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Le lupin angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) est une plante légumineuse utilisée pour la production alimentaire et l'amélioration des sols.L'expansion mondiale de NLL en tant que culture a attiré de nombreux champignons pathogènes, y compris l'anthracnose du lupin, qui cause la maladie dévastatrice de l'anthracnose.Deux allèles, Lanr1 et AnMan, qui confèrent une résistance accrue, ont été utilisés dans la sélection NLL, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus.Dans cette étude, les marqueurs Lanr1 et AnMan ont été utilisés pour cribler des échantillons NLL européens.Les tests du vaccin dans un environnement contrôlé ont confirmé l'efficacité des deux donneurs résistants.Le profilage différentiel de l'expression génique a été réalisé sur des lignées représentatives résistantes et sensibles.La résistance à l'anthracnose était associée à la surexpression des termes d'ontologie génique "GO: 0006952 Defense Response", "GO: 0055114 Redox Process" et "GO: 0015979 Photosynthèse".De plus, la lignée Lanr1(83A:476) a montré une reprogrammation importante du transcriptome rapidement après l'inoculation, tandis que les autres lignées ont montré un retard de cette réponse d'environ 42 heures.Les réponses de défense sont associées aux gènes TIR-NBS, CC-NBS-LRR et NBS-LRR, 10 protéines impliquées dans la pathogenèse, les protéines de transfert des lipides, l'endoglucane-1,3-β-glucosidase, les protéines de paroi cellulaire riches en glycine et les gènes de la voie réactive de l'oxygène.Les premières réponses à 83A:476, y compris la suppression soigneuse des gènes associés à la photosynthèse, ont coïncidé avec une protection réussie pendant la phase de croissance végétative de la biologie fongique, suggérant qu'un effecteur déclenche l'immunité.La réaction de Mandeloop est ralentie, tout comme la traînée horizontale globale.
Le lupin à feuilles étroites (NLL, Lupinus angustifolius L.) est une céréale riche en protéines originaire de la région méditerranéenne occidentale1,2.Il est actuellement cultivé comme culture vivrière pour les animaux et les humains.Il est également considéré comme un engrais vert dans les systèmes de rotation des cultures en raison de la fixation de l'azote par les bactéries symbiotiques fixatrices d'azote et de l'amélioration globale de la structure du sol.NLL a subi un processus de domestication rapide au cours du siècle dernier et est toujours soumis à une forte pression de reproduction3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Avec la généralisation de la culture de NLL, la succession de champignons pathogènes a développé de nouvelles niches agricoles et provoqué de nouvelles maladies destructrices de cultures. Le plus remarquable pour les éleveurs et éleveurs de lupins a été l'apparition de l'anthracnose, causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Le plus remarquable pour les éleveurs et éleveurs de lupins a été l'apparition de l'anthracnose, causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракно за, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. L'émergence de l'anthracnose causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 a été la plus notable pour les agriculteurs et les sélectionneurs de lupins.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg , Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar) Poil。1 Le cas échéant акноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Le plus frappant pour les agriculteurs et les éleveurs de lupins est l'émergence de l'anthracnose causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Les premiers rapports de la maladie sont venus du Brésil et des États-Unis, avec des symptômes typiques apparaissant respectivement en 1912 et 1929.Cependant, après environ 30 ans, l'agent pathogène a été désigné comme Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., téléomorphe Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., téléomorphe Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., téléomorphe de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dans la morphologie ciblée. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .et H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。et H. Schlenk, .Le phénotypage préliminaire de la maladie effectué au milieu du XXe siècle a montré une certaine résistance chez les accessions de NLL et de lupin jaune (L. luteus L.), mais toutes les accessions de lupin blanc (L. albus L.) testées étaient très sensibles15,16.Des études ont montré que le développement de l'anthracnose est associé à une augmentation des précipitations (humidité de l'air) et de la température (de l'ordre de 12 à 28 °C), entraînant une violation de la résistance à des températures plus élevées17, 18. En fait, le temps nécessaire aux conidies pour germer et à la maladie pour commencer était quatre fois plus court à 24 °C (4 heures) qu'à 12 °C (16 heures) dans des conditions d'humidité élevée19.Ainsi, le réchauffement climatique en cours a conduit à la propagation de l'anthracnose.Cependant, la maladie a été observée en France (1982) et en Ukraine (1983) comme signe avant-coureur d'une menace imminente, mais a apparemment été ignorée par l'industrie du lupin à l'époque20,21.Quelques années plus tard, cette maladie dévastatrice s'est propagée dans le monde entier et a également touché de grands pays producteurs de lupin comme l'Australie, la Pologne et l'Allemagne22,23,24.Suite à une épidémie d'anthracnose au milieu des années 1990, un dépistage approfondi a permis d'identifier plusieurs donneurs résistants dans les échantillons NLL19.La résistance de NLL à l'anthracnose est contrôlée par deux allèles dominants distincts trouvés dans différentes sources de matériel génétique : Lanr1 dans le cultivar Tanjil et Wonga et AnMan dans le cultivar.Mandalay 25, 26. Ces allèles complètent les marqueurs moléculaires qui soutiennent la sélection de matériel génétique résistant dans les programmes de sélection25,26,27,28,29,30.La lignée résistante 83A:476 portant l'allèle Lanr1 a été croisée avec la lignée sauvage sensible P27255 pour obtenir une population RIL ségrégeant pour la résistance à l'anthracnose, ce qui a permis d'attribuer le locus Lanr1 au chromosome NLL-1131, 32, 33. chromosome (NLL-11), mais dans des positions différentes29,34,35.Cependant, en raison du petit nombre de RIL et de la grande distance génétique entre les marqueurs et les allèles correspondants, aucune conclusion fiable ne peut être tirée sur leurs gènes sous-jacents.En revanche, l'utilisation de la génétique inverse chez les lupins est difficile du fait de leur très faible potentiel de régénération, ce qui rend les manipulations génétiques lourdes37.
Le développement de matériel génétique domestiqué portant l'allèle recherché à l'état homozygote, comme 83A:476 (Lanr1) et Mandelup (AnMan), a ouvert la porte à l'étude de la résistance à l'anthracnose face à la présence de combinaisons opposées d'allèles dans les populations sauvages.Possibilités de mécanismes moléculaires.Comparez les réponses de défense générées par des génotypes spécifiques.Cette étude a évalué la réponse transcriptomique précoce de NLL à la vaccination contre C. lupini.Tout d'abord, un panel européen de matériel génétique NLL contenant 215 lignées a été criblé à l'aide de marqueurs moléculaires qui marquent les allèles Lanr1 et AnMan.Le phénotypage de l'anthracnose a ensuite été réalisé sur 50 lignées NLL, préalablement sélectionnées pour des marqueurs moléculaires, dans des conditions contrôlées.Sur la base de ces expériences, quatre lignées différant par la résistance à l'anthracnose et la composition allélique Lanr1/AnMan ont été sélectionnées pour le profilage de l'expression différentielle des gènes de défense à l'aide de deux approches complémentaires : le séquençage d'ARN à haut débit et la quantification par PCR en temps réel.
Le criblage d'un ensemble de matériel génétique NLL (N = 215) avec les marqueurs Lanr1 (Anseq3 et Anseq4) et AnMan (Anseq4) et AnMan (AnManM1) a montré qu'une seule lignée (95726, près de Salamanca-b) amplifie l'allèle "résistance" pour tous les marqueurs, tandis que "Présence d'allèles 'susceptibles'" a trouvé la proportion de tous les marqueurs dans 158 (~ 73,5 %).Treize lignées ont produit deux allèles « résistants » du marqueur Lanr1 et 8 lignées ont produit des allèles « résistants » de Lanr1.marqueur.L'allèle "résistance" du marqueur AnMan (tableau complémentaire S1).Deux lignées étaient hétérozygotes pour le marqueur Anseq3 et une hétérozygote pour le marqueur AnManM1.42 lignées (19,5%) portaient des phases opposées des allèles Anseq3 et Anseq4, indiquant une fréquence élevée de recombinaison entre ces deux loci.Les phénotypes d'anthracnose dans des conditions contrôlées (tableau supplémentaire S2) ont révélé une variabilité de la résistance des génotypes testés, qui se reflétait dans la gravité de l'anthracnose.Les différences dans les scores moyens variaient de 1,8 (modérément résistant) à 6,9 (sensible) et les différences de poids des plantes variaient de 0,62 (sensible) à 4,45 g (résistant). Il y avait une corrélation significative entre les valeurs observées dans deux répétitions de l'expérience (0,51 pour les scores de gravité de la maladie, P = 0,00017 et 0,61 pour le poids de la plante, P < 0,0001) ainsi qu'entre ces deux paramètres (− 0,59 et − 0,77, P < 0,0001). Il y avait une corrélation significative entre les valeurs observées dans deux répétitions de l'expérience (0,51 pour les scores de gravité de la maladie, P = 0,00017 et 0,61 pour le poids des plantes, P < 0,0001) ainsi qu'entre ces deux paramètres (− 0,59 et − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторнос тях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,00 01), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Une corrélation significative a été trouvée entre les valeurs observées dans deux répétitions de l'expérience (0,51 pour les scores de gravité de la maladie, P = 0,00017 et 0,61 pour le poids des plantes, P < 0,0001), ainsi qu'entre ces deux paramètres (- 0,59 et -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0.51，P = 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。0.5 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повт орностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 et масса растения 0,61, P <0,0001), et между этими двумя параметрами (-0,59 et -0,0001) 0,77, P <0,0001. Il y avait une corrélation significative entre les valeurs observées en double (score de gravité de la maladie 0,51, P = 0,00017 et poids de la plante 0,61, P < 0,0001) et entre ces deux paramètres (-0,59 et -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Les symptômes typiques observés chez les plantes sensibles comprennent le vrillage et la torsion de la tige ressemblant à une structure en «arc de berger», suivis de lésions ovales avec des sporozoïtes orange / rose (Fig. 1 supplémentaire).Les accessions australiennes portant les gènes Lanr1 (83A:476 et Tanjil) et AnMan (Mandelup) sont modérément résistantes, 0,0331 et 0,0036).Certaines lignées qui portent également des allèles Lanr1 et/ou AnMan « résistants » présentent des symptômes de la maladie.
Fait intéressant, quelques lignées NLL dépourvues d'allèle marqueur «résistant» ont révélé un niveau élevé de résistance à l'anthracnose (comparable ou supérieur à celui des génotypes Lanr1 ou AnMan), telles que Boregine (valeur P < 0,0001 pour les deux paramètres), Bojar (valeur P < 0,0001 pour le score et 0,001 pour le poids de la plante) et Population B-549/79b (valeur P < 0,0001 pour le score et non- significatif pour le poids). Fait intéressant, quelques lignées NLL dépourvues d'allèle marqueur «résistant» ont révélé un niveau élevé de résistance à l'anthracnose (comparable ou supérieur à celui des génotypes Lanr1 ou AnMan), telles que Boregine (valeur P < 0,0001 pour les deux paramètres), Bojar (valeur P < 0,0001 pour le score et 0,001 pour le poids de la plante) et Population B-549/79b (valeur P < 0,0001 pour le score et non- significatif pour le poids). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля , показали высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0 ,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) et популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и н езначимо для массы). Fait intéressant, plusieurs lignées NLL dépourvues d'allèle marqueur "résistant" ont montré un niveau élevé de résistance à l'anthracnose (comparable ou supérieur aux génotypes Lanr1 ou AnMan), telles que Boregine (valeur P < 0,0001 pour les deux paramètres), Bojar (valeur P < 0,0001 pour l'évaluation et 0,001 pour le poids de la plante) et la population B-549/79b (valeur P < 0,0001 pour l'évaluation et non significatif pour le poids).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.0 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Il est intéressant de noter que certains systèmes NLL qui n'ont pas de marqueurs "antigéniques" présentent une résistance horizontale élevée (équivalente aux gènes Lanr1 ou AnMan ou plus), comme Boregine (les deux paramètres P < 0,0001), Bojar (valeur P < 0,0001, poids de la plante 0,001) et la souche B-549/79b (valeur P < 0,0001, poids non significatif). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей « резистентности », показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lan r1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0, 001) et популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Fait intéressant, certaines lignées NLL dépourvues d'allèles marqueurs de "résistance" ont montré des niveaux élevés de résistance à l'anthracnose (comparables ou supérieurs aux génotypes Lanr1 ou AnMan), telles que Boregine (valeur P pour les deux paramètres <0,0001), Bojar (valeur P <0,0001, poids de la plante 0,001) et la population B-549/79b (valeur P <0,0001, poids non significatif). ).Ce phénomène suggère la possibilité d'une nouvelle source génétique de résistance, expliquant le manque de corrélation observé entre les génotypes marqueurs et les phénotypes de la maladie (valeurs P de ~0,42 à ~0,98).Ainsi, le test de Kolmogorov-Smirnov a montré que les données sur la résistance à l'anthracnose étaient à peu près normalement distribuées pour les scores (valeurs P 0,25 et 0,11) et la masse végétale (valeurs P 0,47 et 0,55), suggérant que je fais l'hypothèse que plus d'allèles que Lanr1 et AnMan sont impliqués.
Sur la base des résultats du dépistage de la résistance à l'anthracnose, 4 lignées ont été sélectionnées pour l'analyse du transcriptome : 83A:476, Boregine, Mandelup et Population 22660. Ces lignées ont été retestées pour la résistance à l'anthrax dans des expériences d'inoculation par séquençage d'ARN, à condition qu'elles soient les mêmes que dans le test précédent.Les valeurs des scores étaient les suivantes : Boregin (1,71 ± 1,39), 83A : 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) et population 22660 (6,11 ± 1,29).
Le protocole Illumina NovaSeq 6000 a atteint une moyenne de 40,5 paires de Mread par échantillon (29,7 à 54,4 Mreads) (tableau supplémentaire S3).Les scores d'alignement dans la séquence de référence variaient de 75,5 % à 88,6 %.La corrélation moyenne des données de comptage de lecture entre les variantes expérimentales entre les répétitions biologiques variait de 0,812 à 0,997 (moyenne 0,959). Sur les 35 170 gènes analysés, 2917 n'ont révélé aucune expression et les 4785 autres gènes ont été exprimés à un niveau négligeable (moyenne de base < 5). Sur les 35 170 gènes analysés, 2917 n'ont révélé aucune expression et les 4785 autres gènes ont été exprimés à un niveau négligeable (moyenne de base < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов эк спрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Sur les 35 170 gènes analysés, 2917 n'ont montré aucune expression et les 4785 gènes restants ont été exprimés à un niveau négligeable (moyenne de base <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели не значительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Sur les 35 170 gènes analysés, 2 917 n'étaient pas exprimés et les 4 785 gènes restants avaient une expression négligeable (moyenne de base < 5).Ainsi, le nombre de gènes considérés comme exprimés (moyenne de base ≥ 5) au cours de l'expérience était de 27 468 (78, 1%) (tableau supplémentaire S4).
Dès le premier instant, toutes les lignées NLL ont répondu à l'inoculation de C. lupini (souche Col-08) en reprogrammant le transcriptome (tableau 1), cependant, des différences significatives ont été observées entre les lignées.Ainsi, la lignée de résistance 83A:476 (portant le gène Lanr1) a montré une reprogrammation significative du transcriptome au premier moment (6 hpi) avec une augmentation de 31 à 69 fois du nombre de gènes isolés up et down par rapport à d'autres moments à ce moment.De plus, ce pic a été de courte durée, car l'expression de quelques gènes seulement est restée significativement altérée au deuxième point temporel (12 hpi).Fait intéressant, Boregine, qui a également montré un niveau élevé de résistance dans le test de greffe, n'a pas subi une reprogrammation transcriptionnelle aussi massive au cours de l'expérience.Cependant, le nombre de gènes différentiellement exprimés (DEG) était le même pour Boregine et 83A:476 à 12 HPI.Mandelup et la population 22660 ont montré des pics de DEG au dernier point dans le temps (48 l/s), indiquant un retard relatif dans les réponses de défense.
Étant donné que 83A: 476 a subi une reprogrammation massive du transcriptome en réponse à C. lupini à 6 HPI par rapport à toutes les autres lignées, environ 91% des DEG observés à ce moment étaient spécifiques à la lignée (Fig. 1).Cependant, il y avait un certain chevauchement dans les réponses précoces entre les lignées d'étude, car 68,5 %, 50,9 % et 52,6 % DEG à Boregine, Mandelup et la population 22660, respectivement, se chevauchaient avec ceux trouvés dans 83A: 476 à certains moments.Cependant, ces DEG ne représentaient qu'une petite fraction (0, 97 à 1, 70%) de tous les DEG actuellement détectés à l'aide de 83A: 476.De plus, 11 DEG de toutes les lignées étaient cohérents à ce moment (tableaux supplémentaires S4-S6), y compris les composants communs des réponses de défense des plantes : protéine de transfert des lipides (TanjilG_32225), enzyme endoglucane-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), deux protéines inductibles par le stress comme SAM22 (TanjilG_31528 et TanjilG_31531), protéine basique de latex ( TanjilG_32352) et deux protéines de paroi cellulaire structurelles riches en glycine (TanjilG_19701 et TanjilG_19702).Il y avait également un chevauchement relativement élevé des réponses du transcriptome entre 83A: 476 et Boregine à 24 HPI (total 16-38 % DEG) et entre Mandelup et la population 22660 à 48 HPI (total 14-20 % DEG).
Diagramme de Venn montrant le nombre de gènes différentiellement exprimés (DEG) dans des lignées de lupins à feuilles étroites (NLL) inoculées avec Colletotrichum lupini (souche Col-08 obtenue à partir de champs de lupins à Wierzhenice, Pologne, 1999).Les lignées NLL analysées étaient : 83A:476 (résistante, portant l'allèle Lanr1), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, portant l'allèle AnMan) et la population 22660 (très sensible).L'abréviation hpi signifie heures après la vaccination.Les valeurs nulles ont été supprimées pour simplifier le graphique.
L'ensemble de gènes surexprimés à 6 hpi a été analysé pour la présence de domaines de gènes R canoniques (tableau supplémentaire S7).Cette étude a révélé l'induction du transcriptome des gènes classiques de résistance aux maladies avec les domaines NBS-LRR uniquement à 83A:476.Cet ensemble comprenait un gène TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinq gènes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 et tanjilg_16162) et quatre NBS-LR, Tanjilg_16162) et quatre NBS-LR RE (tanjilg_16162) ainsi que Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) et Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Tous ces gènes ont des domaines canoniques disposés en séquences conservées.En plus des gènes du domaine NBS-LRR, plusieurs kinases RLL ont été activées à 6 hpi, à savoir une chez Boregine (TanjilG_19877), deux chez Mandelup (TanjilG_07141 et TanjilG_19877) et dans la population 22660 (TanjilG_09014 et TanjilG_10361) et deux chez 83A 27:47 6.
Les gènes dont l'expression était significativement altérée en réponse à l'inoculation avec C. lupini (souche Col-08) ont été soumis à une analyse d'enrichissement de Gene Ontology (GO) (tableau supplémentaire S8). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était "GO: 0006952 réponse de défense" qui est apparu dans 6 des 16 combinaisons (temps × ligne) avec une signification élevée (valeur P <0, 001) (Fig. 2). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était "GO: 0006952 réponse de défense" qui est apparu dans 6 des 16 combinaisons (temps × ligne) avec une signification élevée (valeur P <0, 001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой знач имостью (значение P <0,001) (рис. 2). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était «GO: 0006952 réponse de défense», qui est apparu dans 6 des 16 combinaisons (temps × lignée) avec une signification élevée (valeur P <0, 001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Le terme de processus biologique le plus représentatif est « GO:0006952 réponse de défense », qui apparaît dans 6 des 16 combinaisons (时间×线), avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Réponse de la Défense », entre 6 et 16 jours å P <0,001) (рис. 2). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était « GO: 0006952 Defense Response », qui apparaissait dans 6 des 16 combinaisons (temps × ligne) avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Fig. 2).Ce terme était surreprésenté à deux moments dans 83A : 476 et Boregine (6 et 24 hpi) et à un moment dans Mandelup et Population 22660 (12 et 6 hpi, respectivement).C'est un résultat attendu, mettant en évidence la réponse antifongique des lignées résistantes.De plus, 83A:476 a répondu à C. lupini en induisant rapidement des gènes liés à la poussée oxydative représentée par le terme "GO:0055114 processus redox", indiquant une réponse de défense spécifique, tandis que Boregine a révélé des réponses de défense spécifiques, liées au terme "GO".:0006950 Réponse au stress ».La population 22660 a activé la réponse de résistance horizontale impliquant les métabolites secondaires, mettant en évidence le nombre excessif de termes "GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis" et "GO:0006722 Process of triterpene secretariat" (les deux termes appartiennent au même ensemble de gènes), compte tenu des résultats de l'analyse d'enrichissement des termes GO, la stabilité de la réaction de Mandelup était entre Boregine et Population 22660. De plus, la réaction précoce 83A:476 (6 hpi) et réaction retardée Mandelup et Population 22660 incluent le terme GO:0015979 « photosynthèse » et d'autres processus biologiques associés.
Les termes d'ontologie des gènes de bioprocédés sélectionnés dans l'annotation des gènes exprimés de manière différentielle lors des réponses transcriptomiques du lupin à feuilles étroites (NLL) inoculé avec du lupin charbonneux (souche Col-08 obtenue à partir de champs de lupin à Wierzhenice, Pologne, en 1999) sont fortement exagérés.Les lignées NLL analysées étaient : 83A:476 (résistante, portant l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, portant l'allèle homozygote AnMan) et la population 22660 (sensible).
Parce que cette étude visait à identifier les gènes qui contribuent à la résistance à l'anthracnose, les gènes assignés aux termes GO « GO : 0006952 Defensive answers » et « GO : 0055114 Redox Processes » ont été analysés avec des seuils puisque la ligne de base signifie ≥ 30 avec au moins une ligne.× point dans le temps combinant des valeurs statistiquement significatives de log2 (changement de pli).Le nombre de gènes répondant à ces critères était de 65 pour GO:0006952 et de 524 pour GO:0055114.
83A:476 a révélé deux pics DEG annotés avec le terme GO:0006952, le premier à 6 gènes par pouce (64 gènes, régulation à la hausse et à la baisse) et le second à 24 gènes par pouce (15 gènes, régulation à la hausse uniquement).Boregine a également montré que GO:0006952 a culminé au même moment, mais avec moins de DEG (11 et 8) et une activation préférentielle.Mandeloop a montré deux pics de GO: 0006952 à 12 et 48 HPI, tous deux porteurs de 12 gènes (le premier avec des gènes activateurs et le second avec uniquement des gènes suppresseurs), tandis que la population 22660 à 6 HPI (13 gènes) avait une plus grande prédominance du pic d'augmentation.régulation.Il convient de noter que 96,4 % des GO:0006952 DEG dans ces pics avaient le même type de réponse (haut ou bas), indiquant un chevauchement significatif des réponses de défense malgré les différences dans le nombre de gènes impliqués.Le plus grand groupe de séquences liées au terme GO:0006952 code pour la Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), qui appartient au clade de protéines associées à la pathogenèse de classe 10 (PR-10) et au latex de protéines de base.protéine similaire (de type MLP) (Fig. 3).Les deux groupes différaient dans la nature de l'expression et la direction de la réponse.Les gènes codant pour les protéines de type SAM22 ont montré une induction cohérente et significative à des moments précoces (6 ou 12 hpi) et étaient généralement insensibles à la fin de l'expérience (48 hpi), tandis que les protéines de type MLP ont montré une coordination à 6 hpi.hpi.83A:476 et Mandelup à 48 hp/in, presque tous les autres points de données ne répondaient pas.De plus, les différences dans les profils d'expression des gènes de protéines de type SAM22 ont suivi la variabilité observée de la résistance à l'anthracnose, car les lignées plus résistantes avaient plus de points dans le temps induisant de manière significative ces gènes que les gènes plus sensibles.Un autre gène PR-10 de type LlR18A/B a montré un schéma d'expression très similaire au gène de la protéine de type SAM22.
Les principaux composants du terme de processus biologique "GO:0006952 Defense Response" et les profils d'expression des gènes candidats des allèles Lanr1 et AnMan ont été identifiés.L'échelle Log2 représente les valeurs log2 (changement de facteur) entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupins, Wizhenica, Pologne, 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) au même moment.Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, portant l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, portant l'allèle homozygote AnMan) et Population 22660 (sensible).
De plus, les profils d'expression des gènes candidats RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) et AnMan (TanjilG_12861) ont été évalués (Fig. 3).Le gène TanjilG_05042 a montré une réponse significative (activation) à 83A:476 uniquement au premier moment (6 hpi), tandis que TanjilG_12861 était significatif à Mandeloop uniquement à deux moments : 6 hpi (régulation à la baisse) et 24 hpi (6 hpi).Avec.).Ajustable) ).
Les gènes les plus surexprimés dans le terme GO:0055114 "processus redox" étaient les gènes codant pour les protéines du cytochrome P450 et la peroxydase (Fig. 4).Pour les échantillons isolés de 83A:476 à 6 HPI, des valeurs maximales ou minimales de log2 (fold change) (pour 86,6% des gènes) ont été généralement observées entre les plantes inoculées et témoins, soulignant la forte réponse de ce génotype au sexe inoculant.83A:476 a montré le GO le plus significatif : 0055114 DEG à 6 hpi (503 gènes), tandis que le reste des lignées à 48 hpi (Boregine, 31 gènes ; Mandelup, 85 gènes ; et Population 22660, 78 gènes)).Dans la plupart des gènes de la famille GO:0055114, deux types de réponses à la vaccination (activation et inhibition) ont été observées.Fait intéressant, jusqu'à 97,6 % des DEG identifiés pour le terme GO : 0055114 chez Mandelupe à 48 hp Ces observations suggèrent que, malgré l'échelle significativement plus petite (c'est-à-dire le nombre de gènes redox mutés, 85 contre 503), le modèle de réponses transcriptomiques retardées de mandeloup à l'anthracnose est similaire à la réponse précoce de 83A:476.Dans Boregine et Population 22660, cette convergence est plus faible à 51,6 % et 75,6 %, respectivement.
Les schémas d'expression des principaux composants du terme du processus biologique "GO:0055114 Redox process" ont été révélés.L'échelle Log2 représente les valeurs log2 (changement de facteur) entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupins, Wizhenica, Pologne, 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) au même moment.Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, portant l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, portant l'allèle homozygote AnMan) et Population 22660 (sensible).
83A:476 Les réponses transcriptomiques à l'inoculation avec C. lupini (souche Col-08) comprenaient également le silençage coordonné de gènes attribués au terme GO:0015979 "photosynthèse" et d'autres processus biologiques associés (FIG. 5).Cet ensemble GO:0015979 DEG contenait 105 gènes significativement réprimés à 6 hpi à 83A:476.Dans ce sous-ensemble, 37 gènes ont également été régulés négativement chez Mandelup à 48 HPI et 35 au même moment dans la population 22660, dont 19 DEG communs aux deux génotypes.Aucun DEG lié au terme GO : 0015979 n'a été activé de manière significative dans aucune combinaison (ligne x temps).
Les schémas d'expression des principaux composants du terme du processus biologique "GO: 0015979 Photosynthèse" ont été révélés.L'échelle Log2 représente les valeurs log2 (changement de facteur) entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupins, Wizhenica, Pologne, 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) au même moment.Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, portant l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, portant l'allèle homozygote AnMan) et Population 22660 (sensible).
Sur la base des résultats de l'analyse de l'expression différentielle et vraisemblablement impliqué dans les réponses de défense contre les champignons pathogènes, cet ensemble de sept gènes a été sélectionné pour la quantification des profils d'expression par PCR en temps réel (tableau supplémentaire S9).
Le gène de la protéine putative TanjilG_10657 a été induit de manière significative dans toutes les lignées et tous les points temporels étudiés par rapport aux plantes témoins (imitatrices) (tableaux supplémentaires S10, S11).De plus, le profil d'expression de TanjilG_10657 a montré une tendance à la hausse au cours de l'expérience pour toutes les lignées.La population 22660 a montré la sensibilité la plus élevée de TanjilG_10657 à l'inoculation avec une activation de 114 fois et le niveau d'expression relative le plus élevé (4, 4 ± 0, 4) à 24 HPI (Fig. 6a).Le gène de la protéine PR10 LlR18A TanjilG_27015 a également montré une activation sur toutes les lignées et tous les points dans le temps, avec une signification statistique à la plupart des points de données (Fig. 6b).Semblable à TanjilG_10657, le niveau d'expression relative le plus élevé de TanjilG_27015 a été observé dans la population inoculée de 22660 à 24 HPI (19,5 ± 2,4).Le gène de l'endochitinase acide TanjilG_04706 était significativement régulé à la hausse dans toutes les lignées et à tous les moments, à l'exception de Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Elle a été fortement induite au premier point temporel (6 HPI) à 83A:476 (de 10,5 fois) et modérément augmentée dans les autres lignées (de 6,6 à 7,5 fois).Au cours de l'expérience, l'expression de TanjilG_04706 est restée à des niveaux similaires dans 83A:476 et Boregine, tandis que dans Mandelup et Population 22660, elle a considérablement augmenté, atteignant des valeurs relativement élevées (5,9 ± 1,5 et 6,2 ± 1,5, respectivement).Le gène de type endoglucane-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 a montré une activation élevée aux deux premiers moments (6 et 12 hpi) dans toutes les lignées sauf la population 22660 (Fig. 6d).Les niveaux d'expression relative les plus élevés de TanjilG_23384 ont été observés au deuxième point dans le temps (12 hpi) à Mandelup (2,7 ± 0,3) et 83A:476 (1,5 ± 0,1).À 24 HPI, l'expression de TanjilG_23384 était relativement faible dans toutes les lignées étudiées (de 0,04 ± 0,009 à 0,44 ± 0,12).
Profils d'expression de gènes sélectionnés (ag) révélés par PCR quantitative.Les nombres 6, 12 et 24 représentent les heures après la vaccination.Les gènes LanDExH7 et LanTUB6 ont été utilisés pour la normalisation et LanTUB6 a été utilisé pour l'étalonnage inter-séries.Les barres d'erreur représentent l'écart type basé sur trois répétitions biologiques, dont chacune est la moyenne de trois répétitions techniques. La signification statistique des différences dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue en 1999 à partir du champ de lupin à Wierzenica, Pologne) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) est indiquée au-dessus des points de données (* valeur P < 0,05, ** valeur P ≤ 0,01, *** valeur P ≤ 0,001). La signification statistique des différences dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue en 1999 à partir du champ de lupin à Wierzenica, Pologne) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) est indiquée au-dessus des points de données (* valeur P < 0,05, ** valeur P ≤ 0,01, *** valeur P ≤ 0,001). (Colletotric hum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. о инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Des différences statistiquement significatives dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue en 1999 à partir d'un champ de lupins à Wierzhenice, Pologne) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) sont notées au-dessus des points de données (* valeur P < 0, 05, ** valeur P ≤ 0, 01, *** valeur P ≤ 0, 001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达(*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001)。接种 （colletotrichum lupini ， couleur-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Colletotrichum lupini (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) et контрольными (ло жно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0 ,01, ***P-значение ≤ 0,001). Des différences statistiquement significatives dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupins à Verzhenice, Pologne, en 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) sont notées au-dessus des points de données (* valeur P < 0, 05, ** valeur P ≤ 0, 01, *** valeur P ≤ 0, 001).Les lignées NLL analysées étaient : 83A:476 (résistante, portant l'allèle homozygote Lanr1), Mandelup (modérément résistante, portant l'allèle homozygote AnMan), Boregine (résistante, fond génétique inconnu) et la population 22660 (sensible).
Le gène candidat TanjilG_05042 au locus Lanr1 a montré un schéma d'expression nettement différent des profils obtenus à partir d'études RNA-seq (Fig. 6e).Une activation significative de ce gène a été observée chez Mandelup et la population 22660 (jusqu'à 39,7 et 11,7 fois, respectivement), entraînant des niveaux d'expression relativement élevés (jusqu'à 1,4 ± 0,14 et 7,2 ± 1,3, respectivement).83A:476 a également révélé une certaine régulation à la hausse du gène TanjilG_05042 (jusqu'à 3,8 fois), cependant, les niveaux d'expression relatifs atteints (0,044 ± 0,002) étaient plus de 30 fois inférieurs à ceux observés chez Mandelup et la population 22660.analysés par qPCR ont montré des différences significatives dans les niveaux d'expression entre les génotypes dans les variantes vaccinées fictives (contrôle), atteignant une différence de 58 fois entre les populations 22660 et 83A: 476, ainsi qu'entre les populations 22660 et 22660. Une différence double a été obtenue entre Boregine et Mandalup.
Le gène candidat au locus AnMan, TanjilG_12861, a été activé en réponse à la vaccination dans 83A: 476 et Mandelup, était neutre dans la population 22660 et a été régulé négativement dans Boregine (Fig. 6f).L'expression relative du gène TanjilG_12861 était la plus élevée dans 83A inoculé : 476 (0,14 ± 0,01).Le gène de la protéine de choc thermique de classe I de 17, 4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 a montré des niveaux d'expression relatifs inférieurs dans toutes les souches et tous les points temporels étudiés (Fig. 6g).La valeur la plus élevée a été observée à 24 HPI dans la population 22660 (0,14 ± 0,02, une multiplication par huit en réponse à la vaccination).
La comparaison des profils d'expression génique (Fig. 7) a révélé une forte corrélation entre TanjilG_10657 et quatre autres gènes : TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) et TanjilG_04706 (r = 0,79).De tels résultats peuvent indiquer une co-régulation de ces gènes lors des réponses de défense.Les gènes TanjilG_12861 et TanjilG_23384 ont montré des profils d'expression différents avec des valeurs de coefficient de corrélation de Pearson plus faibles (de 0,08 à 0,43 et -0,19 à 0,28, respectivement) par rapport aux autres gènes.
Les corrélations entre les profils d'expression génique ont été détectées à l'aide de la PCR quantitative.Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, portant l'allèle homozygote Lanr1), Mandelup (modérément résistante, portant l'allèle homozygote AnMan), Boregine (résistante, fond génétique inconnu) et Population 22660 (sensible).Trois points dans le temps ont été calculés (6, 12 et 24 heures après l'inoculation), y compris les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupin à Wierzhenice, Pologne, en 1999) et les plantes témoins (inoculations fictives).L'échelle indique la valeur du coefficient de corrélation de Pearson.
Sur la base des données obtenues à 6 chevaux par pouce, la WGCNA a été réalisée sur 9981 DEG identifiés en comparant les plantes inoculées et témoins pour se concentrer sur les réponses de défense précoces (tableau supplémentaire S12).Vingt-deux modules de gènes (clusters) ont été trouvés avec des profils d'expression corrélés (positifs ou négatifs) entre les génotypes et les variants expérimentaux. En moyenne, les niveaux d'expression des gènes décroissaient dans l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les deux variantes, cependant, cette tendance était plus forte dans les plantes témoins). En moyenne, les niveaux d'expression des gènes décroissaient dans l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les deux variantes, cependant, cette tendance était plus forte dans les plantes témoins). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариант ах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). En moyenne, les niveaux d'expression génique ont diminué dans l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les deux variantes, cependant, cette tendance était plus forte dans les plantes témoins).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> population 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вар иантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). En moyenne, les niveaux d'expression des gènes ont diminué dans la série 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (cependant, dans les deux variantes, cette tendance était plus forte dans les plantes témoins).La vaccination a entraîné une régulation positive de l'expression des gènes, en particulier dans les modules 18, 19, 14, 6 et 1 (par ordre décroissant d'effet), une régulation négative (par exemple les modules 9 et 20) ou avec des effets neutres (par exemple les modules 11, 22, 8 et 13).L'analyse d'enrichissement du terme GO (tableau supplémentaire S13) a révélé « GO : 0006952 réponses protectrices » pour le module inoculé (18) avec une activation maximale, y compris les gènes analysés par qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 et TanjilG_27015), ainsi que de nombreux modules de photosynthèse Inoculate les plus supprimés (9).Le concentrateur du module 18 (Fig. 8) a été identifié comme le gène TanjilG_26536 codant pour la protéine LlR18B de type PR-10, et le concentrateur du module 9 a été identifié comme le gène TanjilG_28955 codant pour la protéine PsbQ du photosystème II.Un gène candidat de résistance à l'anthracnose Lanr1, TanjilG_05042, a été trouvé dans le module 22 (Fig. 9) et est associé aux termes "GO:0044260 Processus métaboliques macromoléculaires cellulaires" et "GO:0006355 Régulation transcriptionnelle, modélisation de l'ADN" portant le noyau TanjilG_01212.le gène code pour le facteur de transcription du stress thermique A-4a (HSFA4a).
Analyse de réseau pondérée de la co-expression génique de modules avec des termes de processus biologiques surreprésentés « GO : 0006952 Réponses de défense ».La ligature a été simplifiée pour mettre en évidence les quatre gènes analysés par qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 et TanjilG_27015).
Analyse en réseau pondérée de la co-expression génique d'un module avec un terme de processus biologique surreprésenté « GO : 0006355 : Régulation transcriptionnelle, modélisation de l'ADN » et portant un gène candidat de résistance à l'anthracnose Lanr1 TanjilG_05042.La ligature a été simplifiée pour isoler le gène TanjilG_05042 et le gène central TanjilG_01212.
Le dépistage de la résistance à l'anthracnose effectué en Australie a montré que la plupart des cultivars commercialisés au début étaient sensibles ;Kalya, Coromup et Mandelup ont été décrites comme modérément résistantes, tandis que Wonga, Tanjil et 83A:476 ont été décrites comme hautement résistantes26,27,31.avaient le même allèle de résistance, désigné Lanr1, et Coromup et Mandelup avaient un allèle différent, désigné AnMan10, 26, 39, tandis que Kalya a transmis un allèle différent., Lanr2.Le dépistage de la résistance à l'anthracnose en Allemagne a abouti à l'identification d'une lignée résistante Bo7212 avec un allèle candidat autre que Lanr1, désigné LanrBo36.
Notre étude a révélé une très faible fréquence (environ 6%) de l'allèle Lanr1 dans le matériel génétique testé.Cette observation est cohérente avec les résultats du criblage de matériel génétique est-européen à l'aide des marqueurs Anseq3 et Anseq4, qui ont montré que l'allèle Lanr1 n'est présent que dans deux lignées biélorusses.Cela suggère que l'allèle Lanr1 n'est pas encore largement utilisé par les programmes de sélection locaux, contrairement à l'Australie, où il est l'un des allèles clés pour la sélection assistée par marqueurs.Cela peut être dû au niveau de résistance plus faible fourni par l'allèle Lanr1 dans les conditions de terrain européennes par rapport au rapport australien.De plus, des études sur l'anthracnose dans les zones à fortes précipitations en Australie ont montré que les réponses de résistance médiées par l'allèle Lanr1 peuvent ne pas être efficaces dans des conditions météorologiques qui favorisent la croissance et le développement rapide de l'agent pathogène19,42.En fait, dans la présente étude, certains symptômes d'anthracnose ont également été observés chez des génotypes porteurs de l'allèle Lanr1, suggérant que la résistance peut disparaître dans des conditions optimales pour le développement de C. lupini.De plus, des interprétations faussement positives de la présence de marqueurs Anseq3 et Anseq4, qui sont à environ 1 cM du locus Lanr1, sont possibles 28,30,43 .
Notre étude a montré que 83A:476, portant l'allèle Lanr1, répondait à l'inoculation de C. lupini avec une reprogrammation du transcriptome à grande échelle au premier moment analysé (6 hpi), tandis que chez Mandelup, portant l'allèle AnMan, des réponses transcriptomiques ont été observées beaucoup plus tard.(de 24 à 48 ch).Ces variations temporelles des réponses de défense sont associées à des différences dans les symptômes de la maladie, soulignant l'importance de la reconnaissance précoce des agents pathogènes pour une réponse réussie à la résistance.Pour infecter les tissus végétaux, les spores d'anthrax doivent passer par plusieurs stades de développement à la surface de l'hôte, notamment la germination, la division cellulaire et la formation d'un appressorium.Un appendice est une structure infectieuse qui se fixe à la surface de l'hôte et facilite la pénétration dans les tissus de l'hôte.Ainsi, les spores de C. gloeosporioides dans l'extrait de pois ont montré la première division du noyau après 75-90 minutes d'incubation, la formation d'un tube germinatif après 90-120 minutes et la suppression après 4 heures 45 .Mango C. gloeosporioides a montré plus de 40 % de germination des conidies après 3 heures d'incubation et environ 20 % de formation d'appresseurs après 4 heures.Le gène CAP20 associé à la virulence de C. gloeosporioides a montré une activité transcriptionnelle dans les conidies formant des épiphytes après 3,5 h d'incubation dans de la cire de surface d'avocat avec des concentrations élevées de protéine CAP20 après 4 h 46 min.De même, l'activité des gènes de biosynthèse de la mélanine chez C. trifolii a été induite au cours d'une incubation de 2 heures suivie de la formation d'un appressorium après 1 heure.Des études sur les tissus foliaires ont montré que les fraises inoculées avec C. acutatum ont une première suppression à 8 hpi, tandis que les tomates inoculées avec C. coccodes ont une première suppression à 4 hpi48,49.largement compatible avec l'échelle de temps de Colletotrichum spp.processus infectieux.Les réponses de défense rapides à 83A: 476 suggèrent l'implication de gènes de résistance des plantes et d'immunité déclenchée par l'effecteur (ETI) dans cette lignée, tandis que les réponses retardées de Mandelup soutiennent l'hypothèse de l'immunité déclenchée par le modèle moléculaire micro-associé (MTI) 50. Réponses précoces à 83A: 476 et Mandelup.Le chevauchement partiel entre les gènes régulés à la hausse ou à la baisse dans la réponse retardée soutient également ce concept, car l'ETI est souvent considérée comme une réponse MTI accélérée et améliorée qui aboutit à la mort cellulaire programmée au site de l'infection, connue sous le nom de choc anaphylactique 51,52.
La plupart des gènes attribués au terme surreprésenté Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" sont les 11 homologues de la protéine 22 du message de jeûne induit par le stress (similaire à SAM22) et les sept principales protéines de latex (MLP).-like protéines 31, 34, 43 et 423 ont montré une similarité de séquence.Les gènes de type SAM22 ont montré une activation significative qui a duré plus longtemps, montrant des niveaux accrus de résistance à l'anthracnose (83A: 476 et Boregine).Cependant, les gènes de type MLP n'étaient régulés négativement que dans les lignées portant l'allèle de résistance candidat (83A:476/Lanr1 à 6 hpi et Mandelup/AnMan à 24 hpi).Il convient de noter que tous les homologues de type SAM22 identifiés proviennent d'un groupe de gènes couvrant environ 105 kb, tandis que les gènes de type MLP proviennent de régions distinctes du génome.L'activation coordonnée de ces gènes de type SAM22 a également été trouvée dans notre étude précédente sur la résistance de NLL à l'inoculation de Diaporthetoxica, suggérant qu'ils sont impliqués dans les composants horizontaux de la réponse de défense.Cette conclusion est également étayée par des rapports faisant état d'une réponse positive des gènes de type SAM22 à une blessure ou à un traitement avec de l'acide salicylique, des inducteurs fongiques ou du peroxyde d'hydrogène.
Il a été démontré que les gènes de type MLP réagissent à divers stress abiotiques et biotiques, y compris les infections fongiques bactériennes, virales et pathogènes chez de nombreuses espèces végétales55.Les directions de réponse à certaines interactions entre plantes et agents pathogènes allaient de fortement croissantes (c'est-à-dire pendant l'infestation du cotonnier par Verticillium dahliae) à significativement décroissantes (c'est-à-dire après infection du pommier par Alternaria spp.)56,57.Une régulation négative significative du gène 423 de type MLP a été observée lors des défenses de l'avocat contre l'infection par F. niger et lors de l'infection du pommier Botryosphaeria berengeriana f.CN.piricola et Alternaria alternata sont des pathotypes du pommier58,59.De plus, les cals de pomme surexprimant le gène 423 de type MLP présentaient une expression plus faible des gènes associés à la résistance et étaient plus sensibles aux infections fongiques59.Après Fusarium oxysporum f, le gène 423 de type MLP a également été supprimé dans le germoplasme de haricot commun résistant.CN.Infection du haricot 60.
Les autres membres de la famille PR-10 identifiés dans notre étude RNA-seq étaient les gènes LlR18A et LlR18B en réponse à la régulation positive, ainsi que le gène régulé positivement (1 gène) ou régulé négativement (3 gènes) pour la protéine de transfert lipidique DIR1..En outre, WGCNA met en évidence le gène LlR18B comme plaque tournante dans ce module, qui est très sensible à la vaccination et porte plusieurs gènes de réponse protecteurs.Les gènes LlR18A et LlR18B ont été induits dans des feuilles de lupin jaune en réponse à des bactéries pathogènes, ainsi que dans des tiges NLL après inoculation de D. toxica, tandis que l'homologue de riz de ces gènes, RSOsPR10, a été rapidement induit par une infection fongique vraisemblablement impliquée dans la voie de signalisation de l'acide jasmonique. ic résistance acquise (SAR).Avec le développement de réactions protectrices, la protéine DIR1 est transportée du foyer d'infection à travers le phloème pour induire une SAR dans des organes distants.Fait intéressant, le gène TanjilG_02313 DIR1 a été significativement induit au premier moment dans les lignées 84A:476 et la population 22660, mais la résistance à l'anthracnose ne s'est développée avec succès que dans la lignée 84A:476.Cela peut indiquer une sous-fonctionnalisation du gène DIR1 dans NLL, puisque les trois homologues restants ont répondu à l'inoculation uniquement dans la lignée 83A:476 à 6 hpi, et cette réponse était dirigée vers le bas.
Dans notre étude, les composants les plus courants correspondant au processus biologique appelé "GO:0055114 Redox process" étaient la protéine cytochrome P450, la peroxydase, l'acide linoléique 9S-/13S-lipoxygénase et l'acide 1-aminocyclopropane-1-carboxylique oxydase.De plus, notre WGCNA définit l'homologue HSFA4a comme un hub portant des modules tels que le gène candidat de résistance Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a est un composant de la régulation redox-dépendante de la transcription nucléaire chez les plantes.
Les protéines du cytochrome P450 sont des oxydoréductases qui catalysent les réactions d'hydroxylation dépendantes du NADPH et/ou de l'O2 dans le métabolisme primaire et secondaire, y compris le métabolisme des xénobiotiques, ainsi que des hormones, des acides gras, des stérols, des composants de la paroi cellulaire, des biopolymères et la biosynthèse des composés protecteurs. à un grand nombre d'homologues altérés (37) et des différences dans les schémas de réponse entre des gènes spécifiques, reflétant une révision à la hausse..Utiliser uniquement des données ARN-seq pour élucider la fonction biologique putative des gènes NLL dans une si grande superfamille de protéines serait hautement spéculatif.Cependant, il convient de noter que certains gènes du cytochrome P450 sont associés à une résistance accrue aux champignons ou bactéries pathogènes, y compris une contribution aux réactions allergiques69,70,71.
Les peroxydases de classe III sont des enzymes végétales multifonctionnelles impliquées dans un large éventail de processus métaboliques au cours de la croissance et du développement des plantes, ainsi qu'en réponse à des stress environnementaux tels que la salinité, la sécheresse, une intensité lumineuse élevée et l'attaque d'agents pathogènes72.Les peroxydases sont impliquées dans l'interaction de plusieurs espèces végétales avec Anthracis, notamment Stylosanthes humilis et C. gloeosporioides, Lens culinaris et C. truncatum, Phaseolus vulgaris et C. lindemuthianum, Cucumis sativus et C. lagenarium73,74,75,76.La réponse est très rapide, parfois même à 4 HPI, avant que le champignon ne pénètre dans les tissus végétaux73.Le gène de la peroxydase a également répondu à l'inoculation de D. toxica NLL.En plus de leurs fonctions typiques de régulation de la poussée oxydative ou d'élimination du stress oxydatif, les peroxydases peuvent interférer avec la croissance des agents pathogènes en créant des barrières physiques basées sur le renforcement de la paroi cellulaire lors de la lignification, de la sous-unité ou de la réticulation de composés spécifiques.Cette fonction peut être attribuée in silico au gène TanjilG_03329 codant pour une peroxydase anionique putative formant de la lignine qui a été significativement régulée positivement dans notre étude dans la lignée résistante 83A: 476 à 6 HPI, mais pas dans d'autres souches et points temporels qui n'ont pas répondu.
La 9S-/13S-lipoxygénase de l'acide linoléique est la première étape de la voie oxydative de la biosynthèse des lipides78.Les produits de cette voie ont de multiples fonctions dans la défense des plantes, y compris le renforcement de la paroi cellulaire par la formation de dépôts de callose et de pectine, et la régulation du stress oxydatif par la production d'espèces réactives de l'oxygène79,80,81,82,83.Dans la présente étude, l'expression de l'acide linoléique 9S-/13S-lipoxygénase a été altérée dans toutes les souches, mais dans la population sensible 22660, la régulation à la hausse a prévalu à différents moments, tandis que dans les souches porteuses de Lanr1 résistant et de l'allèle AnMan, elle met l'accent sur la diversification de la couche d'oxylipine dans les réactions protectrices de l'anthrax entre ces génotypes.
L'homologue de la 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxydase (ACO) était significativement régulé à la hausse (9 gènes) ou à la baisse (2 gènes) lorsqu'il était inoculé avec du lupin.À deux exceptions près, toutes ces réponses se sont produites à 6 ch.à 83A:476.La réaction enzymatique médiée par les protéines ACO est l'étape limitant la vitesse de production d'éthylène et est donc hautement réglementée84.L'éthylène est une hormone végétale qui joue divers rôles dans la régulation du développement des plantes et la réponse aux conditions de stress abiotiques et biotiques.L'induction de la transcription ACO et l'activation de la voie de signalisation de l'éthylène sont impliquées dans l'augmentation de la résistance du riz au champignon hémibiotrophe oryzae oryzae en régulant la production d'espèces réactives de l'oxygène et de phytoalexines.Un processus d'infection foliaire très similaire trouvé entre M. oryzae et C. lupini88,89, dans le contexte d'une régulation à la hausse significative des homologues ACO dans la lignée 83A: 476 rapportée dans cette étude, déplace la possibilité de conférer une résistance à l'anthracnose NLL Éthylène une étape centrale de signalisation dans les voies moléculaires .
Dans la présente étude, une suppression à grande échelle de nombreux gènes associés à la photosynthèse a été observée à 6 hpi chez 83A: 476 et à 48 hpi chez Mandeloop et la population 22660.L'ampleur et la progression de ces changements sont proportionnelles au niveau.Une résistance à l'anthracnose a été observée dans cette expérience.Récemment, une répression forte et précoce des transcrits liés à la photosynthèse a été rapportée dans plusieurs modèles d'interactions plantes-pathogènes, y compris des bactéries et des champignons pathogènes.La hâte (à partir de 2 HPI dans certaines interactions) et la suppression globale des gènes associés à la photosynthèse en réponse à l'infection peuvent déclencher l'immunité des plantes en fonction du déploiement d'espèces réactives de l'oxygène et de leur interaction avec la voie de l'acide salicylique pour médier les réactions allergiques 90,94.
En conclusion, les mécanismes de réponse de défense proposés pour la lignée la plus résistante (83A:476) comprennent la reconnaissance rapide des agents pathogènes par le gène R (vraisemblablement TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) et la signalisation de l'acide salicylique et de l'éthylène médiée par la réponse allergique, suivie par l'établissement d'un SAR à longue portée.l'action est soutenue par la protéine DIR-1.Il convient de noter que la période biotrophique de l'infection à C. lupini est très courte (environ 2 jours), suivie d'une croissance nécrotique95.La transition entre ces étapes peut être associée à une nécrose et à l'expression de protéines inductibles par l'éthylène qui agissent comme déclencheurs de réactions d'hypersensibilité chez les plantes hôtes.Par conséquent, la fenêtre temporelle pour une capture réussie de C. lupini au stade biotrophe est très étroite.La reprogrammation des gènes associés au redox et à la photosynthèse observée dans 83A:476 à 6 hpi est cohérente avec la progression des hyphes fongiques et annonce le développement d'une réponse protectrice réussie au stade biotrophique.Les réponses transcriptomiques de Mandelup et de la population 22660 peuvent être trop retardées pour capturer le champignon avant de passer à la croissance nécrotique, cependant, Mandelup peut être plus efficace que la population 22660 car la régulation relativement rapide de la protéine PR-10 favorise la résistance horizontale.
L'ETI, pilotée par le gène canonique R, semble être un mécanisme commun de résistance du haricot à l'anthracnose.Ainsi, chez la légumineuse modèle Medicago truncatula, la résistance à l'anthracnose est conférée par le gène RCT1, membre de la classe de gènes R végétaux TIR-NBS-LRR97.Ce gène confère également une résistance à large spectre à l'anthracnose chez la luzerne lorsqu'il est transféré à des plantes sensibles.Chez le haricot commun (P. vulgaris), plus d'une vingtaine de gènes de résistance à l'anthracnose ont été identifiés à ce jour.Certains de ces gènes se trouvent dans des régions dépourvues de gènes R canoniques, mais de nombreux autres sont situés sur les bords des chromosomes portant le groupe de gènes NBS-LRR, y compris les TIR-NBS-LRR99.L'étude SSR à l'échelle du génome a également confirmé l'association du gène NBS-LRR avec la résistance à l'anthracnose chez le haricot commun.Le gène canonique R a également été trouvé dans la région génomique portant le locus majeur de résistance à l'anthracnose chez le lupin blanc 101.
Nos travaux montrent qu'une réaction de résistance immédiate, activée à un stade précoce de l'infection de la plante (de préférence au plus tard à 12 hpi), protège efficacement le lupin à feuilles étroites de l'anthracnose causée par le champignon pathogène Collelotrichum lupini.À l'aide d'un séquençage à haut débit, nous avons démontré des profils d'expression différentiels des gènes de résistance à l'anthracnose dans les plantes NLL médiés par les gènes de résistance Lanr1 et AnMan.Une défense réussie implique de concevoir avec soin les gènes des protéines impliquées dans le redox, la photosynthèse et la pathogenèse dans les heures qui suivent le premier contact de la plante avec un agent pathogène.Des réactions protectrices similaires, mais retardées dans le temps, sont beaucoup moins efficaces pour protéger les plantes contre les maladies.La résistance à l'anthrax médiée par le gène Lanr1 ressemble à la réponse rapide typique du gène R (immunité déclenchée par l'effecteur), tandis que le gène AnMan fournit très probablement une réponse horizontale (immunité déclenchée par un modèle moléculaire associé aux microbes), offrant un niveau modéré de durabilité.
Les 215 lignées NLL utilisées pour cribler les marqueurs de l'anthracnose comprenaient 74 cultivars, 60 lignées obtenues par croisement ou sélection, 5 mutants et 76 germoplasmes sauvages ou originaux.Les lignes provenaient de 17 pays, principalement de Pologne (58), d'Espagne (47), d'Allemagne (27), d'Australie (26), de Russie (19), de Biélorussie (7), d'Italie (5) et d'autres lignes.de 10 pays.L'ensemble comprend également des lignées résistantes de référence : 83A:476, Tanjil, Wonga portant l'allèle Lanr1 et Mandelup portant l'allèle AnMan.Les lignées ont été obtenues à partir de la base de données européenne sur les ressources génétiques du lupin gérée par Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Pologne (tableau supplémentaire S1).
Les plantes ont été cultivées dans des conditions contrôlées (photopériode 16 heures, température 25°C le jour et 18°C ​​la nuit).Deux réplicats biologiques ont été analysés.L'ADN a été isolé à partir de feuilles âgées de trois semaines à l'aide du kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) conformément au protocole.La qualité et la concentration de l'ADN isolé ont été évaluées par des méthodes spectrophotométriques (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Le marqueur AnManM1 marquant le gène de résistance à l'anthracnose AnMan (dérivé du cv. Mandelup) et les marqueurs Anseq3 et Anseq4 flanquant le gène Lanr1 (dérivé du cv. Tanjil) ont été analysés 11,26,28.Les homozygotes pour l'allèle résistant ont été notés "1", sensibles - comme "0" et hétérozygotes - comme 0,5.
Sur la base des résultats du dépistage des marqueurs AnManM1, AnSeq3 et AnSeq4 et de la disponibilité de semences pour les expériences de suivi finales, 50 lignées NLL ont été sélectionnées pour le phénotypage de résistance à l'anthracnose.L'analyse a été réalisée en double dans une serre contrôlée par ordinateur avec une photopériode de 14 heures avec une plage de température de 22°C le jour et 19°C la nuit.Les graines sont grattées (en coupant le tégument du côté opposé de l'embryon avec une lame tranchante) avant le semis pour éviter la dormance des graines due à un tégument trop dur et pour assurer une germination uniforme.Les plantes ont été cultivées dans des pots (11 × 11 × 21 cm) avec de la terre stérile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovie, Pologne).L'inoculation a été réalisée avec la souche Colletotrichum lupini Col-08, cultivée en 1999 à partir de tiges de plantes de lupin à feuilles étroites cultivées dans un champ à Verzhenitsa, Grande Pologne (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Obtenez une zone.Les isolats ont été cultivés en milieu SNA à 20°C sous lumière noire pendant 21 jours pour induire la sporulation.Quatre semaines après le semis, lorsque les plantes ont atteint le stade 4-6 feuilles, l'inoculation a été réalisée par pulvérisation d'une suspension de conidies à une concentration de 0,5 x 106 conidies par ml.Après inoculation, les plantes ont été maintenues à l'obscurité pendant 24 heures à une humidité d'environ 98% et une température de 25°C pour faciliter la germination des conidies et le processus d'infection.Les plantes ont ensuite été cultivées sous une photopériode de 14 heures à 22°C jour/19°C nuit et 70% d'humidité.Le score de la maladie a été établi 22 jours après l'inoculation et variait de 0 (immunisé) à 9 (très sensible) selon la présence ou l'absence de lésions nécrotiques sur les tiges et les feuilles.De plus, après notation, le poids des plantes a été mesuré.Les relations entre les génotypes marqueurs et les phénotypes de la maladie ont été calculées sous forme de corrélations ponctuelles à deux séquences (absence de marqueurs hétérozygotes dans l'ensemble des lignées pour l'analyse du phénotype de résistance à l'anthracnose).