avec de l'acétone et séché à 60 ° C pendant 3 heures. 00 g) ont été dissous dans du toluène (200 ml) et du 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) a été ajouté en présence de 100 µL de dilaurate de dibutylétain comme catalyseur. Le mélange a été agité à 50°C pendant 8 heures, filtré et séché à 50°C pendant 3 heures.
Du styrène (1 ml), du peroxyde de benzoyle BPO (0,5 ml) et des particules de silice attachées au TEMPO-PMCP (1,5 g) ont été dispersés dans du toluène et purgés à l'azote. La polymérisation du styrène a été effectuée à 100 ° C pendant 12 heures. Le produit résultant a été lavé avec du méthanol et séché à 60 ° C pendant la nuit. Le schéma réactionnel global est illustré à la figure 1.
Les échantillons ont été dégazés à 393 K pendant 1 heure pour obtenir une pression résiduelle inférieure à 10-3 Torr. La quantité de N2 adsorbée à une pression relative de P/P0 = 0,99 a été utilisée pour déterminer le volume poreux total. une colonne en aluminium à l'aide d'un ruban de carbone adhésif. De l'or a été plaqué sur les échantillons à l'aide d'un revêtement par pulvérisation cathodique Q150T, et une couche Au de 5 nm a été déposée sur les échantillons. Cela améliore l'efficacité du processus en utilisant des basses tensions et fournit un grain fin, une pulvérisation à froid. distribution. Des particules de silice nues et des particules de silice liées à un ligand (5 mg chacune) ont été dispersées dans 5 ml d'isopropanol, soniquées pendant 10 min, vortexées pendant 5 min et placées sur le banc optique du Mastersizer. L'analyse thermogravimétrique a été effectuée à une vitesse de 5 ° C par minute sur une plage de température de 30 à 800 ° C.
Des colonnes à alésage étroit en acier inoxydable émaillé de dimensions (100 × 1,8 mm id) ont été garnies en utilisant la méthode de garnissage en suspension, en appliquant la même procédure que celle utilisée dans la réf.31.Une colonne en acier inoxydable (verrée, 100 × 1,8 mm id) avec un raccord de sortie contenant un fritté de 1 µm a été connectée à un slurry packer (Alltech Deerfield, IL, USA). Préparez une suspension de phase stationnaire en suspendant 150 mg de phase stationnaire dans 1,2 mL de méthanol et envoyez-la dans la colonne de stockage. Le méthanol a été utilisé comme solvant de la suspension ainsi que comme solvant propulseur. .Remplissez la colonne séquentiellement en appliquant des pressions de 100 MP pendant 10 minutes, 80 MP pendant 15 minutes et 60 MP pendant 30 minutes. Pendant le compactage, des vibrations mécaniques ont été appliquées avec deux agitateurs de colonne GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) pour assurer un compactage uniforme de la colonne. l'injecteur et au système LC pour vérifier ses performances.
Une pompe LC (10AD Shimadzu, Japon), un injecteur (Valco (USA) C14 W.05) avec une boucle d'injection de 50 nL, un dégazeur à membrane (Shimadzu DGU-14A), une fenêtre capillaire UV-VIS ont été construits. id 365 et des capillaires d'union réductrice (50 μm) ont été installés à la sortie 1/16 "de l'union réductrice. La collecte de données et le traitement chromatographique ont été effectués à l'aide du logiciel Multichro 2000. Surveillance à 254 nm Les analytes ont été testés pour l'absorbance UV. Les données chromatographiques ont été analysées par OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumine de sérum humain, poudre lyophilisée, ≥ 96 % (électrophorèse sur gel d'agarose) 3 mg mélangés à de la trypsine (1,5 mg), de l'urée 4,0 M (1 mL) et du bicarbonate d'ammonium 0,2 M (1 mL). La solution a été agitée pendant 10 minutes et maintenue dans un bain-marie à 37 °C pendant 6 heures, puis désactivée avec 1 mL de TFA à 0,1 %. C
La séparation des mélanges de peptides et des digestions de trypsine HSA a été évaluée séparément sur des colonnes PMP.Vérifiez la séparation du mélange de peptides et de la digestion trypsine de HSA par la colonne PMP et comparez les résultats à la colonne Ascentis Express RP-Amide.Le nombre de plaques théorique est calculé comme suit :
Des images SEM de particules de silice nues et de particules de silice liées à un ligand sont présentées à la Fig.2. Les images SEM de particules de silice nues (A, B) montrent que, contrairement à nos études précédentes, ces particules sont sphériques dans lesquelles les particules sont allongées ou ont une symétrie irrégulière. La surface des particules de silice liées au ligand (C, D) est plus lisse que celle des particules de silice nues, ce qui peut être dû au revêtement de chaînes de polystyrène à la surface des particules de silice.
Images au microscope électronique à balayage de particules de silice nues (A, B) et de particules de silice liées à un ligand (C, D).
Les distributions granulométriques des particules de silice nues et des particules de silice liées à un ligand sont illustrées à la figure 3 (A). Les courbes de distribution granulométrique basées sur le volume ont montré que la taille des particules de silice augmentait après la modification chimique (Fig. 3A). Les données de distribution granulométrique des particules de silice de l'étude actuelle et de l'étude précédente sont comparées dans le tableau 1 (A). de 3,05 μm (particules de silice liées au polystyrène) 34. Ce lot avait une distribution granulométrique plus étroite par rapport à notre étude précédente en raison des ratios variables de PEG, d'urée, de TMOS et d'acide acétique dans le mélange réactionnel. phase MP, l'épaisseur de la couche était de 1,38 µm.
Distribution granulométrique (A) et distribution granulométrique des pores (B) des particules de silice nues et des particules de silice liées au ligand.
La taille des pores, le volume des pores et la surface des particules de silice de l'étude actuelle sont indiqués dans le tableau 1 (B). Les profils PSD des particules de silice nues et des particules de silice liées au ligand sont présentés à la figure 3 (B). Les résultats sont comparables à notre étude précédente. de la courbe est montrée sur la Fig. 3(B). De même, le volume des pores des particules de silice a diminué de 0,67 à 0,58 cm3/g après modification chimique. 05 m2/g après modification chimique.
Les résultats de l'analyse élémentaire de la phase stationnaire sont présentés dans le tableau 2. La charge en carbone de la phase stationnaire actuelle est de 6,35 %, ce qui est inférieur à la charge en carbone de notre étude précédente (particules de silice liées au polystyrène, 7,93 %35 et 10,21 %, respectivement) Le cyanate (PCMP) et le 4-hydroxy-TEMPO ont été utilisés. Le pourcentage en poids d'azote de la phase stationnaire actuelle est de 2,21 %, contre 0,1735 et 0,85 % en poids d'azote dans les études précédentes, respectivement. Cela signifie que le % en poids d'azote est plus élevé dans la phase stationnaire actuelle en raison du phénylmaléimide. du produit final (6) était de 6,35 %, comme indiqué dans le tableau 2. La perte de poids a été vérifiée avec la phase stationnaire PMP, et la courbe TGA est illustrée à la figure 4. La courbe TGA montre une perte de poids de 8,6 %, ce qui est en bon accord avec la charge en carbone (6,35 %) car les ligands contiennent non seulement C mais aussi N, O et H.
Le ligand phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate a été choisi pour la modification de surface des particules de silice car il possède des groupes phénylmaléimide polaires et des groupes vinylisocyanate. Les groupes isocyanate de vinyle peuvent en outre réagir avec le styrène par polymérisation radicalaire vivante. peut être contrôlée par la quantité optimale de styrène et le temps de réaction de la polymérisation radicalaire. La dernière étape de la réaction (polymérisation radicalaire) est critique et peut modifier la polarité de la phase stationnaire. Une analyse élémentaire a été effectuée pour vérifier la charge en carbone de ces phases stationnaires. performances chromatographiques (sélectivité, résolution, valeur N, etc.). Sur la base de ces expériences, une formulation optimisée a été sélectionnée pour préparer la phase stationnaire PMP afin d'assurer une polarité contrôlée et une bonne rétention de l'analyte.
Cinq mélanges de peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enképhaline) ont également été évalués à l'aide d'une colonne PMP utilisant une phase mobile ;60/40 (v/v) acétonitrile/eau (0,1 % TFA) à un débit de 80 μL/min. Dans des conditions d'élution optimales, le nombre théorique de plateaux (N) par colonne (100 × 1,8 mm di) est de 20 000 ± 100 (200 000 plateaux/m²). 5A.Analyse rapide sur une colonne de PMP à haut débit (700 μL/min), cinq peptides ont été élués en une minute, les valeurs N étaient très bonnes, 13 500 ± 330 par colonne (100 × 1,8 mm id), correspond à 135 000 plaques/m (Figure 5B). Trois colonnes de taille identique (100 × 1,8 mm id) ont été remplies avec trois lots différents de PMP phase stationnaire pour vérifier la reproductibilité. La concentration d'analyte pour chaque colonne a été enregistrée en utilisant les conditions d'élution optimales et le nombre de plaques théoriques N et le temps de rétention pour séparer le même mélange test sur chaque colonne. Les données de reproductibilité pour les colonnes PMP sont présentées dans le tableau 4. La reproductibilité de la colonne PMP est bien corrélée avec des valeurs % RSD très faibles, comme indiqué dans le tableau 3.
Séparation du mélange de peptides sur la colonne PMP (B) et la colonne Ascentis Express RP-Amide (A);phase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), dimensions de la colonne PMP (100 × 1,8 mm id) ;analytique L'ordre d'élution des composés : 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) et 5 (leucine) enképhaline acide)).
Une colonne PMP (100 × 1,8 mm id) a été évaluée pour la séparation de digestions trypsiques d'albumine sérique humaine en chromatographie liquide à haute performance. Le chromatogramme de la figure 6 montre que l'échantillon est bien séparé et la résolution est très bonne. a été découpé en 17 pics correspondant à 17 peptides. L'efficacité de séparation de chaque pic dans le HSA digest a été calculée et les valeurs sont données dans le tableau 5.
Une digestion trypsique de HSA (100 x 1,8 mm id) a été séparée sur une colonne PMP ;débit (100 µL/min), phase mobile 60/40 acétonitrile/eau avec 0,1% TFA.
où L est la longueur de la colonne, η est la viscosité de la phase mobile, ΔP est la contre-pression de la colonne et u est la vitesse linéaire de la phase mobile. notre étude précédente Réf.34.La perméabilité de la colonne garnie de particules superficiellement poreuses est de : 1,7 × 10-15 pour les particules de 1,3 μm, 3,1 × 10-15 pour les particules de 1,7 μm, 5,2 × 10-15 et 2,5 × 10-14 m2 pour les particules de 2,6 μm Pour les particules de 5 μm 43. La capacité de la phase PMP est similaire à celle des particules core-shell de 5 μm.
où Wx est le poids de la colonne remplie de chloroforme, Wy est le poids de la colonne remplie de méthanol et ρ est la densité du solvant. Les densités de méthanol (ρ = 0,7866) et de chloroforme (ρ = 1,484). 0,63 et 0,55, respectivement. Cela signifie que la présence de ligands urée réduit la perméabilité de la phase stationnaire. D'autre part, la porosité totale de la colonne PMP (100 × 1,8 mm di) est de 0,60. , tandis que dans les phases stationnaires de type polystyrène, une couche de polymère relativement épaisse se forme autour. Dans une expérience typique, la porosité de la colonne est calculée comme suit :
Les figures 7A,B montrent la colonne PMP (100 × 1,8 mm id) et la colonne Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) en utilisant les mêmes conditions d'élution (c'est-à-dire 60/40 ACN/H2O et 0,1 % TFA).) du complot de van Deemter.Des mélanges de peptides sélectionnés (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ont été préparés dans 20 µL/ Le débit minimum pour les deux colonnes est de 800 µL/min. et 3,9 µm, respectivement. Les valeurs HETP indiquent que l'efficacité de séparation de la colonne PMP (100 × 1,8 mm id) est bien meilleure que celle de la colonne Ascentis Express RP-Amide disponible dans le commerce (100 × 1,8 mm id). id) par rapport à la colonne Ascentis Express RP-Amide est basée sur des améliorations de la forme et de la taille des particules et des procédures de remplissage de colonne complexes utilisées dans les travaux actuels34.
(A) Courbe de van Deemter (HETP versus vitesse linéaire de phase mobile) obtenue à l'aide d'une colonne PMP (100 × 1,8 mm id) dans 60/40 ACN/H2O avec 0,1 % de TFA. (B) Courbe de van Deemter (HETP versus vitesse linéaire de phase mobile) obtenue à l'aide d'une colonne Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) dans 60/40 ACN/H2O avec 0,1 % de TFA. .
Une phase stationnaire en polystyrène à inclusions polaires a été préparée et évaluée pour la séparation de mélanges de peptides synthétiques et de digestions de trypsine d'albumine sérique humaine (HAS) en chromatographie liquide à haute performance. Les performances chromatographiques des colonnes PMP pour les mélanges de peptides sont excellentes en termes d'efficacité et de résolution de séparation. est un autre avantage de cette phase stationnaire.Les colonnes PMP présentent une bonne reproductibilité et peuvent être utilisées pour l'analyse de mélanges de peptides et la digestion par la trypsine de diverses protéines.Nous avons l'intention d'utiliser cette colonne pour la séparation de produits naturels, de composés bioactifs de plantes médicinales et d'extraits fongiques en chromatographie liquide.À l'avenir, les colonnes PMP seront également évaluées pour la séparation de protéines et d'anticorps monoclonaux.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Recherche sur les systèmes de séparation de peptides par chromatographie en phase inversée Partie I : Développement d'un protocole de caractérisation de colonne.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Peptides actifs améliorés conçus pour le traitement des maladies infectieuses.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptides thérapeutiques synthétiques : science et marché.
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatographie.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.La chromatographie liquide avancée-spectrométrie de masse permet l'incorporation de métabolomique et de protéomique largement ciblées.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Le rôle de l'UHPLC dans le développement de médicaments.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspects fondamentaux et pratiques de la chromatographie liquide à ultra haute pression pour les séparations rapides.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Application de la chromatographie liquide ultra-haute performance dans le développement de médicaments.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hydrogels macroporeux monolithiques préparés à partir d'émulsions huile-dans-eau à phase interne élevée pour une purification efficace des entérovirus.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Le rôle de la chromatographie liquide en protéomique.J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Tendances émergentes dans les séparations par chromatographie liquide en phase inversée de peptides et de protéines thérapeutiques : théorie et applications.J.Pharmacie.Science biomédicale.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Séparation bidimensionnelle de peptides à l'aide d'un système RP-RP-HPLC utilisant différentes valeurs de pH dans les première et deuxième dimensions de séparation.J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Les caractéristiques de transfert de masse et les performances cinétiques des colonnes chromatographiques à haut rendement remplies de particules C18 sub-2 μm entièrement et superficiellement poreuses ont été étudiées.J.Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tendances récentes et défis analytiques dans l'isolement, l'identification et la validation des peptides bioactifs végétaux.
Mueller, JB et al.Le paysage protéomique du royaume de la vie.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Traitement en aval de peptides thérapeutiques par chromatographie liquide préparative.Molecule (Bâle, Suisse) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Chromatographie en mode mixte et son application aux biopolymères.J.Chromatographie.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands pour la chromatographie protéique en mode mixte : principe, caractérisation et conception.J.Biotechnologie.144(1), 3-11 (2009).