Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde stipe foar CSS. Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in aktualisearre blêder brûke (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer útsette). Yn 'e tuskentiid sille wy de side sjen litte sûnder stilen en JavaSkript.
Human gut morfogenesis stelt crypt-villus skaaimerken fan 3D epithelial microarchitecture en romtlike organisaasje. Dizze unike struktuer is nedich om te behâlden darm homeostasis troch it beskermjen fan de stam sel niche yn de basale krypt út exogenous microbial antigens en harren metabolites. Dêrneist intestinal villi en secreting mucus oanwêzich funksjoneel differinsjearre sellen op in beskermjende muorre mei in beskermjende muorre. It brûken fan 3D epitheliale struktueren is krúsjaal foar de bou fan in vitro darmmodellen. Opmerklik kin de organyske mimetyske gut-on-a-chip spontane 3D morfogenese fan it intestinale epithelium inducearje mei ferbettere fysiologyske funksjes en biomechanika. ynbêde hybride chip.We beskriuwe detaillearre metoaden foar apparaat fabrication, teelt fan Caco-2 of intestinal organoid epithelial sellen yn konvinsjonele ynstellings likegoed as op in microfluidic platfoarm, induction fan 3D morfogenese, en karakterisearring fan fêststelde 3D epithelia mei help fan meardere imaging modaliteiten. tro morfogenesis metoade brûkt fysiologysk relevante shear stress en meganyske beweging en net nedich komplekse sel engineering of manipulaasje, dy't meie outperform oare besteande techniques.We envision dat ús foarstelde protokol koe hawwe brede gefolgen foar de biomedical ûndersyk mienskip, it bieden fan in metoade te regenerearje 3D intestinal epithelial lagen yn vitro foar biomedical en pharmaceutical, pharmaceutical.
Eksperiminten litte sjen dat intestinale epitheliale Caco-2-sellen kultivearre yn gut-on-a-chip1,2,3,4,5 of bilayer mikrofluïdyske apparaten6,7 spontane 3D morfogenese yn vitro kinne ûndergean sûnder in dúdlik begryp fan it ûnderlizzende meganisme. thelial morfogenesis in vitro, dat is oantoand troch Caco-2 en pasjint-ôflaat intestinal organoïden.Yn dit ûndersyk rjochte wy ús spesifyk op 'e selproduksje en konsintraasjeferdieling fan in krêftige Wnt-antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), yn gut-on-a-chip en modifisearre mikrofluïdyske apparaten mei Transwell-ynserts, neamd "Hybrid Chip". zzled-relatearre proteïne 1, of Soggy-1) oan 'e on-chip gut inhibits morfogenese of fersteurt de prestrukturearre 3D epitheliale laach, wat suggerearret dat antagonistyske stress tidens kultuer ferantwurdlik is foar intestinale morfogenese in vitro. ment troch aktive flushing (bygelyks, yn gut-on-a-chip of hybride-on-a-chip platfoarms) of diffusion .Basolaterale media (bygelyks út Transwell ynfoegje yn grutte basolaterale reservoirs yn putten).
Yn dit protokol jouwe wy in detaillearre metoade foar it meitsjen fan darm-op-in-chip-mikroapparaten en Transwell-ynfoegje hybride chips (stappen 1-5) om intestinale epitheliale sellen te kultivearjen op polydimethylsiloxane (PDMS)-basearre poreuze membranen (stappen 6A, 7A, 8, 9) of polyestersertsmembranen, 7B-membranen, 7B-membranen, 9B-membranen, yn ed 3D morfogenese in vitro (stap 10). Wy identifisearre ek sellulêre en molekulêre skaaimerken yndikatyf fan weefsel-spesifike histogenesis en lineage-ôfhinklike sellulêre differinsjaasje troch it tapassen fan meardere imaging modalities (stappen 11-24). skepping fan 2D monolayers, en intestinal biochemical en Reproduksje fan de biomechanical microenvironment.in vitro.To induce 3D morfogenesis út 2D epithelial monolayers, wy fuorthelle morfogen antagonisten yn beide kweekte foarmen troch streamt it medium yn 'e basolaterale fak fan' e kultuer. Uteinlik, kinne wy ​​in fertsjintwurdiging fan 'e 3D brûkt wurde, te modellearjen morfogen-ôfhinklike epitheliale groei, longitudinale host-mikrobiom co-kultueren, pathogen ynfeksje, inflammatoire blessuere, epitheliale barriêre dysfunksje, en probiotika-basearre terapyen Foarbyld.ynfloeden.
Us protokol kin nuttich wêze foar in breed skala oan wittenskippers yn basis (bgl. intestinale mucosale biology, stamselbiology, en ûntwikkelingsbiology) en tapast ûndersyk (bgl. preclinical drug testing, disease modeling, tissue engineering, and gastroenterology) in brede ynfloed. wurde ferspraat oan publyk dy't de dynamyk fan selsignalearring studearje tidens darmûntwikkeling, regeneraasje of homeostasis. Derneist is ús protokol nuttich foar it ûnderfreegjen fan ynfeksje ûnder ferskate ynfeksjeare aginten lykas Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typebrio of Salmonella Vihimurioler.Doelgroepen fan syktepatology en patogenesis binne ek nuttich. It gebrûk fan in op-chip darmmikrofysiologysysteem kin longitudinale ko-kultuer 10 tastean en dêropfolgjende beoardieling fan hostdefinsje, ymmúnreaksjes en pathogen-relatearre blessuere-reparaasje yn 'e gastrointestinale (GI) traktaat 11. irritable bowel syndroom kin wurde simulearre doe't 3D intestinal epithelial lagen wurde taret mei help fan de pasjint syn 3D intestinal epithelial lagen, dizze sykten befetsje villous atrophy, crypt ferkoarting, mucosal skea, of beheinde epithelial barriêre. seltypen, lykas mononukleêre sellen fan perifeare bloed fan pasjinten (PBMC's), nei modellen dy't 3D-intestinale villus-krypt mikroarsjitektueren befetsje.weefselspesifike ymmúnsellen, 5.
Sûnt 3D epitheliale mikrostruktuer kin wurde fêstmakke en fisualisearre sûnder it seksjeproses, sjoggers dy't wurkje oan romtlike transkriptomika en ôfbyldings mei hege resolúsje as superresolúsje kinne ynteressearre wêze yn ús yn kaart bringen fan 'e spatiotemporale dynamyk fan genen en aaiwiten op epitheliale niches.Ynteressearre yn technology. Reaksje op mikrobiële of ymmúnstimulaasjes. Fierder kin longitudinale host-mikrobiom-crosstalk 10, 14 dy't darmhomeostasis koördinearje kinne yn 'e 3D intestinale mucosale laach wurde fêststeld troch it ko-kultueren fan ferskate mikrobiele soarten, mikrobiele mienskippen of fecale mikrobiota, benammen yn 'e fekale gut-chip.yn it platfoarm.Dizze oanpak is benammen oantreklik foar publyk dy't mucosale immunology, gastroenterology, minsklik mikrobiom, culturomics en klinyske mikrobiology studearje dy't besykje om earder ûnkultuerde darmmikrobiota yn it laboratoarium te kultivearjen. laterale compartments, it protokol kin ek wurde ferspraat oan dyjingen dy't ûntwikkeljen farmaseutyske, biomedical of hege-throughput screening of falidaasje platfoarms foar de fiedsel yndustry. As in bewiis-fan-prinsipe, wy koartlyn oantoand de helberens fan in multiplex hege-throughput morfogenesis systeem scalable nei in 24-well plaat orgaan formaat. de falidaasje fan ús in vitro morfogenese metoade kin wurde fersneld en mooglik oannommen troch in protte ûndersyk laboratoaria, yndustry as oerheid en regeljouwing ynstânsjes om te begripen sellulêre herprogramming fan in vitro gut morfogenese op it transkriptomic nivo te testen drugs of biotherapeutics. sis proses.
In beheind oantal minsklike-relevante eksperimintele modellen binne brûkt om intestinale epitheliale morfogenese te studearjen, benammen troch it ûntbrekken fan ymplemintabele protokollen om 3D-morfogenese yn vitro te inducearjen. Yn feite is in protte fan 'e hjoeddeistige kennis oer darmmorfogenese basearre op bistestúdzjes (bygelyks, zebrafisk20, mûzen21, of kinne se kostber wêze, 21 of kippen kinne kostje, 21, 21 kosten, 2, 21). en it wichtichste, net krekt bepale minsklike ûntwikkeling prosessen. Dizze modellen binne ek tige beheind yn harren fermogen om wurde hifke yn in multi-way scalable wize. Dêrom, ús protokol foar regenerearjen 3D weefsel struktueren in vitro prestearret better as in vivo dier modellen likegoed as oare tradisjonele statyske 2D sel kultuer modellen. de crypt-villus axis yn reaksje op ferskate mucosal of ymmúnsteurnissen stimuli.3D epithelial lagen kinne biede in romte om te studearjen hoe't microbial sellen konkurrearje te foarmjen romtlike nissen en ekologyske evolúsje yn reaksje op host faktoaren (bgl., ynderlike fersus uterlike mucus lagen, útskieding fan IgA en antimicrobial peptiden kinne ferstean de microbiotology, 3D ferstean de microbiotology, 3D ferstean). ta strukturearret har mienskippen en produsearret synergistysk mikrobiële metabolites (bygelyks koarte-keten fatty soeren) dy't foarmje sellulêre organisaasje en stam sel niches yn de basale krypten.
Neist ús metoade foar it meitsjen fan 3D intestinale epitheliale struktueren, binne d'r ferskate in vitro metoaden. Intestinale organoïde kultuer is in state-of-the-art tissue engineering technyk basearre op it kultivearjen fan intestinale stamsellen ûnder spesifike morfogene omstannichheden23,24,25. sed binnen de organoïde en dêrom is de ynfiering fan luminale komponinten lykas mikrobiele sellen of eksogene antigens beheind.Tagong ta organoïde lumens kin ferbettere wurde mei in mikroinjector,26,27 mar dizze metoade is invasive en arbeidsintensyf en fereasket spesjalisearre kennis om út te fieren. Fierder reflektearje tradisjonele organoïde kultueren dy't yn hydrogel-steigers ûnder statyske omstannichheden bewarre wurde, net krekt aktive in vivo biomechanika.
Oare oanpak dy't troch ferskate ûndersyksgroepen brûkt wurde, brûke prestrukturearre 3D hydrogel-steigers om de darmepitheelstruktuer te mimikjen troch isolearre minsklike intestinale sellen op it gel-oerflak te kultivearjen. Fabrikearje hydrogel-steigers mei 3D-printe, mikro-gemalen of litografysk fabrisearre mallen. it oprjochtsjen fan in hege aspekt ratio epithelial struktuer en stroma-epithelial crosstalk troch ynklusyf stromal sellen yn 'e steigers. Lykwols, de aard fan prestructured steigers kin foarkomme de werjefte fan de spontane morfogenetic proses sels. Dizze modellen ek net foarsjen dynamyske luminal of interstitial flow, ûntbrekt de floeistof slijmvliezen ûndersiken dy't brûkt wurde ûnder resinte hydrogel sjirurgyske funksje en ûndersiik. steigers yn in microfluidic platfoarm en patroan intestinal epithelial struktueren mei help fan laser-ets techniken. Mûs intestinal organoids folgje etste patroanen te foarmjen intestinal tubular struktueren, en intraluminal floeistof flow kin wurde recapitulated mei help fan in microfluidics module. Lykwols, dit model net eksposearret spontaneous morphogenetic technyk omfettet meganyske technyk omfettet meganyske ôfdrukken fan deselde groep nei meganyske ôfdrukken. miniature gut buizen mei spontane morfogenetic prosessen.Nettsjinsteande de komplekse fabrication fan ferskillende gut segminten binnen de buis, dit model ek mist luminale floeistof flow en meganyske deformation.Additional, model operabiliteit kin beheind wurde, benammen nei de bioprinting proses is foltôge, perturbing eksperimintele omstannichheden of sel-to-sel ynteraksjes. mimic gut motility, tagonklikens fan ûnôfhinklike apikale en basolaterale compartments, en re-skepping fan komplekse biologyske mikroomjouwings fan modularity.Dêrom kin ús in vitro 3D morfogenese protokol in komplemintêre oanpak te oerwinnen de útdagings fan besteande metoaden.
Us protokol is folslein rjochte op 3D epitheliale morfogenese, mei allinich epitheliale sellen yn kultuer en gjin oare soarten omlizzende sellen lykas mesenchymale sellen, endotheliale sellen, en ymmúnzellen. Lykas earder beskreaun, is de kearn fan ús protokol de yndeksje fan epitheliale morfogenese troch it fuortheljen fan sidemorfogen fan 'e yntrodusearre medium fan' e basolaterale sekretariteit fan 'e basolaterale ynhibitoren fan' e basolaterale ynhibitoren. t-on-a-chip en hybride-on-a-chip kinne ús opnij oanmeitsje de golvende 3D epithelial laach, ekstra biologyske kompleksiteiten lykas epithelial-mesenchymal ynteraksjes33,34, ekstracellulêre Matrix (ECM) deposition 35 en, yn ús model, crypt-villus funksjes dy't oerbringe stamsel nissen yn 'e basale sel nissen bliuwe yn' e mebla sel beskôge yn 'e basale sellen. senchym spylje in wichtige rol yn 'e produksje fan ECM aaiwiten en regeling fan intestinal morfogenese yn vivo35,37,38.De tafoeging fan mesenchymale sellen oan ús model fersterke it morfogenetic proses en sel taheaksel effisjinsje.The endothelial laach (dat wol sizze, capillaries of lymphatics) spilet in wichtige rol yn it regulearjen fan molekulêre sellen en ymmuniteit sellen yn' e gut4-ferfier yn 'e gut. Kultuerkomponinten dy't kinne wurde ferbûn tusken weefselmodellen binne in betingst as weefselmodellen binne ûntworpen om ynteraksjes mei meardere organen te demonstrearjen. Dêrom moatte endotheliale sellen miskien opnommen wurde om krekter fysiologyske skaaimerken te modellearjen mei resolúsje op orgaannivo. Pasjint-ôflaat ymmúnsellen binne ek essensjeel foar it werjaan fan oanberne ymmúnreaksjes, antigeen-presintaasje, yntema-spesifike oanpassing fan ymmuniteit en yntema-spesifike ymmuniteitssykte, yn 'e ymmune-spesifike ymmuniteitssykte,
It gebrûk fan hybride chips is rjochtliniger as gut-on-a-chip, om't it apparaat opset is ienfâldiger en it gebrûk fan Transwell-ynserts soarget foar skalberbere kultuer fan darmepitheel. Lykwols, kommersjeel beskikber Transwell-ynserts mei polyestermembranen binne net elastysk en kinne net peristaltyske-like bewegingen simulearje. de apikale kant.Dúdlik, de statyske eigenskippen yn de apikale compartment komselden ynskeakelje lange-termyn baktearjele co-kultuer yn hybride chips. Wylst wy kinne robúst induce 3D morfogenesis yn Transwell Inserts by it brûken fan hybride chips, it tekoart oan fysiologysk relevante biomechanika en apikale floeistof flow kin beheine de helberens fan potinsjele applikaasje chip.
Folsleine skaal rekonstruksjes fan 'e minsklike crypt-villus as yn gut-on-a-chip en hybride-on-a-chip kultueren binne net folslein fêststeld. Sûnt morfogenese begjint út in epithelial monolayer, 3D microarchitectures net needsaaklikerwize biede morfologyske oerienkomst mei krypten in vivo. Alhoewol't hegere boppeste kanalen op 'e chip liede ta ferhege hichte fan it microengineered epithelium, is de maksimale hichte noch beheind ta ~300-400 µm. ~600 µm41.
Ut in imaging eachpunt, in situ super-resolúsje imaging fan 3D microarchitectures meie wurde beheind ta de gut op in chip, sûnt de fereaske wurk ôfstân fan de objektive lens nei de epitheliale laach is op de oarder fan in pear millimeters.To oerwinnen dit probleem, in fiere objektive kin nedich wêze. by-laach microfabrication fan de darm op in chip giet it om permaninte adhesion tusken elke laach, it is ekstreem útdaagjend te iepenjen of fuortsmite de boppeste laach te ûndersykjen it oerflak struktuer fan de epitheliale laach.
De hydrofobisiteit fan PDMS hat in beheinende faktor west yn mikrofluid-basearre stúdzjes dy't te krijen hawwe mei hydrofobe lytse molekulen, om't PDMS sokke hydrofobe molekulen net spesifyk adsorbearje kin. Alternativen foar PDMS kinne beskôge wurde mei oare polymere materialen. sorpsje fan hydrofobe molekulen.
Uteinlik is ús metoade net goed karakterisearre yn termen fan it leverjen fan in hege-throughput-screening of "ien-maat-past-alles" brûkerfreonlik eksperiminteel platfoarm. It hjoeddeiske protokol fereasket in spuitpomp per mikroapparaat, dy't romte nimt yn in CO2-inkubator en grutskalige eksperiminten foarkomt. ous ynserts dy't trochgeande oanfolling en fuortheljen fan basolaterale media mooglik meitsje).
Om 3D morfogenese fan minsklik intestinal epithelium in vitro induce, wy brûkten in microfluidic chip intestinal apparaat befettet twa parallelle microchannels en in elastysk poreuze membraan tusken te meitsjen in lumen-kapillêre ynterface. beide platfoarms, morfogenese fan ferskate minsklike intestinal epithelial sellen kin oantoand wurde troch it tapassen fan rjochtingsmanipulaasje fan stream te ferwiderjen morfogen antagonisten út de basolateral compartment.De hiele eksperimintele proseduere (figuer 1) bestiet út fiif dielen: (i) microfabrication fan 'e gut chip of Transwell ynsette hybride chip 1-5isteps 1 (intestinale sel tarieding), (de intestinale sel; Caco-2 sellen) of minsklike intestinal organoïden;doazen 2-5), (iii) kultuer fan intestinal epithelial sellen op intestinal chips of hybride chips (stappen 6-9), (iv) induction fan 3D morfogenese in vitro (stap 10) en (v)) te karakterisearjen de 3D epitheliale mikrostruktuer (stappen 11-24). troch epitheliale morfogenese te fergelykjen mei romtlike, tydlike, betingsten of prosedurele kontrôles.
Wy brûkten twa ferskillende kultuerplatfoarms: gut-on-a-chip mei rjochte kanalen of net-lineêre kronkele kanalen, of hybride chips mei Transwell (TW) ynserts yn in mikrofluïdysk apparaat, fabrisearre lykas beskreaun yn Box 1, en stap 1 -5 "Device Fabrication" toant de haadstappen yn it meitsjen fan in inkele chip as in hybride chip of in hybride chip yntestinale sel. intestinal organoids) en kultuer proseduere brûkt yn dit protokol. "In vitro morfogenesis" toant de algemiene stappen wêryn Caco-2 of organoid-ôflaat epithelial sellen wurde kweekt op in intestinal chip of op Transwell ynfoegingen fan in hybride chip, folge troch ynduksje fan 3D morfogenesis en de foarming fan in karakterisearre programma epithelial struktuer wurdt fêststeld ûndersteande yntegreare struktuer of struktuer fan in karakteristysk epithelial. stinale epitheliale lagen kinne brûkt wurde, bygelyks, yn sel differinsjaasje karakterisaasje, gut fysiology stúdzjes, oprjochting fan host-microbiome ekosystemen, en sykte modeling. cus secreted from mucosal surfaces.Fluorescent bylden yn Gut Physiology toant slym produsearre troch kleuring foar sialic acid en N-acetylglucosamine resten mei help fan fluorescent tarwe kimen agglutinin. fluorescent proteïne (GFP) mei microengineered 3D Caco-2 epithelial sellen. It rjochter paniel toant de lokalisaasje fan GFP E. coli co-cultured mei 3D Caco-2 epithelial sellen, folge troch immunofluorescence kleuring mei F-actin (read) en nuclei (blauwe guozzen). gens (bgl. lipopolysaccharide, LPS) en ymmúnsellen (bgl. PBMC;grien). Caco-2-sellen waarden yn kultuer brocht om in 3D-epitheliale laach te fêstigjen. Skaalbalke, 50 µm. Ofbyldings yn ûnderste rige: "Differinsjaasje fan sellen" oanpast mei tastimming fan referinsje.2.Oxford University Press;Reprodusearre mei tastimming fan Ref.5.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" oanpast mei tastimming fan ref.3.NAS;"Disease Modeling" oanpast mei tastimming fan referinsje.5.NAS.
Sawol gut-on-chip en hybride chips waarden makke mei help fan PDMS replika's dy't waarden demoled út silisium mallen troch sêfte lithography1,44 en patroan mei SU-8. It ûntwerp fan de microchannels yn eltse chip wurdt bepaald troch te beskôgje hydrodynamika lykas shear stress en hydrodynamyske druk1,4,12. De oarspronklike gut-on-a-endea design, Fig. rjochte mikrokanalen, hat him ûntwikkele ta in komplekse gut-on-a-chip (útwreide gegevens Fig. 1b) dat omfiemet in pear bûgde mikrokanalen te induce Ferhege fluid ferbliuwstiid, net-lineêre flow patroanen, en multiaxial deformaasje fan kweekte sellen (Fig. 2a-f) sen.Wy hawwe oantoand dat de convoluted Gut-Chip ek sterk induces 3D morfogenese yn in ferlykbere tiid frame mei in ferlykbere graad fan epithelial groei fergelike mei de oarspronklike Gut-Chip, nettsjinsteande de kweekte sel type.Dêrom, te induce 3D morfogenesis, lineêre en komplekse on-chip gut curd-ûntwerpen wurde útwiksele SUPD negatyf molekulen patroanen mei silconi-ferwikseling silconi curd patroan. nei it fuortheljen (fig.2a).Om it darm op in chip te meitsjen, waard de tariede boppeste PDMS-laach sequentieel bûn oan in poreuze PDMS-film en dêrnei ôfstimd mei de legere PDMS-laach troch ûnomkearbere bonding mei in korona-behanneler (Fig. 2b-f). 2h en útwreide gegevens Fig.
a, Skematyske yllustraasje fan de tarieding fan PDMS dielen út SU-8 patroon silisium mallen. De uncured PDMS oplossing waard getten op in silisium mal (lofts), cured by 60 ° C (midden) en demoled (rjochts). De demolted PDMS waard snije yn stikken en skjinmakke foar fierdere gebrûk. skimmel brûkt om te fabryk de PDMS poreuze membrane.d, In rige fan foto 's fan' e boppeste en legere PDMS komponinten en de gearstalde on-chip intestinal device.e, Skematyske fan 'e ôfstimming fan' e boppeste, membraan, en legere PDMS komponinten. um chambers.g, Opset fan gut-on-a-chip foar microfluidic sel kultuer. De fabrisearre gut op in chip gearstald mei in siliconenbuis en spuit waard pleatst op in coverslip. De chip apparaat waard pleatst op it lid fan in 150 mm Petri skûtel foar ferwurkjen. It bynmiddel wurdt brûkt om te sluten de siliconenkit snapshots mei help fan hybride sjips fan hybride sjips en transgene sjips fan hybride sjips fan hybride sjips fan 'e hybride sjips. erts taret ûnôfhinklik te kultuer 2D monolayers fan intestinal epithelial sellen waarden ynfoege yn de hybride chip te induce intestinal 3D morfogenesis.The medium wurdt perfused fia microchannels ûnder de sel laach fêststeld op de Transwell ynfoegje.Scale bar, 1 cm.h Reprinted mei tastimming fan reference.4.Elsevier.
Yn dit protokol, de Caco-2 cell line en intestinal organoids waarden brûkt as epithelial boarnen (Fig. 3a). Beide soarten sellen waarden kultivearre ûnôfhinklik (Box 2 en Box 5) en brûkt om sied de ECM-coated microchannels fan on-chip gut of Transwell ynserts. en passaazjes 10 en 50) yn T-flessen wurde rispe te rieden dissociated sel suspensions troch trypsinization floeistof (box 2). Minsklike intestinal organoids út intestinal biopsies of sjirurgyske resections waarden kweekt yn Matrigel steiger koepels yn 24-well platen te stypjen de strukturele microenvironment as Wâlden, Noggin en essinsjele groei fan morphon, Noggin en essensjele groei. faktoaren taret lykas beskreaun yn Box 3 waarden oanfolle alle oare deis oant de organoïden groeide oant ~ 500 µm yn diameter. Folslein groeid organoïden wurde rispe en dissociated yn inkele sellen foar it sieden op gut of Transwell ynserts op in chip (Fakje 5). ), lesion site (bygelyks, lesion fersus net-lesioned gebiet) en gastrointestinale lokaasje yn it traktaat (bgl. duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, of rectum).
a, Workflow foar de yndeksje fan darmmorfogenese yn 'e darm chip. Caco-2 minsklik intestinal epithelium en intestinal organoïden wurde brûkt yn dit protokol te demonstrearjen 3D morfogenesis. De isolearre epitheliale sellen waarden sied yn de taret gut-on-a-chip apparaat (chip tarieding). 0 (D0), apikale (AP) stream wurdt inisjearre en ûnderhâlden foar de earste 2 dagen (flow, AP, D0-D2). Basolaterale (BL) stream wurdt ek inisjearre tegearre mei cyclic stretching motions (stretch, flow, AP en BL) doe't in folsleine 2D monolayer wurdt foarme. Intestinal 3D morphogenesis neidat spontaan 5 dagen microflugenesis Darm 3D morphogenesis (5 dagen). kontraste ôfbyldings litte represintative morfology fan Caco-2 sellen op elke eksperimintele stap of tiid punt (staafgrafyk, 100 µm). Fjouwer skematyske diagrammen yllustrearje de oerienkommende kaskaden fan gut morfogenese (rjochtsboppe). De stippele pylken yn it skema fertsjintwurdigje de rjochting fan floeistof flow.b, SEM-ôfbylding mei de oerflaktopology fan 'e fêststelde Caco- ft 3 (highlighting de oerflaktopology fan' e oprjochte Cacowhle-3) dashed doaze) toant de regenerearre microvilli op de 3D Caco-2 laach (rjochts) .c, Horizontale frontale werjefte fan fêstige Caco-2 3D, claudin (ZO-1, read) en trochgeande borstel grins membranen bestimpele F-actin (grien) en kearnen (blau) Immunofluorescence confocal fisualisaasje fan 'e midden fan' e intestinal sjips op 'e midden fan' e epithesiale sjips oantsjutte. focal plane foar eltse confocal view.d, Tiid ferrin fan morfologyske feroarings yn organoids kweekt op in chip krigen troch faze kontrast mikroskopy op dagen 3, 7, 9, 11, en 13. De ynset (rjochtsboppe) toant de hege fergrutting fan de foarsjoen image.e, DIC photomicrograph fan organoid 3D epithelium fêststeld yn 'e gut fluorescence fluorescence bylden dy't fêststeld yn' e dei, fluorescence fluorescence op 'e dei. stamsellen (LGR5;magenta), goblet sellen (MUC2; grien), F-actin (griis) en kearnen (cyaan) groeid op gut chips foar 3 dagen, respektivelik (Links) en 13-dagen (midden) organoïden op de epitheliale laach. Sjoch ek Extended Data Figure 3, dy't markearret LGR5 sinjalearjende ôfbyldings fan MUC3D-sinjalearjen fan MUC3D-sinjalearjen fan 'e MUC3D-sinjaalôfbyldings fan' e MUC3D organoid epithelium fêststeld yn de darm op in chip troch staining it plasma membraan mei CellMask dye (rjochts) op dei 13 fan kultuer.Scale bar is 50 μm, útsein as oars oanjûn.b Werprinte mei tastimming fan referinsje.2.Oxford University Press;c Oanpast mei tastimming fan Reference.2.Oxford University Press;e en f oanpast mei tastimming troch ferwizing.12 Under Creative Commons License CC BY 4.0.
Yn 'e darm op in chip is it nedich om it hydrofobe oerflak fan' e PDMS-poreuze membraan te feroarjen foar suksesfolle ECM-coating.Yn dit protokol tapasse wy twa ferskillende metoaden om de hydrofobisiteit fan PDMS-membranen te feroarjen. membrane.Mar, microfluidic kultuer fan organoid epithelium fereasket gemysk-basearre oerflak funksjonalisaasje te berikken effisjinte ôfsetting fan ECM aaiwiten troch sequentially tapassen polyethyleneimine (PEI) en glutaraldehyde oan PDMS mikrokanalen. idic sel kultuer begjint troch perfusing allinnich it medium yn de boppeste mikrokanaal oant de sellen foarmje in folsleine monolayer, wylst de legere microchannel behâldt statyske omstannichheden. Dizze optimalisearre metoade foar oerflak aktivearring en ECM coating makket it taheakjen fan organoid epithelium te induce 3D morfogenesis op de PDMS oerflak.
Transwell kultueren ek nedich ECM coating foarôfgeand oan sel sieden;lykwols, Transwell kultueren net nedich komplekse foarbehanneling stappen te aktivearjen it oerflak fan poreuze ynserts. Foar groeiende Caco-2 sellen op Transwell Inserts, ECM coating op poreuze ynserts versnelt de taheaksel fan dissociated Caco-2 sellen (<1 oere) en strakke knooppunt barriêre formaasje (<1-2 dagen op TransTowell sekuerdere organoïde kultueren op TransTowell seed organoids). coated ynserts, hechte oan it membraan oerflak (<3 h) en ûnderhâlden oant de organoids foarmje in folsleine monolayer mei barriêre yntegriteit. Transwell kultueren wurde útfierd yn 24-well platen sûnder it brûken fan hybride chips.
In vitro 3D morfogenese kin inisjearre wurde troch it tapassen fan floeistofstream oan de basolaterale aspekt fan in fêstige epitheliale laach. Yn 'e darm op in chip, epithelial morfogenese begûn doe't it medium waard perfused yn' e boppeste en legere microchannels (Fig. 3a). Lykas earder beskreaun, is it kritysk te yntrodusearje floeistofstream yn 'e kontinuïteit fan inferior rehibitor (baso-laterale rehibitor) rehibitor (basolaterale rehibitor rjochting). Om genôch fiedingsstoffen en serum te leverjen oan sellen bûn op poreuze membranen en generearje luminale skuorspanning, tapasse wy typysk dûbele stream yn 'e darm op in chip. Yn hybride chips waarden Transwell-ynfoegingen dy't epitheliale monolagen befetsje yn' e hybride chips ynfoege.Dan waard it medium tapast ûnder de basolaterale kant fan 'e poreuze Transwelle yn' e 5 dagen fan 'e poreuze Trans-inisjele ynliedingen fan' e poreuze Transwelle-reed. basolaterale stream yn beide kultuerplatfoarms.
De morfologyske skaaimerken fan microengineered 3D epitheliale lagen kinne wurde analysearre troch it tapassen fan ferskate imaging modaliteiten, ynklusyf faze kontrast mikroskopy, differinsjaaloperator ynterferinsje kontrast (DIC) mikroskopy, SEM, of immunofluorescence konfokale mikroskopy (figueren 3 en 4). optyske transparânsje fan PDMS en polyester films, sawol de gut-on-a-chip en hybride chip platfoarms kinne leverje real-time in situ imaging sûnder de needsaak foar seksje of disassembly fan it apparaat. % (wt/vol) ) bovine serum albumine (BSA), yn folchoarder. Ofhinklik fan it sel type, ferskate fixatives, permeabilizers, en blokkearjende aginten kinne brûkt wurde. 2-phenylene) indole, DAPI) of F-actin (bygelyks, fluorescently markearre phalloidin). Fluorescence-basearre live imaging kin ek útfierd wurde in situ te detect mucus produksje (Fig.1, "Seldifferinsjaasje" en "Gut fysiology"), willekeurich kolonisaasje fan mikrobiële sellen (Fig. 1, "Host-mikrobe co-kultuer"), de werving fan ymmúnsteurnissen sellen (Fig. 1, 'Disease Modeling') of de kontoeren fan 3D epithelial morfology (Fig. de boppeste laach fan 'e legere microchannel laach, lykas beskreaun yn ref.As werjûn yn Fig.. 2, de 3D epithelial morfology likegoed as de microvilli op de apikale borstel grins kin wurde visualized troch SEM (Fig. 3b). De útdrukking fan differinsjaasje markers kin wurde beoardiele troch it útfieren fan kwantitative PCR5 of single-cell laach RNA yn dit gefal groeie 3D of single-cell RNA yn dizze guunct groeie. chips of hybride chips wurde rispe troch trypsinization en dan brûkt foar molekulêre of genetyske analyze.
a, Workflow foar de yndeksje fan intestinal morfogenese yn in hybride chip. Caco-2 en intestinal organoids wurde brûkt yn dit protokol te demonstrearjen 3D morfogenesis yn in hybride chip platfoarm. Dissociated epithelial sellen waarden sied yn taret Transwell Inserts (TW prep; sjoch figuer hjirûnder). ûnder statyske omstannichheden (TW-kultuer). Nei 7 dagen waard in inkele Transwell-ynfoegje mei in 2D-monolaach fan epitheliale sellen yntegreare yn in hybride chip om in basolaterale stream yn te fieren (Flow, BL), wat úteinlik late ta de generaasje fan in 3D epitheliale laach (morfogenesis). op by elke eksperimintele stap of tiid punt. De skematyk yn de boppeste lagen yllustrearje de eksperimintele konfiguraasje foar eltse step.b, Hybrid chips (lofts skematyske) kin liede ta 3D morfogenese fan organoid epithelial sellen mei top-down confocal mikroskopy views nommen op ferskillende Z posysjes (boppeste, midden, en legere;sjoch rjochts skematyske en oerienkommende stippellinen).toande foar de hân lizzende morfologyske skaaimerken.F-actin (cyaan), nucleus (griis) .c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled werjefte) fan organoid-ôflaat epitheliale sellen kultivearre yn statyske Transwell (TW; ynset binnen wite dashed doaze) fersus hybride chip (grutste folsleine skot) fergeliking fan respektyflik 32D morphology fan 32D morphology fergeliking fan 32D fertikale werjeften. (ynfoege yn 'e rjochter boppehoeke; "XZ") ek sjen litte 2D en 3D features.Scale bar, 100 µm.c Werprinte mei tastimming fan referinsje.4.Elsevier.
Kontrôles kinne wurde taret troch it kultivearjen fan deselde sellen (Caco-2 of intestinale organoïde epitheliale sellen) yn twadiminsjonale monolagen ûnder konvinsjonele statyske kultuerbetingsten. Opmerklik kin fiedingsfermindering resultearje fanwegen de beheinde folumekapasiteit fan 'e mikrokanalen (dus ~4 µL yn it boppekanaal op' e orizjinele gut-chip-ûntwerp, foar en nei it fergelikjen fan epithelire-chip-ûntwerp, foar en nei it fergelikjen). .
It sêfte litografyske proses moat wurde útfierd yn in skjinne keamer. Foar elke laach op 'e chip (boppeste en ûnderste lagen en membranen) en hybride chips waarden ferskate fotomaskers brûkt en makke op aparte silisiumwafels, om't de hichten fan' e mikrokanalen ferskillend wiene. is 200 µm.
Plak in 3-inch silisium wafel yn in skûtel mei aceton. Swirlje de plaat foar 30 sekonden foarsichtich, dan lucht droegje de wafer. Ferfetsje de wafel nei in plaat mei IPA, spin dan de plaat foar 30 s om skjin te meitsjen.
In piranha-oplossing (mingsel fan wetterstofperoxid en konsintrearre sulfuric acid, 1: 3 (vol / vol)) kin opsjoneel brûkt wurde om it fuortheljen fan organyske resten fan it silisiumwafer-oerflak te maksimalisearjen.
Piranha oplossing is ekstreem corrosive en genereart waarmte. Oanfoljende feiligens foarsoarchsmaatregels binne nedich. Foar ôffal ôffal, lit de oplossing koelje en oermeitsje nei in skjinne, droege ôffal container. Brûk sekundêre konteners en goed label ôffal containers.Please folgje de foarsjenning syn feiligens rjochtlinen foar mear detaillearre prosedueres.
Dûbelje de wafels troch se op in 200 ° C heule plaat foar 10 min te pleatsen. Nei dehydratisaasje waard de wafel fiif kear yn 'e loft skodde om te koelen.
Giet ~10 g fotoresist SU-8 2100 op it sintrum fan 'e skjinmakke silisiumwafel. Brûk pincet om de fotoresist gelijkmatig op' e wafel te fersprieden. Pleatst de wafel sa no en dan op in 65 ° C heule plaat om de fotoresist minder kleverich te meitsjen en makliker te fersprieden. Pleats de wafel net direkt op 'e hite plaat.
SU-8 waard evenredich ferdield oer de wafel troch draaiende spincoating. Programmearje in ynkommende rotaasje fan 'e SU-8 foar 5-10 s om te propagearjen by 500 rpm by in fersnelling fan 100 rpm / s. de boppeste laach fan 'e gut op' e chip; sjoch "Krityske stappen" hjirûnder) ynsteld op in fersnelling fan 300 rpm / s 30 sekonden by 1.200 rpm.
De haadspinsnelheid kin oanpast wurde neffens de doeldikte fan it SU-8-patroan op 'e silisiumwafel.
Om SU-8-patroanen fan 500 µm hichte te meitsjen foar de boppeste laach fan 'e darm op' e chip, waarden de spincoating en sêfte bakstappen fan dizze Box (stappen 7 en 8) sequentieel werhelle (sjoch stap 9) om twa lagen fan 250 µm te meitsjen. m heech.
Sêft bakje de SU-8-coated wafers troch de wafels foarsichtich op in waarme plaat te pleatsen op 65 ° C foar 5 min, skeakelje dan de ynstelling nei 95 ° C en inkubearje foar in ekstra 40 min.
Om in hichte fan 500 μm fan it SU-8-patroan yn it boppeste mikrokanaal te berikken, werhelje stappen 7 en 8 om twa 250 μm dikke SU-8-lagen te generearjen.
Mei help fan de UV Mask Aligner, útfiere in lamp test neffens de fabrikant syn ynstruksjes foar it berekkenjen fan de bleatstelling tiid fan de wafel.
Nei it bepalen fan 'e eksposysjetiid, pleats it fotomasker op' e maskerhâlder fan 'e UV-masker-aligner en pleats it fotomasker op' e SU-8 coated wafer.
Plak it printe oerflak fan it fotomasker direkt op 'e SU-8-coated kant fan' e silisiumwafel om UV-dispersje te minimalisearjen.
Bliuw de SU-8-coated wafer en fotomasker fertikaal oan 260 mJ / cm2 fan UV-ljocht foar de foarbepaalde eksposysjetiid (sjoch stap 10 fan dit fak).
Nei UV-eksposysje waarden SU-8-coated silisium wafers bakt op 65 ° C foar 5 min en 95 ° C foar 15 min op elke heule plaat om patroanen te meitsjen mei in hichte fan 200 μm.
De ûntwikkelder wurdt getten yn in glêzen skûtel, en de bakte wafel wurdt pleatst yn de skûtel.It folume fan SU-8 developer kin fariearje ôfhinklik fan de grutte fan 'e glêzen plaat. Soargje derfoar dat jo genôch SU-8 developer brûke om folslein fuortsmite unexposed SU-8.Bygelyks, by it brûken fan in 150 mm diameter glêzen skûtel mei in 1 L kapasiteit mei 1 L-kapasiteit, brûke ~ 20 SU-0 minuten foar gelegenheid foar ûntwikkeling fan 5 SU-0 minuten. rotaasje.
Spoel de ûntwikkele skimmel mei ~ 10 mL frisse ûntwikkelder folge troch IPA troch de oplossing te spuiten mei in pipet.
Plak de wafel yn in plasmareiniger en bleatstelle oan soerstofplasma (atmosfearysk gas, doeldruk 1 × 10-5 Torr, krêft 125 W) foar 1.5 min.
Plak de wafel yn in fakuüm-ekssiccator mei in glêzen slide deryn. Wafers en dia's kinne njonken inoar pleatst wurde. As de fakuüm-ekssiccator troch in plaat yn ferskate lagen ferdield is, set de dia's yn 'e legere keamer en de wafels yn 'e boppeste keamer.Drop 100 μL trichloro(1H, fluoro-silane-oplossing, 1H, fluorocyl en in oplossing fan trichlor fakuüm foar silanization.
Thaw in flesje fan beferzen Caco-2 sellen yn in 37 ° C wetter bad, dan oerdrage de thawed sellen nei in T75 kolf mei 15 mL fan 37 ° C prewarmed Caco-2 medium.
Om Caco-2-sellen troch te jaan by ~ 90% gearrin, earst waarm Caco-2-medium, PBS, en 0.25% trypsin / 1 mM EDTA yn in 37 ° C wetterbad.
Aspirearje it medium troch fakuüm aspiraasje. Waskje sellen twa kear mei 5 mL waarme PBS troch it werheljen fan fakuüm aspiraasje en it tafoegjen fan frisse PBS.