Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.Jo brûke in browserferzje mei beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder stilen en JavaScript.
Toant in karrousel fan trije dia's tagelyk.Brûk de knoppen Foarige en Folgjende om troch trije dia's tagelyk te bewegen, of brûk de sliderknoppen oan 'e ein om troch trije dia's tagelyk te bewegen.
De bloed-harsensbarriêre en de bloed-harsensbarriêre foarkomme dat bioterapeutyske aginten har doelen yn it sintrale senuwstelsel berikke, en hinderje dêrmei effektive behanneling fan neurologyske sykten.Om nije harsentransporters yn vivo te ûntdekken, yntrodusearren wy in T7-faag-peptidebibleteek en serieel sammele bloed en cerebrospinale floeistof (CSF) mei in kanulearre bewust grut swimbadmodel fan rotten.Spesifike fage klonen waarden tige ferrike yn CSF nei fjouwer rondes fan seleksje.Testen fan yndividuele kandidaat-peptiden iepenbiere mear dan 1000-fâldige ferriking yn CSF.De bioaktiviteit fan 'e peptide-bemiddele levering nei it harsens waard befêstige troch in 40% reduksje yn it nivo fan amyloïde-β yn' e cerebrospinale floeistof mei in BACE1-peptide-ynhibitor keppele oan it identifisearre nije transitpeptide.Dizze resultaten suggerearje dat de peptiden identifisearre troch in vivo fage-seleksjemetoaden brûkbere auto's kinne wêze foar systemyske levering fan makromolekulen nei it harsens mei in therapeutysk effekt.
Sintraal nervous systeem (CNS) rjochte terapyûndersyk hat foar it grutste part rjochte op it identifisearjen fan optimalisearre medisinen en aginten dy't CNS-targeting-eigenskippen fertoane, mei minder ynspanning om de meganismen te ûntdekken dy't aktive medisynlevering nei it harsens driuwe.Dit begjint no te feroarjen, om't medisynlevering, foaral grutte molekulen, in yntegraal diel is fan moderne neuroscience-medisynûntwikkeling.De omjouwing fan it sintrale senuwstelsel is goed beskerme troch it cerebrovaskulêre barriêresysteem, besteande út de bloed-harsensbarriêre (BBB) ​​en de bloed-harsensbarriêre (BCBB)1, wêrtroch it útdaagjend is om medisinen oan it brein te leverjen1,2.It wurdt rûsd dat hast alle medisinen mei grutte molekulen en mear as 98% fan medisinen mei lytse molekulen út it brein wurde eliminearre3.Dêrom is it heul wichtich om nije harsensferfiersystemen te identifisearjen dy't effisjinte en spesifike levering fan therapeutyske medisinen leverje oan it CNS 4,5.De BBB en BCSFB presintearje lykwols ek in poerbêste kâns foar medisynferliening, om't se alle struktueren fan it harsens penetrearje en ynfiere troch har wiidweidige vasculature.Sa binne de hjoeddeistige ynspanningen om net-invasive metoaden fan levering oan it harsens te brûken foar in grut part basearre op it meganisme fan receptor-mediated transport (PMT) mei de endogenous BBB6-receptor.Nettsjinsteande resinte wichtige foarútgong mei it brûken fan it transferrinreceptorpaad7,8, is fierdere ûntwikkeling fan nije leveringssystemen mei ferbettere eigenskippen fereaske.Dêrta wie ús doel om peptiden te identifisearjen dy't yn steat binne om CSF-ferfier te bemiddeljen, om't se yn prinsipe kinne wurde brûkt om makromolekulen oan it CNS te leverjen of om nije reseptorpaden te iepenjen.Benammen spesifike receptors en transporters fan it cerebrovaskulêre systeem (BBB en BSCFB) kinne as potinsjele doelen tsjinje foar de aktive en spesifike levering fan biotherapeutyske medisinen.Cerebrospinale floeistof (CSF) is in sekretarisprodukt fan 'e choroid plexus (CS) en is yn direkt kontakt mei de interstitiale floeistof fan' e harsens troch de subarachnoïde romte en ventrikulêre romte4.Koartlyn is oantoand dat subarachnoïde cerebrospinale floeistof oermjittich diffundearret yn it ynterstitium fan 'e harsens9.Wy hoopje tagong te krijen ta de parenchymale romte mei dit subarachnoïde ynstreamkanaal of direkt fia de BBB.Om dit te berikken hawwe wy in robúste in vivo faagseleksjestrategy ymplementearre dy't ideaal identifisearret peptiden dy't troch ien fan dizze twa ûnderskate paden transportearre wurde.
Wy beskriuwe no in sekwinsjele in vivo faag-werjefte-screeningmetoade mei CSF-sampling keppele mei hege trochput-sekwinsje (HTS) om inisjele seleksjerondes te kontrolearjen mei it heechste biblioteekferskaat.Screening waard útfierd op bewuste rotten mei in permanint ymplantearre grutte cisterna (CM) kanule om bloedkontaminaasje te foarkommen.Wichtich selekteart dizze oanpak sawol harsensrjochting as peptiden mei transportaktiviteit oer de cerebrovaskulêre barriêre.Wy brûkten T7-fagen fanwegen har lytse grutte (~ 60 nm)10 en suggereare dat se geskikt binne foar it ferfier fan vesikels dy't transzellulêre krusing fan 'e endotheliale en / of epitheliale-medulla-barriêre mooglik meitsje.Nei fjouwer rûnen fan panning waarden faagpopulaasjes isolearre mei sterke in vivo CSF-ferriking en cerebral microvessel-feriening.Wichtich wiene wy ​​​​yn steat om ús befiningen te befestigjen troch te demonstrearjen dat de foarkar en gemysk synthesisearre bêste kandidaat-peptiden yn steat binne om proteïnelading yn 'e cerebrospinale floeistof te ferfieren.Earst waarden de farmakodynamyske effekten fan it CNS fêststeld troch it kombinearjen fan in liedend transitpeptide mei in ynhibitor fan it BACE1-peptide.Njonken it demonstrearjen dat in vivo funksjonele screeningstrategyen nije braintransportpeptiden kinne identifisearje as effektive proteïnefrachtdragers, ferwachtsje wy dat ferlykbere funksjonele seleksjebenaderingen ek wichtich wurde by it identifisearjen fan nije harsentransportpaden.
Op grûn fan plaque-foarmjende ienheden (PFU), nei de faag-ferpakkingstap, waard in bibleteek fan willekeurige 12-mer lineêre T7-faagpeptiden mei in ferskaat fan sawat 109 ûntwurpen en makke (sjoch Materialen en metoaden).It is wichtich om te notearjen dat wy dizze bibleteek soarchfâldich analysearren foardat in vivo panning.PCR-amplifikaasje fan fagebibleteekmonsters mei help fan modifisearre primers generearre amplicons dy't direkt fan tapassing wiene op HTS (Supplementary Fig. 1a).Troch a) HTS11 sequencing flaters, b) ynfloed op de kwaliteit fan primers (NNK) 1-12, en c) de oanwêzigens fan wyld-type (wt) phage (skelet Inserts) yn 'e standby bibleteek, in folchoarder filtering proseduere waard ymplemintearre te extract allinnich ferifiearre folchoarder ynformaasje (oanfoljende Fig. 1b).Dizze filterstappen jilde foar alle HTS-sekwinsjebiblioteken.Foar de standertbibleteek waarden in totaal fan 233.868 lêzen krigen, wêrfan 39% de filterkritearia passe en waarden brûkt foar biblioteekanalyse en seleksje foar folgjende rûndes (oanfoljende figuer 1c–e).De lêzings wiene foaral multiples fan 3 base pearen yn 'e lingte mei in peak op 36 nucleotides (Supplementary Fig. 1c), befêstigje it bibleteek ûntwerp (NNK) 1-12.Opmerklik befette sawat 11% fan 'e bibleteekleden in 12-diminsjonale wyldtype (wt) rêchbonke PAGISRELVDKL-ynfoegje, en hast de helte fan' e sekwinsjes (49%) befette ynfoegings of deletions.De HTS fan 'e bibleteekbibleteek befêstige de hege ferskaat oan peptiden yn' e bibleteek: mear as 81% fan peptide-sekwinsjes waarden mar ien kear fûn en allinich 1.5% barde yn ≥4 eksimplaren (Supplementary Fig. 2a).De frekwinsjes fan aminosoeren (aa) op alle 12-posysjes yn it repertoire korrelearren goed mei de frekwinsjes dy't ferwachte wurde foar it oantal codons generearre troch it degenerearre NKK-repertoire (Supplementary Fig. 2b).De waarnommen frekwinsje fan aa-residuen kodearre troch dizze ynserts korrelearre goed mei de berekkene frekwinsje (r = 0,893) (oanfoljende Fig. 2c).De tarieding fan faagbiblioteken foar ynjeksje omfettet de stappen fan amplifikaasje en fuortheljen fan endotoxine.Dit is earder oantoand om it ferskaat oan faagbiblioteken mooglik te ferminderjen12,13.Dêrom sekuerden wy in plaat-amplified faagbibleteek dy't endotoxine-ferwidering hie ûndergien en fergelike it mei de orizjinele biblioteek om de frekwinsje fan AA te skatten.In sterke korrelaasje (r = 0.995) waard waarnommen tusken it orizjinele swimbad en it fersterke en suvere swimbad (Supplementary Fig. 2d), wat oanjout dat konkurrinsje tusken klonen fersterke op platen mei T7-faag gjin grutte bias feroarsake.Dizze fergeliking is basearre op 'e frekwinsje fan tripeptide-motiven yn elke bibleteek, om't it ferskaat oan biblioteken (~ 109) sels net mei HTS folslein fêstlein wurde kin.Frekwinsje analyze fan aa op elke posysje die bliken in lytse posysje-ôfhinklike bias yn de lêste trije posysjes fan it ynfierd repertoire (oanfoljende Fig. 2e).As konklúzje konkludearren wy dat de kwaliteit en ferskaat fan 'e bibleteek akseptabel wiene en allinich lytse feroaringen yn ferskaat waarden beoardiele troch amplifikaasje en tarieding fan fagebiblioteken tusken ferskate rûnten fan seleksje.
Serial cerebrospinal fluid sampling kin útfierd wurde troch sjirurgysk ymplantearjen fan in kanule yn 'e CM fan bewuste rotten om identifikaasje te fasilitearjen fan T7 phage ynjeksje yntravenous (iv) fia de BBB en / of BCSFB (Fig. 1a-b).Wy brûkten twa ûnôfhinklike seleksjewapens (wapens A en B) yn 'e earste trije rûnen fan in vivo seleksje (fig. 1c).Wy hawwe de stringens fan 'e seleksje stadichoan ferhege troch it ferminderjen fan it totale bedrach fan faag yntrodusearre yn' e earste trije rondes fan seleksje.Foar de fjirde ronde fan panning kombinearren wy samples út tûken A en B en fierden trije ekstra ûnôfhinklike seleksjes.Om de in vivo-eigenskippen fan T7-faagdieltsjes yn dit model te studearjen, waard wylde-type faag (PAGISRELVDKL-master-ynfoegje) yn ratten fia de sturt ynjeksje.Herstel fan fagen út cerebrospinale floeistof en bloed op ferskate tiidpunten die bliken dat relatyf lytse T7 icosahedral fagen in flugge initial klaring faze fan it bloed compartment (Supplementary Fig. 3).Op grûn fan de administreare titers en it bloedvolumint fan 'e ratten, hawwe wy berekkene dat allinich sawat 1% wt.phage út de administraasje doasis waard ûntdutsen yn it bloed 10 minuten nei intravenous ynjeksje.Nei dizze earste rappe delgong waard in stadiger primêre klaring mjitten mei in heale libben fan 27.7 minuten.Wichtich, mar in pear fagen waarden ophelle út it CSF-kompartment, wat oanjout op in lege eftergrûn foar wylde-type fage-migraasje yn it CSF-kompartement (oanfoljende Fig. 3).Yn trochsneed waarden allinich sawat 1 x 10-3% titers fan T7-faag yn it bloed en 4 x 10-8% fan ynearsten infusearre fagen ûntdutsen yn 'e cerebrospinale floeistof oer de hiele samplingperioade (0-250 min).Opmerklik wie de heale-libben (25.7 min) fan wyld-type faag yn cerebrospinale floeistof fergelykber mei dy waarnommen yn bloed.Dizze gegevens litte sjen dat de barriêre dy't it CSF-fak skiedt fan it bloed yntakt is yn CM-kanulearre ratten, wêrtroch in vivo seleksje fan faagbiblioteken mooglik makket om klonen te identifisearjen dy't maklik wurde ferfierd fan it bloed nei it CSF-kompartement.
(a) It ynstellen fan in metoade foar re-sampling cerebrospinale floeistof (CSF) út in grut swimbad.(b) Diagram dat de sellulêre lokaasje fan 'e barriêre fan it sintrale senuwstelsel (CNS) toant en de seleksjestrategy brûkt om peptiden te identifisearjen dy't de bloed-harsensbarriêre (BBB) ​​en de bloed-harsensbarriêre oerstekke.(c) In vivo phage display screening flowchart.Yn elke ronde fan seleksje waarden fagen (dieridentifikatoren binnen de pylken) intraveneus ynjeksje.Twa ûnôfhinklike alternative tûken (A, B) wurde apart bewarre oant de 4e seleksjeronde.Foar seleksjerûnen 3 en 4 waard elke faagkloon ekstrahearre út CSF manuell sequearre.(d) Kinetika fan fage isolearre fan bloed (reade sirkels) en cerebrospinale floeistof (griene trijehoeken) yn 'e earste ronde fan seleksje yn twa kanulearre ratten nei intravenous ynjeksje fan' e T7-peptidebibleteek (2 x 1012 fagen / bist).Blauwe fjilden jouwe de gemiddelde initial konsintraasje fan faag yn it bloed, berekkene út it bedrach fan ynjeksje faag, rekken hâldend mei it totale bloed folume.De swarte fjilden jouwe it krúspunt oan fan 'e y-line ekstrapolearre út bloedfaagkonsintraasjes.(e, f) Presintearje de relative frekwinsje en ferdieling fan alle mooglike oerlappende tripeptide motiven fûn yn it peptide.It oantal motiven fûn yn 1000 lêzingen wurdt werjûn.Signifikant (p <0,001) binne ferrike motiven markearre mei reade stippen.(e) Korrelaasje scatterplot fergeliket de relative frekwinsje fan it tripeptide motyf fan de ynjeksje bibleteek mei bloed-ôflaat faag fan bisten #1.1 en #1.2.(f) Korrelaasje scatterplot fergelike mei de relative frekwinsjes fan bist faag tripeptide motiven #1.1 en #1.2 isolearre yn bloed en cerebrospinale floeistof.(g, h) Sequence ID-fertsjintwurdiging fan faag ferrike yn bloed (g) tsjin ynjeksjede biblioteken en faag ferrike yn CSF (h) fersus bloed nei in ronde fan in vivo seleksje yn beide bisten.De grutte fan de ien-letter koade jout oan hoe faak dat aminosoer foarkomt op dy posysje.Grien = poal, pears = neutraal, blau = basis, read = soer en swart = hydrofobe aminosoeren.Figure 1a, b waard ûntwurpen en produsearre troch Eduard Urich.
Wy ynjeksje in faag peptide bibleteek yn twa CM ynstrumint rotten (kladen A en B) en isolearre faag út cerebrospinale floeistof en bloed (figuer 1d).De earste rappe klaring fan 'e bibleteek wie minder útsprutsen yn ferliking mei de wyldtype faag.De gemiddelde heale-libben fan 'e ynjeksjede bibleteek yn beide bisten wie 24.8 minuten yn bloed, fergelykber mei wyldtype faag, en 38.5 minuten yn CSF.Bloed- en cerebrospinale fluid-faagmonsters fan elk bist waarden ûnderwurpen oan HTS en alle identifisearre peptiden waarden analysearre foar de oanwêzigens fan in koart tripeptide-motyf.Tripeptide-motiven waarden keazen om't se in minimale basis leverje foar struktuerfoarming en peptide-protein-ynteraksjes14,15.Wy fûnen in goede korrelaasje yn 'e distribúsje fan motiven tusken de ynjeksjede faagbibleteek en klonen dy't út it bloed fan beide bisten ekstrahearre binne (Fig. 1e).De gegevens jouwe oan dat de gearstalling fan 'e bibleteek mar mar mar in bytsje ferrike is yn it bloedfak.Amino acid frekwinsjes en konsensus sekwinsjes waarden fierder analysearre op elke posysje mei help fan in oanpassing fan de Weblogo16 software.Ynteressant fûnen wy in sterke ferriking yn bloed glycine residuen (Fig. 1g).Doe't bloed waard fergelike mei klonen selektearre út CSF, sterke seleksje en wat deseleksje fan motiven waarden waarnommen (Fig. 1f), en bepaalde aminosoeren wiene foarkar oanwêzich op foarbeskaaide posysjes yn de 12-lid (Fig. 1h).Opmerklik, yndividuele bisten ferskille signifikant yn cerebrospinale floeistof, wylst bloed glycine ferriking waard waarnommen yn beide bisten (Supplementary Fig. 4a-j).Nei stringende filterjen fan folchoardergegevens yn 'e cerebrospinale floeistof fan bisten #1.1 en #1.2, waarden in totaal fan 964 en 420 unike 12-mer-peptiden krigen (Supplementary Fig. 1d-e).De isolearre faagklonen waarden fersterke en ûnderwurpen oan in twadde ronde fan in vivo seleksje.Phage út 'e twadde ronde fan seleksje waarden ûnderwurpen oan HTS yn elk dier en alle identifisearre peptiden waarden brûkt as ynput foar in motyf-erkenningsprogramma om it foarkommen fan tripeptide-motiven te analysearjen (Fig. 2a, b, ef).Yn ferliking mei de earste syklus fan 'e fage weromfûn út CSF, observearre wy fierdere seleksje en deseleksje fan in protte motiven yn CSF yn tûken A en B (Fig. 2).In netwurk identifikaasje algoritme waard tapast om te bepalen oft se fertsjintwurdige ferskillende patroanen fan konsekwinte folchoarder.In dúdlike oerienkomst waard waarnommen tusken de 12-dimensionale sekwinsjes weromfûn troch CSF yn alternative clade A (fig. 2c, d) en clade B (fig. 2g, h).De gearstalde analyze yn elke branch die bliken ferskate seleksjeprofilen foar 12-mer-peptiden (Supplementary Fig. 5c, d) en in ferheging fan 'e CSF / bloedtiterferhâlding oer de tiid foar poolde klonen nei de twadde ronde fan seleksje yn ferliking mei de earste ronde fan seleksje (Supplementary Fig. 5e).).
Ferriking fan motiven en peptiden yn cerebrospinale floeistof troch twa opienfolgjende rûnten fan in vivo funksjonele faag werjaan seleksje.
Alle cerebrospinale floeistoffagen weromfûn fan 'e earste ronde fan elk dier (bisten #1.1 en #1.2) waarden gearfoege, fersterke, HT-sequence en opnij ynjeksje (2 x 1010 fagen / bist) 2 SM-kanulearre rotten (#1.1 → #).2.1 en 2.2, 1.2 → 2.3 en 2.4).(a, b, e, f) Korrelaasje scatterplots fergelykje de relative frekwinsje fan tripeptide motiven fan alle CSF-ôflaat fagen yn 'e earste en twadde seleksje rûnen.Relative frekwinsje en distribúsje fan motiven dy't alle mooglike oerlappende tripeptiden fertsjintwurdigje fûn yn peptiden yn beide oriïntaasjes.It oantal motiven fûn yn 1000 lêzingen wurdt werjûn.Motiven dy't signifikant (p <0.001) binne selektearre of útsletten yn ien fan 'e fergelike bibleteken wurde markearre mei reade stippen.(c, d, g, h) Sequence logo fertsjintwurdiging fan alle CSF-rike 12 amino acid lange sekwinsjes basearre op rondes 2 en 1 fan in vivo seleksje.De grutte fan de ien-letter koade jout oan hoe faak dat aminosoer foarkomt op dy posysje.Om it logo te fertsjintwurdigjen, wurdt de frekwinsje fan CSF-sekwinsjes helle út yndividuele bisten tusken twa seleksjerondes fergelike en de ferrike sekwinsjes yn 'e twadde ronde wurde toand: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 en (h) #1.2–#2.4.De meast ferrike aminosoeren op in bepaalde posysje yn (c, d) bisten nr.2.1 en nr.2.2 of (g, h) yn bisten nr.2.3 en nr.2.4 wurde werjûn yn kleur.Grien = poal, pears = neutraal, blau = basis, read = soer en swart = hydrofobe aminosoeren.
Nei de tredde ronde fan seleksje identifisearren wy 124 unike peptide-sekwinsjes (#3.1 en #3.2) fan 332 CSF-rekonstitueare faagklonen isolearre fan twa bisten (Supplementary Fig. 6a).De folchoarder LGSVS (18,7%) hie it heechste relatyf oanpart, folge troch de wyldtype-ynserts PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), en SARGSWREIVSLS (2,2%).Yn 'e lêste fjirde omloop hawwe wy twa ûnôfhinklik selekteare tûken út trije aparte bisten (figuer 1c).Fan 'e 925 sequearre faagklonen weromfûn út CSF, fûnen wy yn' e fjirde ronde 64 unike peptidesekwinsjes (Supplementary Fig. 6b), wêrby't it relatyf oanpart fan wyld-type faag sakke nei 0,8%.De meast foarkommende CSF-klonen yn 'e fjirde omloop wiene LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) en RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).It lingteberik fan 'e selekteare peptiden is te tankjen oan nukleotide-ynfoegingen / wiskjes as foartidige stopkodons yn' e bibleteekprimers by it brûken fan ûntaarde codons foar NNK-biblioteekûntwerp.Premature stopkodons generearje koartere peptiden en wurde selektearre om't se it geunstige aa-motyf befetsje.Langere peptiden kinne resultearje út ynserts / deletions yn 'e primers fan' e syntetyske bibleteken.Dit pleatst it ûntwurpen stopkodon bûten it frame en lêst it oant in nije stopkodon streamôfwerts ferskynt.Yn it algemien, wy berekkene ferriking faktoaren foar alle fjouwer seleksje rûndes troch it fergelykjen fan de ynfier gegevens mei de stekproef útfier gegevens.Foar de earste ronde fan screening brûkten wy wylde-type faagtiters as in net-spesifike eftergrûnferwizing.Ynteressant wie negative fage-seleksje tige sterk yn 'e earste CSF-syklus, mar net yn bloed (Fig. 3a), wat kin wêze troch de lege kâns fan passive diffusion fan' e measte leden fan 'e peptidebibleteek yn' e CSF-fak of relative fagen tendearje effisjinter te hâlden of fuorthelle út 'e bloedstream as bakteriofagen.Yn 'e twadde ronde fan panning waard lykwols sterke seleksje fan fagen yn CSF beoardiele yn beide clades, wat suggerearret dat de foarige ronde ferrike waard yn fagen dy't peptiden werjaan dy't CSF-uptake befoarderje (Fig. 3a).Nochris, sûnder signifikante bloedferriking.Ek yn 'e tredde en fjirde rûnen waarden de faagklonen signifikant ferrike yn CSF.Fergelykjen fan de relative frekwinsje fan elke unike peptide-sekwinsje tusken de lêste twa rûnten fan seleksje, fûnen wy dat de sekwinsjes noch mear ferrike waarden yn 'e fjirde ronde fan seleksje (fig. 3b).In totaal fan 931 tripeptide motiven waarden ekstrahearre út alle 64 unike peptide sekwinsjes mei help fan beide peptide oriïntaasjes.De meast ferrike motiven yn 'e fjirde omloop waarden nauwer ûndersocht foar har ferrikingsprofilen oer alle rûnten yn ferliking mei de ynjeksjede bibleteek (cut-off: 10% ferriking) (Supplementary Fig. 6c).Algemiene patroanen fan seleksje lieten sjen dat de measte ûndersochte motiven yn alle foargeande rûnten fan beide seleksjetûken ferrike waarden.Guon motiven (bygelyks SGL, VSG, LGS GSV) wiene lykwols foaral fan alternative klade A, wylst oaren (bygelyks FGW, RTN, WGF, NTR) ferrike waarden yn alternative klade B.
Validaasje fan CSF-transport fan CSF-ferrike faag-werjûn peptiden en biotinylearre liederpeptiden konjugearre oan streptavidin-ladings.
(a) Ferrikingsferhâldingen berekkene yn alle fjouwer rûnten (R1-R4) basearre op ynjeksje (ynput = I) fage (PFU) titers en bepaalde CSF-faagtiters (útfier = O).Ferrikingsfaktoaren foar de lêste trije rûnen (R2-R4) waarden berekkene troch ferliking mei de foarige omloop en de earste omloop (R1) mei gewichtsgegevens.Iepen bars binne cerebrospinale floeistof, skadede bars binne plasma.(***p<0.001, basearre op Student's t-test).(b) List fan 'e meast oerfloedige fagepeptiden, rangearre neffens har relatyf oanpart oan alle fagen sammele yn CSF nei ronde 4 fan seleksje.De seis meast foarkommende faagklonen wurde markearre yn kleur, nûmere en har ferrikingsfaktoaren tusken rûnen 3 en 4 fan seleksje (ynset).(c, d) De seis meast ferrike faag klonen, lege faag en âlder faag peptide bibleteken út rûn 4 waarden yndividueel analysearre yn in CSF sampling model.CSF en bloedmonsters waarden sammele op de oantsjutte tiidpunten.(c) Gelikense hoemannichten fan 6 kandidaat-faag-klonen (2 x 1010 fagen/dieren), lege fagen (#1779) (2 x 1010 fagen/dieren) en faag-peptidebiblioteken fan stock (2 x 1012 fagen/dieren) Ynjeksje op syn minst 3 CM, dy't skieden wurdt troch de sturt administrearre troch dier.De CSF-farmakokinetika fan elke ynjeksjede faagkloon en faagpeptidebibleteek oer de tiid wurdt toand.(d) toant de gemiddelde CSF / bloedferhâlding foar alle herstelde fagen / ml oer de samplingtiid.(e) Fjouwer syntetyske liederpeptiden en ien scrambled kontrôle waarden keppele mei biotine oan streptavidin fia har N-terminus (tetramer display) folge troch ynjeksje (sturt vein iv, 10 mg streptavidin / kg).Op syn minst trije yntubearre rotten (N = 3).).CSF-samples waarden sammele op 'e oantsjutte tiidpunten en streptavidin-konsintraasjes waarden mjitten troch CSF anty-streptavidin ELISA (nd = net ûntdutsen).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, basearre op ANOVA-test).(f) Fergeliking fan 'e aminosoersekwinsje fan' e meast ferrike faagpeptideklon #2002 (poarper) mei oare selekteare faagpeptideklonen út 'e 4e ronde fan seleksje.Identike en ferlykbere aminosoerenfragminten binne kleurkodearre.
Fan alle ferrike fagen yn 'e fjirde ronde (Fig. 3b) waarden seis kandidaat-klonen selektearre foar fierdere yndividuele analyze yn it CSF-samplingmodel.Gelikense bedraggen fan seis kandidaat phage, lege phage (gjin ynfoegje) en profaag peptide biblioteken waarden ynjeksje yn trije cannulated CM bisten, en pharmacokinetics waarden bepaald yn CSF (Fig. 3c) en bloed (Supplementary Fig. 7) assays.Alle ûndersochte fageklonen rjochte it CSF-fak op in nivo 10-1000 kear heger as dat fan 'e lege kontrôlefaag (#1779).Klonen #2020 en #2077 hienen bygelyks sawat 1000 kear hegere CSF-titers dan kontrôlefaag.It farmakokinetyske profyl fan elk selekteare peptide is oars, mar se hawwe allegear in hege CSF-homingfeardigens.Wy observearre in konstante fermindering oer de tiid foar klonen #1903 en #2011, wylst foar klonen #2077, #2002 en #2009 in ferheging yn 'e earste 10 minuten kin oanjaan op aktyf ferfier, mar moat wurde ferifiearre.Klonen #2020, #2002, en #2077 stabilisearren op hege nivo's, wylst de CSF-konsintraasje fan kloon #2009 stadichoan ôfnaam nei de earste ferheging.Wy fergelike dan de relative frekwinsje fan elke CSF-kandidaat mei syn bloedkonsintraasje (Fig. 3d).De korrelaasje fan 'e gemiddelde titer fan elke CSF-kandidaat mei syn bloedtiter op alle samplingtiden liet sjen dat trije fan' e seis kandidaten signifikant ferrike waarden yn bloed CSF.Ynteressant toande kloon #2077 hegere bloedstabiliteit (oanfoljende figuer 7).Om te befêstigjen dat de peptiden sels yn steat binne om oare lading as faagdieltsjes aktyf te ferfieren yn it CSF-fak, hawwe wy fjouwer liederpeptiden derivatisearre mei biotine oan 'e N-terminus dêr't de peptiden hechtsje oan it faagdieltsje.Biotinylearre peptiden (nr. 2002, 2009, 2020 en 2077) waarden konjugearre mei streptavidin (SA) om multimeryske foarmen te krijen dy't in bytsje mimike fan faagmjitkunde.Dit formaat hat ús ek tastien om SA-eksposysje te mjitten yn bloed en cerebrospinale floeistof as lading-transportearjende proteïnepeptiden.Wichtich, faaggegevens koenen faak wurde reprodusearre as synthetyske peptiden yn dit SA-konjugearre formaat administreare waarden (Fig. 3e).De scrambled peptiden hienen minder inisjele eksposysje en flugger CSF-klaring mei net te detektearjen nivo's binnen 48 oeren.Om ynsjoch te krijen yn 'e leveringspaden fan dizze peptidefaagklonen yn' e CSF-romte, analysearren wy de lokalisaasje fan yndividuele faagpeptide-hits mei immunohistochemy (IHC) om faagdieltsjes direkt 1 oere nei intravenous ynjeksje yn vivo te detektearjen.Opmerklik kinne klonen #2002, #2077 en #2009 wurde ûntdutsen troch sterke kleuring yn harsenskapillaren, wylst kontrôlefaag (#1779) en kloon #2020 net waarden ûntdutsen (oanfoljende figuer 8).Dit suggerearret dat dizze peptiden bydrage oan it effekt op it harsens krekt troch it oerstekken fan de BBB.Fierdere detaillearre analyze is nedich om dizze hypoteze te testen, om't de BSCFB-rûte ek belutsen wurde kin.By it fergelykjen fan de aminosoerensekwinsje fan 'e meast ferrike kloan (#2002) mei oare selektearre peptiden, waard opmurken dat guon fan harren ferlykbere aminosoeren-útwreidingen hawwe, wat in ferlykbere transportmeganisme oanjaan kin (fig. 3f).
Troch syn unike plasmaprofyl en signifikante ferheging fan CSF yn 'e rin fan' e tiid, waard phage display clone #2077 fierder ûndersocht oer in langere 48-oere perioade en koe de rappe ferheging fan CSF werjaan yn assosjaasje mei oanhâldende SA-nivo's (Fig. 4a).Oangeande oare identifisearre fage-klonen, kleurde #2077 sterk foar harsens-kapillaren en toande signifikante kolokalisaasje mei kapillêre markerlektine as se besjoen op hegere resolúsje en mooglik wat kleurjen yn 'e parenchymale romte (figuer 4b).Om te ûndersykjen oft peptide-bemiddele pharmakologyske effekten koenen wurde krigen yn 'e CNS, hawwe wy in eksperimint útfierd wêryn biotinylearre ferzjes fan i) it #2077 transitpeptide en ii) it BACE1-ynhibitorpeptide mei SA yn twa ferskillende ferhâldingen mingd waarden.Foar ien kombinaasje brûkten wy allinich de BACE1-peptide-ynhibitor en foar de oare brûkten wy in 1:3-ferhâlding fan BACE1-peptide-ynhibitor nei #2077-peptide.Beide samples waarden yntravenus administreare en bloed- en cerebrospinale floeistofnivo's fan beta-amyloïde peptide 40 (Abeta40) waarden oer de tiid mjitten.Abeta40 waard mjitten yn CSF, om't it BACE1-ynhibysje reflekteart yn it harsensparenchym.Lykas ferwachte, fermindere beide kompleksen signifikant bloednivo's fan Abeta40 (Fig. 4c, d).Lykwols, allinich samples dy't in mingsel fan peptide nr.2077 en in ynhibitor fan it BACE1-peptide konjugearre oan SA feroarsake in signifikante fermindering fan Abeta40 yn 'e cerebrospinale floeistof (fig. 4c).De gegevens litte sjen dat peptide nr.2077 is yn steat om it 60 kDa SA-proteïne yn it CNS te ferfieren en feroarsake ek pharmakologyske effekten mei SA-konjugearre ynhibitoren fan it BACE1-peptide.
(a) Klonale ynjeksje (2 × 10 fagen / bist) fan T7-faag dy't lange termyn farmakokinetyske profilen fan CSF-peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) en net-ynjeksjede kontrôlefaag (#1779) sjen litte yn op syn minst trije CM-yntubere rotten.(b) Konfokaal mikroskopysk byld fan represintative kortikale mikrofezels yn faag-ynjeksjede ratten (2 × 10 10 fagen / bist) dy't tsjinkleuring fan peptide #2077 en skippen (lektine) sjen litte.Dizze faagklonen waarden oan 3 ratten administreare en mochten 1 oere sirkulearje foardat perfúzje.Harsens waarden yndield en kleurd mei polyklonale FITC-labele antykladen tsjin it T7-faagkapside.Tsien minuten foarôfgeand oan perfúzje en dêropfolgjende fixaasje, waard DyLight594-labele lektine yntravenus administrearre.Fluorescent bylden sjen litte lektin kleuring (read) fan 'e luminale kant fan microvessels en fagen (grien) yn' e lumen fan capillaries en perivascular harsens weefsel.De skaalbalke komt oerien mei 10 µm.(c, d) Biotinylearre BACE1-ynhiberend peptide allinich as yn kombinaasje mei biotinylearre transitpeptide #2077 waard keppele oan streptavidin folge troch intravenous ynjeksje fan op syn minst trije kanulearre CM-ratten (10 mg streptavidin / kg).BACE1 peptide-ynhibitor-bemiddele reduksje yn Aβ40 waard mjitten troch Aβ1-40 ELISA yn bloed (read) en cerebrospinale floeistof (oranje) op 'e oanjûne tiidpunten.Foar bettere dúdlikens wurdt in stippelline op 'e grafyk tekene op in skaal fan 100%.(c) Persintaazje reduksje yn Aβ40 yn bloed (reade trijehoeken) en cerebrospinale floeistof (oranje trijehoeken) yn ratten behannele mei streptavidin konjugearre oan transitpeptide #2077 en BACE1-ynhiberend peptide yn in 3: 1-ferhâlding.(d) Persintaazje reduksje yn bloed Aβ40 (reade sirkels) en cerebrospinale floeistof (oranje sirkels) fan ratten behannele mei streptavidin keppele oan in BACE1-ynhiberend peptide allinich.De Aβ-konsintraasje yn 'e kontrôle wie 420 pg / ml (standertôfwiking = 101 pg / ml).
Phage-display is mei súkses tapast yn ferskate gebieten fan biomedysk ûndersyk17.Dizze metoade is brûkt foar in vivo stúdzjes fan vaskulêre ferskaat18,19, lykas ûndersiken dy't rjochte binne op serebrale skippen20,21,22,23,24,25,26.Yn dizze stúdzje hawwe wy de tapassing fan dizze seleksjemetoade net allinich útwreide nei de direkte identifikaasje fan peptiden dy't rjochte binne op serebrale skippen, mar ek nei de ûntdekking fan kandidaten mei aktive transporteigenskippen om de bloed-harsensbarriêre oer te stekken.Wy beskriuwe no de ûntwikkeling fan in in vivo seleksjeproseduere yn CM yntubearre rotten en demonstrearje har potensjeel om peptiden te identifisearjen mei CSF homing-eigenskippen.Mei it brûken fan de T7-faag dy't in bibleteek fan 12-mer willekeurige peptiden werjaan, koenen wy demonstrearje dat de T7-faag lyts genôch is (sawat 60 nm yn diameter)10 om oan te passen oan 'e bloed-harsensbarriêre, en dêrmei direkt de bloed-harsensbarriêre of choroidplexus oerstekke.Wy observearre dat it rispjen fan CSF fan cannulated CM-ratten in goed kontrolearre in vivo funksjonele screeningmetoade wie, en dat de ekstrahearre faag net allinich bûn oan 'e vasculature, mar ek fungearre as in transporter oer de bloed-harsensbarriêre.Fierder, troch tagelyk bloed te sammeljen en HTS oan te passen op CSF ​​en bloed-ôflaat fagen, hawwe wy befêstige dat ús kar foar CSF net beynfloede waard troch bloedferriking of fitness foar útwreiding tusken rûnten fan seleksje.It bloedfak makket lykwols diel út fan 'e seleksjeproseduere, om't fagen dy't by steat binne om it CSF-fak te berikken, lang genôch moatte oerlibje en sirkulearje yn' e bloedstream om harsels yn it harsens te ferrykjen.Om betroubere folchoarderynformaasje út rau HTS-gegevens te ekstrahearjen, hawwe wy filters ymplementearre oanpast oan platfoarm-spesifike sequencing-flaters yn 'e analyseworkflow.Troch kinetyske parameters yn te nimmen yn 'e screeningmetoade befêstigje wy de rappe farmakokinetika fan wylde type T7-fagen (t½ ~ 28 min) yn bloed24, 27, 28 en bepale ek har heale libben yn cerebrospinale floeistof (t½ ~ 26 min) per minuut).Nettsjinsteande ferlykbere farmakokinetyske profilen yn bloed en CSF, koe mar 0.001% fan 'e bloedkonsintraasje fan faag wurde ûntdutsen yn CSF, wat oanjout op lege eftergrûnmobiliteit fan wylde type T7-faag oer de bloed-harsensbarriêre.Dit wurk markearret it belang fan 'e earste ronde fan seleksje by it brûken fan in vivo panningstrategyen, foaral foar faagsystemen dy't rap út 'e sirkulaasje wurde wiske, om't in pear klonen it CNS-fak kinne berikke.Sa wie yn 'e earste omloop de reduksje fan biblioteekferskaat tige grut, om't mar in beheind oantal klonen úteinlik sammele waarden yn dit tige strikte CSF-model.Dizze yn vivo panningstrategy omfette ferskate seleksjestappen lykas aktive akkumulaasje yn 'e CSF-fak, klon-oerlibjen yn' e bloedfak, en rappe fuortheljen fan T7-faag-klonen út it bloed binnen de earste 10 minuten (Fig. 1d en Supplementary Fig. 4M).).Sa waarden, nei de earste omloop, ferskate faag-klonen identifisearre yn CSF, hoewol deselde earste pool waard brûkt foar yndividuele bisten.Dit suggerearret dat meardere strange seleksje stappen foar boarne biblioteken mei grutte oantallen bibleteekleden resultearje yn in signifikante fermindering fan ferskaat.Dêrom sille willekeurige eveneminten in yntegraal diel wurde fan it earste seleksjeproses, dy't it resultaat sterk beynfloedzje.It is wierskynlik dat in protte fan 'e klonen yn' e orizjinele bibleteek in heul ferlykbere oanstriid foar CSF-ferriking hiene.Sels ûnder deselde eksperimintele omstannichheden kinne seleksjeresultaten lykwols ferskille fanwege it lytse oantal fan elke bepaalde kloon yn 'e earste pool.
De motiven ferrike yn CSF ferskille fan dy yn it bloed.Ynteressant hawwe wy de earste ferskowing opmurken nei glycine-rike peptiden yn it bloed fan yndividuele bisten.(Fig. 1g, Oanfoljende Fig. 4e, 4f).Fagen dy't glycinepeptiden befetsje kinne stabiler wêze en minder wierskynlik út 'e sirkulaasje helle wurde.Dizze glycine-rike peptiden waarden lykwols net ûntdutsen yn 'e cerebrospinale floeistofmonsters, wat suggerearret dat de curated bibleteken twa ferskillende seleksjestappen gongen: ien yn it bloed en in oar tastien om te sammeljen yn' e cerebrospinale floeistof.CSF-ferrike klonen dy't fuortkomme út 'e fjirde seleksjeronde binne wiidweidich hifke.Hast alle yndividueel hifke klonen waarden befêstige te wêzen ferrike yn CSF yn ferliking mei lege kontrôle faag.Ien peptide hit (# 2077) waard yn mear detail ûndersocht.It toande in langere plasma-healtiid yn fergeliking mei oare hits (figuer 3d en oanfoljende figuer 7), en ynteressant befette dit peptide in cysteine-residu oan 'e C-terminus.It is koartlyn oantoand dat de tafoeging fan cysteine ​​oan peptiden har farmakokinetyske eigenskippen kin ferbetterje troch te binen oan albumine 29.Dit is op it stuit ûnbekend foar peptide #2077 en fereasket fierdere stúdzje.Guon peptiden lieten in valence-ôfhinklikens sjen yn CSF-ferriking (gegevens net werjûn), dy't relatearre wurde kinne mei de werjûn oerflakgeometry fan 'e T7-kapside.It T7-systeem dat wy brûkten toande 5-15 kopyen fan elk peptide per faagdieltsje.IHC waard útfierd op kandidaat lead phage klonen ynjeksje yntravenous yn 'e cerebral cortex fan ratten (Supplementary Fig. 8).De gegevens lieten sjen dat op syn minst trije klonen (nr. 2002, nr. 2009 en nr. 2077) ynteraksje mei de BBB.It bliuwt te bepalen oft dizze BBB-ynteraksje resulteart yn 'e accumulation fan CSF of de beweging fan dizze klonen direkt nei de BCSFB.Wichtich litte wy sjen dat de selekteare peptiden har CSF-transportkapasiteit behâlde as se synthesisearre en bûn binne oan 'e proteinlading.Bining fan N-terminale biotinylearre peptiden oan SA werhellet yn essinsje de resultaten dy't krigen binne mei har respektive fageklonen yn bloed en cerebrospinale floeistof (Fig. 3e).Uteinlik litte wy sjen dat leadpeptide #2077 de harsensaksje fan in biotinylearre peptide-ynhibitor fan BACE1 konjugearre oan SA befoarderje kin, wêrtroch útsprutsen farmakodynamyske effekten yn 'e CNS troch signifikant ferminderjen fan Abeta40-nivo's yn CSF (Fig. 4).Wy koene gjin homologen yn 'e databank identifisearje troch in peptidesekwinsje homologysykjen fan alle hits út te fieren.It is wichtich om te notearjen dat de grutte fan 'e T7-bibleteek sawat 109 is, wylst de teoretyske bibleteekgrutte foar 12-mers 4 x 1015 is. Dêrom hawwe wy allinich in lyts fraksje fan' e ferskaatromte fan 'e 12-mer peptidebibleteek selektearre, wat kin betsjutte dat mear optimisearre peptiden kinne wurde identifisearre troch hitevaluearjen fan 'e neistlizzende romte.Hypotetysk kin ien fan 'e redenen wêrom't wy gjin natuerlike homologen fan dizze peptiden hawwe fûn, deseleksje wêze kinne tidens evolúsje om de ûnkontroleare yngong fan bepaalde peptidemotiven yn it harsens te foarkommen.
Mei-inoar jouwe ús resultaten in basis foar takomstich wurk om de transportsystemen fan 'e cerebrovaskulêre barriêre yn vivo yn mear detail te identifisearjen en te karakterisearjen.De basisopset fan dizze metoade is basearre op in funksjonele seleksjestrategy dy't net allinich klonen identifisearret mei serebrale vaskulêre binende eigenskippen, mar omfettet ek in krityske stap wêryn suksesfolle klonen intrinsike aktiviteit hawwe om biologyske barriêres yn vivo oer te stekken yn it CNS-fak.is om it meganisme fan ferfier fan dizze peptiden te ferklearjen en har foarkar foar bining oan 'e mikrovaskulatuer spesifyk foar de harsensregio.Dit kin liede ta de ûntdekking fan nije paden foar it ferfier fan de BBB en receptors.Wy ferwachtsje dat de identifisearre peptiden direkt kinne bine oan cerebrovaskulêre receptors of oan sirkulearjende liganden dy't troch de BBB of BCSFB ferfierd wurde.De peptidefektors mei CSF-transportaktiviteit ûntdutsen yn dit wurk sille fierder ûndersocht wurde.Wy ûndersiikje op it stuit de harsenspesifisiteit fan dizze peptiden foar har fermogen om de BBB en / of BCSFB oer te stekken.Dizze nije peptiden sille ekstreem weardefolle ark wêze foar de potensjele ûntdekking fan nije receptors as paden en foar de ûntwikkeling fan nije heul effisjinte platfoarms foar it leverjen fan makromolekulen, lykas biologyske, nei it harsens.
Cannulate de grutte cisterna (CM) mei help fan in wiziging fan de earder beskreaun metoade.Verdoofde Wistar-ratten (200-350 g) waarden op in stereotaksysk apparaat monteare en in mediane ynsnijing waard makke oer de rasearre en aseptysk taret skalp om de skedel te bleatsjen.Boarje twa gatten yn it gebiet fan 'e boppeste sjerp en befestigje de befestigingsskroeven yn' e gatten.In ekstra gat waard boarre yn 'e laterale occipital crest foar stereotaktyske begelieding fan in roestfrij stiel kanyle yn' e CM.Tapasse dental cement om 'e kanule en befestigje mei skroeven.Nei foto-hurding en cement ferhurding, de hûd wûn waard sletten mei 4/0 supramid suture.De juste pleatsing fan 'e kanule wurdt befêstige troch spontane leakage fan cerebrospinal fluid (CSF).Ferwiderje de rat út it stereotaksyske apparaat, ûntfange passende postoperative soarch en pinebehear, en lit it op syn minst ien wike herstelle oant tekens fan bloed wurde waarnommen yn 'e cerebrospinale floeistof.Wistar-ratten (Crl:WI/Han) waarden krigen fan Charles River (Frankryk).Alle rotten waarden hâlden ûnder spesifike pathogenfrije omstannichheden.Alle bist eksperiminten waarden goedkard troch de Veterinary Office fan de stêd fan Basel, Switserlân, en waarden útfierd yn oerienstimming mei Animal License No.
Hâld de rat foarsichtich bewust mei de CM-kanule yn 'e hân.Ferwiderje Datura út 'e kanule en sammelje 10 µl spontaan streamende cerebrospinale floeistof.Om't de patens fan 'e kanule úteinlik kompromittearre waard, waarden allinich dúdlike cerebrospinale floeistofmonsters mei gjin bewiis fan bloedkontaminaasje of ferkleuring opnommen yn dizze stúdzje.Parallel waard sawat 10-20 μl bloed nommen fan in lyts ynsidint oan 'e tip fan' e sturt yn buizen mei heparine (Sigma-Aldrich).CSF en bloed waarden sammele op ferskate tiidpunten nei intravenous ynjeksje fan T7-faag.Likernôch 5-10 μl fan floeistof waard wegere foardat elke CSF-monster waard sammele, wat oerienkomt mei it deade folume fan 'e katheter.
Biblioteken waarden oanmakke mei de T7Select 10-3b-fektor lykas beskreaun yn it T7Select-systeemhantlieding (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Koartsein, in willekeurige 12-mer DNA-ynfoegje waard synthesisearre yn it folgjende formaat:
It NNK-kodon waard brûkt om dûbele stopkodons en aminosoeren-overekspresje yn 'e ynset te foarkommen.N is in mei de hân mingde ekwimolêre ferhâlding fan elke nukleotide, en K is in mei de hân mingde ekwimolêre ferhâlding fan adenine en cytosine nukleotide.Single stranded regio's waarden omboud ta dûbele stranded DNA troch fierdere ynkubaasje mei dNTP (Novagen) en Klenow enzyme (New England Biolabs) yn Klenow buffer (New England Biolabs) foar 3 oeren by 37 ° C.Nei de reaksje waard dûbelstrenged DNA weromfûn troch EtOH-precipitaasje.De resultearjende DNA waard digested mei beheining enzymen EcoRI en HindIII (beide fan Roche).De ôfsplitste en suvere (QIAquick, Qiagen) ynfoegje (T4 ligase, New England Biolabs) waard doe yn-frame ligearre yn in foarôfgesplitste T7-fektor nei aminosoer 348 fan it 10B-kapsidegen.Ligation reaksjes waarden incubated by 16 ° C. foar 18 oeren foarôfgeand oan in vitro ferpakking.Fage-ferpakking in vitro waard útfierd neffens de ynstruksjes levere mei de T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) en de ferpakkingsoplossing waard ien kear fersterke nei lysis mei Escherichia coli (BLT5615, Novagen).De lysates waarden centrifuged, titrated en beferzen by -80 ° C. as stock oplossing fan glycerol.
Direkte PCR-amplifikaasje fan faag fariabele regio's fersterke yn bouillon of plaat mei proprietêre 454 / Roche-amplicon-fúzjeprimers.De foarút fúzje primer befettet sekwinsjes flankearjend de fariabele regio (NNK) 12 (sjabloan-spesifike), GS FLX Titanium Adapter A, en in fjouwer-base biblioteek kaai sequence (TCAG) (oanfoljende figuer 1a):
De omkearde fúzjeprimer befettet ek biotine ferbûn oan it fangen fan kralen en de GS FLX Titanium Adapter B nedich foar klonale amplifikaasje tidens emulsie PCR:
De amplicons waarden doe ûnderwurpen oan 454/Roche pyrosequencing neffens it 454 GS-FLX Titanium protokol.Foar hantlieding fan Sanger-sekwinsje (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), waard T7-faag-DNA fersterke troch PCR en sequearre mei de folgjende primer-pearen:
Ynserts fan yndividuele plaques waarden ûnderwurpen oan PCR-amplifikaasje mei de Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (neffens de ynstruksjes fan de fabrikant).Fier in waarme start (10 min by 95 °C) en 35 boostsyklusen (50 s by 95 °C, 1 min by 50 °C, en 1 min by 72 °C).
Fage út biblioteken, wyld-type faag, fage rêden út CSF en bloed, of yndividuele klonen waarden fersterke yn Escherichia coli BL5615 yn TB bouillon (Sigma Aldrich) of yn 500 cm2 skûtels (Thermo Scientific) foar 4 h op 37 ° C.Fagen waarden út 'e platen ekstrahearre troch de platen te spieljen mei Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) of troch de plaques te sammeljen mei sterile pipettetips.Fagen waarden isolearre fan kultuersupernatant as ekstraksjebuffer mei ien ronde fan polyetyleenglycol (PEG 8000) delslach (Promega) en resuspendearre yn Tris-EDTA-buffer.
De fersterke fage waard ûnderwurpen oan 2-3 rûnten fan endotoxine-ferwidering mei endotoxine-ferwideringskralen (Miltenyi Biotec) foarôfgeand oan intravenous (IV) ynjeksje (500 μl / bist).Yn de earste omloop waarden 2×1012 fagen ynfierd;yn 'e twadde, 2 × 1010 fagen;yn de tredde en fjirde seleksje rûndes, 2 × 109 fagen per bist.Fage-ynhâld yn CSF en bloedmonsters sammele op 'e oantsjutte tiidpunten waard bepaald troch plaque-tellen neffens de ynstruksjes fan' e fabrikant (T7Select-systeemhantlieding).Fage-seleksje waard útfierd troch intravenous ynjeksje fan suvere bibleteken yn 'e sturt of troch opnij ynjeksje fan faag ekstrakt út CSF út' e foarige seleksjeronde, en folgjende rispingen waarden respektivelik útfierd op 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, en 240 min bloedmonsters.In totaal fan fjouwer rûnen fan in vivo panning waarden útfierd wêryn de twa selekteare tûken apart waarden opslein en analysearre tidens de earste trije rondes fan seleksje.Alle fage-ynserts dy't út CSF út 'e earste twa rûnen fan seleksje ekstrahearre waarden, waarden ûnderwurpen oan 454/Roche-pyrosequencing, wylst alle klonen dy't út CSF út' e lêste twa rûnen fan seleksje ekstrahearre waarden manuell sequearre.Alle bloedfagen út 'e earste omloop fan seleksje waarden ek ûnderwurpen oan 454/Roche pyrosequencing.Foar ynjeksje fan fage-klonen waarden selekteare fagen fersterke yn E. coli (BL5615) op 500 cm2-platen by 37 ° C foar 4 oeren.Yndividueel selektearre en mei de hân sequearre klonen waarden propagearre yn TB medium.Nei fage-ekstraksje, suvering en fuortheljen fan endotoxine (lykas hjirboppe beskreaun), 2 × 1010 fagen / bist yn 300 μl waarden ynjeksje yn ien sturt.
Foarferwurking en kwalitatyf filterjen fan folchoardergegevens.Raw 454 / Roche-gegevens waarden omboud fan in binêre standert streamkaartformaat (sff) nei in Pearson-minsklike lêsber formaat (fasta) mei help fan software fan ferkeapers.Fierdere ferwurking fan 'e nukleotide-sekwinsje waard útfierd mei proprietêre C-programma's en skripts (net útjûn softwarepakket) lykas hjirûnder beskreaun.De analyze fan primêre gegevens omfettet strikte prosedueres foar filterjen yn mear stadia.Om lêzen út te filterjen dy't gjin jildige 12mer-ynfoegje DNA-sekwinsje befette, waarden de lêzen sequentieel ôfstimd op startlabel (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoplabel (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) en eftergrûnynfoegje (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) mei help fan de globale test Needleman-Wunsch Needleman.ôfstimming wêrtroch maksimaal 2 ynkonsistinsjes per ôfstimming31.Dêrom waarden lêzen sûnder start- en stop-tags en lêzings mei eftergrûnynfoegingen, dat wol sizze ôfstimmingen dy't it tastiene oantal mismatches grutter meitsje, út 'e bibleteek fuortsmiten.Wat de oerbleaune lêzings oanbelanget, waard de N-mer DNA-sekwinsje dy't útwreidet fan 'e startmarkearring en einiget foardat de stopmarkearring út' e orizjinele lêssekwinsje útsletten waard en fierder ferwurke (hjirnei oantsjutten as "ynfoegje").Nei oersetting fan 'e ynfoegje wurdt it diel nei it earste stopkodon oan' e 5 'ein fan' e primer fuortsmiten fan 'e ynfoegje.Dêrnjonken waarden nukleotiden dy't liede ta ûnfolsleine codons oan it 3'-ein fan 'e primer ek fuortsmiten.Om ynserts út te sluten dy't allinich eftergrûnsekwinsjes befetsje, waarden oersette ynserts begjinnend mei it aminosoerpatroan "PAG" ek fuortsmiten.Peptiden mei in post-translasjonele lingte fan minder dan 3 aminosoeren waarden út 'e bibleteek fuortsmiten.Ta beslút, fuortsmite oerstallichheid yn de ynfoegje pool en bepale de frekwinsje fan eltse unike ynfoegje.De resultaten fan dizze analyze omfette in list mei nukleotide-sekwinsjes (ynserts) en har (lêze) frekwinsjes (oanfoljende figueren 1c en 2).
Groep N-mer DNA Inserts troch sequence oerienkomst: Om elimineren 454 / Roche-spesifike sequencing flaters (lykas problemen mei sequencing homopolymer extensions) en fuortsmite minder wichtige oerstallichheden, earder filtere N-mer DNA sequence Inserts (inserts) wurde sortearre troch oerienkomst.ynfoegings (oant 2 net-oerienkommende bases tastien) mei in iteratyf algoritme definiearre as folget: ynfoegingen wurde earst sorteare op har frekwinsje (hege nei leechste), en as se itselde binne, troch har sekundêre sortearje op lingte (langste nei koartste) ).Sa definiearje de meast foarkommende en langste ynfoegingen de earste "groep".De groepfrekwinsje is ynsteld op de kaaifrekwinsje.Dêrnei waard elke ynfoegje oerbleaun yn 'e sorteare list besocht om ta te foegjen oan' e groep troch in pearse Needleman-Wunsch-ôfstimming.As it oantal net-oerienkomsten, ynfoegingen of wiskjes yn in ôfstimming net mear as in drompel fan 2 binne, wurdt in ynfoeging tafoege oan 'e groep, en de totale groepfrekwinsje wurdt ferhege mei hoe faaks de ynfoegje is tafoege.Inserts tafoege oan in groep wurde markearre as brûkt en útsletten fan fierdere ferwurking.As de ynfoegje folchoarder kin net tafoege wurde oan in al besteande groep, de ynfoegje folchoarder wurdt brûkt foar it meitsjen fan in nije groep mei de passende ynfoegje frekwinsje en markearre as brûkt.De iteraasje einiget as elke ynfoegjesekwinsje is brûkt om in nije groep te foarmjen of kin wurde opnommen yn in al besteande groep.Ommers, groepearre ynserts besteande út nukleotiden wurde úteinlik oerset yn peptide sekwinsjes (peptide bibleteken).It resultaat fan dizze analyze is in set fan ynfoegingen en har oerienkommende frekwinsjes dy't it oantal opfolgjende lêzings meitsje (oanfoljende figuer 2).
Motyfgeneraasje: Op grûn fan in list mei unike peptiden waard in bibleteek makke mei alle mooglike aminosoerenpatroanen (aa) lykas hjirûnder werjûn.Elk mooglik patroan fan lingte 3 waard ekstrahearre út it peptide en it omkearde patroan waard tafoege tegearre mei in mienskiplike motyfbibleteek mei alle patroanen (tripeptiden).Biblioteken fan tige repetitive motiven waarden sekwearre en oerstalligens fuorthelle.Dan, foar elk tripeptide yn 'e motyfbibleteek, kontrolearren wy op syn oanwêzigens yn' e bibleteek mei help fan komputerynstruminten.Yn dit gefal wurdt de frekwinsje fan it peptide mei it fûne motyftripeptide tafoege en tawiisd oan it motyf yn 'e motyfbibleteek ("oantal motiven").It resultaat fan motyfgeneraasje is in twadiminsjonale array dy't alle foarkommen fan tripeptiden (motiven) en har respektive wearden befettet, dat is it oantal sequencenlêzingen dy't resultearje yn it korrespondearjende motyf as de lêzings wurde filtere, groepeare en oerset.Metriken lykas hjirboppe yn detail beskreaun.
Normalisaasje fan it oantal motiven en oerienkommende scatterplots: It oantal motiven foar elke stekproef waard normalisearre mei
wêr't ni it oantal lêzings is mei ûnderwerp i.Sa stiet vi foar it persintaazje frekwinsje fan lêzen (of peptiden) befettet motyf i yn de stekproef.P-wearden foar it net-normalisearre oantal motiven waarden berekkene mei Fisher's eksakte test.Oangeande korrelogrammen fan it oantal motiven, waarden de korrelaasjes fan Spearman berekkene mei it normalisearre oantal motiven mei R.
Om de ynhâld fan aminosoeren op elke posysje yn 'e peptidebibleteek te visualisearjen, waarden weblogogrammen 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) makke.Earst wurdt de ynhâld fan aminosoeren op elke posysje fan it 12-mer-peptide opslein yn in 20 × 12-matrix.Dan wurdt in set fan 1000 peptiden mei deselde relative aminosoerenynhâld op elke posysje generearre yn fasta-sekwinsjeformaat en levere as ynfier nei web-logo 3, dy't in grafyske foarstelling genereart fan 'e relative aminosoerenynhâld op elke posysje.foar in opjûne peptide bibleteek.Om multidimensionale datasets te visualisearjen, waarden waarmtekaarten makke mei in yntern ûntwikkele ark yn R (biosHeatmap, in noch te frijlitten R-pakket).De dendrogrammen presintearre yn 'e waarmtekaarten waarden berekkene mei Ward's hiërargyske klustermetoade mei de Euklidyske ôfstânmetrik.Foar statistyske analyze fan motyfscoregegevens waarden P-wearden foar unnormalisearre skoare berekkene mei Fisher's eksakte test.P-wearden foar oare datasets waarden berekkene yn R mei help fan Student's t-test of ANOVA.
Selektearre fagen klonen en fagen sûnder ynserts waarden ynjeksje yntravenous fia de sturt (2 × 1010 fagen / bist yn 300 μl PBS).Tsien minuten foarôfgeand oan perfúzje en folgjende fixaasje waarden deselde bisten yntraveneus ynjeksje mei 100 μl fan DyLight594-labele lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuten nei faag-ynjeksje waarden ratten troch it hert perfuseare mei 50 ml PBS folge troch 50 ml 4% PFA / PBS.Brain-monsters waarden boppedat oernachtich fêststeld yn 4% PFA / PBS en oernacht yn 30% sukrose by 4 ° C socht.Samples wurde flash beferzen yn it OCT-mingsel.Immunohistochemyske analyze fan beferzen samples waard útfierd by keamertemperatuer op 30 µm kryoseksjes blokkearre mei 1% BSA en ynkubeare mei polyklonale FITC-labele antykladen tsjin T7 fage (Novus NB 600-376A) by 4 ° C.Incubate oernachtsje.Uteinlik waarden de seksjes 3 kear wosken mei PBS en ûndersocht mei in konfokale lasermikroskoop (Leica TCS SP5).
Alle peptiden mei in minimale suverens fan 98% waarden synthesized troch GenScript USA, biotinylated en lyophilized.Biotine wurdt bûn fia in ekstra triple glycine spacer oan 'e N-terminus.Kontrolearje alle peptiden mei massaspektrometrie.
Streptavidin (Sigma S0677) waard mingd mei in 5-fâldige ekwimolêre oerfloed fan biotinylearre peptide, biotinylearre BACE1-ynhiberend peptide, of in kombinaasje (3: 1-ferhâlding) fan biotinylearre BACE1-ynhiberend peptide en BACE1-ynhiberend peptide yn DMSOBS / 10% peptide.1 oere by keamertemperatuer foar ynjeksje.Streptavidin-konjugearre peptiden waarden yntraveneus yn in doasis fan 10 mg / kg yn ien fan 'e sturtvenen fan rotten mei in cerebral holte ynjeksje.
De konsintraasje fan streptavidin-peptide kompleksen waard beoardiele troch ELISA.Nunc Maxisorp mikrotiterplaten (Sigma) waarden oernachtich by 4 ° C bedekt mei 1.5 μg / ml mûs anty-streptavidin-antibody (Thermo, MA1-20011).Nei blokkearjen (blokkearjende buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatine, 1% BSA) by keamertemperatuer foar 2 oeren, waskje de plaat mei 0,05% Tween-20 / PBS (waskbuffer) foar 3 Second, CSF en plasma-bufferferdunne1,0ma waarden tafoege oan CSF- en plasma-monsters 0ma, tafoege oan CSF- en plasmamonsters SF 1:115).De plaat waard dan oernachtich by 4 ° C ynkubearre mei deteksje-antilichaam (1 μg / ml, anty-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Nei trije waskjenstappen waard streptavidin ûntdutsen troch ynkubaasje yn TMB-substraatoplossing (Roche) foar maksimaal 20 min.Nei it stopjen fan kleurûntwikkeling mei 1M H2SO4, mjit de absorbânsje by 450 nm.
De funksje fan it streptavidin-peptide-BACE1-ynhibitorkompleks waard beoardiele troch Aβ (1-40) ELISA neffens it protokol fan 'e fabrikant (Wako, 294-64701).Koartsein, CSF-monsters waarden verdund yn standert diluent (1:23) en ynkubeare oernacht by 4 ° C yn 96-well platen bedekt mei BNT77 capture antibody.Nei fiif waskjenstappen waard HRP-konjugearre BA27 antykodym tafoege en ynkubeare foar 2 oeren by 4 ° C., folge troch fiif wasstappen.Aβ (1-40) waard ûntdutsen troch ynkubaasje yn TMB-oplossing foar 30 minuten by keamertemperatuer.Nei't kleurûntwikkeling is stoppe mei stopoplossing, mjit de absorption by 450 nm.Plasma-monsters waarden ûnderwurpen oan fêste faze-ekstraksje foarôfgeand oan Aβ (1-40) ELISA.Plasma waard tafoege oan 0,2% DEA (Sigma) yn 96-well platen en ynkubeare by keamertemperatuer foar 30 minuten.Nei it opienfolgjende waskjen fan de SPE-platen (Oasis, 186000679) mei wetter en 100% methanol, waarden plasmamonsters oan 'e SPE-platen tafoege en alle flüssigens waard fuorthelle.Samples waarden wosken (earst mei 5% methanol dan 30% methanol) en eluearre mei 2% NH4OH / 90% methanol.Nei it droegjen fan it eluaat by 55 ° C foar 99 min by konstante N2-stroom, waarden de samples fermindere yn standert diluents en Aβ (1-40) waard mjitten lykas hjirboppe beskreaun.
Hoe sitearje dit artikel: Urich, E. et al.Levering fan lading nei it harsens mei help fan transitpeptiden identifisearre yn vivo.de wittenskip.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J, Skjorringe T, Thomsen LB, Moos T.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., en Martinez-Martinez, P. Levering fan peptide en proteïne medisinen oer de bloed-harsensbarriêre.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM De bloed-harsensbarriêre: in flessehals yn 'e ûntwikkeling fan harsens medisyn.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, en Byrd, A. Perspektyf foar ferbettere medisynferliening en rjochte op it harsens fia de choroid plexus-CSF-paad.Pharmaceutical Research 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisearring fan biofarmaceutika mei molekulêre Trojaanske hynders foar harsensferliening.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptor-mediated peptidetransport oer de bloed-harsensbarriêre.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Ferheegje harsenspenetraasje en effektiviteit fan therapeutyske antykladen mei monovalente molekulêre shuttles.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrine receptor (TfR) ferfier bepaalt harsens opname fan affiniteit farianten fan TfR antistoffen.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).