Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
De evolúsje fan mikrobiële parasiten omfettet in tsjinaksje tusken natuerlike seleksje, wêrtroch't parasiten ferbetterje, en genetyske drift, wêrtroch't parasiten genen ferlieze en skealike mutaasjes sammelje.Hjir, om te begripen hoe't dizze tsjinaksje bart op 'e skaal fan ien makromolekule, beskriuwe wy de kryo-EM-struktuer fan it ribosoom fan Encephalitozoon cuniculi, in eukaryot organisme mei ien fan' e lytste genomen yn 'e natuer.De ekstreme reduksje fan rRNA yn E. cuniculi-ribosomen wurdt begelaat troch ungewoane strukturele feroarings, lykas de evolúsje fan earder ûnbekende fusearre rRNA-linkers en rRNA sûnder bulten.Dêrnjonken oerlibbe it E. cuniculi-ribosoom it ferlies fan rRNA-fragminten en aaiwiten troch it ûntwikkeljen fan de mooglikheid om lytse molekulen te brûken as strukturele mimiken fan ôfbrutsen rRNA-fragminten en aaiwiten.Oer it algemien litte wy sjen dat molekulêre struktueren lang tocht wurde fermindere, degenerearre, en ûnderwurpen oan slopende mutaasjes hawwe in oantal kompensearjende meganismen dy't hâlden se aktyf nettsjinsteande ekstreme molekulêre contractions.
Om't de measte groepen mikrobiële parasiten unyk molekulêre ark hawwe om har hosts te eksploitearjen, moatte wy faak ferskate therapeutika ûntwikkelje foar ferskate groepen parasiten1,2.Nije bewiis suggerearret lykwols dat guon aspekten fan parasyt-evolúsje konvergent en foar in grut part foarsisber binne, wat in potinsjele basis oanjout foar brede therapeutyske yntervinsjes yn mikrobiële parasiten3,4,5,6,7,8,9.
Foarige wurk hat in mienskiplike evolúsjonêre trend identifisearre yn mikrobiële parasiten neamd genome reduksje of genome ferfal10,11,12,13.Aktueel ûndersyk docht bliken dat as mikro-organismen har frij libjende libbensstyl opjaan en intracellulêre parasiten (of endosymbionts) wurde, har genomen stadiche, mar geweldige metamorfoazen oer miljoenen jierren ûndergean9,11.Yn in proses bekend as genome ferfal, sammelje mikrobiele parasiten skealike mutaasjes dy't in protte earder wichtige genen yn pseudogenen feroarje, wat liedt ta stadichoan genferlies en mutaasje-kollaps14,15.Dizze ynstoarting kin oant 95% fan 'e genen yn' e âldste intracellulêre organismen ferneatigje yn ferliking mei nau besibbe frij-libjende soarten.Sa is de evolúsje fan intracellulêre parasiten in toulûken tusken twa tsjinoerstelde krêften: Darwinistyske natuerlike seleksje, dy't liedt ta de ferbettering fan parasiten, en it ynstoarten fan it genoom, dat parasiten yn it ferjit smyt.Hoe't de parasyt it slagge om út dizze tug-of-war te kommen en de aktiviteit fan syn molekulêre struktuer te behâlden, bliuwt ûndúdlik.
Hoewol it meganisme fan genoomferfal net folslein begrepen is, liket it benammen te foarkommen troch faak genetyske drift.Om't parasiten yn lytse, aseksuele en genetysk beheinde populaasjes libje, kinne se skealike mutaasjes dy't soms foarkomme by DNA-replikaasje net effektyf eliminearje.Dit liedt ta ûnomkearbere accumulation fan skealike mutaasjes en reduksje fan it parasytgenoom.Dêrtroch ferliest de parasyt net allinich genen dy't net mear nedich binne foar syn fuortbestean yn 'e intrazellulêre omjouwing.It is it ûnfermogen fan parasytpopulaasjes om sporadyske skealike mutaasjes effektyf te eliminearjen dy't feroarsaket dat dizze mutaasjes troch it genoom sammelje, ynklusyf har wichtichste genen.
In protte fan ús hjoeddeistige begryp fan genome-reduksje is allinich basearre op fergelikingen fan genome-sekwinsjes, mei minder omtinken foar feroaringen yn eigentlike molekulen dy't húshâldingsfunksjes útfiere en as potinsjele drugsdoelen tsjinje.Fergelykjende ûndersiken hawwe oantoand dat de lêst fan skealike intrazellulêre mikrobiele mutaasjes proteïnen en nukleïnesoeren liket te predisponearjen om misfold en aggregearje, wêrtroch't se mear chaperone ôfhinklik en hypersensitive binne foar waarmte19,20,21,22,23.Derneist hawwe ferskate parasiten - ûnôfhinklike evolúsje soms skieden troch safolle as 2,5 miljard jier - in ferlykber ferlies fan kwaliteitskontrôtsintra yn har proteïnsynthese5,6 en DNA-reparaasjemeganismen24.Net folle is lykwols bekend oer de ynfloed fan intrazellulêre libbensstyl op alle oare eigenskippen fan sellulêre makromolekulen, ynklusyf molekulêre oanpassing oan in tanimmende lêst fan skealike mutaasjes.
Yn dit wurk, om better begripe de evolúsje fan aaiwiten en nucleic soeren fan intracellular microorganisms, wy bepale de struktuer fan ribosomen fan intracellular parasyt Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi is in fungus-like organisme dat heart ta in groep parasitêre mikrosporidia dy't ûngewoan lytse eukaryotyske genomen hawwe en dêrom brûkt wurde as modelorganismen om genoomferfal te studearjen25,26,27,28,29,30.Koartlyn waard cryo-EM ribosomstruktuer bepaald foar matig fermindere genomen fan Microsporidia, Paranosema locustae, en Vairimorpha necatrix31,32 (~ 3.2 Mb genome).Dizze struktueren suggerearje dat wat ferlies fan rRNA-amplifikaasje kompensearre wurdt troch de ûntwikkeling fan nije kontakten tusken oanbuorjende ribosomale proteïnen of de oankeap fan nije msL131,32 ribosomale proteïnen.Soarten Encephalitozoon (genoom ~ 2,5 miljoen bp), tegearre mei har neiste relative Ordospora, demonstrearje de ultime graad fan genoomreduksje yn eukaryoten - se hawwe minder dan 2000 proteïne-kodearjende genen, en it wurdt ferwachte dat har ribosomen net allinich sûnder rRNA-útwreidingsfragminten (rRNA-baktearyske ribosomen hawwe) ribosomale aaiwiten troch har gebrek oan homologen yn it E. cuniculi-genoom26,27,28.Dêrom konkludearren wy dat it E. cuniculi-ribosoom earder ûnbekende strategyen foar molekulêre oanpassing oan genoomferfal ûntdekke kin.
Us kryo-EM-struktuer stiet foar it lytste eukaryotysk cytoplasmysk ribosoom dat wurdt karakterisearre en jout ynsjoch yn hoe't de ultime graad fan genome-reduksje beynfloedet de struktuer, gearstalling en evolúsje fan 'e molekulêre masines dy't yntegraal is foar de sel.Wy fûnen dat it E. cuniculi-ribosoom in protte fan 'e wiid bewarre prinsipes fan RNA-folding en ribosom-assemblage skeint, en ûntduts in nij, earder ûnbekend ribosomaal proteïne.Hiel ûnferwachts litte wy sjen dat mikrosporidia-ribosomen de mooglikheid hawwe ûntwikkele om lytse molekulen te binen, en hypoteze dat trunkaasjes yn rRNA en aaiwiten evolúsjonêre ynnovaasjes triggerje dy't úteinlik nuttige kwaliteiten kinne jaan oan it ribosom.
Om ús begryp fan 'e evolúsje fan aaiwiten en nukleïnesoeren yn intracellulêre organismen te ferbetterjen, hawwe wy besletten om E. cuniculi-sporen te isolearjen fan kultueren fan ynfekteare sûchdiersellen om har ribosomen te suverjen en de struktuer fan dizze ribosomen te bepalen.It is lestich om in grut oantal parasitêre mikrosporidia te krijen, om't mikrosporidia net yn in fiedingsmedium kinne wurde kweekt.Ynstee dêrfan groeie en reprodusearje se allinich binnen de hostsel.Dêrom, om E. cuniculi-biomassa te krijen foar ribosomreiniging, hawwe wy de sûchdiernier-selline RK13 ynfekteare mei E. cuniculi-sporen en dizze ynfekteare sellen ferskate wiken yn kultuer brocht om E. cuniculi te groeien en te fermannichfâldigjen.Mei help fan in besmette sel monolayer fan likernôch in heale fjouwerkante meter, wy wienen by steat om te suverjen sa'n 300 mg fan Microsporidia sporen en brûke se te isolearjen ribosomen.Wy fersteurden dan de suvere sporen mei glêzen kralen en isolearren de rûge ribosomen mei stapsgeze polyetyleenglycolfraksje fan 'e lysaten.Dit joech ús om sawat 300 µg rau E. cuniculi-ribosomen te krijen foar strukturele analyze.
Wy sammele doe cryo-EM-ôfbyldings mei de resultearjende ribosom-samples en ferwurke dizze ôfbyldings mei maskers dy't oerienkomme mei de grutte ribosomale subunit, lytse subunit-kop en lytse subunit.Tidens dit proses sammele wy ôfbyldings fan sawat 108,000 ribosomale dieltsjes en berekkene kryo-EM-ôfbyldings mei in resolúsje fan 2.7 Å (oanfoljende figueren 1-3).Wy brûkten doe cryoEM-ôfbyldings om rRNA, ribosomaal proteïne, en hibernaasjefaktor Mdf1 te modellearjen dy't ferbûn binne mei E. cuniculi-ribosomen (fig. 1a, b).
in Struktuer fan it E. cuniculi-ribosoom yn kompleks mei de hibernaasjefaktor Mdf1 (pdb id 7QEP).b Kaart fan hibernation faktor Mdf1 assosjearre mei de E. cuniculi ribosom.c Sekondêre struktuerkaart fergeliket weromfûn rRNA yn Microsporidian soarten mei bekende ribosomale struktueren.De panielen litte de lokaasje sjen fan 'e fersterke rRNA-fragminten (ES) en aktive ribosomenplakken, ynklusyf de dekodearjende side (DC), de sarcinicin-loop (SRL), en it peptidyltransferase-sintrum (PTC).d De elektroanentichtens dy't oerienkomt mei it peptidyltransferase-sintrum fan it E. cuniculi-ribosoom suggerearret dat dizze katalytyske side deselde struktuer hat yn 'e E. cuniculi-parasyt en syn hosts, ynklusyf H. sapiens.e, f De oerienkommende elektroanentichtens fan it dekodearjen sintrum (e) en de skematyske struktuer fan it dekodearjen sintrum (f) jouwe oan dat E. cuniculi hat resten U1491 ynstee fan A1491 (E. coli nûmering) yn in protte oare eukaryoten.Dizze feroaring suggerearret dat E. cuniculi gefoelich wêze kin foar antibiotika dy't dizze aktive side rjochtsje.
Yn tsjinstelling ta de earder fêststelde struktueren fan V. necatrix en P. locustae ribosomen (beide struktueren fertsjintwurdigje deselde microsporidia famylje Nosematidae en binne hiel ferlykber mei elkoar), 31,32 E. cuniculi ribosomen ûndergean tal fan prosessen fan rRNA en protein fragmintaasje.Fierdere denaturaasje (oanfoljende figueren 4-6).Yn rRNA omfette de meast opfallende feroarings folslein ferlies fan it fersterke 25S rRNA-fragmint ES12L en parsjele degeneraasje fan h39-, h41- en H18-helices (Fig. 1c, Oanfoljende Fig. 4).Under ribosomale aaiwiten omfette de meast opfallende feroaringen folslein ferlies fan it eS30-protein en ferkoarting fan 'e eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, en eS7-proteinen (oanfoljende 5, 5).
Sa, de ekstreme reduksje fan de genomen fan Encephalotozoon / Ordospora soarten wurdt wjerspegele yn harren ribosomen struktuer: E. cuniculi ribosomes belibje de meast dramatyske ferlies fan aaiwyt ynhâld yn eukaryote cytoplasmic ribosomes ûnderwurpen oan strukturele karakterisearring, en se hawwe net iens dy rRNA en aaiwyt fragminten dy't net allinnich yn, mar ek yn it libben conserved, mar ek in soad conserved libben.De struktuer fan 'e E. cuniculi ribosome jout it earste molekulêre model foar dizze feroarings en ûntbleatet evolúsjonêre eveneminten dy't oersjoen binne troch sawol ferlykjende genomika en stúdzjes fan yntrazellulêre biomolekulêre struktuer (Supplementary Fig. 7).Hjirûnder beskriuwe wy elk fan dizze eveneminten tegearre mei har wierskynlike evolúsjonêre oarsprong en har potensjele ynfloed op ribosomefunksje.
Wy fûnen doe dat, neist grutte rRNA-trunkaasjes, E. cuniculi-ribosomen rRNA-fariaasjes hawwe op ien fan har aktive siden.Hoewol it peptidyltransferasesintrum fan it E. cuniculi-ribosoom deselde struktuer hat as oare eukaryotyske ribosomen (fig. 1d), ferskilt it dekodearjensintrum troch sesjefariaasje by nukleotide 1491 (E. coli-nûmering, fig. 1e, f).Dizze observaasje is wichtich om't de dekodearjende side fan eukaryotyske ribosomen typysk residuen G1408 en A1491 befettet yn ferliking mei baktearjele-type residuen A1408 en G1491.Dizze fariaasje leit oan 'e ûnderskate gefoelichheid fan baktearjele en eukaryotyske ribosomen foar de aminoglycosidefamylje fan ribosomale antibiotika en oare lytse molekulen dy't de dekodearjende side rjochtsje.Op 'e dekodearjende side fan' e E. cuniculi-ribosoom waard residu A1491 ferfongen troch U1491, wêrtroch mooglik in unike binende ynterface foar lytse molekulen dy't rjochtsje op dizze aktive side.Deselde A14901 fariant is ek oanwêzich yn oare microsporidia lykas P. locustae en V. necatrix, wat suggerearret dat it is wiidferspraat ûnder microsporidia soarten (fig. 1f).
Om't ús E. cuniculi ribosommonsters isolearre waarden fan metabolysk ynaktive sporen, testen wy de cryo-EM-kaart fan E. cuniculi foar earder beskreaune ribosombinding ûnder stress of hongerbetingsten.Hibernaasjefaktoaren 31,32,36,37, 38. Wy passe de earder fêststelde struktuer fan it hibernearjende ribosoom mei de cryo-EM-kaart fan it E. cuniculi-ribosom.Foar docking waarden S. cerevisiae ribosomen brûkt yn kompleks mei hibernaasje faktor Stm138, sprinkhanen ribosomen yn kompleks mei Lso232 faktor, en V. necatrix ribosomen yn kompleks mei Mdf1 en Mdf231 faktoaren.Tagelyk fûnen wy de kryo-EM-tichtens dy't oerienkomt mei de restfaktor Mdf1.Fergelykber mei Mdf1 dy't bindet oan it V. necatrix-ribosoom, bindet Mdf1 ek oan it E. cuniculi-ribosoom, wêr't it de E-side fan it ribosoom blokkeart, wat mooglik helpt om ribosomen beskikber te meitsjen as parasytsporen metabolysk ynaktyf wurde by licheminaktivaasje (figuer 2).).
Mdf1 blokkearret de E-side fan it ribosom, wat liket te helpen it ribosoom te ynaktivearjen as parasytsporen metabolysk ynaktyf wurde.Yn 'e struktuer fan' e E. cuniculi-ribosoom fûnen wy dat Mdf1 in earder ûnbekend kontakt foarmet mei de L1-ribosomstamme, it diel fan 'e ribosoom dat de frijlitting fan deacylearre tRNA út' e ribosom fasilitearret by de proteinsynteze.Dizze kontakten suggerearje dat Mdf1 dissociates út it ribosoom mei help fan deselde meganisme as deacetylated tRNA, it jaan fan in mooglike ferklearring foar hoe't it ribosome ferwideret Mdf1 te reaktivearjen protein synteze.
Us struktuer liet lykwols in ûnbekend kontakt sjen tusken Mdf1 en it L1 ribosomskonk (it diel fan it ribosoom dat helpt by it frijlitten fan deacylearre tRNA út it ribosom by proteïnsynteze).Benammen Mdf1 brûkt deselde kontakten as de elbow segmint fan de deacylated tRNA molecule (figuer 2).Dit earder ûnbekende molekulêre modeling liet sjen dat Mdf1 dissociates út it ribosom mei help fan deselde meganisme as deacetylated tRNA, dat ferklearret hoe't it ribosome ferwideret dizze hibernation faktor te reaktivearjen protein synteze.
By it konstruearjen fan it rRNA-model fûnen wy dat it E. cuniculi-ribosoom abnormaal opfolde rRNA-fragminten hat, dy't wy fusearre rRNA neamden (fig. 3).Yn ribosomen dy't de trije domeinen fan it libben span, falt rRNA yn struktueren wêryn't de measte rRNA-basen of basepaar en fold mei elkoar of ynteraksje mei ribosomale aaiwiten38,39,40.Yn E. cuniculi-ribosomen lykje rRNA's lykwols dit foldprinsipe te skeinen troch guon fan har helices te konvertearjen yn ûntfolde rRNA-regio's.
Struktuer fan 'e H18 25S rRNA-helix yn S. cerevisiae, V. necatrix, en E. cuniculi.Typysk, yn ribosomen dy't de trije libbensdomeinen oerspant, draait dizze linker yn in RNA-helix dy't 24 oant 34 resten befettet.Yn Microsporidia, yn tsjinstelling, wurdt dizze rRNA-linker stadichoan fermindere ta twa single-stringed uridine-rike linkers dy't mar 12 resten befetsje.De measte fan dizze resten binne bleatsteld oan solvents.De figuer lit sjen dat parasitêr microsporidia lykje te skeinen de algemiene prinsipes fan rRNA folding, dêr't rRNA bases wurde meastal keppele oan oare bases of belutsen by rRNA-protein ynteraksjes.Yn mikrosporidia krije guon rRNA-fragminten in ûngeunstige fold, wêrby't de eardere rRNA-heliks in ienstrengich fragmint wurdt dat hast yn in rjochte line langer wurdt.De oanwêzigens fan dizze ûngewoane regio's lit microsporidia rRNA rRNA-fragminten op ôfstân bine mei in minimaal oantal RNA-basen.
It meast opfallende foarbyld fan dizze evolúsjonêre oergong kin beoardiele wurde yn 'e H18 25S rRNA-helix (fig. 3).Yn soarten fan E. coli oant minsken befetsje de basen fan dizze rRNA-helix 24-32 nukleotiden, dy't in wat ûnregelmjittige helix foarmje.Yn earder identifisearre ribosomale struktueren fan V. necatrix en P. locustae,31,32 binne de basen fan 'e H18-helix foar in part uncoiled, mar nukleotide-baseparing wurdt bewarre bleaun.Yn E. cuniculi wurdt dit rRNA-fragmint lykwols de koartste linkers 228UUUGU232 en 301UUUUUUUUUUU307.Oars as typyske rRNA fragminten, dizze uridine-rike linkers net coil of meitsje wiidweidich kontakt mei ribosomale aaiwiten.Ynstee dêrfan nimme se solvent-iepen en folslein útfolde struktueren wêryn't de rRNA-strengen hast rjochtút ferlingd wurde.Dizze útwreide konformaasje ferklearret hoe't E. cuniculi allinich 12 RNA-basen brûkt om de 33 Å-gap tusken de H16- en H18-rRNA-helices te foljen, wylst oare soarten op syn minst twa kear safolle rRNA-basen nedich binne om it gat te foljen.
Sa kinne wy ​​bewize dat, troch energetysk ûngeunstige folding, parasitêre mikrosporidia in strategy hawwe ûntwikkele om sels dy rRNA-segminten te kontraktearjen dy't breed bewarre bliuwe oer soarten yn 'e trije domeinen fan it libben.Blykber, troch it sammeljen fan mutaasjes dy't rRNA-helices transformearje yn koarte poly-U-linkers, kinne E. cuniculi ûngewoane rRNA-fragminten foarmje dy't sa min mooglik nukleotiden befetsje foar ligaasje fan distale rRNA-fragminten.Dit helpt te ferklearjen hoe't microsporidia in dramatyske reduksje yn har basis molekulêre struktuer berikte sûnder har strukturele en funksjonele yntegriteit te ferliezen.
In oar ûngewoane eigenskip fan E. cuniculi rRNA is it uterlik fan rRNA sûnder thickenings (figuer 4).Bulgen binne nukleotiden sûnder basispearen dy't út 'e RNA-helix draaie ynstee fan dêryn te ferbergjen.De measte rRNA-protrusions fungearje as molekulêre kleefstoffen, en helpe by it binen fan neistlizzende ribosomale aaiwiten of oare rRNA-fragminten.Guon fan 'e bulten fungearje as hinges, wêrtroch't de rRNA-helix optimaal flexe en falt foar produktive proteinsynthese 41 .
a In rRNA protrusion (S. cerevisiae nûmering) is ôfwêzich yn de E. cuniculi ribosomen struktuer, mar oanwêzich yn de measte oare eukaryoten b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, en E. cuniculi ynterne ribosomen.parasiten misse in protte fan 'e âlde, tige bewarre rRNA-bulten.Dizze verdikkingen stabilisearje de ribosomstruktuer;dêrom, harren ôfwêzigens yn microsporidia jout in fermindere stabiliteit fan rRNA folding yn microsporidia parasiten.Fergeliking mei P stammen (L7 / L12 stammen yn baktearjes) docht bliken dat it ferlies fan rRNA bulten soms oerienkomt mei it ferskinen fan nije bulten neist de ferlerne bulten.De H42-helix yn it 23S/28S rRNA hat in âlde bulge (U1206 yn Saccharomyces cerevisiae) dy't rûsd is op syn minst 3,5 miljard jier âld te wêzen fanwegen syn beskerming yn trije domeinen fan it libben.Yn microsporidia wurdt dizze bulge eliminearre.Der ferskynde lykwols in nije bulte neist de ferlerne bulte (A1306 yn E. cuniculi).
Opfallend fûnen wy dat E. cuniculi-ribosomen de measte rRNA-bulten misse dy't fûn binne yn oare soarten, ynklusyf mear as 30 bulten bewarre yn oare eukaryoten (fig. 4a).Dit ferlies elimineert in protte kontakten tusken ribosomale subunits en neistlizzende rRNA helices, soms it meitsjen fan grutte holle voids binnen de ribosomen, wêrtroch't de E. cuniculi ribosomen mear poreus yn ferliking mei mear tradisjonele ribosomen (figuer 4b).Opmerklik fûnen wy dat de measte fan dizze bulten ek ferlern gienen yn 'e earder identifisearre V. necatrix en P. locustae ribosomstrukturen, dy't troch eardere strukturele analyzes oersjoen waarden31,32.
Soms wurdt it ferlies fan rRNA-bulten begelaat troch de ûntwikkeling fan nije bulten neist de ferlerne bulge.Bygelyks, de ribosomale P-stam befettet in U1208-bulte (yn Saccharomyces cerevisiae) dy't oerlibbe fan E. coli oant minsken en wurdt dêrom rûsd op 3,5 miljard jier âld.Tidens proteïnesynteze helpt dizze bulge de P-stam te bewegen tusken iepen en sletten konformaasjes, sadat it ribosoom oersettingsfaktoaren kin rekrutearje en se leverje oan 'e aktive side.By E. cuniculi ribosomen is dizze ferdikking ôfwêzich;lykwols, in nije thickening (G883) leit allinnich yn trije basis pearen kin bydrage oan it restaurearjen fan de optimale fleksibiliteit fan de P stam (figuer 4c).
Us gegevens oer rRNA sûnder bulten suggerearje dat rRNA-minimalisaasje net beheind is ta it ferlies fan rRNA-eleminten op it oerflak fan 'e ribosom, mar kin ek de ribosomkearn belûke, it meitsjen fan in parasyt-spesifike molekulêre defekt dat net beskreaun is yn frije libbene sellen.libbene soarten wurde waarnommen.
Nei it modelleren fan kanonike ribosomale aaiwiten en rRNA, fûnen wy dat konvinsjonele ribosomale komponinten de trije dielen fan it kryo-EM-ôfbylding net kinne ferklearje.Twa fan dizze fragminten binne lytse molekulen yn grutte (figuer 5, oanfoljende figuer 8).It earste segmint is sandwiched tusken de ribosomale aaiwiten uL15 en eL18 yn in posysje meastentiids beset troch de C-terminus fan eL18, dat wurdt ynkoarte yn E. cuniculi.Hoewol wy de identiteit fan dit molekule net kinne bepale, wurdt de grutte en foarm fan dit tichtheideilân goed ferklearre troch de oanwêzigens fan spermidinemolekulen.Syn bining oan it ribosom wurdt stabilisearre troch microsporidia-spesifike mutaasjes yn de uL15 aaiwiten (Asp51 en Arg56), dy't lykje te fergrutsjen de affiniteit fan it ribosom foar dit lytse molekule, as se tastean uL15 te wrap it lytse molekule yn in ribosomale struktuer.Oanfoljende figuer 2).8, oanfoljende gegevens 1, 2).
Cryo-EM-ôfbylding dy't de oanwêzigens fan nukleotiden sjen litte bûten de ribose bûn oan it E. cuniculi-ribosom.Yn it E. cuniculi-ribosoom nimt dit nukleotide itselde plak yn as it 25S rRNA A3186-nukleotide (Saccharomyces cerevisiae-nûmering) yn de measte oare eukaryote ribosomen.b Yn de ribosomale struktuer fan E. cuniculi sit dit nukleotide tusken de ribosomale aaiwiten uL9 en eL20, en stabilisearret dêrmei it kontakt tusken de twa aaiwiten.cd eL20 sekwinsje behâld analyze ûnder microsporidia soarten.De fylogenetyske beam fan Microsporidia soarten (c) en meardere folchoarder alignment fan de eL20 aaiwyt (d) litte sjen dat nucleotide-binende resten F170 en K172 wurde bewarre yn meast typyske Microsporidia, mei útsûndering fan S. lophii, mei útsûndering fan iere branching Microsporidia, dy't behâlden de ES39L rRNA extension.e Dizze figuer lit sjen dat nukleotide-binende residuen F170 en K172 allinich oanwêzich binne yn eL20 fan it sterk fermindere mikrosporidia-genoom, mar net yn oare eukaryoten.Oer it algemien suggerearje dizze gegevens dat Microsporidian ribosomen in nukleotide-binende side hawwe ûntwikkele dy't AMP-molekulen liket te binen en se te brûken om proteïne-proteïne-ynteraksjes yn 'e ribosomale struktuer te stabilisearjen.De hege behâld fan dizze binende side yn Microsporidia en syn ôfwêzigens yn oare eukaryoten suggerearret dat dizze side in selektyf oerlibjen foardiel kin leverje foar Microsporidia.Sa, de nukleotide-binende pocket yn de microsporidia ribosome liket net te wêzen in degenerearre skaaimerk of ein foarm fan rRNA degradaasje lykas earder beskreaun, mar leaver in brûkbere evolúsjonêre ynnovaasje wêrmei de microsporidia ribosome te bine direkt lytse molekulen, mei help fan se as molekulêre boustiennen.boustiennen foar ribosomen.Dizze ûntdekking makket it mikrosporidia-ribosoom it ienige ribosoom dat bekend is om ien nukleotide te brûken as syn strukturele boublok.f Hypotetyske evolúsjonêre paad ôflaat fan nukleotidebinding.
De twadde lege molekulêre gewicht tichtens leit oan de ynterface tusken ribosomale aaiwiten uL9 en eL30 (Fig. 5a).Dizze ynterface waard earder beskreaun yn 'e struktuer fan' e Saccharomyces cerevisiae-ribosom as in binende side foar it 25S-nukleotide fan rRNA A3186 (diel fan 'e ES39L rRNA-útwreiding)38.It waard oantoand dat yn degenerearre P. locustae ES39L ribosomen, dizze ynterface bynt in ûnbekende single nucleotide 31, en it wurdt oannommen dat dit nucleotide is in fermindere definitive foarm fan rRNA, wêryn de lingte fan rRNA is ~ 130-230 basen.ES39L wurdt redusearre ta ien nukleotide 32.43.Us kryo-EM-ôfbyldings stypje it idee dat tichtens kin wurde ferklearre troch nukleotiden.De hegere resolúsje fan ús struktuer liet lykwols sjen dat dit nukleotide in ekstraribosomale molekule is, mooglik AMP (Fig. 5a, b).
Wy fregen doe oft de nukleotide-binende side ferskynde yn it E. cuniculi-ribosoom of oft it earder bestie.Om't nukleotidebinding benammen bemiddele wurdt troch de Phe170- en Lys172-residuen yn it eL30-ribosomaalprotein, beoardielje wy it behâld fan dizze residuen yn 4396 represintative eukaryoten.Lykas yn it gefal fan uL15 hjirboppe, fûnen wy dat de Phe170- en Lys172-residuen allinich yn typyske Microsporidia bewarre wurde, mar ôfwêzich yn oare eukaryoten, ynklusyf atypyske Microsporidia Mitosporidium en Amphiamblys, wêryn it ES39L rRNA-fragmint net fermindere is 44, 45, 45c (Fig.-e).
Mei-elkoar stypje dizze gegevens it idee dat E. cuniculi en mooglik oare kanonike mikrosporidia de mooglikheid hawwe ûntwikkele om effisjint grutte oantallen lytse metabolites yn 'e ribosomstruktuer te fangen om te kompensearjen foar de delgong yn rRNA- en proteinnivo's.Dêrby hawwe se in unyk fermogen ûntwikkele om nukleotiden bûten it ribosoom te binen, wat docht bliken dat parasitêre molekulêre struktueren kompensearje troch oerfloedich lytse metabolites te fangen en se te brûken as strukturele mimiken fan ôfbrutsen RNA- en proteïnefragminten..
It tredde unsimulearre diel fan ús cryo-EM-kaart, fûn yn 'e grutte ribosomale subunit.De relatyf hege resolúsje (2,6 Å) fan ús kaart suggerearret dat dizze tichtheid heart ta aaiwiten mei unike kombinaasjes fan grutte sydketen residuen, dy't tastien ús te identifisearjen dizze tichtheid as in earder ûnbekend ribosomale aaiwyt dat wy identifisearre as It waard neamd msL2 (Microsporidia-spesifike proteïne L2) (metoaden, figuer 6).Us homology-sykjen liet sjen dat msL2 bewarre bleaun is yn 'e Microsporidia-klade fan' e genus Encephaliter en Orosporidium, mar ôfwêzich yn oare soarten, ynklusyf oare Microsporidia.Yn 'e ribosomale struktuer beslacht msL2 in gat foarme troch it ferlies fan it útwreide ES31L rRNA.Yn dizze leechte helpt msL2 it rRNA-foldjen te stabilisearjen en kin it ferlies fan ES31L kompensearje (figuer 6).
in Elektrontensiteit en model fan it Microsporidia-spesifike ribosomale proteïne msL2 fûn yn E. cuniculi-ribosomen.b De measte eukaryote ribosomen, ynklusyf de 80S ribosomen fan Saccharomyces cerevisiae, hawwe ES19L rRNA amplification ferlern yn de measte Microsporidian soarten.De earder fêststelde struktuer fan it V. necatrix microsporidia ribosom suggerearret dat it ferlies fan ES19L yn dizze parasiten kompensearre wurdt troch de evolúsje fan it nije msL1 ribosomale proteïne.Yn dizze stúdzje fûnen wy dat it E. cuniculi-ribosoom ek in ekstra ribosomale RNA-mimikprotein ûntwikkele as in skynbere kompensaasje foar it ferlies fan ES19L.msL2 (op it stuit annotearre as it hypotetysk ECU06_1135 proteïne) en msL1 hawwe lykwols ferskillende strukturele en evolúsjonêre oarsprong.c Dizze ûntdekking fan 'e generaasje fan evolúsjonêr net-relatearre msL1- en msL2-ribosomale proteïnen suggerearret dat as ribosomen skealike mutaasjes yn har rRNA sammelje, se ungewoane nivo's fan komposysjeferskaat kinne berikke yn sels in lytse subset fan nau besibbe soarten.Dizze ûntdekking koe helpe te ferdúdlikjen de oarsprong en evolúsje fan it mitochondriale ribosoom, dat is bekend om syn sterk fermindere rRNA en abnormale fariabiliteit yn proteïne gearstalling oer soarten.
Wy fergelike dan it msL2-proteïne mei it earder beskreaune msL1-proteïne, it ienige bekende mikrosporidia-spesifike ribosomale proteïne fûn yn it V. necatrix-ribosom.Wy woenen testen oft msL1 en msL2 evolúsjonêr besibbe binne.Us analyze liet sjen dat msL1 en msL2 deselde holte yn 'e ribosomale struktuer besette, mar hawwe ferskillende primêre en tertiêre struktueren, wat har ûnôfhinklike evolúsjonêre oarsprong oanjout (figuer 6).Sa jout ús ûntdekking fan msL2 bewiis dat groepen kompakte eukaryote soarten selsstannich struktureel ûnderskate ribosomale proteïnen kinne ûntwikkelje om it ferlies fan rRNA-fragminten te kompensearjen.Dizze fynst is opmerklik yn dat de measte cytoplasmyske eukaryotyske ribosomen in ûnferoarlik proteïne befetsje, ynklusyf deselde famylje fan 81 ribosomale proteïnen.It uterlik fan msL1 en msL2 yn ferskate clades fan microsporidia yn reaksje op it ferlies fan útwreide rRNA-segminten suggerearret dat degradaasje fan 'e molekulêre arsjitektuer fan' e parasiten feroarsaket dat parasiten kompensearjende mutaasjes sykje, dy't úteinlik liede kinne ta har oankeap yn ferskate parasytpopulaasjes.struktueren.
Uteinlik, doe't ús model foltôge wie, fergelike wy de gearstalling fan it E. cuniculi-ribosoom mei dat foarsein út 'e genoomsekwinsje.Ferskate ribosomale aaiwiten, wêrûnder eL14, eL38, eL41 en eS30, waarden earder tocht te ûntbrekken yn it E. cuniculi-genoom troch it skynbere ûntbrekken fan har homologen út it E. cuniculi-genoom.Ferlies fan in protte ribosomale aaiwiten wurdt ek foarsein yn de measte oare sterk fermindere intracellular parasiten en endosymbionts.Bygelyks, hoewol de measte frije libbene baktearjes deselde famylje fan 54 ribosomale aaiwiten befetsje, hawwe mar 11 fan dizze proteïnefamyljes detectable homologen yn elk analysearre genoom fan host-beheinde baktearjes.As stipe fan dit begryp is in ferlies fan ribosomale proteïnen eksperiminteel waarnommen yn V. necatrix en P. locustae microsporidia, dy't de eL38- en eL4131,32-proteinen misse.
Us struktueren litte lykwols sjen dat allinich eL38, eL41 en eS30 eins ferlern binne yn it E. cuniculi-ribosom.It eL14-proteïne waard bewarre en ús struktuer liet sjen wêrom't dit proteïne net fûn wurde koe yn 'e homology-sykjen (Fig. 7).Yn E. cuniculi ribosomen, it grutste part fan de eL14 binende site wurdt ferlern troch degradaasje fan de rRNA-amplified ES39L.By it ûntbrekken fan ES39L ferlear eL14 it measte fan syn sekundêre struktuer, en mar 18% fan 'e eL14-sekwinsje wie identyk yn E. cuniculi en S. cerevisiae.Dit minne folchoarderbehâld is opmerklik, om't sels Saccharomyces cerevisiae en Homo sapiens - organismen dy't 1,5 miljard jier útinoar evoluearren - mear as 51% fan deselde resten diele yn eL14.Dit abnormale ferlies fan behâld ferklearret wêrom't E. cuniculi eL14 op it stuit annotearre wurdt as it putative M970_061160 proteïne en net as it eL1427 ribosomale proteïne.
en De Microsporidia ribosom ferlear de ES39L rRNA útwreiding, dy't foar in part eliminearre de eL14 ribosomale proteïne binding site.By it ûntbrekken fan ES39L ûndergiet it eL14 mikrosporeprotein in ferlies fan sekundêre struktuer, wêrby't de eardere rRNA-binende α-helix degenerearret yn in lus mei minimale lingte.b Meardere folchoarder alignment lit sjen dat de eL14 proteïne is tige konservearre yn eukaryote soarten (57% folchoarder identiteit tusken gist en minsklike homologues), mar min konservearre en divergent yn microsporidia (wêryn net mear as 24% fan resten binne identyk oan de eL14 homologue).fan S. cerevisiae of H. sapiens).Dizze minne folchoarderbehâld en fariabiliteit fan sekundêre struktuer ferklearret wêrom't de eL14-homolooch nea fûn is yn E. cuniculi en wêrom't dit proteïne nei alle gedachten ferlern gien is yn E. cuniculi.Yn tsjinstelling, E. cuniculi eL14 waard earder annotearre as in putative M970_061160 proteïne.Dizze waarnimming suggerearret dat mikrosporidia genoomferskaat op it stuit oerskatte wurdt: guon genen dy't op it stuit tocht wurde ferlern te gean yn mikrosporidia binne feitlik bewarre bleaun, hoewol yn tige differinsearre foarmen;ynstee, guon wurde tocht te koade foar microsporidia genen foar wjirm-spesifike aaiwiten (bygelyks, de hypotetysk aaiwyt M970_061160) eins koade foar de hiel ferskaat aaiwiten fûn yn oare eukaryoten.
Dizze fynst suggerearret dat rRNA-denaturaasje kin liede ta in dramatysk ferlies fan folchoarderbehâld yn neistlizzende ribosomale aaiwiten, wêrtroch dizze aaiwiten net te detektearjen binne foar homologyske sykopdrachten.Sa kinne wy ​​​​de eigentlike graad fan molekulêre degradaasje yn lytse genoomorganismen oerskatte, om't guon aaiwiten dy't tocht wurde ferlern te wêzen, eins oanhâlde, al binne se yn sterk feroare foarmen.
Hoe kinne parasiten de funksje fan har molekulêre masines behâlde ûnder betingsten fan ekstreme genoomreduksje?Us stúdzje beantwurdet dizze fraach troch it beskriuwen fan de komplekse molekulêre struktuer (ribosome) fan E. cuniculi, in organisme mei ien fan 'e lytste eukaryotyske genomen.
It is al hast twa desennia bekend dat proteïne- en RNA-molekulen yn mikrobiele parasiten faak ferskille fan har homologe molekulen yn frij-libjende soarten, om't se gjin kwaliteitskontrôlesintra hawwe, wurde fermindere ta 50% fan har grutte yn frijlibjende mikroben, ensfh.in protte slopende mutaasjes dy't it foldjen en funksje beynfloedzje.Bygelyks, de ribosomen fan lytse genome organismen, ynklusyf in protte intracellular parasiten en endosymbionts, wurdt ferwachte te ûntbrekken ferskate ribosomale aaiwiten en oant ien tredde fan rRNA nucleotides fergelike mei frij-libjende soarten 27, 29, 30, 49. Lykwols, de wize dy't dizze molekulen funksjonearje benammen in mystery troch kompatibiliteit bliuwt in parasyt studearje.
Us stúdzje lit sjen dat de struktuer fan makromolekulen in protte aspekten fan evolúsje iepenbierje kinne dy't lestich binne te ekstrahearjen út tradisjonele ferlykjende genomyske stúdzjes fan intrazellulêre parasiten en oare host-beheinde organismen (Supplementary Fig. 7).Bygelyks, it foarbyld fan it eL14-protein lit sjen dat wy de eigentlike graad fan degradaasje fan it molekulêre apparaat yn parasitêre soarten oerskatte kinne.Encephalityske parasiten wurde no leaud dat se hûnderten mikrosporidia-spesifike genen hawwe.Us resultaten litte lykwols sjen dat guon fan dizze skynber spesifike genen eins gewoan hiel ferskillende farianten binne fan genen dy't gewoan binne yn oare eukaryoten.Boppedat lit it foarbyld fan it msL2-proteïne sjen hoe't wy nije ribosomale proteïnen oersjen en de ynhâld fan parasitêre molekulêre masines ûnderskatte.It foarbyld fan lytse molekulen lit sjen hoe't wy de meast geniale ynnovaasjes kinne oersjen yn parasitêre molekulêre struktueren dy't har nije biologyske aktiviteit jaan kinne.
Mei-inoar ferbetterje dizze resultaten ús begryp fan 'e ferskillen tusken de molekulêre struktueren fan host-beheinde organismen en har tsjinhingers yn frij-libjende organismen.Wy litte sjen dat molekulêre masines, lang tocht wurde fermindere, degenerearre, en ûnderwurpen oan ferskate slopende mutaasjes, ynstee hawwe in set fan systematysk oersjoen ûngewoane strukturele funksjes.
Oan 'e oare kant suggerearje de net-bulky rRNA-fragminten en fusearre fragminten dy't wy fûnen yn' e ribosomen fan E. cuniculi dat genoomreduksje sels dy dielen fan 'e basismolekulêre masines kin feroarje dy't bewarre wurde yn' e trije domeinen fan it libben - nei hast 3,5 miljard jier.ûnôfhinklike evolúsje fan soarten.
De bulgefrije en fusearre rRNA-fragminten yn E. cuniculi-ribosomen binne fan bysûnder belang yn it ljocht fan eardere stúdzjes fan RNA-molekulen yn endosymbiotyske baktearjes.Bygelyks, yn 'e aphid endosymbiont Buchnera aphidicola, rRNA- en tRNA-molekulen hawwe bliken dien te hawwen temperatuer-gefoelige struktueren fanwege A + T gearstalling bias en in heech oanpart fan net-kanonike basis pearen20,50.Dizze feroaringen yn RNA, lykas feroaringen yn proteïnemolekulen, wurde no tocht dat se ferantwurdlik binne foar de oerôfhinklikens fan endosymbionts op partners en it ûnfermogen fan endosymbionts om waarmte 21, 23 oer te bringen.Hoewol't parasitêr microsporidia rRNA hat struktureel ûnderskate feroarings, suggerearret de aard fan dizze feroarings dat fermindere termyske stabiliteit en hegere ôfhinklikens fan chaperone aaiwiten meie wêze mienskiplike skaaimerken fan RNA molekulen yn organismen mei redusearre genomen.
Oan 'e oare kant litte ús struktueren sjen dat parasytmikrosporidia in unyk fermogen hawwe ûntwikkele om wiidweidich bewarre rRNA- en proteïnfragminten te wjerstean, it ûntwikkeljen fan de mooglikheid om oerfloedige en maklik beskikbere lytse metaboliten te brûken as strukturele mimiken fan ûntaarde rRNA- en proteïnefragminten.Molekulêre struktuer degradaasje..Dizze miening wurdt stipe troch it feit dat lytse molekulen dy't kompensearje foar it ferlies fan proteïnefragminten yn 'e rRNA en ribosomen fan E. cuniculi bine oan mikrosporidia-spesifike resten yn' e uL15- en eL30-proteinen.Dit suggerearret dat it binen fan lytse molekulen oan ribosomen in produkt wêze kin fan positive seleksje, wêrby't Microsporidia-spesifike mutaasjes yn ribosomale aaiwiten binne selektearre foar har fermogen om de affiniteit fan ribosomen foar lytse molekulen te fergrutsjen, wat liede kin ta effisjintere ribosomale organismen.De ûntdekking ûntbleatet in tûke ynnovaasje yn 'e molekulêre struktuer fan mikrobiële parasiten en jout ús in better begryp fan hoe't parasyt molekulêre struktueren har funksje behâlde nettsjinsteande reduktive evolúsje.
Op it stuit bliuwt de identifikaasje fan dizze lytse molekulen ûndúdlik.It is net dúdlik wêrom't it ferskinen fan dizze lytse molekulen yn 'e ribosomale struktuer ferskilt tusken mikrosporidia-soarten.Benammen is it net dúdlik wêrom't nukleotidebinding yn 'e ribosomen fan E. cuniculi en P. locustae beoardiele wurdt, en net yn' e ribosomen fan V. necatrix, nettsjinsteande de oanwêzigens fan it F170-residinsje yn 'e eL20- en K172-proteinen fan V. necatrix.Dizze deletion kin feroarsake wurde troch residu 43 uL6 (lizzend neist de nukleotide-binende pocket), dat is tyrosine yn V. necatrix en net threonine yn E. cuniculi en P. locustae.De bulk aromaatyske sydketen fan Tyr43 kin ynterferearje mei nukleotidebinding fanwege steryske oerlap.As alternatyf kin de skynbere nukleotide-deletion wêze troch de lege resolúsje fan kryo-EM-ôfbylding, dy't de modellering fan V. necatrix ribosomale fragminten hinderet.
Oan 'e oare kant suggerearret ús wurk dat it proses fan genoomferfal in ynventive krêft kin wêze.Benammen de struktuer fan 'e E. cuniculi-ribosome suggerearret dat it ferlies fan rRNA- en proteïnefragminten yn' e microsporidia-ribosom evolúsjonêre druk skept dy't feroaringen yn 'e ribosomstruktuer befoarderet.Dizze farianten komme fier fan 'e aktive side fan' e ribosoom foar en lykje te helpen te behâlden (of te herstellen) optimale ribosomassemblage dy't oars fersteurd wurde soe troch fermindere rRNA.Dit suggerearret dat in grutte ynnovaasje fan 'e microsporidia ribosome liket te hawwen evoluearre yn in needsaak om gendrift te bufferen.
Faaks wurdt dit it bêste yllustrearre troch nukleotidebinding, dy't oant no ta noch nea waarnommen is by oare organismen.It feit dat nukleotide-ferbinende resten oanwêzich binne yn typyske mikrosporidia, mar net yn oare eukaryoten, suggerearret dat nukleotide-binende plakken net allinich reliken binne dy't wachtsje om te ferdwinen, of de definitive side foar rRNA om te restaurearjen yn 'e foarm fan yndividuele nukleotiden.Ynstee, dizze side liket as in nuttige funksje dy't koe hawwe evoluearre oer ferskate rondes fan positive seleksje.Nukleotide-binende plakken kinne in byprodukt wêze fan natuerlike seleksje: as ES39L ienris degradearre is, wurde mikrosporidia twongen om kompensaasje te sykjen om optimale ribosombiogenese te herstellen yn 'e ôfwêzigens fan ES39L.Om't dit nukleotide de molekulêre kontakten fan it A3186-nukleotide yn ES39L kin mimike, wurdt it nukleotidemolekule in boublok fan it ribosom, wêrfan de bining fierder ferbettere wurdt troch mutaasje fan 'e eL30-sekwinsje.
Oangeande de molekulêre evolúsje fan intracellular parasiten, ús stúdzje lit sjen dat de krêften fan Darwinian natuerlike seleksje en genetyske drift fan genome ferfal net wurkje parallel, mar oscillere.Earst elimineert genetyske drift wichtige skaaimerken fan biomolekulen, wêrtroch kompensaasje sa nedich is.Allinnich as parasiten dizze need befredigje troch Darwinske natuerlike seleksje, sille har makromolekulen in kâns hawwe om har meast yndrukwekkende en ynnovative eigenskippen te ûntwikkeljen.Wichtich is dat de evolúsje fan nukleotide-binende plakken yn 'e E. cuniculi-ribosoom suggerearret dat dit ferlies-oan-winst-patroan fan molekulêre evolúsje net allinich skealike mutaasjes amortisearret, mar soms folslein nije funksjes oan parasitêre makromolekulen jout.
Dit idee is yn oerienstimming mei Sewell Wright's bewegende lykwichtsteory, dy't stelt dat in strang systeem fan natuerlike seleksje it fermogen fan organismen om te ynnovearjen beheint51,52,53.As genetyske drift lykwols natuerlike seleksje fersteurt, kinne dizze driften feroaringen produsearje dy't op himsels net oanpasber (of sels skealik) binne, mar liede ta fierdere feroarings dy't in hegere fitness as nije biologyske aktiviteit leverje.Us ramt stipet dit idee troch te yllustrearjen dat deselde soarte mutaasje dy't de fold en funksje fan in biomolekule ferminderet, de wichtichste trigger liket te wêzen foar har ferbettering.Yn oerienstimming mei it win-win evolúsjonêre model, ús stúdzje lit sjen dat genome ferfal, tradisjoneel sjoen as in degenerative proses, is ek in wichtige driuwfear fan ynnovaasje, soms en faaks sels faak tastean makromolekulen te krijen nije parasitêr aktiviteiten.kinne se brûke.