Guon ûnderwerpen foar probleemoplossing fan LC binne nea ferâldere, om't der problemen binne yn 'e LC-praktyk, sels as ynstruminttechnology yn 'e rin fan' e tiid ferbetteret. Der binne in protte manieren wêrop problemen kinne ûntstean yn in LC-systeem en yn minne piekfoarm einigje. As problemen relatearre oan piekfoarm ûntsteane, helpt in koarte list mei mooglike oarsaken foar dizze resultaten ús probleemoplossingsûnderfining te ferienfâldigjen.
It wie leuk om dizze kolom "LC Troubleshooting" te skriuwen en elke moanne oer ûnderwerpen nei te tinken, om't guon ûnderwerpen nea út 'e moade reitsje. Wylst op it mêd fan chromatografyûndersyk bepaalde ûnderwerpen of ideeën ferâldere reitsje as se ferfongen wurde troch nijere en bettere ideeën, op it mêd fan probleemoplossing, sûnt it earste artikel oer probleemoplossing ferskynde yn dit tydskrift (it LC Journal doetiids), om't guon ûnderwerpen noch relevant binne) yn 1983 (1). Yn 'e ôfrûne jierren haw ik ferskate LC Troubleshooting-seksjes rjochte op hjoeddeistige trends dy't ynfloed hawwe op floeibere chromatografy (LC) (bygelyks de relative fergeliking fan ús begryp fan it effekt fan druk op retinsje [2] Nije foarútgong) Us ynterpretaasje fan LC-resultaten en hoe't jo problemen kinne oplosse mei moderne LC-ynstruminten. Yn 'e ôflevering fan dizze moanne gean ik troch mei myn searje (3), dy't begon yn desimber 2021, dy't rjochte wie op guon fan' e "libben en dea" ûnderwerpen fan LC-probleemoplossing - eleminten dy't geweldich binne foar elke probleemoplosser binne essensjeel, nettsjinsteande de leeftyd fan it systeem dat wy brûke. It kearnûnderwerp fan dizze searje is tige relevant foar de ferneamde muorrekaart "LC Troubleshooting Guide" fan 'e LCGC (4) dy't hinget yn in protte laboratoaria. Foar it tredde diel fan dizze searje haw ik keazen om te fokusjen op problemen yn ferbân mei pykfoarm of pykkarakteristiken. Ungelooflijk genôch listet de muorrekaart 44 ferskillende potinsjele oarsaken fan minne pykfoarm! Wy kinne al dizze problemen net yn detail beskôgje yn ien artikel, dus yn dizze earste ôflevering oer it ûnderwerp sil ik my rjochtsje op guon fan 'e problemen dy't ik it meast sjoch. Ik hoopje dat jonge en âlde LC-brûkers wat nuttige tips en herinneringen fine oer dit wichtige ûnderwerp.
Ik merk dat ik hieltyd faker fragen oer probleemoplossing beantwurdzje mei "alles is mooglik". Dit antwurd liket miskien maklik as wy observaasjes beskôgje dy't lestich te ynterpretearjen binne, mar ik fyn it faak passend. Mei in protte mooglike oarsaken fan in minne pykfoarm is it wichtich om iepen te stean by it beskôgjen fan wat it probleem wêze kin, en om prioriteit te jaan oan potinsjele oarsaken om ús probleemoplossingsynspanningen te begjinnen, mei fokus op dy meast foarkommende mooglikheden, dit punt is tige wichtich.
In wichtige stap yn elke probleemoplossingsoefening - mar ien dy't ik tink ûnderskat wurdt - is it erkennen dat der in probleem is dat oplost wurde moat. Erkennen dat der in probleem is betsjut faak it erkennen dat wat der mei it ark bart oars is as ús ferwachtingen, dy't foarme wurde troch teory, empiryske kennis en ûnderfining (5). De "pykfoarm" dêr't hjir nei ferwiist ferwiist eins net allinich nei de foarm fan 'e pyk (symmetrysk, asymmetrysk, glêd, pluizig, foarrâne, sturtfoarm, ensfh.), mar ek nei de breedte. Us ferwachtingen foar de werklike pykfoarm binne ienfâldich. Teory (6) stipet de ferwachting út it learboek goed dat, yn 'e measte gefallen, de chromatografyske pieken symmetrysk moatte wêze en oerienkomme moatte mei de foarm fan in Gaussyske ferdieling, lykas te sjen is yn figuer 1a. Wat wy ferwachtsje fan pykbreedtes is in komplekser probleem, en wy sille dit ûnderwerp yn in takomstich artikel beprate. De oare pykfoarmen yn figuer 1 litte guon fan 'e oare mooglikheden sjen dy't waarnommen wurde kinne - mei oare wurden, guon fan 'e manieren wêrop dingen mis kinne gean. Yn 'e rest fan dizze ôflevering sille wy tiid besteegje oan it besprekken fan guon spesifike foarbylden fan situaasjes dy't kinne liede ta dizze foarmtypen.
Soms wurde pieken hielendal net waarnommen yn it chromatogram dêr't se ferwachte wurde te eluearjen. De boppesteande muorrekaart jout oan dat de ôfwêzigens fan in pyk (oannommen dat it stekproef eins de doelanalyt befettet yn in konsintraasje dy't de detektorrespons genôch meitsje moat om it boppe de rûs te sjen) meastentiids relatearre is oan in ynstrumintprobleem of ferkearde mobile fazeomstannichheden (as se al waarnommen wurde). pieken, meastentiids te "swak"). In koarte list mei potinsjele problemen en oplossingen yn dizze kategory is te finen yn tabel I.
Lykas hjirboppe neamd, is de fraach hoefolle peakferbreding tolerearre wurde moat foardat der omtinken oan jûn wurdt en besocht wurdt it te reparearjen in kompleks ûnderwerp dat ik yn in takomstich artikel beprate sil. Myn ûnderfining is dat wichtige peakferbreding faak begelaat wurdt troch in wichtige feroaring yn 'e peakfoarm, en peaktailing komt faker foar as pre-peak of splitting. De nominaal symmetryske pieken wurde lykwols ek ferbrede, wat feroarsake wurde kin troch in pear ferskillende redenen:
Elk fan dizze problemen is yn detail besprutsen yn eardere nûmers fan Troubleshooting LC, en lêzers dy't ynteressearre binne yn dizze ûnderwerpen kinne dizze eardere artikels rieplachtsje foar ynformaasje oer de woarteloarsaken en mooglike oplossingen foar dizze problemen. Mear details.
Peak tailing, peak fronting, en splitting kinne allegear feroarsake wurde troch gemyske of fysike ferskynsels, en de list mei mooglike oplossingen foar dizze problemen ferskilt sterk, ôfhinklik fan oft wy te krijen hawwe mei in gemysk of fysyk probleem. Faak kinne jo, troch de ferskate pieken yn in chromatogram te fergelykjen, wichtige oanwizings fine oer hokker de skuldige is. As alle pieken yn in chromatogram ferlykbere foarmen hawwe, is de oarsaak wierskynlik net fysyk. As mar ien of in pear pieken beynfloede binne, mar de rest der goed útsjocht, is de oarsaak wierskynlik gemysk.
De gemyske oarsaken fan peak tailing binne te kompleks om hjir koart te besprekken. De ynteressearre lêzer wurdt ferwiisd nei de resinte útjefte fan "LC Troubleshooting" foar in mear yngeande diskusje (10). In maklik ding om te besykjen is lykwols om de massa fan 'e ynjeksjeare analyte te ferminderjen en te sjen oft de peakfoarm ferbetteret. As dat sa is, dan is dit in goede oanwizing dat it probleem "massa-oerlêst" is. Yn dit gefal moat de metoade beheind wurde ta it ynjeksjearjen fan lytse analytemassa's, of moatte de chromatografyske omstannichheden feroare wurde, sadat goede peakfoarmen kinne wurde krigen, sels mei gruttere ynjeksjeare massa's.
Der binne ek in protte mooglike fysike redenen foar peak tailing. Lêzers dy't ynteressearre binne yn in detaillearre diskusje oer de mooglikheden wurde ferwiisd nei in oare resinte útjefte fan "LC Troubleshooting" (11). Ien fan 'e mear foarkommende fysike oarsaken fan peak tailing is in minne ferbining op in punt tusken de ynjektor en detektor (12). In ekstreem foarbyld wurdt werjûn yn figuer 1d, in pear wiken lyn krigen yn myn laboratoarium. Yn dit gefal bouden wy in systeem mei in nije ynjeksjeklep dy't wy noch net earder brûkt hiene, en ynstalleare wy in ynjeksjelus mei lyts folume mei in ferrule dy't op in roestfrij stielen kapillêr getten wie. Nei wat earste probleemoplossingseksperiminten realisearren wy ús dat de poartedjipte yn 'e ynjeksjeklepstator folle djipper wie as wy wend wiene, wat resultearre yn in grut dead folume oan 'e ûnderkant fan' e poarte. Dit probleem is maklik oplost troch de ynjeksjelus te ferfangen troch in oare buis, wy kinne de ferrule oanpasse oan 'e juste posysje om it dead folume oan' e ûnderkant fan 'e poarte te eliminearjen.
Peakfronten lykas dy werjûn yn figuer 1e kinne ek feroarsake wurde troch fysike of gemyske problemen. In mienskiplike fysike oarsaak fan 'e foarrâne is dat it dieltsjesbêd fan 'e kolom net goed ynpakt is, of dat de dieltsjes yn 'e rin fan' e tiid opnij organisearre binne. Lykas by peak tailing feroarsake troch dit fysike ferskynsel, is de bêste manier om dit op te lossen om de kolom te ferfangen en troch te gean. Fundamenteel ûntsteane foarrâne-peakfoarmen mei gemyske oarsprong faak út wat wy "net-lineare" retinsjebetingsten neame. Under ideale (lineare) omstannichheden is de hoemannichte analyt dy't troch de stasjonêre faze bewarre wurdt (dus de retinsjefaktor) lineêr relatearre oan de konsintraasje fan 'e analyt yn' e kolom. Chromatografysk betsjut dit dat as de massa fan analyt dy't yn 'e kolom ynjektearre wurdt tanimt, de peak heger wurdt, mar net breder. Dizze relaasje wurdt brutsen as it retinsjegedrach net-lineêr is, en de pieken wurde net allinich heger, mar ek breder as mear massa ynjektearre wurdt. Derneist bepale net-lineare foarmen de foarm fan chromatografyske pieken, wat resulteart yn foar- of efterrânen. Lykas by massa-oerlêst dy't peak tailing feroarsaket (10), wurdt peak leading feroarsake troch net-lineare retinsje kin ek diagnostisearre wurde troch it ferminderjen fan 'e ynjeksjeare analytmassa. As de piekfoarm ferbetteret, moat de metoade oanpast wurde om de ynjeksjekwaliteit dy't de foarrâne feroarsaket net te oertreffen, of de chromatografyske omstannichheden moatte feroare wurde om dit gedrach te minimalisearjen.
Soms observearje wy wat liket op in "split" piek, lykas te sjen is yn figuer 1f. De earste stap by it oplossen fan dit probleem is om te bepalen oft de piekfoarm te tankjen is oan partielle ko-eluasje (d.w.s. de oanwêzigens fan twa ûnderskate, mar nau eluearjende ferbiningen). As der eins twa ferskillende analyten binne dy't ticht byinoar eluearje, dan is it in kwestje fan it ferbetterjen fan har resolúsje (bygelyks troch it ferheegjen fan selektiviteit, behâld of plaattelling), en de skynbere "split" pieken binne relatearre oan fysike prestaasjes. Prestaasjes hawwe neat te krijen mei de kolom sels. Faak is de wichtichste oanwizing foar dizze beslút oft alle pieken yn it chromatogram splitfoarmen fertoane, of mar ien of twa. As it mar ien of twa binne, is it wierskynlik in probleem mei ko-eluasje; as alle pieken splitst binne, is it wierskynlik in fysyk probleem, wierskynlik relatearre oan de kolom sels.
Splitpeaken dy't relatearre binne oan de fysike eigenskippen fan 'e kolom sels binne meastentiids te tankjen oan foar in part blokkearre yn- of útlaatfritten, of reorganisaasje fan dieltsjes yn 'e kolom, wêrtroch't de mobile faze rapper streamt as de mobile faze yn bepaalde gebieten fan 'e kolomkanaalfoarming yn oare regio's (11). Foar in part ferstoppe fritt kin soms ferholpen wurde troch de stream troch de kolom om te kearen; yn myn ûnderfining is dit lykwols meastentiids in koarte-termyn oplossing ynstee fan in lange-termyn oplossing. Dit is faak fataal by moderne kolommen as de dieltsjes binnen de kolom rekombinearje. Op dit punt is it it bêste om de kolom te ferfangen en troch te gean.
De pyk yn figuer 1g, ek fan in resint foarbyld yn myn eigen laboratoarium, jout meastentiids oan dat it sinjaal sa heech is dat it it hege ein fan it responsberik berikt hat. Foar optyske absorbânsjedetektors (UV-vis yn dit gefal), as de analytkonsintraasje tige heech is, absorbearret de analyt it measte ljocht dat troch de streamsel fan 'e detektor giet, wêrtroch't der tige min ljocht te detektearjen is. Under dizze omstannichheden wurdt it elektryske sinjaal fan 'e fotodetektor sterk beynfloede troch ferskate boarnen fan lûd, lykas stroailjocht en "tsjustere stroom", wêrtroch't it sinjaal tige "wazig" fan uterlik is en ûnôfhinklik is fan 'e analytkonsintraasje. As dit bart, kin it probleem faak maklik oplost wurde troch it ynjeksjevolume fan 'e analyt te ferminderjen - it ynjeksjevolume te ferminderjen, it monster te ferdunnen, of beide.
Yn 'e chromatografyskoalle brûke wy it detektorsignaal (d.w.s. de y-as yn it chromatogram) as in yndikator fan 'e analytkonsintraasje yn it stekproef. Dat it liket frjemd om in chromatogram te sjen mei in sinjaal ûnder nul, om't de ienfâldige ynterpretaasje is dat dit in negative analytkonsintraasje oanjout - wat fansels net fysyk mooglik is. Yn myn ûnderfining wurde negative pieken it meast waarnommen by it brûken fan optyske absorbânsjedetektors (bygelyks UV-vis).
Yn dit gefal betsjut in negative pyk gewoan dat de molekulen dy't út 'e kolom eluearje minder ljocht absorbearje as de mobile faze sels direkt foar en nei de pyk. Dit kin bygelyks foarkomme by it brûken fan relatyf lege deteksjegolflingten (<230 nm) en mobile faze-tafoegings dy't it measte ljocht by dizze golflingten absorbearje. Sokke tafoegings kinne mobile faze-oplosmiddelkomponinten wêze lykas metanol of bufferkomponinten lykas asetaat of formiaat. Men kin eins negative pieken brûke om in kalibraasjekromme ta te rieden en krekte kwantitative ynformaasje te krijen, dus d'r is gjin fûnemintele reden om se per se te foarkommen (dizze metoade wurdt soms oantsjutten as "yndirekte UV-deteksje") (13). As wy lykwols echt negative pieken hielendal foarkomme wolle, is yn it gefal fan absorbânsjedeteksje de bêste oplossing om in oare deteksjegolflingte te brûken, sadat de analyte mear absorbearret as de mobile faze, of de gearstalling fan 'e mobile faze te feroarjen, sadat se minder ljocht absorbearje as analyten.
Negative pieken kinne ek ferskine by it brûken fan brekingsyndeks (RI)-deteksje as de brekingsyndeks fan oare komponinten as de analyte yn it stekproef, lykas de oplosmiddelmatrix, oars is as de brekingsyndeks fan 'e mobile faze. Dit bart ek mei UV-vis-deteksje, mar dit effekt wurdt faak ferswakke yn ferliking mei RI-deteksje. Yn beide gefallen kinne negative pieken minimalisearre wurde troch de gearstalling fan 'e stekproefmatrix better oerien te bringen mei dy fan 'e mobile faze.
Yn diel trije oer it basisûnderwerp fan LC-probleemoplossing haw ik situaasjes besprutsen wêryn't de waarnommen pykfoarm ferskilt fan 'e ferwachte of normale pykfoarm. Effektive probleemoplossing fan sokke problemen begjint mei kennis fan ferwachte pykfoarmen (basearre op teory of eardere ûnderfining mei besteande metoaden), dus ôfwikingen fan dizze ferwachtingen binne fanselssprekkend. Problemen mei pykfoarm hawwe in protte ferskillende potinsjele oarsaken (te breed, tailing, leading edge, ensfh.). Yn dizze ôflevering besprek ik yn detail guon fan 'e redenen dy't ik it meast sjoch. It kennen fan dizze details biedt in goed plak om te begjinnen mei probleemoplossing, mar fangt net alle mooglikheden. Lêzers dy't ynteressearre binne yn in mear yngeande list mei oarsaken en oplossingen kinne ferwize nei de LCGC "LC Troubleshooting Guide" muorrekaart.
(4) LCGC "LC Troubleshooting Guide" muorrekaart. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data-analyze en sinjaalferwurking yn chromatografy (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF en Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.