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Il existe un besoin pour un système in vitro fiable qui puisse reproduire avec précision l'environnement physiologique du cœur pour les tests de dépistage de drogue.La disponibilité limitée des systèmes de culture de tissus cardiaques humains a conduit à des interprétations inexactes des effets cardiaques des médicaments.Ici, nous avons développé un modèle de culture de tissu cardiaque (CTCM) qui stimule électromécaniquement les tranches de cœur et subit un étirement physiologique pendant les phases systolique et diastolique du cycle cardiaque.Après 12 jours de culture, cette approche a partiellement amélioré la viabilité des coupes cardiaques, mais n'a pas totalement préservé leur intégrité structurelle.Par conséquent, après un criblage de petites molécules, nous avons constaté que l'ajout de 100 nM de triiodothyronine (T3) et de 1 μM de dexaméthasone (Dex) à notre milieu maintenait la microstructure des coupes pendant 12 jours.En combinaison avec le traitement T3/Dex, le système CTCM a maintenu les profils transcriptionnels, la viabilité, l'activité métabolique et l'intégrité structurelle au même niveau que le tissu cardiaque frais pendant 12 jours.De plus, un étirement excessif du tissu cardiaque en culture induit une signalisation cardiaque hypertrophique, ce qui prouve la capacité du CTCM à imiter les conditions hypertrophiques induites par l'étirement cardiaque.En conclusion, CTCM peut modéliser la physiologie et la physiopathologie du cœur en culture sur de longues périodes de temps, permettant un dépistage fiable des médicaments.
Avant la recherche clinique, des systèmes in vitro fiables sont nécessaires pour reproduire avec précision l'environnement physiologique du cœur humain.Ces systèmes doivent imiter l'étirement mécanique, la fréquence cardiaque et les propriétés électrophysiologiques altérés.Les modèles animaux sont couramment utilisés comme plate-forme de dépistage de la physiologie cardiaque avec une fiabilité limitée pour refléter les effets des médicaments sur le cœur humain1,2.En fin de compte, le modèle expérimental de culture de tissu cardiaque idéal (CTCM) est un modèle hautement sensible et spécifique pour diverses interventions thérapeutiques et pharmacologiques, reproduisant avec précision la physiologie et la physiopathologie du cœur humain3.L'absence d'un tel système limite la découverte de nouveaux traitements pour l'insuffisance cardiaque4,5 et a fait de la cardiotoxicité des médicaments une raison majeure de sortie du marché6.
Au cours de la dernière décennie, huit médicaments non cardiovasculaires ont été retirés de l'utilisation clinique parce qu'ils provoquaient un allongement de l'intervalle QT entraînant des arythmies ventriculaires et la mort subite7.Ainsi, il existe un besoin croissant de stratégies de dépistage précliniques fiables pour évaluer l'efficacité et la toxicité cardiovasculaires.L'utilisation récente de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPS-CM) dans le dépistage de médicaments et les tests de toxicité fournit une solution partielle à ce problème.Cependant, la nature immature des hiPS-CM et le manque de complexité multicellulaire du tissu cardiaque sont les principales limites de cette méthode.Des études récentes ont montré que cette limitation peut être partiellement surmontée en utilisant le hiPS-CM précoce pour former des hydrogels de tissu cardiaque peu de temps après le début des contractions spontanées et en augmentant progressivement la stimulation électrique au fil du temps.Cependant, ces microtissus hiPS-CM n'ont pas les propriétés électrophysiologiques et contractiles matures du myocarde adulte.De plus, le tissu cardiaque humain a une structure plus complexe, constituée d'un mélange hétérogène de différents types de cellules, notamment des cellules endothéliales, des neurones et des fibroblastes stromaux, interconnectés par des ensembles spécifiques de protéines de la matrice extracellulaire.Cette hétérogénéité des populations de non-cardiomyocytes11,12,13 dans le cœur des mammifères adultes est un obstacle majeur à la modélisation du tissu cardiaque à l'aide de types de cellules individuelles.Ces limitations majeures soulignent l'importance de développer des méthodes de culture de tissu myocardique intact dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Des sections minces cultivées (300 µm) du cœur humain se sont révélées être un modèle prometteur de myocarde humain intact.Cette méthode donne accès à un système multicellulaire 3D complet similaire au tissu cardiaque humain.Cependant, jusqu'en 2019, l'utilisation de coupes cardiaques cultivées était limitée par la courte survie de la culture (24 h).Cela est dû à un certain nombre de facteurs, notamment le manque d'étirement physico-mécanique, l'interface air-liquide et l'utilisation de supports simples qui ne répondent pas aux besoins du tissu cardiaque.En 2019, plusieurs groupes de recherche ont démontré que l'incorporation de facteurs mécaniques dans les systèmes de culture de tissus cardiaques peut prolonger la durée de vie de la culture, améliorer l'expression cardiaque et imiter la pathologie cardiaque.Deux études élégantes 17 and 18 montrent que la charge mécanique uniaxiale a un effet positif sur le phénotype cardiaque pendant la culture.Cependant, ces études n'ont pas utilisé la charge physico-mécanique tridimensionnelle dynamique du cycle cardiaque, puisque les sections cardiaques ont été chargées soit avec des forces de traction isométriques 17 soit avec une charge auxotonique linéaire 18 .Ces méthodes d'étirement tissulaire ont entraîné la suppression de nombreux gènes cardiaques ou la surexpression de gènes associés à des réponses d'étirement anormales.Notamment, Pitoulis et al.19 ont développé un bain de culture de tranches cardiaques dynamiques pour la reconstruction du cycle cardiaque à l'aide d'un retour de transducteur de force et d'entraînements de tension.Bien que ce système permette une modélisation plus précise du cycle cardiaque in vitro, la complexité et le faible débit de la méthode limitent l'application de ce système.Notre laboratoire a récemment développé un système de culture simplifié utilisant la stimulation électrique et un milieu optimisé pour maintenir la viabilité des coupes de tissu cardiaque porcin et humain jusqu'à 6 jours20,21.
Dans le manuscrit actuel, nous décrivons un modèle de culture de tissu cardiaque (CTCM) utilisant des sections du cœur porcin qui intègre des signaux humoraux pour récapituler la physiologie cardiaque tridimensionnelle et la distension physiopathologique au cours du cycle cardiaque.Ce CTCM peut augmenter la précision de la prédiction préclinique des médicaments à un niveau jamais atteint auparavant en fournissant un système cardiaque rentable à moyen débit qui imite la physiologie/pathophysiologie du cœur des mammifères pour les tests précliniques des médicaments.
Les signaux mécaniques hémodynamiques jouent un rôle essentiel dans le maintien de la fonction des cardiomyocytes in vitro 22,23,24.Dans le manuscrit actuel, nous avons développé un CTCM (figure 1a) qui peut imiter l'environnement cardiaque adulte en induisant une stimulation électrique et mécanique à des fréquences physiologiques (1,2 Hz, 72 battements par minute).Pour éviter un étirement excessif des tissus pendant la diastole, un dispositif d'impression 3D a été utilisé pour augmenter la taille des tissus de 25 % (Fig. 1b).La stimulation électrique induite par le système C-PACE a été programmée pour démarrer 100 ms avant la systole à l'aide d'un système d'acquisition de données pour reproduire entièrement le cycle cardiaque.Le système de culture tissulaire utilise un actionneur pneumatique programmable (LB Engineering, Allemagne) pour étendre cycliquement une membrane de silicone flexible pour provoquer l'expansion des tranches de cœur dans la chambre supérieure.Le système était connecté à une conduite d'air externe via un transducteur de pression, ce qui permettait d'ajuster avec précision la pression (± 1 mmHg) et le temps (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Attachez la section de tissu à l'anneau de support de 7 mm, représenté en bleu, à l'intérieur de la chambre de culture du dispositif.La chambre de culture est séparée de la chambre à air par une fine membrane souple en silicone.Placez un joint entre chaque chambre pour éviter les fuites.Le couvercle de l'appareil contient des électrodes en graphite qui fournissent une stimulation électrique.b Représentation schématique du grand dispositif tissulaire, de l'anneau de guidage et de l'anneau de support.Les coupes de tissu (marron) sont placées sur le dispositif surdimensionné avec l'anneau de guidage placé dans la rainure sur le bord extérieur du dispositif.À l'aide du guide, placez soigneusement l'anneau de support enduit d'adhésif acrylique tissulaire sur la section de tissu cardiaque.c Graphique montrant le temps de stimulation électrique en fonction de la pression de la chambre à air contrôlée par un actionneur pneumatique programmable (PPD).Un dispositif d'acquisition de données a été utilisé pour synchroniser la stimulation électrique à l'aide de capteurs de pression.Lorsque la pression dans la chambre de culture atteint le seuil défini, un signal d'impulsion est envoyé au C-PACE-EM pour déclencher une stimulation électrique.d Image de quatre CTCM placés sur une étagère d'incubateur.Quatre appareils sont connectés à un PPD via un circuit pneumatique, et des capteurs de pression sont insérés dans la valve hémostatique pour surveiller la pression dans le circuit pneumatique.Chaque appareil contient six sections de tissu.
À l'aide d'un seul actionneur pneumatique, nous avons pu contrôler 4 dispositifs CTCM, chacun pouvant contenir 6 coupes de tissu (Fig. 1d).Dans CTCM, la pression d'air dans la chambre à air est convertie en pression synchrone dans la chambre à fluide et induit une expansion physiologique de la tranche cardiaque (figure 2a et film supplémentaire 1).Évaluation de l'étirement des tissus à 80 mm Hg.Art.ont montré un étirement des coupes de tissu de 25 % (Fig. 2b).Il a été démontré que ce pourcentage d'étirement correspond à une longueur de sarcomère physiologique de 2,2 à 2,3 µm pour une contractilité normale de la section cardiaque17,19,25.Le mouvement des tissus a été évalué à l'aide de paramètres de caméra personnalisés (Figure supplémentaire 1).L'amplitude et la vitesse du mouvement des tissus (Fig. 2c, d) correspondaient à l'étirement pendant le cycle cardiaque et au temps pendant la systole et la diastole (Fig. 2b).L'étirement et la vitesse du tissu cardiaque pendant la contraction et la relaxation sont restés constants pendant 12 jours en culture (Fig. 2f).Pour évaluer l'effet de la stimulation électrique sur la contractilité pendant la culture, nous avons développé une méthode de détermination de la déformation active à l'aide d'un algorithme d'ombrage (Fig. 2a, b supplémentaire) et avons pu faire la distinction entre les déformations avec et sans stimulation électrique.La même section du cœur (Fig. 2f).Dans la région mobile de la coupure (R6-9), la tension pendant la stimulation électrique était 20 % plus élevée qu'en l'absence de stimulation électrique, ce qui indique la contribution de la stimulation électrique à la fonction contractile.
Des traces représentatives de la pression de la chambre à air, de la pression de la chambre à fluide et des mesures de mouvement des tissus confirment que la pression de la chambre modifie la pression de la chambre à fluide, provoquant un mouvement correspondant de la tranche de tissu.b Traces représentatives du pourcentage d'étirement (bleu) des sections de tissu correspondant au pourcentage d'étirement (orange).c Le mouvement mesuré de la tranche cardiaque est cohérent avec la vitesse de mouvement mesurée.(d) Trajectoires représentatives du mouvement cyclique (ligne bleue) et de la vitesse (ligne pointillée orange) dans une tranche de cœur.e Quantification du temps de cycle (n = 19 tranches par groupe, provenant de porcs différents), temps de contraction (n = 19 tranches par groupe), temps de relaxation (n = 19 tranches par groupe, provenant de porcs différents), mouvement des tissus (n = 25 ).tranches)/groupe de différents porcs), vitesse systolique maximale (n = 24(D0), 25(D12) tranches/groupe de différents porcs) et vitesse de relaxation maximale (n = 24(D0), 25(D12) tranches/groupe de différents porcs).Le test t de Student bilatéral n'a montré aucune différence significative dans aucun paramètre.f Traces d'analyse de souche représentatives de coupes de tissus avec (rouge) et sans stimulation électrique (bleue), dix zones régionales de coupes de tissus de la même section.Les panneaux inférieurs montrent la quantification de la différence de pourcentage de contrainte dans les coupes de tissu avec et sans stimulation électrique dans dix zones de différentes sections. (n = 8 tranches/groupe de porcs différents, un test t de Student bilatéral est effectué ; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 tranches/groupe de porcs différents, un test t de Student bilatéral est effectué ; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 ? ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sections/groupe de porcs différents, test t de Student bilatéral ; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01 , *p<0,05). (n = 8 sections/groupe, provenant de porcs différents, test t de Student bilatéral ; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
Dans notre précédent système de culture de tranches de cœur biomimétique statique [20, 21], nous avons maintenu la viabilité, la fonction et l'intégrité structurelle des tranches de cœur pendant 6 jours en appliquant une stimulation électrique et en optimisant la composition du milieu.Cependant, après 10 jours, ces chiffres ont fortement chuté.Nous nous référerons aux sections cultivées dans notre système de culture biomimétique statique précédent 20, 21 conditions de contrôle (Ctrl) et nous utiliserons notre milieu précédemment optimisé comme conditions MC et culture sous stimulation mécanique et électrique simultanée (CTCM).appelé .Premièrement, nous avons déterminé que la stimulation mécanique sans stimulation électrique était insuffisante pour maintenir la viabilité des tissus pendant 6 jours (Fig. 3a, b supplémentaires).Fait intéressant, avec l'introduction de la stimulation physio-mécanique et électrique à l'aide de STCM, la viabilité des coupes cardiaques de 12 jours est restée la même que dans les coupes cardiaques fraîches dans des conditions MS, mais pas dans des conditions Ctrl, comme le montre l'analyse MTT (Fig. 1).3a).Cela suggère que la stimulation mécanique et la simulation du cycle cardiaque peuvent maintenir les coupes de tissus viables deux fois plus longtemps que ce qui a été rapporté dans notre précédent système de culture statique.Cependant, l'évaluation de l'intégrité structurelle des coupes de tissus par immunomarquage de la troponine T cardiaque et de la connexine 43 a montré que l'expression de la connexine 43 était significativement plus élevée dans les tissus MC au jour 12 que chez les témoins le même jour.Cependant, l'expression uniforme de la connexine 43 et la formation de disques Z n'étaient pas entièrement maintenues (Fig. 3b).Nous utilisons un cadre d'intelligence artificielle (IA) pour quantifier l'intégrité structurelle des tissus26, un pipeline d'apprentissage en profondeur basé sur l'image basé sur la coloration de la troponine-T et de la connexine43 pour quantifier automatiquement l'intégrité structurelle et la fluorescence des tranches de cœur en termes de force de localisation.Cette méthode utilise un réseau de neurones convolutifs (CNN) et un cadre d'apprentissage en profondeur pour quantifier de manière fiable l'intégrité structurelle du tissu cardiaque de manière automatisée et impartiale, comme décrit dans la référence.26. Le tissu MC a montré une similarité structurelle améliorée au jour 0 par rapport aux coupes témoins statiques.De plus, la coloration au trichrome de Masson a révélé un pourcentage de fibrose significativement plus faible dans les conditions de SEP par rapport aux conditions de contrôle au jour 12 de la culture (Fig. 3c).Bien que CTCM ait augmenté la viabilité des coupes de tissu cardiaque au jour 12 à un niveau similaire à celui du tissu cardiaque frais, il n'a pas amélioré de manière significative l'intégrité structurelle des coupes cardiaques.
un graphique à barres montre la quantification de la viabilité MTT de tranches de cœur frais (J0) ou de tranches de cœur en culture pendant 12 jours soit en culture statique (J12 Ctrl) soit en CTCM (J12 MC) (n = 18 (J0), 15 (J12 Ctrl), 12 (J12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à une voie est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à J0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). un graphique à barres montre la quantification de la viabilité MTT de tranches de cœur fraîches (J0) ou de tranches de cœur en culture pendant 12 jours soit en culture statique (J12 Ctrl) soit en CTCM (J12 MC) (n = 18 (J0), 15 (J12 Ctrl ), 12 (J12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à une voie est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à J0 et ** p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl).l'histogramme montre la quantification de la viabilité des coupes de cœur frais MTT (J0) ou culture de coupes de cœur pendant 12 jours soit en culture statique (contrôle à J12) soit en CTCM (contrôle à J12) (n = 18 (J0), 15 (contrôle à J12) ), 12 (J12 MC) coupes/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est réalisé ;####p < 0,0001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). ####p < 0,0001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogramme montrant la quantification de la viabilité du MTT dans des coupes de coeur frais (J0) ou des coupes de coeur cultivées pendant 12 jours en culture statique (D12 contrôle) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (J0), 15 (D12 contrôle)), 12 (D12 MC) coupes/groupe de porcs différents, test ANOVA à une voie ;####p < 0,0001 par rapport à D0, **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). ####p < 0,0001 par rapport à D0, **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl).b Troponine-T (vert), connexine 43 (rouge) et DAPI (bleu) dans des coupes cardiaques fraîchement isolées (D0) ou des coupes cardiaques cultivées dans des conditions statiques (Ctrl) ou des conditions CTCM (MC) pendant 12 jours) d'images représentatives d'immunofluorescence (échelle à blanc = 100 µm). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe chacune provenant de porcs différents, un test ANOVA unidirectionnel est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллек том (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ANOVA ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Quantification de l'intégrité structurale du tissu cardiaque par intelligence artificielle (n = 7 (J0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) coupes/groupes de porcs différents, test ANOVA à un facteur réalisé ; ####p < 0,0001 vs à J0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe de porc différent, test ANOVA unidirectionnel ; p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe de porcs différents, test ANOVA unidirectionnel ; ####p < 0,0001 与D0相比，**** p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечно й ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Intelligence artificielle pour quantifier l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) coupes/groupe de porcs différents, test ANOVA à un facteur ; ####p<0,0001 vs .D0 Pour comparaison ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) pour les tranches de cœur colorées avec la tache trichrome de Masson (échelle nue = 500 µm) (n = 10 tranches/groupe chacune provenant de porcs différents, un test ANOVA unidirectionnel est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) pour les tranches de cœur colorées au trichrome de Masson (Échelle nue = 500 µm) (n = 10 tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA unidirectionnel est effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c. (n = 10 срезов/гру ппу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 et ***p < 0,00 1 pour сравнению с D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) de coupes cardiaques colorées au trichrome de Masson (échelle non enduite = 500 µm) (n = 10 coupes/groupe de porcs différents, test ANOVA à un facteur effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à J0 et ***p < 0,001 par rapport à J12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C度 = 500 µm） （n = 10比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c. рашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, кажд ### #p < 0,0001 par rapport à D0, ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) de coupes cardiaques colorées au trichrome de Masson (blanc = 500 µm) (n = 10 coupes/groupe, chacune d'un porc différent, testées par analyse de variance unidirectionnelle ;### # p < 0,0001 par rapport à J0, ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl).Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
Nous avons émis l'hypothèse qu'en ajoutant de petites molécules au milieu de culture, l'intégrité des cardiomyocytes pourrait être améliorée et le développement de la fibrose réduit pendant la culture CTCM.Nous avons donc criblé les petites molécules en utilisant nos cultures témoins statiques20,21 en raison du petit nombre de facteurs de confusion.La dexaméthasone (Dex), la triiodothyronine (T3) et le SB431542 (SB) ont été choisis pour cet écran.Ces petites molécules ont déjà été utilisées dans des cultures hiPSC-CM pour induire la maturation des cardiomyocytes en augmentant la longueur du sarcomère, les tubules en T et la vitesse de conduction.De plus, le Dex (un glucocorticoïde) et le SB sont connus pour supprimer l'inflammation29,30.Par conséquent, nous avons testé si l'inclusion d'une ou d'une combinaison de ces petites molécules améliorerait l'intégrité structurelle des sections cardiaques.Pour le dépistage initial, la dose de chaque composé a été sélectionnée en fonction des concentrations couramment utilisées dans les modèles de culture cellulaire (1 μM Dex27, 100 nM T327 et 2,5 μM SB31).Après 12 jours de culture, la combinaison de T3 et de Dex a entraîné une intégrité structurelle optimale des cardiomyocytes et un remodelage fibreux minimal (Figures supplémentaires 4 et 5).De plus, l'utilisation de concentrations doubles ou doubles de T3 et de Dex a produit des effets délétères par rapport aux concentrations normales (Fig. 6a, b supplémentaires).
Après le dépistage initial, nous avons effectué une comparaison directe de 4 conditions de culture (figure 4a) : Ctrl : sections de cœur cultivées dans notre culture statique précédemment décrite en utilisant notre milieu optimisé ;20.21 TD : T3 et Ctrl s ont ajouté Dex mercredi ;MC : coupes cardiaques cultivées en CTCM avec notre milieu préalablement optimisé ;et MT : CTCM avec T3 et Dex ajoutés au milieu.Après 12 jours de culture, la viabilité des tissus MS et MT est restée la même que dans les tissus frais évalués par le test MTT (Fig. 4b).Fait intéressant, l'ajout de T3 et de Dex aux cultures transwell (TD) n'a pas entraîné d'amélioration significative de la viabilité par rapport aux conditions Ctrl, indiquant un rôle important de la stimulation mécanique dans le maintien de la viabilité des sections cardiaques.
un diagramme de conception expérimentale illustrant les quatre conditions de culture utilisées pour évaluer les effets de la stimulation mécanique et de la supplémentation en T3/Dex sur le milieu pendant 12 jours. b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à une voie est effectué ; ####p < 0,0001, ### p < 0,001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à une voie est effectué ; ####p < 0,0001, ### p < 0,001 par rapport à J0 et **p < 0,01 par rapport à J12 ctrl). b льтивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC et MT) pour сравнению со све , après analyse de la variance ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 avec D0 et **p < 0,01 avec D12 Ctrl). b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité à 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (témoin, TD, MC et MT) par rapport aux coupes de cœur frais (J0) (n = 18 (J0), 15 (J12 Ctrl, J12 TD et J12 MT), 12 (J12 MC) coupes/groupe de porcs différents, test ANOVA à un facteur ; ####p < 0,0001, ### p < 0,001 vs D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b. ению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/г руппа, односторонний тест ANOVA ; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контроле ì D12). b Histogramme montrant les 4 conditions de culture (témoin, TD, MC et MT) par rapport aux coupes de cœur frais (J0) (n = 18 (J0), 15 (J12 Ctrl, J12 TD et J12 MT), de différents porcs 12 (J12 MC) coupes/groupe, test ANOVA à un facteur ; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs J0, **p<0. 01 vs contrôle D12). c Le graphique à barres montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 6 tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ###p < 0,001, par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c Le graphique à barres montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 6 tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ###p < 0,001, par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c ультивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC et MT) pour сравнению со св ежими срезами сердца (D0) (n = 6 тест ANOVA ; ###p < 0,001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). c L'histogramme montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (témoin, TD, MC et MT) par rapport aux coupes de cœur frais (J0) (n = 6 coupes/groupe de porcs différents, test ANOVA à un facteur effectué ; ###p < 0,001 par rapport à J0 et ***p < 0,001 par rapport à J12 Ctrl). c.通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c. ле культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC et MT) pour сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были про pour ANOVA ; ###p < 0,001 pour сравнению с D0, ***p < 0,001 pour сравнению с D12 (контроль). c Histogramme montrant la quantification du flux de glucose à 12 jours post-culture pour les 4 conditions de culture (témoin, TD, MC et MT) par rapport aux coupes cardiaques fraîches (J0) (n = 6 coupes/groupe, provenant de porcs différents, des tests ANOVA unilatéraux ont été effectués, ###p < 0,001 par rapport à J0, ***p < 0,001 par rapport à J12 (contrôle).d Tracés d'analyse de souche de tissus frais (bleu), jour 12 MC (vert) et jour 12 MT (rouge) à dix points de coupe de tissu régionaux (n = 4 tranches/groupe, test ANOVA à une voie ; il n'y avait pas de différence significative entre les groupes).e Parcelle volcanique montrant des gènes exprimés de manière différentielle dans des coupes de cœur frais (D0) par rapport à des coupes de cœur cultivées dans des conditions statiques (Ctrl) ou dans des conditions MT (MT) pendant 10 à 12 jours.f Carte thermique des gènes de sarcomère pour les coupes cardiaques cultivées dans chacune des conditions de culture.Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
La dépendance métabolique au passage de l'oxydation des acides gras à la glycolyse est une caractéristique de la dédifférenciation des cardiomyocytes.Les cardiomyocytes immatures utilisent principalement le glucose pour la production d'ATP et ont des mitochondries hypoplasiques avec peu de crêtes5,32.Les analyses d'utilisation du glucose ont montré que dans les conditions MC et MT, l'utilisation du glucose était similaire à celle des tissus du jour 0 (figure 4c).Cependant, les échantillons Ctrl ont montré une augmentation significative de l'utilisation du glucose par rapport aux tissus frais.Cela indique que la combinaison de CTCM et de T3/Dex améliore la viabilité des tissus et préserve le phénotype métabolique des coupes cardiaques cultivées de 12 jours.De plus, l'analyse de la souche a montré que les niveaux de souche restaient les mêmes que dans le tissu cardiaque frais pendant 12 jours dans des conditions MT et MS (Fig. 4d).
Pour analyser l'impact global du CTCM et du T3/Dex sur le paysage transcriptionnel mondial du tissu de tranche cardiaque, nous avons effectué un RNAseq sur des tranches cardiaques des quatre conditions de culture différentes (Données supplémentaires 1).Fait intéressant, les sections MT ont montré une similitude transcriptionnelle élevée avec le tissu cardiaque frais, avec seulement 16 gènes exprimés de manière différentielle sur 13 642 gènes.Cependant, comme nous l'avons montré précédemment, les tranches Ctrl présentaient 1229 gènes exprimés de manière différentielle après 10 à 12 jours de culture (Fig. 4e).Ces données ont été confirmées par qRT-PCR des gènes du cœur et des fibroblastes (Fig. 7a-c supplémentaires).Fait intéressant, les sections Ctrl ont montré une régulation négative des gènes cardiaques et du cycle cellulaire et l'activation de programmes de gènes inflammatoires.Ces données suggèrent que la dédifférenciation, qui se produit normalement après une culture à long terme, est complètement atténuée dans des conditions de MT (Fig. 8a, b supplémentaires).Une étude approfondie des gènes du sarcomère a montré que ce n'est que dans des conditions MT que les gènes codant pour le sarcomère (Fig. 4f) et le canal ionique (Fig. 9 supplémentaire) sont préservés, les protégeant de la suppression dans les conditions Ctrl, TD et MC.Ces données démontrent qu'avec une combinaison de stimulation mécanique et humorale (T3/Dex), le transcriptome des tranches cardiaques peut rester similaire aux tranches cardiaques fraîches après 12 jours de culture.
Ces découvertes transcriptionnelles sont étayées par le fait que l'intégrité structurelle des cardiomyocytes dans les coupes cardiaques est mieux préservée dans des conditions de MT pendant 12 jours, comme le montre la connexine 43 intacte et localisée (Fig. 5a).De plus, la fibrose dans les coupes cardiaques dans les conditions MT était significativement réduite par rapport à Ctrl et similaire aux coupes cardiaques fraîches (Fig. 5b).Ces données démontrent que la combinaison de la stimulation mécanique et du traitement T3/Dex préserve efficacement la structure cardiaque dans les coupes cardiaques en culture.
a Images d'immunofluorescence représentatives de la troponine-T (vert), de la connexine 43 (rouge) et du DAPI (bleu) dans des sections cardiaques fraîchement isolées (D0) ou cultivées pendant 12 jours dans les quatre conditions de culture de section cardiaque (barre d'échelle = 100 µm).). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (J0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à J0 et *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (J0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; #### p < 0,0001 par rapport à J0 et *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного ин теллекта (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) торный тест ANOVA ; #### p < 0,0001 pour сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantification de l'intégrité structurale du tissu cardiaque par intelligence artificielle (n = 7 (J0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) coupes/groupe de porcs différents, test ANOVA à un facteur réalisé ; #### p < 0,0001 par rapport à J0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl相比）。Quantification de l'intégrité structurale du tissu cardiaque à l'aide de l'intelligence artificielle chez différents porcs (n = 7 (J0 et J12 Ctrl), 5 (J12 TD, J12 MC et J12 MT) sections/groupe) avec un test ANOVA à un facteur ;#### p < 0,0001 à partir de D0 et *p < 0,05 à ****p < 0,0001 à partir de D12 Ctrl). #### p < 0,0001 par rapport à D0 et *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification des tranches de cœur colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification des tranches de cœur colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b омным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/ группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 et ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification de coupes cardiaques colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) coupes/groupe de porcs différents, effectuées par ANOVA unidirectionnelle ; ####p < 0,0001 vs D0 et ***p < 0,001 ou ****p < 0,0 001 contre D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0 .001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 (比例 尺 尺 尺 = 500 µm) 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b омом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных сви ней / группы, один- способ ANOVA ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification de coupes cardiaques colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (J0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 coupes (D12 MT) de différents porcs/groupe, une méthode ANOVA ; ####p < 0,0001 par rapport à J0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl).Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
Enfin, la capacité du CTCM à imiter l'hypertrophie cardiaque a été évaluée en augmentant l'étirement du tissu cardiaque.Dans CTCM, la pression maximale de la chambre à air est passée de 80 mmHg à 80 mmHg.Art.(étirement normal) jusqu'à 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Cela correspond à une augmentation de 32% de l'étirement (Fig. 6b), qui était précédemment indiquée comme le pourcentage d'étirement correspondant requis pour les sections cardiaques pour atteindre une longueur de sarcomère similaire à celle observée dans l'hypertrophie.L'étirement et la vitesse du tissu cardiaque pendant la contraction et la relaxation sont restés constants pendant six jours de culture (Fig. 6c).Le tissu cardiaque des conditions MT a été soumis à des conditions d'étirement normal (MT (Normal)) ou de surétirement (MT (OS)) pendant six jours.Déjà après quatre jours de culture, le biomarqueur hypertrophique NT-ProBNP était significativement élevé dans le milieu dans les conditions MT (OS) par rapport aux conditions MT (normales) (Fig. 7a).De plus, après six jours de culture, la taille des cellules dans MT (OS) (Fig. 7b) a augmenté de manière significative par rapport aux sections de cœur MT (normal).De plus, la translocation nucléaire de NFATC4 était significativement augmentée dans les tissus sur-étirés (Fig. 7c).Ces résultats montrent le développement progressif du remodelage pathologique après une hyperdistension et soutiennent le concept selon lequel le dispositif CTCM peut être utilisé comme plate-forme pour étudier la signalisation de l'hypertrophie cardiaque induite par l'étirement.
Des traces représentatives de la pression de la chambre à air, de la pression de la chambre à fluide et des mesures de mouvement des tissus confirment que la pression de la chambre modifie la pression de la chambre à fluide, provoquant un mouvement correspondant de la tranche de tissu.b Courbes représentatives du pourcentage d'étirement et du taux d'étirement pour les sections de tissu normalement étirées (orange) et surétirées (bleu).c Graphique à barres montrant le temps de cycle (n = 19 tranches par groupe, de différents porcs), le temps de contraction (n = 18-19 tranches par groupe, de différents porcs), le temps de relaxation (n = 19 tranches par groupe, de différents porcs), l'amplitude du mouvement des tissus (n = 14 tranches/groupe, de différents porcs), la vitesse systolique maximale (n = 14 tranches/groupe, de différents porcs) et le taux de relaxation maximal (n = 14 (J0), 15 ( D6) ) sections/groupes) de différents porcs), le test t de Student bilatéral n'a montré aucune différence significative dans aucun paramètre, indiquant que ces paramètres sont restés constants pendant 6 jours de culture avec surtension.Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
a Quantification par graphique à barres de la concentration de NT-ProBNP dans les milieux de culture à partir de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal MT (Norm) ou de surétirement (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4 MTOS) tranches/groupe de différents porcs, une ANOVA à deux voies est effectuée ; ** p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). a Quantification par graphique à barres de la concentration de NT-ProBNP dans les milieux de culture à partir de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal MT (Norm) ou de surétirement (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4 MTOS) tranches/groupe de différents porcs, une ANOVA à deux voies est effectuée ; ** p < 0,01 par rapport à l'étirement normal).Histogramme quantitatif de la concentration de NT-ProBNP dans le milieu de culture à partir de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement MT normal (norme) ou de surétirement (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4).MTOS) tranches/groupe de différents porcs, une analyse de variance à deux facteurs est effectuée ;**p < 0,01 pour сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS) ，p < 0,01）。 a Quantification de la concentration de NT-ProBNP dans des tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal MT (Norm) ou de surétirement (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de différents 猪的切片/组，可以双向方方发发动 ; **par rapport à un étirement normal, p < 0,01).histogramme Quantification des concentrations de NT-ProBNP dans des tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement MT normal (norme) ou de surétirement (OS) normal (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) et D4 MTOS) tranches/groupe de porcs différents, analyse de variance à deux facteurs ;**p < 0,01 pour сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). b Images représentatives pour les tranches de cœur colorées avec la troponine-T et WGA (à gauche) et la quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe de 10 tranches différentes de différents porcs, un test t de Student à deux queues est effectué ; ****p < 0,0001 par rapport à l'étirement normal). b Images représentatives pour les tranches de cœur colorées avec la troponine-T et WGA (à gauche) et la quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe de 10 tranches différentes de porcs différents, un test t de Student à deux queues est effectué ; ****p < 0,0001 par rapport à l'étirement normal). b. личественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 ? p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Images représentatives de sections cardiaques colorées avec de la troponine-T et de l'AZP (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe de 10 sections différentes de différents porcs, un test t de Student bilatéral a été effectué ; **** p < 0,0001 par rapport à la souche normale). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Images représentatives de tranches de cœur colorées avec calcarein-T et WGA (à gauche) et taille de cellule (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 à partir de 10 tranches différentes (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test；par rapport à un étirement normal，****p < 0,0001). b. личественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Images représentatives de sections cardiaques colorées avec de la troponine-T et de l'AZP (à gauche) et quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 sections différentes de porcs différents) Cellules/groupe, critère bilatéral t de Student ;****p < 0,0001 par rapport à la déformation normale). c Images représentatives pour les tranches de cœur MTOS des jours 0 et 6 immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4 et quantification de la translocation de NFATC4 vers les noyaux des CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe de porcs différents, un test t de Student à deux queues est effectué ; *p < 0,05). c Images représentatives des tranches de cœur MTOS des jours 0 et 6 immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4 et quantification de la translocation de NFATC4 vers les noyaux des CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe de porcs différents, un test t de Student à deux queues est effectué ; * p < 0,05). c. понина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D 6 MTOS) à ; *p < 0,05). c Images représentatives des coupes cardiaques à 0 et 6 jours MTOS, immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4, et quantification de la translocation de NFATC4 dans le noyau des cellules caverneuses (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe de différents porcs) ont effectué le test t de Student à deux queues ;*p < 0,05). c的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Images représentatives de calcanine-T et NFATC4 immunomarquage 第0天和第6天MTOS tranches cardiaques et NFATC4 de différents noyaux cellulaires NFATC4 易位至CM的quantité化 (n = 4 (J0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS sur 0 et 6 jours sur понином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MT OS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Images représentatives de tranches de cœur MTOS aux jours 0 et 6 pour l'immunomarquage de la troponine-T et de NFATC4 et la quantification de la translocation de NFATC4 dans le noyau de CM de différents porcs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe, critère t bilatéral de Student ; * p < 0,05).Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.
La recherche cardiovasculaire translationnelle nécessite des modèles cellulaires qui reproduisent fidèlement l'environnement cardiaque.Dans cette étude, un dispositif CTCM a été développé et caractérisé qui peut stimuler les sections ultrafines du cœur.Le système CTCM comprend une stimulation électromécanique physiologiquement synchronisée et un enrichissement des fluides T3 et Dex.Lorsque des sections de cœur de porc ont été exposées à ces facteurs, leur viabilité, leur intégrité structurelle, leur activité métabolique et leur expression transcriptionnelle sont restées les mêmes que dans le tissu cardiaque frais après 12 jours de culture.De plus, un étirement excessif du tissu cardiaque peut provoquer une hypertrophie du cœur causée par une hyperextension.Dans l'ensemble, ces résultats confirment le rôle essentiel des conditions de culture physiologiques dans le maintien d'un phénotype cardiaque normal et fournissent une plate-forme pour le dépistage des médicaments.
De nombreux facteurs contribuent à créer un environnement optimal pour le fonctionnement et la survie des cardiomyocytes.Les plus évidents de ces facteurs sont liés (1) aux interactions intercellulaires, (2) à la stimulation électromécanique, (3) aux facteurs humoraux et (4) aux substrats métaboliques.Les interactions physiologiques de cellule à cellule nécessitent des réseaux tridimensionnels complexes de plusieurs types de cellules pris en charge par une matrice extracellulaire.De telles interactions cellulaires complexes sont difficiles à reconstruire in vitro par co-culture de types de cellules individuelles, mais peuvent être facilement réalisées en utilisant la nature organotypique des coupes cardiaques.
L'étirement mécanique et la stimulation électrique des cardiomyocytes sont essentiels au maintien du phénotype cardiaque33,34,35.Alors que la stimulation mécanique a été largement utilisée pour le conditionnement et la maturation du hiPSC-CM, plusieurs études élégantes ont récemment tenté de stimuler mécaniquement des tranches de cœur en culture en utilisant une charge uniaxiale.Ces études montrent que le chargement mécanique uniaxial 2D a un effet positif sur le phénotype du cœur pendant la culture.Dans ces études, des sections du cœur ont été soit chargées avec des forces de traction isométriques17, une charge auxotonique linéaire18, soit le cycle cardiaque a été recréé à l'aide d'un retour de transducteur de force et d'entraînements de tension.Cependant, ces méthodes utilisent l'étirement tissulaire uniaxial sans optimisation environnementale, ce qui entraîne la suppression de nombreux gènes cardiaques ou la surexpression de gènes associés à des réponses d'étirement anormales.Le CTCM décrit ici fournit un stimulus électromécanique 3D qui imite le cycle cardiaque naturel en termes de temps de cycle et d'étirement physiologique (étirement de 25 %, systole de 40 %, diastole de 60 % et 72 battements par minute).Bien que cette stimulation mécanique tridimensionnelle seule ne soit pas suffisante pour maintenir l'intégrité des tissus, une combinaison de stimulation humorale et mécanique utilisant T3/Dex est nécessaire pour maintenir adéquatement la viabilité, la fonction et l'intégrité des tissus.
Les facteurs humoraux jouent un rôle important dans la modulation du phénotype cardiaque adulte.Cela a été mis en évidence dans les études HiPS-CM dans lesquelles T3 et Dex ont été ajoutés aux milieux de culture pour accélérer la maturation cellulaire.La T3 peut influencer le transport des acides aminés, des sucres et du calcium à travers les membranes cellulaires36.De plus, T3 favorise l'expression du MHC-α et la régulation négative du MHC-β, favorisant la formation de myofibrilles à contraction rapide dans les cardiomyocytes matures par rapport aux myofibrilles à contraction lente dans le CM fœtal.Le déficit en T3 chez les patients hypothyroïdiens entraîne la perte des bandes myofibrillaires et un taux réduit de développement du tonus37.Dex agit sur les récepteurs des glucocorticoïdes et il a été démontré qu'il augmente la contractilité du myocarde dans les cœurs perfusés isolés ;38 on pense que cette amélioration est liée à l'effet sur l'entrée induite par les dépôts de calcium (SOCE) 39,40.De plus, Dex se lie à ses récepteurs, provoquant une large réponse intracellulaire qui supprime la fonction immunitaire et l'inflammation30.
Nos résultats indiquent que la stimulation mécanique physique (MS) a amélioré les performances globales de la culture par rapport à Ctrl, mais n'a pas réussi à maintenir la viabilité, l'intégrité structurelle et l'expression cardiaque pendant 12 jours en culture.Par rapport à Ctrl, l'ajout de T3 et de Dex aux cultures CTCM (MT) a amélioré la viabilité et maintenu des profils de transcription, une intégrité structurelle et une activité métabolique similaires avec du tissu cardiaque frais pendant 12 jours.De plus, en contrôlant le degré d'étirement des tissus, un modèle d'hypertrophie cardiaque induite par l'hyperextension a été créé à l'aide de STCM, illustrant la polyvalence du système STCM.Il convient de noter que bien que le remodelage cardiaque et la fibrose impliquent généralement des organes intacts dont les cellules circulantes peuvent fournir les cytokines appropriées ainsi que la phagocytose et d'autres facteurs de remodelage, des sections du cœur peuvent encore imiter le processus fibrotique en réponse au stress et aux traumatismes.dans les myofibroblastes.Cela a déjà été évalué dans ce modèle de tranche cardiaque.Il convient de noter que les paramètres CTCM peuvent être modulés en modifiant la pression/l'amplitude et la fréquence électriques pour simuler de nombreuses conditions telles que la tachycardie, la bradycardie et l'assistance circulatoire mécanique (cœur mécanique déchargé).Cela fait du système un débit moyen pour le dépistage des drogues.La capacité du CTCM à modéliser l'hypertrophie cardiaque induite par le surmenage ouvre la voie au test de ce système pour une thérapie personnalisée.En conclusion, la présente étude démontre que l'étirement mécanique et la stimulation humorale sont essentiels au maintien de la culture des coupes de tissu cardiaque.
Bien que les données présentées ici suggèrent que CTCM est une plate-forme très prometteuse pour la modélisation du myocarde intact, cette méthode de culture présente certaines limites.La principale limitation de la culture CTCM est qu'elle impose des contraintes mécaniques dynamiques continues sur les tranches, ce qui empêche la capacité de surveiller activement les contractions des tranches cardiaques au cours de chaque cycle.De plus, en raison de la petite taille des coupes cardiaques (7 mm), la capacité d'évaluer la fonction systolique en dehors des systèmes de culture à l'aide de capteurs de force traditionnels est limitée.Dans le manuscrit actuel, nous surmontons partiellement cette limitation en évaluant la tension optique comme indicateur de la fonction contractile.Cependant, cette limitation nécessitera des travaux supplémentaires et pourra être résolue à l'avenir en introduisant des méthodes de surveillance optique de la fonction des tranches de cœur en culture, telles que la cartographie optique à l'aide de colorants sensibles au calcium et à la tension.Une autre limitation du CTCM est que le modèle de travail ne manipule pas le stress physiologique (précharge et postcharge).En CTCM, la pression a été induite dans des directions opposées pour reproduire un étirement physiologique de 25 % en diastole (étirement complet) et en systole (durée de la contraction pendant la stimulation électrique) dans de très grands tissus.Cette limitation devrait être supprimée dans les futures conceptions CTCM par une pression adéquate sur le tissu cardiaque des deux côtés et en appliquant les relations pression-volume exactes qui se produisent dans les cavités du cœur.
Le remodelage induit par l'étirement excessif rapporté dans ce manuscrit se limite à imiter les signaux d'hyperétirement hypertrophique.Ainsi, ce modèle peut aider à l'étude de la signalisation hypertrophique induite par l'étirement sans avoir besoin de facteurs humoraux ou neuronaux (qui n'existent pas dans ce système).D'autres études sont nécessaires pour augmenter la multiplicité de CTCM, par exemple, la co-culture avec des cellules immunitaires, les facteurs humoraux plasmatiques circulants et l'innervation lors de la co-culture avec des cellules neuronales amélioreront les possibilités de modélisation de la maladie avec CTCM.
Treize porcs ont été utilisés dans cette étude.Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Louisville.L'arc aortique a été clampé et le cœur a été perfusé avec 1 L de cardioplégie stérile (NaCl 110 mM, CaCl2 1,2 mM, KCl 16 mM, MgCl2 16 mM, NaHCO3 10 mM, héparine 5 U/mL, pH jusqu'à 7,4) ; les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'à ce qu'ils soient transportés au laboratoire sur de la glace, ce qui est généralement <10 min. les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'à ce qu'ils soient transportés au laboratoire sur de la glace, ce qui est généralement <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лаборатор ию на льду, что обычно занимает <10 мин. les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'au transport au laboratoire sur glace, ce qui prend généralement moins de 10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, об ычно <10 mois. Gardez les cœurs sur la cardioplégie de glace jusqu'au transport au laboratoire sur la glace, généralement <10 min.
Le dispositif CTCM a été développé dans le logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) SolidWorks.Les chambres de culture, les séparateurs et les chambres à air sont en plastique acrylique transparent CNC.La bague d'appui de 7 mm de diamètre est en polyéthylène haute densité (PEHD) au centre et possède une rainure de joint torique pour accueillir le joint torique en silicone utilisé pour sceller le support en dessous.Une fine membrane de silice sépare la chambre de culture de la plaque de séparation.La membrane en silicone est découpée au laser à partir d'une feuille de silicone de 0,02″ d'épaisseur et a une dureté de 35A.Les joints en silicone inférieur et supérieur sont découpés au laser à partir d'une feuille de silicone de 1/16″ d'épaisseur et ont une dureté de 50A.Des vis et des écrous à oreilles en acier inoxydable 316L sont utilisés pour fixer le bloc et créer un joint étanche à l'air.
Une carte de circuit imprimé (PCB) dédiée est conçue pour être intégrée au système C-PACE-EM.Les prises du connecteur de la machine suisse sur le PCB sont connectées aux électrodes en graphite par des fils de cuivre argentés et des vis en bronze 0-60 vissées dans les électrodes.Le circuit imprimé est placé dans le capot de l'imprimante 3D.
Le dispositif CTCM est contrôlé par un actionneur pneumatique programmable (PPD) qui crée une pression circulatoire contrôlée similaire à un cycle cardiaque.Au fur et à mesure que la pression à l'intérieur de la chambre à air augmente, la membrane de silicone flexible se dilate vers le haut, forçant le milieu sous le site tissulaire.La zone de tissu sera alors étirée par cette expulsion de liquide, mimant l'expansion physiologique du cœur pendant la diastole.Au pic de relaxation, une stimulation électrique a été appliquée à travers des électrodes en graphite, ce qui a réduit la pression dans la chambre à air et provoqué la contraction des sections de tissu.À l'intérieur du tuyau se trouve une valve hémostatique avec un capteur de pression pour détecter la pression dans le système d'air.La pression détectée par le capteur de pression est appliquée à un collecteur de données connecté à l'ordinateur portable.Cela permet une surveillance continue de la pression à l'intérieur de la chambre à gaz.Lorsque la pression maximale de la chambre a été atteinte (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), le dispositif d'acquisition de données a reçu l'ordre d'envoyer un signal au système C-PACE-EM pour générer un signal de tension biphasique pendant 2 ms, réglé sur 4 V.
Des coupes de cœur ont été obtenues et les conditions de culture dans 6 puits ont été réalisées comme suit : Transférer les cœurs récoltés du récipient de transfert vers un plateau contenant une cardioplégie froide (4°C).Le ventricule gauche a été isolé avec une lame stérile et découpé en morceaux de 1-2 cm3.Ces blocs de tissus ont été fixés à des supports tissulaires avec un adhésif tissulaire et placés dans un bain de tissu microtome vibrant contenant la solution de Tyrode et oxygéné en continu (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM M gCl2 (1 ml de solution 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml de solution 1 M), jusqu'à 1 L ddH2O).Le microtome vibrant a été réglé pour couper des tranches de 300 µm d'épaisseur à une fréquence de 80 Hz, une amplitude de vibration horizontale de 2 mm et une vitesse d'avance de 0,03 mm/s.Le bain de tissu a été entouré de glace pour maintenir la solution au frais et la température a été maintenue à 4°C.Transférer les coupes de tissus du bain microtome à un bain d'incubation contenant une solution de Tyrode oxygénée en continu sur de la glace jusqu'à ce que suffisamment de coupes soient obtenues pour une plaque de culture.Pour les cultures transpuits, les coupes de tissus ont été fixées sur des supports en polyuréthane stériles de 6 mm de large et placées dans 6 ml de milieu optimisé (milieu 199, supplément 1x ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalin et 2X antibiotique-antifongique).Une stimulation électrique (10 V, fréquence 1,2 Hz) a été appliquée aux coupes de tissu via le C-Pace.Pour les conditions TD, du T3 et du Dex frais ont été ajoutés à 100 nM et 1 μM à chaque changement de milieu.Le milieu est saturé en oxygène avant remplacement 3 fois par jour.Les coupes de tissus ont été cultivées dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2.
Pour les cultures CTCM, des coupes de tissus ont été placées sur une imprimante 3D sur mesure dans une boîte de Pétri contenant une solution de Tyrode modifiée.L'appareil est conçu pour augmenter la taille de la tranche du cœur de 25% de la surface de l'anneau de support.Ceci est fait pour que les sections du cœur ne s'étirent pas après avoir été transférées de la solution de Tyrode au milieu et pendant la diastole.A l'aide de colle histoacrylique, des coupes de 300 µm d'épaisseur ont été fixées sur un anneau support de 7 mm de diamètre.Après avoir fixé les sections de tissu à l'anneau de support, coupez les sections de tissu en excès et remettez les sections de tissu attachées dans le bain de solution de Tyrode sur glace (4 ° C) jusqu'à ce que suffisamment de sections aient été préparées pour un appareil.Le temps de traitement total pour tous les appareils ne doit pas dépasser 2 heures.Après que 6 coupes de tissus aient été attachées à leurs anneaux de support, le dispositif CTCM a été assemblé.La chambre de culture CTCM est pré-remplie avec 21 ml de milieu pré-oxygéné.Transférer les coupes de tissus dans la chambre de culture et éliminer soigneusement les bulles d'air avec une pipette.La section de tissu est ensuite guidée dans le trou et doucement pressée en place.Enfin, placez le capuchon de l'électrode sur l'appareil et transférez l'appareil dans l'incubateur.Connectez ensuite le CTCM au tube à air et au système C-PACE-EM.L'actionneur pneumatique s'ouvre et la vanne d'air ouvre le CTCM.Le système C-PACE-EM a été configuré pour délivrer 4 V à 1,2 Hz pendant la stimulation biphasique pendant 2 ms.Le milieu a été changé deux fois par jour et les électrodes ont été changées une fois par jour pour éviter l'accumulation de graphite sur les électrodes.Si nécessaire, des coupes de tissus peuvent être retirées de leurs puits de culture pour expulser les bulles d'air qui auraient pu tomber sous eux.Pour les conditions de traitement MT, T3 / Dex a été ajouté frais à chaque changement de milieu avec 100 nM de T3 et 1 μM de Dex.Les dispositifs CTCM ont été cultivés dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2.
Pour obtenir des trajectoires étirées de tranches de cœur, un système de caméra spécial a été développé.Un appareil photo reflex (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japon) a été utilisé avec un objectif macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).La visualisation a été réalisée à température ambiante après remplacement du milieu par du milieu frais.La caméra est positionnée à un angle de 51° et la vidéo est enregistrée à 30 images par seconde.Tout d'abord, un logiciel open source (MUSCLEMOTION43) a été utilisé avec Image-J pour quantifier le mouvement des tranches de cœur.Le masque a été créé à l'aide de MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) pour définir les régions d'intérêt pour battre les tranches de cœur afin d'éviter le bruit.Des masques segmentés manuellement sont appliqués à toutes les images d'une séquence d'images, puis transmis au plug-in MUSCLEMOTION.Muscle Motion utilise l'intensité moyenne des pixels de chaque image pour quantifier son mouvement par rapport à l'image de référence.Les données ont été enregistrées, filtrées et utilisées pour quantifier le temps de cycle et évaluer l'étirement des tissus pendant le cycle cardiaque.La vidéo enregistrée a été post-traitée à l'aide d'un filtre numérique à phase zéro du premier ordre.Pour quantifier l'étirement des tissus (crête à crête), une analyse crête à crête a été effectuée pour faire la distinction entre les pics et les creux dans le signal enregistré.De plus, la suppression des tendances est effectuée à l'aide d'un polynôme d'ordre 6 pour éliminer la dérive du signal.Le code de programme a été développé dans MATLAB pour déterminer le mouvement global des tissus, le temps de cycle, le temps de relaxation et le temps de contraction (code de programme supplémentaire 44).
Pour l'analyse de déformation, en utilisant les mêmes vidéos créées pour l'évaluation de l'étirement mécanique, nous avons d'abord tracé deux images représentant les pics de mouvement (les points de mouvement les plus élevés (supérieurs) et les plus bas (inférieurs)) selon le logiciel MUSCLEMOTION.Nous avons ensuite segmenté les régions tissulaires et appliqué une forme d'algorithme d'ombrage au tissu segmenté (Fig. 2a supplémentaire).Le tissu segmenté a ensuite été divisé en dix sous-surfaces et la contrainte sur chaque surface a été calculée à l'aide de l'équation suivante : Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, où Sup et Sdown sont les distances de la forme par rapport aux ombres supérieure et inférieure du tissu, respectivement (Fig. 2b supplémentaire).
Les coupes cardiaques ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 heures.Les tissus fixés ont été déshydratés dans 10% et 20% de saccharose pendant 1 h, puis dans 30% de saccharose pendant une nuit.Les sections ont ensuite été enrobées dans un composé à température de coupe optimale (composé OCT) et progressivement congelées dans un bain d'isopentane/glace carbonique.Conservez les blocs d'enrobage OCT à -80 oC jusqu'à la séparation.Les lames ont été préparées sous forme de coupes d'une épaisseur de 8 μm.
Pour retirer l'OCT des sections cardiaques, chauffer les lames sur un bloc chauffant à 95 ° C pendant 5 min.Ajouter 1 ml de PBS à chaque lame et incuber pendant 30 minutes à température ambiante, puis imprégner les sections en réglant 0,1% de Triton-X dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante.Pour empêcher les anticorps non spécifiques de se lier à l'échantillon, ajouter 1 ml de solution de BSA à 3 % aux lames et incuber pendant 1 heure à température ambiante.La BSA a ensuite été retirée et les lames ont été lavées avec du PBS.Marquez chaque échantillon avec un crayon.Des anticorps primaires (dilués au 1:200 dans 1% de BSA) (connexine 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) et de la troponine-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ont été ajoutés en 90 minutes, puis des anticorps secondaires (dilués au 1:200 dans 1% de BSA) contre la souris Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A1 6079), contre le lapin Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) pendant 90 minutes supplémentaires Lavé 3 fois avec du PBS Pour distinguer la coloration cible de l'arrière-plan, nous avons utilisé uniquement l'anticorps secondaire comme contrôle. Enfin, la coloration nucléaire DAPI a été ajoutée et les lames ont été placées dans un vectashield (Vector Laboratories) et scellées avec du vernis à ongles. -x grossissement) et un microscope Keyence avec un grossissement de 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) à 5 μg/ml dans du PBS a été utilisé pour la coloration WGA et appliqué sur des coupes fixes pendant 30 minutes à température ambiante.Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS et du noir Soudan a été ajouté à chaque lame et incubées pendant 30 minutes.Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS et un milieu d'enrobage vectashield a été ajouté.Les lames ont été visualisées sur un microscope Keyence à un grossissement de 40x.
L'OCT a été retiré des échantillons comme décrit ci-dessus.Après avoir retiré l'OCT, plongez les lames dans la solution de Bouin pendant la nuit.Les lames ont ensuite été rincées à l'eau distillée pendant 1 heure puis placées dans une solution de fuchsine acide d'aloès Bibrich pendant 10 minutes.Ensuite, les lames ont été lavées avec de l'eau distillée et placées dans une solution de 5 % de phosphomolybdène/5 % d'acide phosphotungstique pendant 10 minutes.Sans rinçage, transférer les lames directement dans la solution de bleu d'aniline pendant 15 minutes.Ensuite, les lames ont été lavées à l'eau distillée et placées dans une solution d'acide acétique à 1% pendant 2 minutes.Les lames ont été séchées dans de l'éthanol 200 N et transférées sur du xylène.Les lames colorées ont été visualisées à l'aide d'un microscope Keyence avec un objectif 10x.Le pourcentage de surface de fibrose a été quantifié à l'aide du logiciel Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numéro de catalogue V13154, selon le protocole du fabricant avec quelques modifications.En particulier, un poinçon chirurgical d'un diamètre de 6 mm a été utilisé pour assurer une taille de tissu uniforme lors de l'analyse MTT.Les tissus ont été individuellement plaqués dans les puits d'une plaque à 12 puits contenant un substrat MTT selon le protocole du fabricant.Les coupes sont incubées à 37°C pendant 3 heures et le tissu vivant métabolise le substrat MTT pour former un composé formazan violet.Remplacer la solution MTT par 1 ml de DMSO et incuber à 37 ° C pendant 15 minutes pour extraire le formazan violet des coupes cardiaques.Les échantillons ont été dilués au 1:10 dans du DMSO dans des plaques à fond transparent à 96 puits et l'intensité de la couleur pourpre a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de plaque Cytation (BioTek).Les lectures ont été normalisées au poids de chaque tranche de cœur.
Le milieu de tranche de cœur a été remplacé par un milieu contenant 1 μCi/ml de [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) pour le test d'utilisation du glucose comme décrit précédemment.Après 4 heures d'incubation, ajouter 100 µl de milieu dans un microtube à centrifuger ouvert contenant 100 µl de HCl 0,2 N.Ensuite, le tube a été placé dans un tube à scintillation contenant 500 µl de dH2O pour évaporer [3H]2O pendant 72 heures à 37°C.Retirez ensuite le tube de microcentrifugeuse du tube à scintillation et ajoutez 10 ml de liquide de scintillation.Les comptages de scintillation ont été effectués à l'aide d'un analyseur de scintillation liquide Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).L'utilisation du glucose a ensuite été calculée en tenant compte de l'activité spécifique du [5-3H]-glucose, de l'équilibre et du bruit de fond incomplets, de la dilution du [5-3H]- en glucose non marqué et de l'efficacité du compteur à scintillation.Les données sont normalisées à la masse des sections du cœur.
Après homogénéisation des tissus dans du Trizol, l'ARN a été isolé à partir de coupes cardiaques à l'aide du kit Qiagen miRNeasy Micro #210874 selon le protocole du fabricant.La préparation de la bibliothèque RNAsec, le séquençage et l'analyse des données ont été effectués comme suit :
1 μg d'ARN par échantillon a été utilisé comme matière première pour la préparation de la banque d'ARN.Les bibliothèques de séquençage ont été générées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ARN NEBNext UltraTM pour Illumina (NEB, États-Unis) conformément aux recommandations du fabricant, et des codes d'index ont été ajoutés aux séquences d'attributs pour chaque échantillon.En bref, l'ARNm a été purifié à partir de l'ARN total en utilisant des billes magnétiques attachées avec des oligonucléotides poly-T.La fragmentation est réalisée à l'aide de cations divalents à haute température dans NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).L'ADNc du premier brin a été synthétisé à l'aide d'amorces hexamères aléatoires et de la transcriptase inverse M-MuLV (RNase H-).Le deuxième brin d'ADNc est ensuite synthétisé en utilisant l'ADN polymérase I et la RNase H. Les surplombs restants sont convertis en extrémités franches par l'activité exonucléase/polymérase.Après adénylation de l'extrémité 3' du fragment d'ADN, un adaptateur NEBNext avec une structure en boucle en épingle à cheveux lui est attaché pour le préparer à l'hybridation.Pour la sélection de fragments d'ADNc de longueur préférée 150-200 bp.les fragments de bibliothèque ont été purifiés à l'aide du système AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, États-Unis).Ensuite, 3 μl d'enzyme USER (NEB, USA) avec un ADNc de taille sélectionnée ligaturé avec un adaptateur ont été utilisés pendant 15 minutes à 37°C puis pendant 5 minutes à 95°C avant la PCR.La PCR a ensuite été réalisée à l'aide de l'ADN polymérase Phusion High-Fidelity, d'amorces PCR universelles et d'amorces Index (X).Enfin, les produits de PCR ont été purifiés (système AMPure XP) et la qualité de la bibliothèque évaluée sur un système Agilent Bioanalyzer 2100.La banque d'ADNc a ensuite été séquencée à l'aide d'un séquenceur Novaseq.Les fichiers d'images brutes d'Illumina ont été convertis en lectures brutes à l'aide de CASAVA Base Calling.Les données brutes sont stockées dans des fichiers au format FASTQ(fq) qui contiennent les séquences de lecture et les qualités de base correspondantes.Sélectionnez HISAT2 pour faire correspondre les lectures de séquençage filtrées au génome de référence Sscrofa11.1.En général, HISAT2 prend en charge les génomes de toute taille, y compris les génomes de plus de 4 milliards de bases, et des valeurs par défaut sont définies pour la plupart des paramètres.Les lectures d'épissage à partir des données RNA Seq peuvent être efficacement alignées à l'aide de HISAT2, le système le plus rapide actuellement disponible, avec une précision identique ou supérieure à toute autre méthode.
L'abondance des transcrits reflète directement le niveau d'expression des gènes.Les niveaux d'expression génique sont évalués par l'abondance des transcrits (nombre de séquençage) associés au génome ou aux exons.Le nombre de lectures est proportionnel aux niveaux d'expression des gènes, à la longueur des gènes et à la profondeur de séquençage.Les FPKM (fragments par millier de paires de bases de transcrit séquencés par million de paires de bases) ont été calculés et les valeurs P de l'expression différentielle ont été déterminées à l'aide du package DESeq2.Nous avons ensuite calculé le taux de fausses découvertes (FDR) pour chaque valeur P en utilisant la méthode Benjamini-Hochberg9 basée sur la fonction R intégrée "p.adjust".
L'ARN isolé des coupes cardiaques a été converti en ADNc à une concentration de 200 ng/μl à l'aide du mélange SuperScript IV Vilo Master de Thermo (Thermo, n° de catalogue 11756050).La RT-PCR quantitative a été réalisée à l'aide d'une plaque de réaction transparente à 384 puits Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, n° cat. 4483319) et d'un adhésif optique microamp (Thermo, n° cat. 4311971).Le mélange réactionnel consistait en 5 µl de Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl de Taqman Primer et 3,5 µl de H2O mélangés par puits.Des cycles de qPCR standard ont été exécutés et les valeurs CT ont été mesurées à l'aide d'un instrument de PCR en temps réel Applied Biosystems Quantstudio 5 (module de 384 puits; produit # A28135).Les amorces Taqman ont été achetées auprès de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Les valeurs CT de tous les échantillons ont été normalisées au gène domestique GAPDH.
La diffusion dans les médias du NT-ProBNP a été évaluée à l'aide du kit NT-ProBNP (porc) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) selon le protocole du fabricant.En bref, 250 ul de chaque échantillon et standard ont été ajoutés en double dans chaque puits.Immédiatement après avoir ajouté l'échantillon, ajouter 50 µl de réactif de dosage A dans chaque puits.Secouez doucement la plaque et scellez avec du mastic.Ensuite, les comprimés ont été incubés à 37°C pendant 1 heure.Aspirer ensuite la solution et laver les puits 4 fois avec 350 µl de solution de lavage 1X, en incubant la solution de lavage pendant 1 à 2 minutes à chaque fois.Ajouter ensuite 100 µl de réactif de dosage B par puits et sceller avec du scellant pour plaque.Le comprimé a été doucement secoué et incubé à 37°C pendant 30 minutes.Aspirer la solution et laver les puits 5 fois avec 350 µl de solution de lavage 1X.Ajouter 90 µl de solution de substrat dans chaque puits et sceller la plaque.Incuber la plaque à 37°C pendant 10-20 minutes.Ajouter 50 µl de solution d'arrêt dans chaque puits.La plaque a été immédiatement mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque Cytation (BioTek) réglé à 450 nm.
Des analyses de puissance ont été effectuées pour choisir les tailles de groupe qui fourniront > 80 % de puissance pour détecter un changement absolu de 10 % dans le paramètre avec un taux d'erreur de type I de 5 %. Des analyses de puissance ont été effectuées pour choisir les tailles de groupe qui fourniront > 80 % de puissance pour détecter un changement absolu de 10 % dans le paramètre avec un taux d'erreur de type I de 5 %. Plus de 80% de plus ности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Une analyse de puissance a été effectuée pour sélectionner des tailles de groupe qui fourniraient > 80 % de puissance pour détecter un changement de paramètre absolu de 10 % avec un taux d'erreur de type I de 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Ыыл проведен анализ мощности для Выбора рззера групvresы, который оeес démar нения параметров и 5% частоты шшибок тип'I I. Une analyse de puissance a été effectuée pour sélectionner une taille de groupe qui fournirait > 80 % de puissance pour détecter un changement de paramètre absolu de 10 % et un taux d'erreur de type I de 5 %.Des coupes de tissus ont été sélectionnées au hasard avant l'expérience.Toutes les analyses étaient en aveugle et les échantillons n'ont été décodés qu'après que toutes les données aient été analysées.Le logiciel GraphPad Prism (San Diego, CA) a été utilisé pour effectuer toutes les analyses statistiques. Pour toutes les statistiques, les valeurs de p ont été considérées comme significatives à des valeurs < 0,05. Pour toutes les statistiques, les valeurs de p ont été considérées comme significatives à des valeurs <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pour toutes les statistiques, les valeurs de p ont été considérées comme significatives à des valeurs <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pour toutes les statistiques, les valeurs de p ont été considérées comme significatives à des valeurs <0,05.Le test t de Student bilatéral a été effectué sur les données avec seulement 2 comparaisons.Une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle a été utilisée pour déterminer la signification entre plusieurs groupes.Lors de la réalisation de tests post hoc, la correction de Tukey a été appliquée pour tenir compte des comparaisons multiples.Les données RNAsec ont des considérations statistiques particulières lors du calcul du FDR et du p.adjust comme décrit dans la section Méthodes.
Pour plus d'informations sur la conception de l'étude, voir le résumé du rapport de recherche sur la nature lié à cet article.