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Des particules de silice poreuses ont été préparées par la méthode sol-gel avec quelques modifications pour obtenir des particules à larges pores. Ces particules ont été dérivées avec du N-phénylmaléimide-méthylvinyl isocyanate (PMI) et du styrène par polymérisation par transfert de chaîne inverse-fragmentation (RAFT) pour produire des polyamides intercalés avec du N-phénylmaléimide. Phase stationnaire de styrène (PMP). Des colonnes en acier inoxydable à alésage étroit (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) ont été remplies d'un garnissage en suspension. Les performances chromatographiques de la colonne PMP ont été évaluées pour séparer un mélange de peptides synthétiques composé de cinq peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino-enképhaline) et d'hydrolysat tryptique d'albumine sérique humaine (HAS). Dans des conditions d'élution optimales, le nombre théorique de plaques avec un mélange de peptides a atteint 280 000 plaques/m². En comparant les performances de séparation de la colonne développée avec la colonne commerciale Ascentis Express RP-Amide, il a été observé que l'efficacité de séparation de la colonne PMP était supérieure à celle de la colonne commerciale en termes d'efficacité de séparation et de résolution.
L'industrie biopharmaceutique est devenue un marché mondial en pleine expansion, avec une croissance significative de sa part de marché ces dernières années. Avec la croissance fulgurante de ce secteur1,2,3, l'analyse des peptides et des protéines est devenue un besoin important. Outre le peptide cible, diverses impuretés se forment lors de la synthèse peptidique ; une purification chromatographique est donc nécessaire pour obtenir la pureté souhaitée. L'analyse et la caractérisation des protéines dans les fluides corporels, les tissus et les cellules constituent une tâche extrêmement complexe en raison du grand nombre d'espèces potentiellement détectables présentes dans un seul échantillon. Bien que la spectrométrie de masse soit un outil efficace pour le séquençage des peptides et des protéines, l'introduction directe de ces échantillons dans le spectromètre de masse rend la séparation insatisfaisante. Ce problème peut être résolu en réalisant une chromatographie liquide (LC) avant l'analyse par spectrométrie de masse, ce qui réduira la quantité d'analytes entrant dans le spectromètre de masse à un instant donné4,5,6. De plus, les analytes peuvent se concentrer dans une zone étroite lors de la séparation en phase liquide, ce qui permet de les concentrer et d'augmenter la sensibilité de la détection par spectrométrie de masse. La chromatographie liquide (LC) a considérablement progressé au cours de la dernière décennie et est devenue une méthode largement utilisée pour l’analyse protéomique7,8,9,10.
La chromatographie liquide en phase inverse (RP-LC) est largement utilisée pour purifier et séparer des mélanges de peptides en utilisant de la silice modifiée par octadécyle (ODS) comme phase stationnaire11,12,13. Cependant, en raison de leur structure complexe et de leur nature amphotère,14,15 les phases stationnaires RP ne permettent pas une séparation satisfaisante des peptides et des protéines. Par conséquent, l'analyse de peptides et de protéines contenant des fragments polaires et apolaires nécessite des phases stationnaires spécialement conçues pour interagir et retenir ces analytes16. La chromatographie mixte, qui offre des interactions multimodales, peut constituer une alternative à la RP-LC pour la séparation des peptides, des protéines et d'autres mélanges complexes. Plusieurs phases stationnaires mixtes ont été préparées et des colonnes remplies de ces phases stationnaires ont été utilisées pour séparer les peptides et les protéines17,18,19,20,21. Français En raison de la présence de groupes polaires et non polaires, les phases stationnaires en mode mixte (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation polaire/RPLC) conviennent à la séparation des peptides et des protéines22,23,24,25,26,27,28. , les phases stationnaires polaires intercalées avec des groupes polaires liés de manière covalente présentent de bonnes capacités de séparation et une sélectivité unique pour les analytes polaires et non polaires car la séparation dépend de l'interaction entre l'analyte et la phase stationnaire Interactions multimodales 29,30,31,32. Récemment, Zhang et al. 30 ont obtenu des phases stationnaires à terminaison béhényle de polyamines et ont séparé avec succès des hydrocarbures, des antidépresseurs, des flavonoïdes, des nucléosides, des œstrogènes et certains autres analytes. Le matériau stationnaire polaire intégré possède à la fois des groupes polaires et non polaires, il peut donc être utilisé pour séparer les peptides et les protéines en parties hydrophobes et hydrophiles. Les colonnes polaires en ligne (par exemple, les colonnes C18 avec amide en ligne) sont disponibles sous le nom commercial de colonnes Ascentis Express RP-Amide, mais ces colonnes n'ont été utilisées que pour l'analyse de l'amine 33.
Dans l'étude actuelle, une phase stationnaire polaire d'inclusion (N-phénylmaléimide, polystyrène d'inclusion) a été préparée et évaluée pour la séparation des peptides et le clivage tryptique de la HSA. La stratégie suivante a été utilisée pour préparer la phase stationnaire. Des particules de silice poreuses ont été préparées selon les procédures décrites dans nos publications précédentes, avec quelques modifications dans les schémas de préparation 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Les ratios d'urée, de polyéthylène glycol (PEG), de TMOS et d'acide acétique aqueux ont été ajustés pour obtenir des particules de silice avec de grandes tailles de pores. Deuxièmement, un nouveau ligand phénylmaléimide-méthylvinyl isocyanate a été synthétisé et ses particules de silice dérivées ont été utilisées pour préparer des phases stationnaires polaires incluses. La phase stationnaire obtenue a été conditionnée dans une colonne en acier inoxydable (diamètre intérieur 100 × 1,8 mm) selon un schéma de conditionnement optimisé. Le conditionnement de la colonne est facilité par des vibrations mécaniques pour assurer une couche uniforme à l'intérieur de la colonne. La colonne remplie a été évaluée pour la séparation d'un mélange de peptides composé de cinq peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptide leucine-enképhaline) et d'hydrolysats tryptiques de sérum albumine humaine (HSA). Il a été observé que le mélange de peptides et le produit de digestion tryptique de HSA se séparaient avec une bonne résolution et une bonne efficacité. L'efficacité de séparation de la colonne PMP a été comparée à celle de la colonne Ascentis Express RP-Amide. Il a été observé que les peptides et les protéines présentaient une bonne résolution et une efficacité de séparation élevée sur la colonne PMP, et que l'efficacité de séparation de la colonne PMP était supérieure à celle de la colonne Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyéthylène glycol), urée, acide acétique, triméthoxyorthosilicate (TMOS), triméthylchlorosilane (TMCS), trypsine, albumine sérique humaine (HSA), chlorure d'ammonium, urée, hexaméthylméthacryloyldisilazane (HMDS), chlorure de méthacryloyle (MC), styrène, 4-hydroxy-TEMPO, peroxyde de benzoyle (BPO), acétonitrile (ACN) pour HPLC, méthanol, 2-propanol et acétone. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, États-Unis).
Un mélange d'urée (8 g), de polyéthylène glycol (8 g) et de 8 ml d'acide acétique 0,01 N a été agité pendant 10 minutes, puis 24 ml de TMOS y ont été ajoutés sous refroidissement par glace. Le mélange réactionnel a été chauffé à 40 °C pendant 6 heures, puis à 120 °C pendant 8 heures dans un autoclave en acier inoxydable. L'eau a été décantée et le résidu a été séché à 70 °C pendant 12 heures. Les blocs mous séchés ont été finement broyés et calcinés dans un four à 550 °C pendant 12 heures. Trois lots ont été préparés et caractérisés afin de tester la reproductibilité de la taille des particules, de la taille des pores et de la surface spécifique.
Groupe polaire et phase stationnaire pour chaînes de polystyrène. La procédure de préparation est décrite ci-dessous.
Le N-phénylmaléimide (200 mg) et l'isocyanate de méthyle et de vinyle (100 mg) ont été dissous dans du toluène anhydre, puis 0,1 ml de 2,2'-azoisobutyronitrile (AIBN) a été ajouté au ballon de réaction pour obtenir un copolymère de phénylmaléimide et d'isocyanate de méthyle et de vinyle (PMCP). Le mélange a été chauffé à 60°C pendant 3 heures, filtré et séché dans une étuve à 40°C pendant 3 heures.
Des particules de silice séchées (2 g) ont été dispersées dans du toluène sec (100 ml), agitées et soniquées pendant 10 min dans un ballon à fond rond de 500 ml. Du PMCP (10 mg) a été dissous dans du toluène et ajouté goutte à goutte au ballon de réaction via une ampoule à addition. Le mélange a été chauffé à reflux à 100 °C pendant 8 heures, filtré, lavé à l'acétone et séché à 60 °C pendant 3 heures. Ensuite, les particules de silice associées au PMCP (100 g) ont été dissoutes dans du toluène (200 ml), puis du 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) y a été ajouté en présence de 100 μl de dilaurate de dibutylétain comme catalyseur. Le mélange a été agité à 50 °C pendant 8 heures, filtré et séché à 50 °C pendant 3 heures.
Du styrène (1 ml), du peroxyde de benzoyle BPO (0,5 ml) et des particules de silice fixées sur du TEMPO-PMCP (1,5 g) ont été dispersés dans du toluène et purgés à l'azote. La polymérisation du styrène a été réalisée à 100 °C pendant 12 heures. Le produit obtenu a été lavé au méthanol et séché pendant une nuit à 60 °C. Le schéma général de la réaction est présenté à la figure 1.
Français Les échantillons ont été dégazés à 393 K pendant 1 h jusqu'à l'obtention d'une pression résiduelle inférieure à 10–3 Torr. La quantité de N2 adsorbée à une pression relative P/P0 = 0,99 a été utilisée pour déterminer le volume poreux total. La morphologie des particules de silice pure et liée à un ligand a été examinée à l'aide d'un microscope électronique à balayage (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japon). Les échantillons secs (silice pure et particules de silice liée à un ligand) ont été placés sur des tiges d'aluminium à l'aide de ruban de carbone. De l'or a été déposé sur l'échantillon à l'aide d'un dispositif de pulvérisation cathodique Q150T, et une couche d'or de 5 nm d'épaisseur a été déposée sur l'échantillon. Cela améliore l'efficacité du processus basse tension et permet une pulvérisation à froid fine. L'analyse élémentaire a été réalisée à l'aide d'un analyseur de composition élémentaire Flash EA1112 de Thermo Electron (Waltham, MA, États-Unis). Un granulomètre Malvern (Worcestershire, Royaume-Uni) Mastersizer 2000 a été utilisé pour obtenir la distribution granulométrique. Des particules de silice non enrobées et des particules de silice liées à un ligand (5 mg chacune) ont été dispersées dans 5 ml d'isopropanol, soniquées pendant 10 minutes, agitées pendant 5 minutes et placées sur un banc optique Mastersizer. L'analyse thermogravimétrique est réalisée à une vitesse de 5 °C par minute dans une plage de températures allant de 30 à 800 °C.
Des colonnes en acier inoxydable à alésage étroit revêtues de fibre de verre de dimensions (DI 100 × 1,8 mm) ont été remplies par la méthode de remplissage de suspension selon la même procédure que dans la référence 31. La colonne en acier inoxydable (revêtue de fibre de verre, DI 100 × 1,8 mm) et une sortie contenant un fritté de 1 µm ont été connectées à une machine de conditionnement de suspension (Alltech Deerfield, IL, États-Unis). Préparer une suspension de la phase stationnaire en suspendant 150 mg de la phase stationnaire dans 1,2 ml de méthanol et en l'introduisant dans une colonne réservoir. Le méthanol a été utilisé comme solvant de la suspension et solvant témoin. Remplir la colonne en appliquant une séquence de pression de 100 MP pendant 10 min, 80 MP pendant 15 min et 60 MP pendant 30 min. Le processus de remplissage a utilisé deux vibrateurs de colonne de chromatographie en phase gazeuse (Alltech, Deerfield, IL, États-Unis) pour la vibration mécanique afin d'assurer un remplissage uniforme de la colonne. Fermer le packer à boues et relâcher lentement la pression pour éviter d'endommager la colonne. La colonne a été déconnectée de la buse à boues et un autre raccord a été fixé à l'entrée et connecté au système LC pour tester son fonctionnement.
Un MLC personnalisé a été construit à l'aide d'une pompe LC (10AD Shimadzu, Japon), d'un échantillonneur avec une boucle d'injection de 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), d'un dégazeur à membrane (Shimadzu DGU-14A) et d'une fenêtre capillaire UV-VIS. Un détecteur (UV-2075) et une microcolonne émaillée ont été utilisés. Utiliser des tubes de connexion très étroits et courts afin de minimiser l'effet d'une expansion supplémentaire de la colonne. Après remplissage de la colonne, installer un capillaire (50 µm de diamètre intérieur 365) à la sortie de la jonction réductrice de 1/16″ et installer un capillaire (50 µm) de la jonction réductrice. La collecte des données et le traitement des chromatogrammes sont effectués à l'aide du logiciel Multichro 2000. À 254 nm, l'absorbance UV des analytes a été surveillée à 0. Les données chromatographiques ont été analysées avec OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumine sérique humaine, poudre lyophilisée, ≥ 96 % (électrophorèse sur gel d'agarose) 3 mg mélangés à de la trypsine (1,5 mg), de l'urée 4,0 M (1 ml) et du bicarbonate d'ammonium 0,2 M (1 ml). La solution a été agitée pendant 10 min et conservée au bain-marie à 37 °C pendant 6 h, puis désactivée avec 1 ml de TFA à 0,1 %. Filtrer la solution et conserver à une température inférieure à 4 °C.
La séparation d'un mélange de peptides et d'HSA digérée par voie tryptique sur une colonne PMP a été évaluée séparément. Vérifier l'hydrolyse tryptique d'un mélange de peptides et d'HSA séparés par une colonne PMP et comparer les résultats avec ceux d'une colonne Ascentis Express RP-Amide. Le nombre de plateaux théoriques est calculé selon l'équation suivante :
Les images MEB des particules de silice pure et des particules de silice liées à un ligand sont présentées dans la figure 2. Les images MEB des particules de silice pure (A, B) montrent une forme sphérique dans laquelle les particules sont allongées ou présentent une symétrie irrégulière par rapport à nos études précédentes. La surface des particules de silice liées par le ligand (C, D) est plus lisse que celle des particules de silice pure, ce qui pourrait être dû aux chaînes de polystyrène recouvrant la surface des particules de silice.
Micrographies électroniques à balayage de particules de silice pure (A, B) et de particules de silice liées à un ligand (C, D).
Français La distribution granulométrique des particules de silice pure et des particules de silice liées à un ligand est présentée dans la Fig. 2.3(A). Les courbes de distribution granulométrique volumétrique ont montré que la taille des particules de silice a augmenté après modification chimique (Fig. 3A). Les données de distribution granulométrique de la silice de l'étude actuelle et de l'étude précédente sont comparées dans le Tableau 1(A). La taille granulométrique volumétrique d(0,5) du PMP était de 3,36 µm, contre une valeur d(0,5) de 3,05 µm dans notre étude précédente (particules de silice liées au polystyrène)34. En raison du changement du rapport PEG, urée, TMOS et acide acétique dans le mélange réactionnel, la distribution granulométrique de ce lot était plus étroite par rapport à notre étude précédente. La taille des particules de la phase PMP est légèrement plus grande que celle de la phase de particules de silice liées au polystyrène que nous avons étudiée précédemment. Cela signifie que la fonctionnalisation de surface des particules de silice avec du styrène n'a déposé qu'une couche de polystyrène (0,97 µm) sur la surface de la silice, tandis que dans la phase PMP, l'épaisseur de la couche était de 1,38 µm.
Distribution de la taille des particules (A) et distribution de la taille des pores (B) des particules de silice pure et des particules de silice liées à un ligand.
Français La taille des pores, le volume des pores et la surface spécifique des particules de silice utilisées dans cette étude sont présentés dans le tableau 1 (B). Les profils PSD des particules de silice pure et des particules de silice liées à un ligand sont présentés dans les figures 3(B). Les résultats étaient comparables à ceux de notre étude précédente34. Les tailles de pores des particules de silice pure et liée à un ligand étaient respectivement de 310 Å et 241 Å, indiquant qu'après modification chimique, la taille des pores a diminué de 69 Å, comme indiqué dans le tableau 1 (B), et la courbe de décalage est présentée dans la figure. La surface spécifique des particules de silice dans l'étude actuelle est de 116 m2/g, ce qui est comparable à notre étude précédente (124 m2/g). Comme indiqué dans le tableau 1(B), la surface spécifique (m2/g) des particules de silice après modification chimique a également diminué de 116 m2/g à 105 m2/g.
Français Les résultats de l'analyse élémentaire de la phase stationnaire sont présentés dans le tableau 2. La teneur en carbone de la phase stationnaire actuelle est de 6,35 %, ce qui est inférieur à celui de notre étude précédente (particules de silice associées au polystyrène, respectivement 7,93 %35 et 10,21 %) 42. La teneur en carbone de la phase stationnaire actuelle ci-dessous, car certains ligands polaires tels que le phénylmaléimide méthylvinylisocyanate (PCMP) et le 4-hydroxy-TEMPO ont été utilisés en plus du styrène dans la préparation du SP. Le pourcentage pondéral d'azote dans la phase stationnaire actuelle est de 2,21 % contre 0,1735 et 0,85 % dans les études précédentes42. Cela signifie que la phase stationnaire actuelle a un pourcentage pondéral élevé d'azote en raison du phénylmaléimide. Français De même, les produits (4) et (5) ont une teneur en carbone de 2,7 % et 2,9 %, respectivement, tandis que le produit final (6) a une teneur en carbone de 6,35 %, comme indiqué dans le tableau 2. L'analyse thermogravimétrique (ATG) a été utilisée sur la phase stationnaire de PMP pour tester la perte de poids, et la courbe ATG est présentée dans la figure 4. La courbe ATG montre une perte de poids de 8,6 %, ce qui est en bon accord avec la teneur en carbone (6,35 %), puisque les ligands contiennent non seulement C , mais aussi N, O et H.
Le ligand phénylmaléimide-méthylvinyl isocyanate a été choisi pour modifier la surface des particules de silice en raison de ses groupes phénylmaléimide et vinylisocyanate polaires. Les groupes vinylisocyanate peuvent réagir avec le styrène par polymérisation radicalaire vivante. La deuxième raison est d'insérer un groupe ayant des interactions modérées avec l'analyte et aucune interaction électrostatique forte entre l'analyte et la phase stationnaire, puisque la fraction phénylmaléimide n'a pas de charge virtuelle à pH normal. La polarité de la phase stationnaire peut être contrôlée par la quantité optimale de styrène et le temps de réaction de la polymérisation radicalaire. L'étape finale de la réaction (polymérisation radicalaire) est critique car elle modifie la polarité de la phase stationnaire. Une analyse élémentaire a été réalisée pour vérifier la teneur en carbone de ces phases stationnaires. Il a été observé qu'une augmentation de la quantité de styrène et du temps de réaction augmente la teneur en carbone de la phase stationnaire et inversement. Les SP préparées avec différentes concentrations de styrène présentent des charges en carbone différentes. De même, ces phases stationnaires ont été placées sur des colonnes en acier inoxydable et leurs caractéristiques chromatographiques (sélectivité, résolution, valeur N, etc.) ont été vérifiées. Sur la base de ces expériences, une composition optimisée pour la préparation de la phase stationnaire PMP a été choisie afin d'assurer une polarité contrôlée et une bonne rétention de l'analyte.
Français La colonne PMP a également été évaluée pour l'analyse de cinq mélanges de peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enképhaline) en utilisant la capacité de la phase mobile. 60/40 (v/v) ACN/eau (0,1 % TFA) à un débit de 80 µl/min. Dans des conditions d'élution optimales (200 000 plaques/m), le nombre de plaques théoriques (N) par colonne (100 × 1,8 mm) est de 20 000 ± 100. Les valeurs N pour les trois colonnes PMP sont présentées dans le tableau 3 et les chromatogrammes sont présentés dans la figure 5A. Analyse rapide à haut débit (700 µl/min) sur une colonne PMP, cinq peptides élués en une minute, excellente valeur N de 13 500 ± 330 par colonne (100 x 1,8 mm de diamètre), équivalent à 135 000 plaques/m (Fig. 5B). Trois colonnes de même taille (diamètre intérieur 100 x 1,8 mm) ont été remplies de trois lots différents de phase stationnaire PMP pour tester la reproductibilité. Les analytes ont été enregistrés pour chaque colonne en séparant le même mélange d'essai sur chaque colonne en utilisant des conditions d'élution optimales, le nombre de plaques théoriques N et le temps de rétention. Les données de reproductibilité pour les colonnes PMP sont présentées dans le tableau 4. La reproductibilité de la colonne PMP était bien corrélée avec de très faibles valeurs %RSD comme indiqué dans le tableau 3.
Séparation de mélanges de peptides sur colonne PMP (B) et colonne Ascentis Express RP-Amide (A), phase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensions de la colonne PMP (100 x 1,8 mm id), analyse Ordre d'élution des composés : 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) et 5 (acide leucique enképhaline).
Une colonne PMP (diamètre intérieur 100 x 1,8 mm) a été évaluée pour la séparation de l'hydrolysat tryptique de l'albumine sérique humaine par HPLC. Le chromatogramme de la figure 6 montre que les échantillons sont bien séparés avec une très bonne résolution. Les solutions de HSA ont été analysées à un débit de 100 μl/min, avec une phase mobile composée d'acétonitrile/eau 70/30 et de 0,1 % de TFA. Le clivage de la HSA a été divisé en 17 pics, comme le montre le chromatogramme (figure 6), correspondant à 17 peptides. Les efficacités de séparation des pics individuels de l'hydrolysat de HSA ont été calculées et les valeurs sont présentées dans le tableau 5.
Les hydrolysats tryptiques HSA ont été séparés sur une colonne PMP (diamètre intérieur 100 x 1,8 mm), débit (100 μl/min), phase mobile 60/40 acétonitrile/eau et 0,1 % TFA.
Français où L est la longueur de la colonne, η est la viscosité de la phase mobile, ΔP est la contre-pression de la colonne et u est la vitesse linéaire de la phase mobile. La perméabilité de la colonne PMP était de 2,5 × 10–14 m2, le débit était de 25 µl/min, 60/40 v/v a été utilisé. ACN/eau. La perméabilité de la colonne PMP (ID 100 × 1,8 mm) était similaire à celle de notre précédente étude Ref.34. La perméabilité d'une colonne remplie de particules superficiellement poreuses est de 1,7 × 10 ,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 pour les particules de 5 µm43. Par conséquent, la perméabilité de la phase PMP est similaire à la perméabilité des particules cœur-coquille d'une taille de 5 µm.
où Wx est la masse de la colonne remplie de chloroforme, Wy est la masse de la colonne remplie de méthanol et ρ est la densité du solvant. Densité du méthanol (ρ = 0,7866) et du chloroforme (ρ = 1,484). La porosité totale de la colonne de particules de silice-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 et de notre colonne C18-urée31 précédemment étudiée était respectivement de 0,63 et 0,55. Cela signifie que la présence de ligands urée réduit la perméabilité de la phase stationnaire. D'autre part, la porosité totale de la colonne PMP (diamètre intérieur 100 × 1,8 mm) est de 0,60. Les colonnes PMP sont moins perméables que les colonnes remplies de particules de silice liées au C18 car dans les phases stationnaires de type C18, les ligands C18 sont attachés aux particules de silice en chaînes linéaires, tandis que dans les phases stationnaires de type polystyrène, un polymère relativement épais se forme autour des particules. couche A. Dans une expérience typique, la porosité de la colonne est calculée comme suit :
Français Les figures 7A et B montrent les courbes de Van Deemter pour une colonne PMP (diamètre intérieur 100 x 1,8 mm) et une colonne Ascentis Express RP-Amide (diamètre intérieur 100 x 1,8 mm) dans les mêmes conditions d'élution, 60/40 ACN/H2O et 0,1 % TFA 20 µl/min à 800 µl/min sur les deux colonnes. Les valeurs HETP minimales au débit optimal (80 µl/min) étaient respectivement de 2,6 µm et 3,9 µm pour la colonne PMP et la colonne Ascentis Express RP-Amide. Les valeurs HETP montrent que l'efficacité de séparation de la colonne PMP (diamètre intérieur 100 x 1,8 mm) est bien supérieure à celle de la colonne Ascentis Express RP-Amide disponible dans le commerce (diamètre intérieur 100 x 1,8 mm). Le graphique de van Deemter de la figure 7(A) montre que la diminution de la valeur N n'est pas significativement plus élevée avec l'augmentation du débit par rapport à notre étude précédente. L'efficacité de séparation supérieure de la colonne PMP (diamètre intérieur 100 × 1,8 mm) par rapport à la colonne Ascentis Express RP-Amide est basée sur la forme et la taille améliorées des particules et sur la procédure sophistiquée de remplissage de la colonne utilisée dans les travaux actuels34.
(A) Graphique de Van Deemter (HETP vs. vitesse linéaire de la phase mobile) obtenu sur une colonne PMP (distance interne 100 x 1,8 mm) dans 60/40 ACN/H2O avec 0,1 % de TFA. (B) Graphique de Van Deemter (HETP versus vitesse linéaire de la phase mobile) obtenu sur une colonne Ascentis Express RP-Amide (distance interne 100 x 1,8 mm) dans 60/40 ACN/H2O avec 0,1 % de TFA.
Une phase stationnaire polaire de polystyrène intercalé a été préparée et évaluée pour la séparation d'un mélange de peptides synthétiques et d'hydrolysat tryptique de sérumalbumine humaine (HSA) en chromatographie liquide haute performance. Les performances chromatographiques des colonnes PMP pour les mélanges de peptides sont excellentes en termes d'efficacité de séparation et de résolution. Cette efficacité de séparation accrue des colonnes PMP est due à plusieurs facteurs, tels que la granulométrie et la taille des pores de la silice, la synthèse contrôlée des phases stationnaires et la complexité des matériaux de remplissage de la colonne. Outre cette efficacité de séparation élevée, cette phase stationnaire présente un autre avantage : la faible contre-pression de la colonne à haut débit. Les colonnes PMP sont hautement reproductibles et peuvent être utilisées pour l'analyse de mélanges de peptides et la digestion tryptique de diverses protéines. Nous prévoyons d'utiliser cette colonne pour la séparation de composés bioactifs issus de produits naturels, d'extraits de plantes médicinales et de champignons en chromatographie liquide. À l'avenir, les colonnes PMP seront également évaluées pour la séparation de protéines et d'anticorps monoclonaux.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Étude des systèmes de séparation de peptides par chromatographie en phase inverse, partie I : Développement d'un protocole pour la caractérisation des colonnes. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Étude des systèmes de séparation de peptides par chromatographie en phase inverse, partie I : Développement d'un protocole pour la caractérisation des colonnes.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., et Petersson, P. Étude des systèmes de séparation de peptides par chromatographie en phase inverse, partie I : développement d'un protocole pour la caractérisation des colonnes. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Étude des systèmes de séparation de peptides par chromatographie en phase inverse, partie I : Développement d'un protocole pour les caractéristiques des colonnes. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Étude des systèmes de séparation de peptides par chromatographie en phase inverse, partie I : Développement d'un protocole pour les caractéristiques des colonnes.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., et Petersson, P. Étude des systèmes de séparation de peptides par chromatographie en phase inverse, partie I : développement d'un protocole pour la caractérisation des colonnes.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Méthodes de création de peptides actifs améliorés pour le traitement des maladies infectieuses. Biotechnologie. Réalisations 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptides thérapeutiques synthétiques : science et marché. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptides thérapeutiques synthétiques : science et marché.Vliege P, Lisowski V, Martinez J et Chreschatyski M. Peptides thérapeutiques synthétiques : science et marché.Vliege P, Lisowski V, Martinez J et Khreschatsky M. Peptides thérapeutiques synthétiques : science et marché. Découverte de médicaments. Aujourd'hui 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Chromatographie liquide protéomique avancée. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Chromatographie liquide protéomique avancée.Voir F., Smith RD et Shen Yu. Chromatographie liquide protéomique avancée. Xie, F., Smith, RD et Shen, Y. Xie, F., Smith, RD et Shen, Y. Composition protéique avancée 液相色谱。Voir F., Smith RD et Shen Yu. Chromatographie liquide protéomique avancée.J. Chromatographie. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. La chromatographie liquide-spectrométrie de masse avancée est capable de combiner la métabolomique et la protéomique à large base. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Le rôle de l'UHPLC dans le développement pharmaceutique. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Le rôle de l'UHPLC dans le développement pharmaceutique.Chesnut, SM et Salisbury, JJ Le rôle de l'UHPLC dans le développement pharmaceutique.Chesnut, SM et Salisbury, JJ Le rôle de l'UHPLC dans le développement de médicaments. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspects fondamentaux et pratiques de la chromatographie liquide à ultra-haute pression pour les séparations rapides. Wu, N. & Clausen, AM Aspects fondamentaux et pratiques de la chromatographie liquide à ultra-haute pression pour les séparations rapides.Wu, N. et Clausen, AM Aspects fondamentaux et pratiques de la chromatographie liquide à haute pression pour une séparation rapide. Wu, N. et Clausen, AM. Wu, N. & Clausen, AM Aspects fondamentaux et pratiques de la chromatographie liquide à ultra-haute pression pour une séparation rapide.Wu, N. et Clausen, AM Aspects fondamentaux et pratiques de la chromatographie liquide à haute pression pour une séparation rapide.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Utilisation de la chromatographie liquide ultra-performante dans le développement pharmaceutique. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Utilisation de la chromatographie liquide ultra-performante dans le développement pharmaceutique.Ren, SA et Chelischeff, P. L'utilisation de la chromatographie liquide à ultra haute performance dans le développement pharmaceutique. Wren, SA et Tchelitcheff, P. Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA et Chelischeff, P. Application de la chromatographie liquide ultra-performante au développement de médicaments.J. Chromatographie. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Un hydrogel macroporeux monolithique dérivé d'une émulsion huile dans eau avec une phase interne élevée pour une purification efficace de l'entérovirus 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Le rôle de la chromatographie liquide en protéomique. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Le rôle de la chromatographie liquide en protéomique.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. et Wilkins, JA Le rôle de la chromatographie liquide en protéomique. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. et Wilkins, JA. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. et Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. et Wilkins, JA Le rôle de la chromatographie liquide en protéomique.J. Chromatographie. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nouvelles tendances dans les séparations par chromatographie liquide en phase inverse de peptides et de protéines thérapeutiques : théorie et applications. & Guillarme, D. Nouvelles tendances dans les séparations par chromatographie liquide en phase inverse de peptides et de protéines thérapeutiques : théorie et applications. & Guillarme, D. Nouvelles tendances en matière de thérapies peptidiques et biologiques avec une chromatographie plus rapide dans le mode actuel : théorie je exécution. & Guillarme, D. Nouvelles tendances dans la séparation des peptides et protéines thérapeutiques par chromatographie liquide en phase inverse : théorie et applications. & Guillarme, D. & Gularmé, D.et Guillarmé, D. Nouvelles tendances dans la séparation des peptides et protéines thérapeutiques par chromatographie liquide en phase inverse : théorie et applications.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Séparation bidimensionnelle de peptides à l'aide du système RP-RP-HPLC avec différents pH dans les première et deuxième dimensions de séparation. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Séparation bidimensionnelle de peptides à l'aide du système RP-RP-HPLC avec différents pH dans les première et deuxième dimensions de séparation.Gilar M., Olivova P., Dali AE et Gebler JK Séparation bidimensionnelle de peptides à l'aide du système RP-RP-HPLC avec différents pH dans les première et deuxième dimensions de séparation.Gilar M., Olivova P., Dali AE et Gebler JK Séparation bidimensionnelle de peptides en utilisant différentes valeurs de pH dans les première et deuxième dimensions de séparation en utilisant le système RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Étude du transfert de masse et des caractéristiques cinétiques des colonnes de chromatographie haute performance remplies de particules C18 entièrement poreuses et superficiellement poreuses inférieures à 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tendances récentes et défis analytiques dans l'isolement, l'identification et la validation des peptides bioactifs végétaux. anus. Créature anale. Chimique. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Paysage protéomique du règne de la vie. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Post-traitement de peptides thérapeutiques par chromatographie liquide préparative. Molecules (Bâle, Suisse) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Chromatographie en mode mixte et ses applications aux biopolymères. Yang, Y. & Geng, X. Chromatographie en mode mixte et ses applications aux biopolymères.Yang, Yu. et Geng, X. Chromatographie en mode mixte et son application aux biopolymères. Yang, Y. et Geng, X. Yang, Y. & Geng, X. Chromatographie en mode mixte et son application dans les biopolymères.Yang, Yu. et Gene, X. Chromatographie en mode mixte et son application aux biopolymères.J. Chromatographie. A 1218(49), 8813–8825 (2011).