Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
Liquid biopsy (LB) is in konsept dat rap oan populariteit wint op it biomedyske mêd.It konsept is benammen basearre op it opspoaren fan fragminten fan sirkulearjend ekstrazellulêr DNA (ccfDNA), dy't benammen as lytse fragminten nei selsdea yn ferskate weefsels frijkomme.In lyts part fan dizze fragminten komt fan frjemde (bûtenlânske) weefsels of organismen.Yn it hjoeddeiske wurk hawwe wy dit konsept tapast op mossels, in sentinel-soarte bekend om har hege seewetterfiltraasjekapasiteit.Wy brûke it fermogen fan moksels om as natuerlike filters op te treden om miljeu-DNA-fragminten fan in ferskaat oan boarnen te fangen om ynformaasje te jaan oer de biodiversiteit fan marine-kust-ekosystemen.Us resultaten litte sjen dat mosselhemolymph DNA-fragminten befetsje dy't sterk ferskille yn grutte, fan 1 oant 5 kb.Shotgun sequencing die bliken dat in grut oantal DNA-fragminten binne fan bûtenlânske mikrobiële komôf.Under harren fûnen wy DNA-fragminten fan baktearjes, archaea en firussen, ynklusyf firussen dy't bekend binne om in ferskaat oan hosts te ynfektearjen dy't gewoanlik fûn wurde yn kustseekosystemen.Ta beslút, ús stúdzje docht bliken dat it konsept fan LB tapast op mossels fertsjintwurdiget in rike, mar noch net ûntdutsen boarne fan kennis oer mikrobieel ferskaat yn marine kustekosystemen.
De ynfloed fan klimaatferoaring (CC) op 'e biodiversiteit fan marine ekosystemen is in rap groeiende gebiet fan ûndersyk.Globale opwaarming feroarsaket net allinich wichtige fysiologyske spanningen, mar triuwt ek de evolúsjonêre grinzen fan 'e thermyske stabiliteit fan marine-organismen, dy't de habitat fan in oantal soarten beynfloedzje, wêrtroch't se sykje nei geunstigere omstannichheden [1, 2].Neist it beynfloedzjen fan de biodiversiteit fan metazoanen, fersteurt CC it delikate lykwicht fan host-mikrobiële ynteraksjes.Dizze mikrobiële dysbacteriosis foarmet in serieuze bedriging foar marine-ekosystemen, om't it marine-organismen gefoeliger makket foar ynfekteare patogenen [3, 4].It wurdt leaud dat SS in wichtige rol spylje yn massale deaden, wat in serieus probleem is foar it behear fan wrâldwide marine-ekosystemen [5, 6].Dit is in wichtich probleem sjoen de ekonomyske, ekologyske en fiedingseffekten fan in protte marine soarten.Dit is benammen wier foar bivalven dy't yn 'e poalregio's libje, wêr't de effekten fan CK direkte en hurder binne [6, 7].Yn feite binne bivalven lykas Mytilus spp.wurde breed brûkt om de effekten fan CC op marine-ekosystemen te kontrolearjen.Net ferrassend is in relatyf grut oantal biomarkers ûntwikkele om har sûnens te kontrolearjen, faaks mei help fan in twa-tier oanpak wêrby't funksjonele biomarkers basearre binne op enzymatyske aktiviteit of sellulêre funksjes lykas sellenviabiliteit en fagozytyske aktiviteit [8].Dizze metoaden omfetsje ek de mjitting fan 'e konsintraasje fan spesifike drukyndikatoaren dy't accumulearje yn sêfte weefsels nei de opname fan grutte hoemannichten seewetter.De hege filtraasjekapasiteit en semi-iepen sirkulaasjesysteem fan bivalven jouwe lykwols in kâns om nije hemolymph-biomarkers te ûntwikkeljen mei it konsept fan floeibere biopsie (LB), in ienfâldige en minimaal invasive oanpak foar pasjintbehear.bloedmonsters [9, 10].Hoewol ferskate soarten sirkulearjende molekulen kinne fûn wurde yn minsklike LB, is dit konsept primêr basearre op DNA-sekwinsjeanalyse fan sirkulearjende ekstrazellulêre DNA (ccfDNA) fragminten yn plasma.Yn feite is de oanwêzigens fan sirkulearjend DNA yn minsklik plasma bekend sûnt it midden fan 'e 20e ieu [11], mar it is pas yn' e lêste jierren dat de komst fan hege-throughput sequencing metoaden hat laat ta klinyske diagnoaze basearre op ccfDNA.De oanwêzigens fan dizze sirkulearjende DNA-fragminten is foar in part te tankjen oan de passive frijlitting fan genomysk DNA (kearn en mitochondrial) nei seldea. Yn sûne persoanen is de konsintraasje fan ccfDNA normaal leech (<10 ng / ml), mar kin mei 5-10 kear ferhege wurde yn pasjinten dy't lije oan ferskate patologyen of ûnderwurpen binne oan stress, wat resulteart yn weefselskea. Yn sûne persoanen is de konsintraasje fan ccfDNA normaal leech (<10 ng / ml), mar kin mei 5-10 kear ferhege wurde yn pasjinten dy't lije oan ferskate patologyen of ûnderwurpen binne oan stress, wat resulteart yn weefselskea. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/mл), но может повышаться в 5–10 serials логией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Yn sûne minsken is de konsintraasje fan cccDNA normaal leech (<10 ng / ml), mar it kin tanimme mei 5-10 kear yn pasjinten mei ferskate patologyen of ûnder stress dy't liedt ta weefsel skea.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各姍病理煄嚏嚏芗嚄嚏嚏嚗嚏嚏加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刖 手理 刖可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены yn 5-10 perioaden логиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-konsintraasjes binne normaal leech (<10 ng / ml) yn sûne persoanen, mar kinne 5-10-fâld wurde ferhege yn pasjinten mei ferskate patologyen of stress, wat resulteart yn weefselskea.De grutte fan ccfDNA-fragminten fariearret breed, mar farieart normaal fan 150 oant 200 bp.[12].Analyse fan sels-ôflaat ccfDNA, dat wol sizze, ccfDNA fan normale as transformearre hostsellen, kin brûkt wurde om genetyske en epigenetyske feroaringen te detektearjen dy't oanwêzich binne yn it nukleêre en / of mitochondriale genoom, en helpe kliïnten dêrmei spesifike molekulêre rjochte terapyen te selektearjen [13].ccfDNA kin lykwols wurde krigen fan bûtenlânske boarnen lykas ccfDNA fan fetale sellen yn 'e swierens of fan transplantearre organen [14,15,16,17].ccfDNA is ek in wichtige boarne fan ynformaasje foar it opspoaren fan de oanwêzigens fan nukleïnesoeren fan in ynfeksjeare agint (bûtenlân), wêrtroch net-invasive opspoaren fan wiidferspraat ynfeksjes net identifisearre wurde troch bloedkultueren, it foarkommen fan invasive biopsie fan ynfekteare weefsel [18].Resinte stúdzjes hawwe yndie oantoand dat minsklik bloed in rike boarne fan ynformaasje befettet dy't brûkt wurde kin om virale en baktearjende patogenen te identifisearjen, en dat sawat 1% fan it ccfDNA fûn yn minsklik plasma fan bûtenlânske komôf is [19].Dizze stúdzjes litte sjen dat de biodiversiteit fan it sirkulearjende mikrobiom fan in organisme kin wurde beoardiele mei ccfDNA-analyse.Lykwols, oant koartlyn, dit konsept waard brûkt allinnich yn minsken en, yn mindere mjitte, yn oare vertebraten [20, 21].
Yn it hjoeddeiske papier brûke wy it LB-potinsjeel om it ccfDNA fan Aulacomya atra te analysearjen, in súdlike soarte dy't gewoanlik fûn wurdt yn 'e subantarktyske Kerguelen-eilannen, in groep eilannen boppe op in grut plato dat 35 miljoen jier lyn foarme.fulkanyske útbarsting.Mei help fan in in vitro eksperiminteel systeem fûnen wy dat DNA-fragminten yn seewetter fluch opnommen wurde troch moksels en yn it hemolymph-kompartmint komme.Shotgun sequencing hat oantoand dat mossel hemolymph ccfDNA befettet DNA fragminten fan syn eigen en net-sels oarsprong, ynklusyf symbiose baktearjes en DNA fragminten út biomes typysk foar kâlde fulkanyske marine kustekosystemen.Hemolymph ccfDNA befettet ek virale sekwinsjes ôflaat fan firussen mei ferskate hostberiken.Wy fûnen ek DNA-fragminten fan mearsellige bisten lykas bonke fisken, seeanemonen, algen en ynsekten.Ta beslút, ús stúdzje toant dat it LB-konsept mei súkses kin wurde tapast op marine ynvertebraten om in ryk genomysk repertoire te generearjen yn marine-ekosystemen.
Folwoeksenen (55-70 mm lang) Mytilus platensis (M. platensis) en Aulacomya atra (A. atra) waarden sammele út de intertidal rotsige kusten fan Port-au-France (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E .).Kerguelen-eilannen yn desimber 2018. Oare folwoeksen blauwe mussels (Mytilus spp.) waarden krigen fan in kommersjele leveransier (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) en pleatst yn in temperatuer kontrolearre (4 ° C) beluchte tank mei 10-20 L fan 32‰ keunstmjittige pekel.(keunstmjittich see sâlt Reef Crystal, Instant Ocean, Firginia, Feriene Steaten).Foar elk eksperimint waarden de lingte en gewicht fan yndividuele skelpen mjitten.
In fergese protokol foar iepen tagong foar dit programma is online beskikber (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Koartsein, LB hemolymph waard sammele út abductor spieren lykas beskreaun [22].De hemolymph waard dúdlik troch centrifugaasje by 1200 × g foar 3 minuten, de supernatant waard beferzen (-20 ° C) oant gebrûk.Foar isolaasje en suvering fan cfDNA waarden samples (1.5-2.0 ml) ûntdocht en ferwurke mei it NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) neffens de ynstruksjes fan de fabrikant.ccfDNA waard opslein by -80 ° C oant fierdere analyze.Yn guon eksperiminten waard ccfDNA isolearre en suvere mei de QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Purified DNA waard kwantifisearre mei in standert PicoGreen assay.De fragmintferdieling fan it isolearre ccfDNA waard analysearre troch kapillêre elektroforese mei in Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) mei in High Sensitivity DNA Kit.De assay waard útfierd mei 1 µl fan it ccfDNA-monster neffens de ynstruksjes fan de fabrikant.
Foar sequencing fan hemolymph ccfDNA fragminten, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) taret shotgun biblioteken mei help fan de Illumina DNA Mix kit fan de Illumina MiSeq PE75 kit.In standert adapter (BioO) waard brûkt.Raw gegevensbestannen binne beskikber fan it NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 en SRR8924809).Basis lêskwaliteit waard beoardiele mei FastQC [23].Trimmomatic [24] is brûkt foar knipadapters en lêzen fan minne kwaliteit.Shotgun-lêzen mei keppele einen waarden FLASH gearfoege yn langere single-lêzen mei in minimale oerlap fan 20 bp om mismatches te foarkommen [25]. Gefoelige lêzingen waarden annotearre mei BLASTN mei in bivalve NCBI Taksonomy-database (e-wearde <1e-3 en 90% homology), en maskering fan sekwinsjes mei lege kompleksiteit waard útfierd mei DUST [26]. Gefoelige lêzingen waarden annotearre mei BLASTN mei in bivalve NCBI Taksonomy-database (e-wearde <1e-3 en 90% homology), en maskering fan sekwinsjes mei lege kompleksiteit waard útfierd mei DUST [26]. (Obъединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двулхорче 1e-3 en 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием [26]. Gepoolde lêzingen waarden annotearre mei BLASTN mei help fan de NCBI bivalve taksonomy databank (e wearde <1e-3 en 90% homology), en lege kompleksiteit folchoarder maskering waard útfierd mei help fan DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的伿唌DUST 2低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 輽濹 2行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данныхна двуNC е e <1e-3 en 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использов [26]. Gepoolde lêzingen waarden annotearre mei BLASTN mei de NCBI bivalve taksonomyske databank (e wearde <1e-3 en 90% homology), en sekwinsjemaskering mei lege kompleksiteit waard útfierd mei DUST [26].Lêzen waarden ferdield yn twa groepen: relatearre oan bivalve-sekwinsjes (hjir selslêzen neamd) en net-relatearre (net-selslêzen).Twa groepen waarden apart gearstald mei MEGAHIT om contigs te generearjen [27].Underwilens waard de taksonomyske ferdieling fan bûtenlânske mikrobiomlêzingen klassifisearre mei Kraken2 [28] en grafysk fertsjintwurdige troch in Krona-taartdiagram op Galaxy [29, 30].De optimale kmers waard bepaald as kmers-59 út ús foarriedige eksperiminten. Self contigs waarden doe identifisearre troch ôfstimming mei BLASTN (bivalve NCBI databank, e wearde <1e-10 en 60% homology) foar in definitive annotaasje. Self contigs waarden doe identifisearre troch ôfstimming mei BLASTN (bivalve NCBI databank, e wearde <1e-10 en 60% homology) foar in definitive annotaasje. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатированы с BLASTN) и гомология 60%) для окончательной аннотации. Self-contigs waarden doe identifisearre troch matching tsjin BLASTN (NCBI bivalve databank, e wearde <1e-10 en 60% homology) foar definitive annotaasje.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (BINC для BLASTN) х моллюсков, значение e <1e-10 en гомология 60%). Self-contigs waarden doe identifisearre foar definitive annotaasje troch oerienkommende tsjin BLASTN (NCBI bivalve databank, e wearde <1e-10 en 60% homology). Parallel waarden net-sels-groep-kontigs annotearre mei BLASTN (nt NCBI-database, e-wearde <1e-10 en 60% homology). Parallel waarden net-sels-groep-kontigs annotearre mei BLASTN (nt NCBI-database, e-wearde <1e-10 en 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (oant NCBI, oant <10% e.g.). Parallel waarden bûtenlânske groepkontigs annotearre mei BLASTN (NT NCBI databank, e wearde <1e-10 en 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги. и гомология 60%). Parallel waarden net-sels-groep-contigs annotearre mei BLASTN (nt NCBI-database, e-wearde <1e-10 en 60% homology). BLASTX waard ek útfierd op nonself contigs mei help fan de nr en RefSeq protein NCBI databases (e wearde <1e-10 en 60% homology). BLASTX waard ek útfierd op nonself contigs mei help fan de nr en RefSeq protein NCBI databases (e wearde <1e-10 en 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr y RefSeq NCBI (semble 1-0 NCBI) %). BLASTX waard ek útfierd op net-sels-contigs mei help fan de nr en RefSeq NCBI protein databases (e wearde <1e-10 en 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉怉 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉怉 吺 Blastx jo ôfberden by kontaktarren контигах ск с даннием баз дннием наз д д и RefSeq NCBI (зна-10 и гомология 60%). BLASTX waard ek útfierd op net-sels contigs mei help fan de nr en RefSeq NCBI protein databases (e wearde <1e-10 en 60% homology).De BLASTN- en BLASTX-pools fan net-sels-contigs fertsjintwurdigje de definitive contigs (sjoch Oanfoljende triem).
De primers brûkt foar PCR wurde neamd yn Tabel S1.Taq DNA-polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) waard brûkt om de ccfDNA-doelgenen te fersterkjen.De folgjende reaksjebetingsten waarden brûkt: denaturaasje by 95 ° C foar 3 minuten, 95 ° C foar 1 minút, set annealingtemperatuer foar 1 minút, ferlinging by 72 ° C foar 1 minút, 35 cycles, en úteinlik 72 ° C binnen 10 minuten..PCR-produkten waarden skieden troch elektroforese yn agarosegels (1.5%) mei SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) by 95 V.
Mussels (Mytilus spp.) waarden acclimatized yn 500 ml oxygenated seewetter (32 PSU) foar 24 oeren by 4 ° C.Plasmid-DNA mei in ynfoegje dy't koade foar de minsklike galectin-7 cDNA-sekwinsje (NCBI-tagongsnûmer L07769) waard tafoege oan 'e fial by in definitive konsintraasje fan 190 μg / μl.Mussels ynkubearre ûnder deselde omstannichheden sûnder DNA tafoeging wiene de kontrôle.Yn de tredde kontrôletank stie DNA sûnder moksels.Om de kwaliteit fan DNA yn seewetter te kontrolearjen, waarden seewettermonsters (20 μl; trije werhellingen) út elke tank op 'e oantsjutte tiid nommen.Foar plasmid DNA traceability, LB mossels waarden rispe op de oantsjutte tiden en analysearre troch qPCR en ddPCR.Fanwege de hege sâlt ynhâld fan seewetter, aliquots waarden verdund yn PCR kwaliteit wetter (1:10) foarôfgeand oan alle PCR assays.
Digital droplet PCR (ddPCR) waard útfierd mei it BioRad QX200 protokol (Mississauga, Ontario, Kanada).Brûk it temperatuerprofyl om de optimale temperatuer te bepalen (Tabel S1).Druppels waarden oanmakke mei in QX200 drop generator (BioRad).ddPCR waard útfierd as folget: 95 ° C foar 5 min, 50 cycles fan 95 ° C foar 30 s en in opjûne annealing temperatuer foar 1 min en 72 ° C foar 30 s, 4 ° C foar 5 min en 90 ° C binnen 5 minuten.It oantal drippen en positive reaksjes (oantal eksimplaren / µl) waard mjitten mei in QX200 drop reader (BioRad).Samples mei minder dan 10.000 druppels waarden ôfwiisd.Patroankontrôle waard net elke kear útfierd as ddPCR waard útfierd.
qPCR waard útfierd mei Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austraalje) en LGALS7 spesifike primers.Alle kwantitative PCR's waarden útfierd yn 20 µl mei de QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR waard begon mei in 15 min ynkubaasje by 95 ° C folge troch 40 syklusen by 95 ° C foar 10 sekonden en by 60 ° C foar 60 sekonden mei ien gegevenssammeling.Meltkurven waarden generearre mei opienfolgjende mjittingen by 95 ° C foar 5 s, 65 ° C foar 60 s, en 97 ° C oan 'e ein fan' e qPCR.Elke qPCR waard útfierd yn triplicate, útsein foar kontrôlemonsters.
Om't mossels bekend binne om har hege filtraasjesnelheid, hawwe wy earst ûndersocht oft se DNA-fragminten dy't yn seewetter oanwêzich binne filterje en behâlde kinne.Wy wiene ek ynteressearre yn oft dizze fragminten accumulearje yn har semi-iepen lymfesysteem.Wy hawwe dit probleem eksperiminteel oplost troch it lot te folgjen fan oplosbere DNA-fragminten tafoege oan blauwe mokseltanks.Om it folgjen fan DNA-fragminten te fasilitearjen, brûkten wy bûtenlânske (net sels) plasmide-DNA mei it minsklike galectin-7-gen.ddPCR spoart plasmid DNA-fragminten yn seewetter en mussels.Us resultaten litte sjen dat as de hoemannichte DNA-fragminten yn seewetter oer de tiid (oant 7 dagen) relatyf konstant bleau by it ûntbrekken fan moksels, dan yn 'e oanwêzigens fan moksels dit nivo binnen 8 oeren hast folslein ferdwûn (fig. 1a,b).Fragminten fan exogenous DNA waarden maklik ûntdutsen binnen 15 min yn intravalvular fluid en hemolymph (Fig. 1c).Dizze fragminten koene noch oant 4 oeren nei eksposysje wurde ûntdutsen.Dizze filteraktiviteit mei respekt foar DNA-fragminten is te fergelykjen mei de filteraktiviteit fan baktearjes en algen [31].Dizze resultaten suggerearje dat mossels frjemde DNA kinne filterje en sammelje yn har floeibere kompartementen.
Relative konsintraasjes fan plasmid DNA yn seewetter yn 'e oanwêzigens (A) of ôfwêzigens (B) fan mussels, mjitten troch ddPCR.Yn A wurde de resultaten útdrukt as persintaazjes, wêrby't de grinzen fan 'e fakjes de 75e en 25e percentiles fertsjintwurdigje.De ynrjochte logaritmyske kromme wurdt yn read toand, en it gebiet dat yn griis is skaad stiet foar it 95% betrouwensynterval.Yn B stiet de reade line foar it gemiddelde en de blauwe line stiet foar it 95% fertrouwen ynterval foar de konsintraasje.C Akkumulaasje fan plasmid DNA yn 'e hemolymph en valvulêre floeistof fan mossels op ferskillende tiden nei de tafoeging fan plasmid DNA.Resultaten wurde presintearre as absolute kopyen ûntdutsen / ml (± SE).
Dêrnei ûndersochten wy de oarsprong fan ccfDNA yn moksels sammele út mokselbêden op 'e Kerguelen-eilannen, in ôfstân groep eilannen mei beheinde antropogene ynfloed.Foar dit doel waard cccDNA fan mosselhemolymphs isolearre en suvere troch metoaden dy't gewoanlik brûkt wurde om minsklik cccDNA te suverjen [32, 33].Wy fûnen dat gemiddelde hemolymph ccfDNA-konsintraasjes yn mussels binne yn 'e lege mikrograms per ml hemolymph-berik (sjoch Tabel S2, Oanfoljende ynformaasje).Dit berik fan konsintraasjes is folle grutter dan yn sûne minsken (lege nanograms per milliliter), mar yn seldsume gefallen, yn kankerpasjinten, kin it nivo fan ccfDNA ferskate mikrogrammen per milliliter berikke [34, 35].In analyze fan 'e grutte ferdieling fan hemolymph ccfDNA liet sjen dat dizze fragminten sterk ferskille yn grutte, fariearjend fan 1000 bp oant 1000 bp.oant 5000 bp (fig. 2).Fergelykbere resultaten waarden krigen mei it silika-basearre QIAamp Investigator Kit, in metoade dy't faak brûkt wurdt yn forensyske wittenskip om genomysk DNA fluch te isolearjen en te suverjen fan DNA-samples mei lege konsintraasje, ynklusyf ccfDNA [36].
Fertsjintwurdiger ccfDNA elektroforegram fan mossel hemolymph.Ekstrahearre mei NucleoSnap Plasma Kit (boppeste) en QIAamp DNA Investigator Kit.B Fioele plot toant de ferdieling fan hemolymph ccfDNA konsintraasjes (± SE) yn mussels.De swarte en reade linen fertsjintwurdigje respektivelik de mediaan en it earste en tredde kwartyl.
Likernôch 1% fan ccfDNA yn minsken en primaten hat in bûtenlânske boarne [21, 37].Mei it each op it semi-iepen sirkulaasjesysteem fan bivalven, mikrobiaal ryk seewetter, en de grutteferdieling fan mossel ccfDNA, hawwe wy hypoteze dat mossel hemolymph ccfDNA in ryk en ferskaat pool fan mikrobiaal DNA kin befetsje.Om dizze hypoteze te testen, sekuerden wy hemolymph ccfDNA fan Aulacomya atra-monsters sammele fan 'e Kerguelen-eilannen, wat mear dan 10 miljoen lêzings oplevere, wêrfan 97.6% kwaliteitskontrôle trochjûn.De lêzingen waarden doe klassifisearre neffens sels en net-sels boarnen mei help fan de BLASTN en NCBI bivalve databases (Fig. S1, Oanfoljende ynformaasje).
By minsken kin sawol nukleêre as mitochondriale DNA yn 'e bloedstream frijlitten wurde [38].Yn 'e hjoeddeiske stúdzje wie it lykwols net mooglik om it nukleêre genomyske DNA fan mossels yn detail te beskriuwen, om't it A. atra-genoom net sequearre of beskreaun is.Wy koenen lykwols in oantal ccfDNA-fragminten fan ús eigen komôf identifisearje mei de bivalve bibleteek (Fig. S2, Oanfoljende ynformaasje).Wy befêstigje ek de oanwêzigens fan DNA-fragminten fan ús eigen komôf troch rjochte PCR-amplifikaasje fan dy A. atra-genen dy't sequearre waarden (fig. 3).Lykas, jûn dat it mitochondriale genoom fan A. atra beskikber is yn iepenbiere databases, kin men bewiis fine foar de oanwêzigens fan mitochondriale ccfDNA-fragminten yn 'e hemolymph fan A. atra.De oanwêzigens fan mitochondriale DNA-fragminten waard befêstige troch PCR-amplifikaasje (fig. 3).
Ferskate mitochondrial genen wiene oanwêzich yn de hemolymph fan A. atra (reade stippen - stock nûmer: SRX5705969) en M. platensis (blauwe stippen - stock nûmer: SRX5705968) fersterke troch PCR.Figure oanpast út Breton et al., 2011 B Amplification fan hemolymph supernatant út A. atra Opslein op FTA papier.Brûk in 3 mm-punch om direkt ta te foegjen oan 'e PCR-buis mei de PCR-mix.
Sjoen de oerfloedige mikrobiele ynhâld yn seewetter, rjochte wy ús yn it earstoan op 'e karakterisearring fan mikrobiële DNA-sekwinsjes yn hemolymph.Om dit te dwaan, brûke wy twa ferskillende strategyen.De earste strategy brûkt Kraken2, in algoritme-basearre sequence klassifikaasje programma dat kin identifisearje microbial sekwinsjes mei in krektens te fergelykjen mei BLAST en oare ark [28].Mear as 6719 lêzings waarden bepaald fan baktearjele komôf, wylst 124 en 64 fan respektivelik archaea en firussen wiene (ôfb. 4).De meast foarkommende baktearjele DNA-fragminten wiene Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) en Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Dizze ferdieling is konsistint mei eardere stúdzjes fan 'e marine blauwe mosselmikrobiom [39, 40].Gammaproteobacteria wiene de haadklasse fan Proteobacteria (44%), wêrûnder in protte Vibrionales (fig. 4b).De ddPCR-metoade befêstige de oanwêzigens fan Vibrio DNA-fragminten yn 'e ccfDNA fan A. atra hemolymph (fig. 4c) [41].Om mear ynformaasje te krijen oer de baktearjende oarsprong fan ccfDNA, waard in ekstra oanpak nommen (Fig. S2, Oanfoljende ynformaasje). Yn dit gefal, lêzen dat oerlappe waarden gearstald as paired-ein lêzen en waarden klassifisearre as fan sels (bivalven) of nonself oarsprong mei help fan BLASTN en in e wearde fan 1e-3 en in cutoff mei> 90% homology. Yn dit gefal, lêzen dat oerlappe waarden gearstald as paired-ein lêzen en waarden klassifisearre as fan sels (bivalven) of nonself oarsprong mei help fan BLASTN en in e wearde fan 1e-3 en in cutoff mei> 90% homology. ( В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами en были классивы ворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN en значения e 1e-3 en отсеченио с го 0%. Yn dit gefal waarden oerlappende lêzingen sammele as pear-einige lêzings en waarden klassifisearre as native (bivalve) as net-orizjinele mei BLASTN en e-wearde fan 1e-3 en cutoff mei> 90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒倧倢嚒值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使缄的 的 用 用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 ( В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфицвиров ые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN en 1e-3 en порога гомолога. Yn dit gefal waarden oerlappende lêzingen sammele as pear-einige lêzingen en klassifisearre as eigen (bivalven) as net-orizjinele mei e BLASTN- en 1e-3-wearden en in homology-drompel> 90%.Sûnt it A. atra-genoom noch net sekwearre is, brûkten wy de de novo-assemblagestrategy fan 'e MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler.In totaal fan 147.188 contigs binne identifisearre as ôfhinklik (bivalven) fan komôf.Dizze contigs waarden doe eksplodearre mei e-wearden fan 1e-10 mei BLASTN en BLASTX.Dizze strategy koe ús identifisearje 482 net-bivalve fragminten oanwêzich yn A. atra ccfDNA.Mear as de helte (57%) fan dizze DNA-fragminten waarden krigen fan baktearjes, benammen út gillsymbionten, ynklusyf sulfotrophyske symbionten, en fan gillsymbionten Solemya velum (fig. 5).
Relative oerfloed op type nivo.B Mikrobiaal ferskaat fan twa haadfila's (Firmicutes en Proteobacteria).Representative amplification fan ddPCR C Vibrio spp.A. Fragminten fan it 16S rRNA gen (blau) yn trije atra hemolymphs.
In totaal fan 482 sammele contigs waarden analysearre.Algemiene profyl fan 'e taksonomyske ferdieling fan metagenomyske kontigannotaasjes (prokaryoten en eukaryoten).B Detaillearre ferdieling fan baktearjele DNA-fragminten identifisearre troch BLASTN en BLASTX.
Kraken2-analyze liet ek sjen dat mossel-ccfDNA argeale DNA-fragminten befette, ynklusyf DNA-fragminten fan Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) en Thaurmarcheota (11%) (fig. 6a).De oanwêzigens fan DNA-fragminten ôflaat fan Euryarchaeota en Crenarchaeota, earder fûn yn 'e mikrobiele mienskip fan Kalifornyske mussels, soe net as in ferrassing komme moatte [42].Hoewol Euryarchaeota wurdt faak assosjearre mei ekstreme omstannichheden, is it no erkend dat sawol Euryarchaeota as Crearcheota binne ûnder de meast foarkommende prokaryoten yn 'e marine kryogene omjouwing [43, 44].De oanwêzigens fan methanogene mikroorganismen yn mossels is net ferrassend, sjoen resinte rapporten fan wiidweidige metaanlekken út boaiemlekken op it Kerguelen Plateau [45] en mooglike mikrobiële metaanproduksje waarnommen foar de kust fan 'e Kerguelen-eilannen [46].
Us oandacht ferfoel doe nei lêzingen fan DNA-firussen.Foar safier bekend is dit de earste bûten-doelstúdzje nei de firusynhâld fan moksels.As ferwachte fûnen wy DNA-fragminten fan bakteriofagen (Caudovirales) (fig. 6b).It meast foarkommende firale DNA komt lykwols út in phylum fan nukleozytofirussen, ek wol bekend as it nukleêre cytoplasmyske grut DNA-firus (NCLDV), dat it grutste genoom fan elk firus hat.Binnen dit phylum hearre de measte DNA-sekwinsjes ta de famyljes Mimimidoviridae (58%) en Poxviridae (21%), wêrfan de natuerlike gastheren vertebraten en geleedpotigen omfetsje, wylst in lyts part fan dizze DNA-sekwinsjes hearre ta bekende virologyske algen.Ynfektearret marine eukaryote algen.De sekwinsjes waarden ek krigen fan it Pandora-firus, it gigantyske firus mei de grutste genoomgrutte fan alle bekende virale genera.Ynteressant wie it berik fan hosts bekend dat se ynfekteare binne mei it firus, lykas bepaald troch hemolymph ccfDNA-sekwinsje, relatyf grut (figuer S3, Oanfoljende ynformaasje).It omfettet firussen dy't ynsekten as Baculoviridae en Iridoviridae ynfektearje, en ek firussen dy't amoeben, algen en vertebraten ynfektearje.Wy fûnen ek sekwinsjes dy't oerienkomme mei it Pithovirus sibericum-genoom.Pitoviruses (ek wol "zombiefirussen" neamd) waarden foar it earst isolearre fan 30.000 jier âlde permafrost yn Sibearje [47].Sa binne ús resultaten yn oerienstimming mei eardere rapporten dy't sjen litte dat net alle moderne soarten fan dizze firussen útstoarn binne [48] en dat dizze firussen oanwêzich wêze kinne yn subarktyske marine-ekosystemen op ôfstân.
Uteinlik hawwe wy testen om te sjen oft wy DNA-fragminten fan oare mearsellige bisten koene fine.In totaal fan 482 bûtenlânske contigs waarden identifisearre troch BLASTN en BLASTX mei nt, nr en RefSeq bibleteken (genomysk en proteïne).Us resultaten litte sjen dat ûnder de frjemde fragminten fan ccfDNA fan mearsellige bisten DNA fan bonke bonken oerhearsket (figuer 5).Der binne ek DNA-fragminten fan ynsekten en oare soarten fûn.In relatyf grut part fan 'e DNA-fragminten is net identifisearre, mooglik troch de ûnderfertsjintwurdiging fan in grut oantal marinesoarten yn genomyske databanken yn ferliking mei terrestryske soarten [49].
Yn it hjoeddeiske papier tapasse wy it LB-konsept op mossels, mei it argumint dat sequencing fan hemolymph ccfDNA-skotsekwinsjes ynsjoch kinne jaan yn 'e gearstalling fan marine-kust-ekosystemen.Yn it bysûnder, wy fûnen dat 1) mossel hemolymph befettet relatyf hege konsintraasjes (mikrogram nivo) fan relatyf grutte (~ 1-5 kb) circulating DNA fragminten;2) dizze DNA-fragminten binne sawol ûnôfhinklik as net-ûnôfhinklik.4) De accumulation fan dizze frjemde ccfDNA-fragminten yn 'e hemolymph komt rap foar en draacht by oan de ynterne filteraktiviteit fan mussels.Ta beslút, ús stúdzje docht bliken dat it konsept fan LB, dat is oant no ta benammen tapast op it mêd fan biomedicine, kodearret in rike, mar net ûndersocht boarne fan kennis dy't kin brûkt wurde om better begripe de ynteraksje tusken sentinel soarten en harren omjouwing.
Neist primaten is ccfDNA-isolaasje rapportearre yn sûchdieren, ynklusyf mûzen, hûnen, katten en hynders [50, 51, 52].Lykwols, nei ús kennis, is ús stúdzje de earste dy't de deteksje en sequencing fan ccfDNA rapportearret yn marine soarten mei in iepen sirkulaasjesysteem.Dizze anatomyske funksje en filterfeardigens fan moksels kinne, op syn minst foar in part, de ferskillende grutte skaaimerken fan sirkulearjende DNA-fragminten ferklearje yn ferliking mei oare soarten.By minsken binne de measte DNA-fragminten dy't yn it bloed sirkulearje lytse fragminten dy't yn grutte fariearje fan 150 oant 200 bp.mei in maksimum pyk fan 167 bp [34, 53].In lyts mar signifikant diel fan DNA-fragminten binne tusken 300 en 500 bp yn grutte, en sa'n 5% is langer dan 900 bp.[54].De reden foar dizze grutte ferdieling is dat de wichtichste boarne fan ccfDNA yn plasma foarkomt as gefolch fan selde dea, itsij troch seldea of ​​troch nekrose fan sirkulearjende hematopoietyske sellen yn sûne persoanen of troch apoptose fan tumorsellen yn kankerpasjinten (bekend as sirkulearjende tumor DNA)., ctDNA).De grutte ferdieling fan hemolymph ccfDNA dy't wy fûnen yn mossels rûn fan 1000 oant 5000 bp, wat suggerearret dat mossel ccfDNA in oare oarsprong hat.Dit is in logyske hypoteze, om't mossels in semi-iepen vaskulêr systeem hawwe en libje yn marine akwatyske omjouwings mei hege konsintraasjes fan mikrobiaal genomysk DNA.Yn feite hawwe ús laboratoariumeksperiminten mei eksogene DNA sjen litten dat mossels DNA-fragminten sammelje yn seewetter, op syn minst nei in pear oeren wurde se nei sellulêre opname degradearre en/of frijlitten en/of opslein yn ferskate organisaasjes.Mei it each op de seldsumheid fan sellen (sawol prokaryotyske as eukaryotyske), sil it gebrûk fan intravalvulêre kompartementen de hoemannichte ccfDNA fan selsboarnen as fan bûtenlânske boarnen ferminderje.Yn betinken nommen fan it belang fan bivalve oanberne immuniteit en it grutte oantal sirkulearjende fagocytes, wy fierder hypoteze dat sels bûtenlânske ccfDNA wurdt ferrike yn sirkulearjende fagocytes dy't sammelje frjemde DNA by ynname fan mikro-organismen en / of sellulêre pún.Mei-inoar litte ús resultaten sjen dat bivalve hemolymph ccfDNA in unyk repository is fan molekulêre ynformaasje en fersterket har status as in sentinel-soarte.
Us gegevens jouwe oan dat sequencing en analyse fan baktearje-ôflaat hemolymph ccfDNA-fragminten wichtige ynformaasje kinne leverje oer de baktearjele flora fan 'e host en de baktearjes oanwêzich yn it omlizzende marine-ekosysteem.Shot sequencing techniken hawwe iepenbiere sekwinsjes fan de commensal baktearjes A. atra gill dat soe hawwe mist as konvinsjonele 16S rRNA identifikaasje metoaden hie west brûkt, fanwege in part fan in referinsje bibleteek bias.Yn feite, ús gebrûk fan LB gegevens sammele út M. platensis yn deselde moksellaach by Kerguelen die bliken dat de gearstalling fan gill-assosjearre baktearjele symbionten wie itselde foar beide mokselsoarten (Fig. S4, Oanfoljende ynformaasje).Dizze oerienkomst fan twa genetysk ferskillende moksels kin de gearstalling fan baktearjende mienskippen reflektearje yn 'e kâlde, sulverige en fulkanyske ôfsettings fan Kerguelen [55, 56, 57, 58].Hegere nivo's fan swevelferminderende mikroorganismen binne goed beskreaun by it rispjen fan moksels út bioturbearre kustgebieten [59], lykas de kust fan Port-au-France.In oare mooglikheid is dat de kommensale mokselflora beynfloede wurde kin troch horizontale oerdracht [60, 61].Mear ûndersyk is nedich om de korrelaasje te bepalen tusken it marineomjouwing, it oerflak fan 'e seeboaiem, en de gearstalling fan symbioatyske baktearjes yn moksels.Dizze stúdzjes binne op it stuit oanhâldend.
De lingte en konsintraasje fan hemolymph ccfDNA, har gemak fan suvering, en hege kwaliteit om rappe shotgun-sekwinsje mooglik te meitsjen binne guon fan 'e protte foardielen fan it brûken fan mossel ccfDNA om biodiversiteit te beoardieljen yn marine kustekosystemen.Dizze oanpak is benammen effektyf foar karakterisearjen fan virale mienskippen (viromes) yn in opjûn ekosysteem [62, 63].Oars as baktearjes, archaea en eukaryoten, befetsje virale genomen gjin fylogenetysk bewarre genen lykas 16S-sekwinsjes.Us resultaten jouwe oan dat floeibere biopsieën fan yndikatorsoarten lykas mossels kinne wurde brûkt om relatyf grutte oantallen ccfDNA-firusfragminten te identifisearjen dy't bekend binne om hosts te ynfektearjen dy't typysk kust-mariene ekosystemen bewenje.Dit omfettet firussen dy't bekend binne om protozoa, arthropods, ynsekten, planten en bakteriële firussen (bygelyks bakteriofagen) te ynfektearjen.In ferlykbere ferdieling waard fûn doe't wy ûndersocht de hemolymph ccfDNA virome fan blauwe mussels (M. platensis) sammele yn deselde mossel laach by Kerguelen (Tabel S2, Oanfoljende ynformaasje).Shotgun-sekwinsje fan ccfDNA is yndie in nije oanpak dy't momentum wint yn 'e stúdzje fan' e virome fan minsken as oare soarten [21, 37, 64].Dizze oanpak is benammen nuttich foar it bestudearjen fan dûbelstrengige DNA-firussen, om't gjin inkeld gen bewarre wurdt ûnder alle dûbelstrengige DNA-firussen, dy't de meast ferskaat en brede klasse fan firussen yn Baltimore fertsjintwurdigje [65].Hoewol de measte fan dizze firussen net klassifisearre bliuwe en firussen kinne befetsje fan in folslein ûnbekend diel fan 'e virale wrâld [66], fûnen wy dat de viromes en hostberiken fan 'e mussels A. atra en M. platensis tusken de twa soarten falle.similarly (sjoch figuer S3, oanfoljende ynformaasje).Dizze oerienkomst is net ferrassend, om't it in gebrek oan selektiviteit kin reflektearje yn opname fan DNA oanwêzich yn 'e omjouwing.Takomstige stúdzjes mei suvere RNA binne op it stuit nedich om it RNA-virome te karakterisearjen.
Yn ús stúdzje brûkten wy in heul strange pipeline oanpast fan it wurk fan Kowarski en kollega's [37], dy't in twa-stapke wiskjen brûkte fan poolde lêzings en contigs foar en nei gearstalling fan lânseigen ccfDNA, wat resulteart yn in heech oanpart fan unmapped lêzen.Dêrom kinne wy ​​net útslute dat guon fan dizze net-kaartlêzen noch har eigen oarsprong hawwe kinne, benammen om't wy gjin referinsjegenoom hawwe foar dizze mokselsoarte.Wy hawwe dizze pipeline ek brûkt om't wy soargen wiene oer de chimeras tusken sels- en net-sels-lêzen en de lêslingten generearre troch de Illumina MiSeq PE75.In oare reden foar de mearderheid fan uncharted lêzings is dat in protte fan 'e marine mikroben, benammen yn ôfstân gebieten lykas Kerguelen, binne net annotearre.Wy brûkten Illumina MiSeq PE75, oannommen dat ccfDNA-fragminten fergelykber binne mei minsklike ccfDNA.Foar takomstige stúdzjes, sjoen ús resultaten dy't sjen litte dat hemolymph ccfDNA langer lêzen hat dan minsken en / of sûchdieren, riede wy oan om in sequencing-platfoarm te brûken dat mear geskikt is foar langere ccfDNA-fragminten.Dizze praktyk sil it folle makliker meitsje om mear oanwizings te identifisearjen foar djipper analyse.It krijen fan de op it stuit net beskikbere folsleine A. atra nukleêre genome-sekwinsje soe ek de diskriminaasje fan ccfDNA út sels en net-sels boarnen fasilitearje.Mei it each op dat ús ûndersyk rjochte hat op de mooglikheid fan it tapassen fan it konsept fan floeibere biopsie op mossels, hoopje wy dat as dit konsept wurdt brûkt yn takomstich ûndersyk, nije ark en pipelines sille wurde ûntwikkele om it potinsjeel fan dizze metoade te fergrutsjen om de mikrobiale ferskaat fan mussels te studearjen.marine ekosysteem.
As net-invasive klinyske biomarker binne ferhege minsklike plasmanivo's fan ccfDNA ferbûn mei ferskate sykten, weefselskea, en stressbetingsten [67,68,69].Dizze ferheging is ferbûn mei de frijlitting fan DNA-fragminten fan har eigen komôf nei weefselskea.Wy hawwe dit probleem oanpakt mei acute waarmtestress, wêrby't moksels koart bleatsteld waarden oan in temperatuer fan 30 °C.Wy hawwe dizze analyze útfierd op trije ferskillende soarten moksels yn trije ûnôfhinklike eksperiminten.Wy fûnen lykwols gjin feroaring yn ccfDNA-nivo's nei acute waarmtestress (sjoch figuer S5, oanfoljende ynformaasje).Dizze ûntdekking kin, op syn minst foar in part, it feit ferklearje dat mossels in semi-iepen sirkulaasjesysteem hawwe en grutte hoemannichten bûtenlânske DNA sammelje troch har hege filteraktiviteit.Oan 'e oare kant kinne mossels, lykas in protte ynvertebraten, mear resistint wêze foar stress-induzearre tissue-skea, en beheine dêrmei de frijlitting fan ccfDNA yn har hemolymph [70, 71].
Oant no ta hat DNA-analyse fan biodiversiteit yn akwatyske ekosystemen benammen rjochte op miljeu-DNA (eDNA) metabarcoding.Dizze metoade is lykwols normaal beheind yn biodiversiteitsanalyse as primers wurde brûkt.It brûken fan shotgun sequencing omgiet de beheiningen fan PCR en de biased seleksje fan primer sets.Sa, yn in sin, ús metoade is tichter by de koartlyn brûkte hege-throughput eDNA Shotgun sequencing metoade, dy't by steat is om direkt sequence fragminten DNA en analysearje hast alle organismen [72, 73].D'r binne lykwols in oantal fûnemintele problemen dy't LB ûnderskiede fan standert eDNA-metoaden.Fansels is it wichtichste ferskil tusken eDNA en LB it gebrûk fan natuerlike filterhosts.It gebrûk fan marine soarten lykas sponges en bivalven (Dresseina spp.) As in natuerlik filter foar it studearjen fan eDNA is rapportearre [74, 75].De stúdzje fan Dreissena brûkte lykwols weefselbiopsjes dêr't DNA út helle waard.Analyse fan ccfDNA fan LB fereasket gjin weefselbiopsy, spesjalisearre en soms djoere apparatuer en logistyk ferbûn mei eDNA of weefselbiopsy.Yn feite hawwe wy koartlyn rapporteare dat ccfDNA fan LB kin wurde opslein en analysearre mei FTA-stipe sûnder in kâlde ketting te behâlden, wat in grutte útdaging is foar ûndersyk yn ôfstângebieten [76].De ekstraksje fan ccfDNA út floeibere biopsies is ek ienfâldich en leveret DNA fan hege kwaliteit foar shotgun sequencing en PCR-analyse.Dit is in grut foardiel sjoen guon fan 'e technyske beheiningen ferbûn mei eDNA-analyze [77].De ienfâld en lege kosten fan 'e samplingmetoade is ek benammen geskikt foar programma's foar monitoring op lange termyn.Njonken har hege filterfermogen is in oare bekende skaaimerk fan bivalven de gemyske mucopolysaccharide-komposysje fan har slym, dy't de opname fan firussen befoarderet [78, 79].Dit makket bivalven in ideaal natuerlik filter foar it karakterisearjen fan biodiversiteit en de ynfloed fan klimaatferoaring yn in bepaald akwatysk ekosysteem.Hoewol de oanwêzigens fan host-ôflaat DNA-fragminten kin wurde sjoen as in beheining fan 'e metoade yn ferliking mei eDNA, de kosten ferbûn mei it hawwen fan sa'n lânseigen ccfDNA yn ferliking mei eDNA is tagelyk begryplik foar de grutte hoemannichte ynformaasje beskikber foar sûnensstúdzjes.offset host.Dit omfettet de oanwêzigens fan virale sekwinsjes yntegreare yn it genoom fan 'e gasthear.Dit is benammen wichtich foar moksels, sjoen de oanwêzigens fan horizontaal oerdroegen leukemyske retrofirussen yn bivalven [80, 81].In oar foardiel fan LB boppe eDNA is dat it de fagozytyske aktiviteit fan sirkulearjende bloedsellen yn 'e hemolymph eksploitearret, dy't mikroorganismen (en har genomen) opsmyt.Phagocytosis is de wichtichste funksje fan bloedsellen yn bivalven [82].Uteinlik profiteart de metoade fan 'e hege filterkapasiteit fan moksels (gemiddeld 1,5 l / h seewetter) en twa-dagen sirkulaasje, dy't it mingen fan ferskate lagen seewetter ferheegje, wêrtroch it fangen fan heterolooch eDNA mooglik is.[83, 84].Sa is mossel ccfDNA-analyse in nijsgjirrige avenue sjoen de fiedings-, ekonomyske en miljeu-ynfloeden fan mossels.Fergelykber mei de analyze fan LB sammele fan minsken, iepenet dizze metoade ek de mooglikheid om genetyske en epigenetyske feroaringen yn host-DNA te mjitten yn reaksje op eksogene stoffen.Bygelyks, tredde-generaasje sequencing technologyen kinne wurde foarsjoen te fieren genome-wide methylation analyze yn lânseigen ccfDNA mei help fan nanopore sequencing.Dit proses moat wurde fasilitearre troch it feit dat de lingte fan 'e mossel ccfDNA fragminten is by útstek kompatibel mei lang-lêzen sequencing platfoarms dy't tastean genome-wide DNA methylation analyze fan in inkele sequencing run sûnder de needsaak foar gemyske transformaasjes.Dêrom kin it weardefolle ynsjoch leverje yn 'e ûnderlizzende meganismen dy't reageare nei bleatstelling oan klimaatferoaring of fersmoarging [87].It gebrûk fan LB is lykwols net sûnder beheiningen.It is ûnmooglik om te sizzen dat dit de oanwêzigens fan yndikatorsoarten yn it ekosysteem fereasket.Lykas hjirboppe neamd, fereasket it brûken fan LB om de biodiversiteit fan in bepaald ekosysteem te beoardieljen ek in strange bioinformatika-pipeline dy't rekken hâldt mei de oanwêzigens fan DNA-fragminten út 'e boarne.In oar grut probleem is de beskikberens fan referinsjegenoom foar marine soarten.It wurdt hope dat inisjativen lykas it Marine Mammal Genomes Project en it koartlyn oprjochte Fish10k-projekt [88] sokke analyse yn 'e takomst sille fasilitearje.De tapassing fan it LB-konsept foar organismen dy't marinefilter fiede is ek kompatibel mei de lêste foarútgong yn sequencing technology, wêrtroch it goed geskikt is foar de ûntwikkeling fan multi-ohm biomarkers om wichtige ynformaasje te jaan oer de sûnens fan marine habitats yn reaksje op miljeu stress.
Genome-sekwinsjegegevens binne deponearre yn it NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ûnder Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impact fan klimaatferoaring op marine libben en ekosystemen.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Beskôgje de kombineare gefolgen fan klimaatferoaring en oare pleatslike stressors op it marineomjouwing.algemiene wittenskiplike omjouwing.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Wittenskip fan 'e earste maart.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Fermindere waarmtetolerânsje ûnder repetitive waarmte-stressbetingsten ferklearret de hege simmerstjerte fan blauwe mussels.Wittenskiplik rapport 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Resinte feroarings yn 'e frekwinsje, oarsaken en omfang fan dierdeaden.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Meardere net-soarte-spesifike patogenen kinne massale mortaliteit fan Pinna nobilis feroarsake hawwe.Libben.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potinsjele ynfloed fan klimaatferoaring op Arktyske zoonotyske sykten.Int J Circumpolar sûnens.2005;64:468–77.
Beyer J, Greene NW, Brooks S, Allan IJ, Ruus A, Gomez T, et al.Blauwe mussels (Mytilus edulis spp.) as sinjaalorganismen yn kontrôle fan kustfersmoarging: in resinsje.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integration of liquid biopsy in cancer treatment.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Maturation fan floeibere biopsie: lit tumor DNA sirkulearje.Nat Rev Kanker.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nucleic soeren yn minsklik plasma.Gearkomste notulen fan Soc Biol dochterûndernimmingen.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. In nije rol foar selfrij DNA as molekulêre marker foar kankerbehanneling.Kwantifikaasje fan biomolêre analyze.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy komt de klinyk yn - ymplemintaasjeproblemen en takomstige útdagings.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW, et al.Fetal DNA is oanwêzich yn memme plasma en serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR.Dopediatrie.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Flüssige biopsie: donorselfrije DNA wurdt brûkt om allogeneic lesions te detektearjen yn in niergraft.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Ynnovaasjes yn prenatale diagnostyk: maternal plasma genome sequencing.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Snelle opspoaring fan patroanen mei metagenomyske folchoarder fan folgjende generaasje fan ynfekteare lichemsfluids.Nat Medicine.2021;27:115-24.