Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining riede wy jo oan om in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
Floeibere biopsie (LB) is in konsept dat rap oan populariteit wint yn 'e biomedyske sektor. It konsept is benammen basearre op it opspoaren fan fragminten fan sirkulearjend ekstrasellulêr DNA (ccfDNA), dy't benammen as lytse fragminten frijkomme nei seldea yn ferskate weefsels. In lyts part fan dizze fragminten komt fan frjemde (frjemde) weefsels of organismen. Yn it hjoeddeiske wurk hawwe wy dit konsept tapast op mossels, in sentinelsoarte dy't bekend stiet om har hege seewetterfiltraasjekapasiteit. Wy brûke it fermogen fan mossels om as natuerlike filters te fungearjen om miljeu-DNA-fragminten út ferskate boarnen te fangen om ynformaasje te jaan oer de biodiversiteit fan marine kustekosystemen. Us resultaten litte sjen dat mosselshemolymfe DNA-fragminten befettet dy't sterk fariearje yn grutte, fan 1 oant 5 kb. Shotgun-sekwinsje liet sjen dat in grut oantal DNA-fragminten fan frjemde mikrobiële oarsprong binne. Under harren fûnen wy DNA-fragminten fan baktearjes, archaea en firussen, ynklusyf firussen dy't bekend binne om in ferskaat oan gastheren te ynfektearjen dy't gewoanlik fûn wurde yn kustmarine-ekosystemen. Konklúzjend lit ús stúdzje sjen dat it konsept fan LB tapast op mossels in rike, mar noch ûnûndersochte boarne fan kennis foarmet oer mikrobiële ferskaat yn marine kustekosystemen.
De ynfloed fan klimaatferoaring (CC) op 'e biodiversiteit fan marine ekosystemen is in rap groeiend ûndersyksgebiet. Globale opwaarming feroarsaket net allinich wichtige fysiologyske stress, mar ferskowt ek de evolúsjonêre grinzen fan 'e termyske stabiliteit fan marine organismen, wêrtroch't it habitat fan in oantal soarten beynfloede wurdt, wêrtroch't se sykje nei geunstiger omstannichheden [1, 2]. Neist it beynfloedzjen fan 'e biodiversiteit fan metazoa, fersteurt CC it delikate lykwicht fan gasthear-mikrobiële ynteraksjes. Dizze mikrobiële dysbakteriose foarmet in serieuze bedriging foar marine ekosystemen, om't it marine organismen gefoeliger makket foar ynfekteare patogenen [3, 4]. Der wurdt leaud dat SS in wichtige rol spilet by massa-dea, wat in serieus probleem is foar it behear fan wrâldwide marine ekosystemen [5, 6]. Dit is in wichtich probleem sjoen de ekonomyske, ekologyske en fiedingseffekten fan in protte marine soarten. Dit jildt foaral foar bivalven dy't yn 'e poalregio's libje, dêr't de effekten fan CK direkter en earnstiger binne [6, 7]. Eins wurde bivalven lykas Mytilus spp. in soad brûkt om de effekten fan CC op marine ekosystemen te kontrolearjen. Net ferrassend is in relatyf grut oantal biomarkers ûntwikkele om har sûnens te kontrolearjen, faak mei in twa-laags oanpak dy't funksjonele biomarkers omfettet basearre op enzymatyske aktiviteit of sellulêre funksjes lykas sellibensfetberens en fagocytyske aktiviteit [8]. Dizze metoaden omfetsje ek de mjitting fan 'e konsintraasje fan spesifike drukindikatoaren dy't opbouwe yn sêfte weefsels nei de opname fan grutte hoemannichten seewetter. De hege filtraasjekapasiteit en it heal-iepene sirkulaasjesysteem fan bivalven biede lykwols in kâns om nije hemolymfebiomarkers te ûntwikkeljen mei it konsept fan floeibere biopsie (LB), in ienfâldige en minimaal invasive oanpak foar pasjintbehear. bloedmonsters [9, 10]. Hoewol ferskate soarten sirkulearjende molekulen te finen binne yn minsklike LB, is dit konsept primêr basearre op DNA-sekwinsjeanalyse fan sirkulearjende ekstrasellulêre DNA (ccfDNA) fragminten yn plasma. Eins is de oanwêzigens fan sirkulearjend DNA yn minsklik plasma bekend sûnt midden 20e iuw [11], mar it is pas yn 'e lêste jierren dat de komst fan hege-trochput sekwinsjemetoaden hat laat ta klinyske diagnoaze basearre op ccfDNA. De oanwêzigens fan dizze sirkulearjende DNA-fragminen is foar in part te tankjen oan de passive frijlitting fan genomysk DNA (nukleêr en mitochondriaal) nei seldea. By sûne persoanen is de konsintraasje fan ccfDNA normaal leech (<10 ng/mL), mar kin mei 5-10 kear ferhege wurde by pasjinten dy't lije oan ferskate patologyen of bleatsteld binne oan stress, wat resulteart yn weefselskea. By sûne persoanen is de konsintraasje fan ccfDNA normaal leech (<10 ng/mL), mar kin mei 5-10 kear ferhege wurde by pasjinten dy't lije oan ferskate patologyen of bleatsteld binne oan stress, wat resulteart yn weefselskea. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/mл), но может повышаться в 5–10 сразунся патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. By sûne minsken is de konsintraasje fan cccDNA normaal leech (<10 ng/mL), mar it kin mei 5-10 kear tanimme by pasjinten mei ferskate patologyen of ûnder stress dy't liedt ta weefselskea.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导燴㻄在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刖 扊 倅刖中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены yn 5-10 perioaden патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-konsintraasjes binne meastentiids leech (<10 ng/ml) by sûne persoanen, mar kinne 5-10 kear ferhege wêze by pasjinten mei ferskate patologyen of stress, wat resulteart yn weefselskea.De grutte fan ccfDNA-fragminen fariëarret sterk, mar farieart meastal fan 150 oant 200 bp. [12]. Analyse fan sels-ôflaat ccfDNA, d.w.s. ccfDNA fan normale of transformearre gasthearsellen, kin brûkt wurde om genetyske en epigenetyske feroarings te detektearjen dy't oanwêzich binne yn it nukleêre en/of mitochondriale genoom, wêrtroch klinisy helpe by it selektearjen fan spesifike molekulêr-rjochte terapyen [13]. CcfDNA kin lykwols wurde krigen fan frjemde boarnen lykas ccfDNA fan fetale sellen tidens swangerskip of fan transplantearre organen [14,15,16,17]. ccfDNA is ek in wichtige boarne fan ynformaasje foar it detektearjen fan 'e oanwêzigens fan nukleïnesoeren fan in ynfeksjeus agint (frjemd), wat net-invasive deteksje fan wiidfersprate ynfeksjes mooglik makket dy't net identifisearre binne troch bloedkultueren, wêrtroch invasive biopsie fan ynfekteare weefsel foarkommen wurdt [18]. Resinte stúdzjes hawwe yndie oantoand dat minsklik bloed in rike boarne fan ynformaasje befettet dy't brûkt wurde kin om firale en baktearjele patogenen te identifisearjen, en dat sawat 1% fan 'e ccfDNA fûn yn minsklik plasma fan frjemde oarsprong is [19]. Dizze stúdzjes litte sjen dat de biodiversiteit fan it sirkulearjende mikrobioom fan in organisme beoardiele wurde kin mei ccfDNA-analyze. Oant koartlyn waard dit konsept lykwols allinnich brûkt by minsken en, yn mindere mate, by oare rêchbonken [20, 21].
Yn dit artikel brûke wy de LB-potinsjeel om it ccfDNA fan Aulacomya atra te analysearjen, in súdlike soarte dy't gewoanlik fûn wurdt yn 'e subantarktyske Kerguelen-eilannen, in groep eilannen boppe op in grut plateau dat 35 miljoen jier lyn ûntstien is. fulkaanútbarsting. Mei help fan in in vitro eksperiminteel systeem hawwe wy fûn dat DNA-fragminen yn seewetter fluch opnommen wurde troch mossels en it hemolymfekompartimint yngeane. Shotgun-sekwinsjearring hat oantoand dat mossels-hemolymfe-ccfDNA DNA-fragminen fan eigen en net-selsoarsprong befettet, ynklusyf symbiotyske baktearjes en DNA-fragminen út biomen dy't typysk binne foar kâlde fulkanyske marine kust-ekosystemen. Hemolymfe-ccfDNA befettet ek firale sekwinsjes ôflaat fan firussen mei ferskate gasthearberiken. Wy hawwe ek DNA-fragminen fûn fan mearsellulêre bisten lykas bonkfisken, seeanemonen, algen en ynsekten. Konklúzjend lit ús stúdzje sjen dat it LB-konsept mei súkses tapast wurde kin op marine ynvertebraten om in ryk genomysk repertoire yn marine ekosystemen te generearjen.
Folwoeksenen (55-70 mm lang) Mytilus platensis (M. platensis) en Aulacomya atra (A. atra) waarden sammele fan 'e yntertidale rotsige kusten fan Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.). Kergueleneilannen yn desimber 2018. Oare folwoeksen blauwe mossels (Mytilus spp.) waarden krigen fan in kommersjele leveransier (PEI Mussel King Inc., Prins Edwardeilân, Kanada) en pleatst yn in temperatuerkontroleare (4°C) beluchte tank mei 10-20 L 32‰ keunstmjittige pekel. (keunstmjittich seesâlt Reef Crystal, Instant Ocean, Firginia, Feriene Steaten). Foar elk eksperimint waarden de lingte en it gewicht fan yndividuele skelpen metten.
In fergees iepen tagongsprotokol foar dit programma is online beskikber (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Koartsein, LB-hemolymfe waard sammele út abduktorspieren lykas beskreaun [22]. De hemolymfe waard klarifisearre troch sintrifugaasje by 1200 × g foar 3 minuten, de supernatant waard beferzen (-20 °C) oant gebrûk. Foar isolaasje en suvering fan cfDNA waarden samples (1.5-2.0 ml) ûntdooid en ferwurke mei de NucleoSnap cfDNA-kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant. ccfDNA waard opslein by -80 °C oant fierdere analyze. Yn guon eksperiminten waard ccfDNA isolearre en suvere mei de QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Suvere DNA waard kwantifisearre mei in standert PicoGreen-assay. De fragmintferdieling fan it isolearre ccfDNA waard analysearre troch kapillêre elektroforese mei in Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) mei in High Sensitivity DNA Kit. De assay waard útfierd mei 1 µl fan it ccfDNA-monster neffens de ynstruksjes fan de fabrikant.
Foar it sekwinsjearjen fan hemolymfe ccfDNA-fragminen hat Genome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) shotgun-bibleteken taret mei de Illumina DNA Mix-kit fan 'e Illumina MiSeq PE75-kit. In standertadapter (BioO) waard brûkt. Rauwe gegevensbestannen binne beskikber fan it NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 en SRR8924809). Basislêskwaliteit waard beoardiele mei FastQC [23]. Trimmomatic [24] is brûkt foar it knippen fan adapters en lêzingen fan minne kwaliteit. Shotgun-lêzingen mei pearde einen waarden FLASH gearfoege ta langere ienige lêzingen mei in minimale oerlaap fan 20 bp om mismatches te foarkommen [25]. Gearfoege lêzingen waarden annotearre mei BLASTN mei in bivalve NCBI Taxonomy-database (e-wearde < 1e−3 en 90% homology), en maskering fan leechkomplekse sekwinsjes waard útfierd mei DUST [26]. Gearfoege lêzingen waarden annotearre mei BLASTN mei in bivalve NCBI Taxonomy-database (e-wearde < 1e−3 en 90% homology), en maskering fan leechkomplekse sekwinsjes waard útfierd mei DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двулхорча (snaчение e < 1e-3 en 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельо с ис. Gearfoege lêzingen waarden annotearre mei BLASTN mei help fan 'e NCBI bivalve taksonomydatabase (e-wearde < 1e-3 en 90% homology), en leechkomplekse sekwinsjemaskering waard útfierd mei DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的伿嶔稕2]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 读濹 2]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных давункор (ûnthâld e <1e-3 en 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельнель с исп6]. Gearfoege lêzingen waarden annotearre mei BLASTN mei help fan 'e NCBI bivalve taksonomyske database (e-wearde <1e-3 en 90% homology), en lege kompleksiteit sekwinsjemaskering waard útfierd mei DUST [26].Lêzingen waarden ferdield yn twa groepen: relatearre oan bivalve sekwinsjes (hjir selslêzingen neamd) en net-relatearre (net-selslêzingen). Twa groepen waarden apart gearstald mei MEGAHIT om contigs te generearjen [27]. Underwilens waard de taksonomyske ferdieling fan frjemde mikrobioomlêzingen klassifisearre mei Kraken2 [28] en grafysk fertsjintwurdige troch in Krona-taartdiagram op Galaxy [29, 30]. De optimale kmers waarden bepaald as kmers-59 út ús foarriedige eksperiminten. Sels-contigs waarden doe identifisearre troch ôfstimming mei BLASTN (bivalve NCBI-database, e-wearde < 1e−10 en 60% homology) foar in definitive annotaasje. Sels-contigs waarden doe identifisearre troch ôfstimming mei BLASTN (bivalve NCBI-database, e-wearde < 1e−10 en 60% homology) foar in definitive annotaasje. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатлию <1e-10 и гомология 60%) foar окончательной аннотации. Self-contigs waarden doe identifisearre troch fergeliking mei BLASTN (NCBI bivalve-database, e-wearde <1e-10 en 60% homology) foar definitive annotaasje.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (ByNC foar BLASTN) двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 en гомология 60%). Self-contigs waarden doe identifisearre foar definitive annotaasje troch oerienkomst mei BLASTN (NCBI bivalve-database, e-wearde <1e-10 en 60% homology). Parallel waarden net-selsgroep-contigs annotearre mei BLASTN (nt NCBI-database, e-wearde < 1e−10 en 60% homology). Parallel waarden net-selsgroep-contigs annotearre mei BLASTN (nt NCBI-database, e-wearde < 1e−10 en 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (oant NCBI, 1 jannewaris 10 jannewaris 2010) 60%). Parallel waarden frjemde groepcontigs annotearre mei BLASTN (NT NCBI-database, e-wearde <1e-10 en 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныNC) <1e-10 и гомология 60%). Parallel waarden net-selsgroep-contigs annotearre mei BLASTN (nt NCBI-database, e-wearde <1e-10 en 60% homology). BLASTX waard ek útfierd op net-sels-contigs mei help fan 'e nr- en RefSeq-proteïne NCBI-databases (e-wearde < 1e−10 en 60% homology). BLASTX waard ek útfierd op net-sels-contigs mei help fan 'e nr- en RefSeq-proteïne NCBI-databases (e-wearde < 1e−10 en 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (sehn <1e-0eие) гомология 60%). BLASTX waard ek útfierd op net-sels-contigs mei help fan de nr- en RefSeq NCBI-proteïnedatabases (e-wearde < 1e-10 en 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉怉 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉怉 吺 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr en RefSeq NCBI (jild <1e-1jе гомология 60%). BLASTX waard ek útfierd op net-sels-contigs mei help fan de nr- en RefSeq NCBI-proteïnedatabases (e-wearde <1e-10 en 60% homology).De BLASTN- en BLASTX-pools fan net-sels-contigs fertsjintwurdigje de definitive contigs (sjoch Oanfoljend bestân).
De primers dy't brûkt binne foar PCR binne neamd yn tabel S1. Taq DNA-polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) waard brûkt om de ccfDNA-doelgenen te amplifisearjen. De folgjende reaksjebetingsten waarden brûkt: denaturaasje by 95 °C foar 3 minuten, 95 °C foar 1 minút, ynstelde annealingtemperatuer foar 1 minút, ferlinging by 72 °C foar 1 minút, 35 syklusen, en úteinlik 72 °C binnen 10 minuten. PCR-produkten waarden skieden troch elektroforese yn agarosegels (1,5%) mei SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) by 95 V.
Mossels (Mytilus spp.) waarden 24 oeren by 4°C akklimatisearre yn 500 ml soerstofryk seewetter (32 PSU). Plasmide-DNA mei in ynfoegsel dat kodearret foar de minsklike galectine-7 cDNA-sekwinsje (NCBI-tagongsnûmer L07769) waard tafoege oan it fleske mei in definitive konsintraasje fan 190 μg/μl. Mossels dy't ûnder deselde omstannichheden sûnder DNA-tafoeging ynkubearre waarden, wiene de kontrôle. De tredde kontrôletank befette DNA sûnder mossels. Om de kwaliteit fan DNA yn seewetter te kontrolearjen, waarden seewettermonsters (20 μl; trije werhellingen) út elke tank nommen op it oanjûne tiidstip. Foar traceerberens fan plasmide-DNA waarden LB-mossels op 'e oanjûne tiden rispe en analysearre mei qPCR en ddPCR. Fanwegen it hege sâltgehalte fan seewetter waarden aliquots ferdund yn wetter fan PCR-kwaliteit (1:10) foar alle PCR-assays.
Digitale drip-PCR (ddPCR) waard útfierd mei it BioRad QX200-protokol (Mississauga, Ontario, Kanada). Brûk it temperatuerprofyl om de optimale temperatuer te bepalen (Tabel S1). Drippen waarden generearre mei in QX200-dripgenerator (BioRad). ddPCR waard as folget útfierd: 95 °C foar 5 minuten, 50 syklusen fan 95 °C foar 30 sekonden en in opjûne annealingtemperatuer foar 1 minuut en 72 °C foar 30 sekonden, 4 °C foar 5 minuten en 90 °C binnen 5 minuten. It oantal drippen en positive reaksjes (oantal kopyen/µl) waarden metten mei in QX200-driplêzer (BioRad). Monsters mei minder as 10.000 drippen waarden ôfwiisd. Patroankontrôle waard net elke kear útfierd as ddPCR waard útfierd.
qPCR waard útfierd mei Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austraalje) en LGALS7-spesifike primers. Alle kwantitative PCR's waarden útfierd yn 20 µl mei de QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR waard begûn mei in ynkubaasje fan 15 minuten by 95 °C, folge troch 40 syklusen by 95 °C foar 10 sekonden en by 60 °C foar 60 sekonden mei ien gegevensferzameling. Smeltkrommen waarden generearre mei opienfolgjende mjittingen by 95 °C foar 5 s, 65 °C foar 60 s, en 97 °C oan 'e ein fan' e qPCR. Elke qPCR waard yn triplikaat útfierd, útsein foar kontrôlemonsters.
Omdat mossels bekend binne om har hege filtraasjesnelheid, hawwe wy earst ûndersocht oft se DNA-fragminen yn seewetter filterje en fêsthâlde koene. Wy wiene ek ynteressearre yn oft dizze fragminen opstapelje yn har healiepen lymfesysteem. Wy hawwe dit probleem eksperiminteel oplost troch it lot fan oplosbere DNA-fragminen dy't tafoege waarden oan blauwe mosselstanks te folgjen. Om it folgjen fan DNA-fragminen te fasilitearjen, brûkten wy frjemd (net sels) plasmide-DNA mei it minsklike galectine-7-gen. ddPCR traceert plasmide-DNA-fragminen yn seewetter en mossels. Us resultaten litte sjen dat as de hoemannichte DNA-fragminen yn seewetter relatyf konstant bleau yn 'e ôfwêzigens fan mossels oer de tiid (oant 7 dagen), dan yn 'e oanwêzigens fan mossels dit nivo hast folslein ferdwûn binnen 8 oeren (Fig. 1a,b). Fragminen fan eksogeen DNA waarden maklik binnen 15 minuten ûntdutsen yn intravalvulêre floeistof en hemolymfe (Fig. 1c). Dizze fragminen koene noch oant 4 oeren nei bleatstelling ûntdutsen wurde. Dizze filterjende aktiviteit mei respekt foar DNA-fragminen is te fergelykjen mei de filterjende aktiviteit fan baktearjes en algen [31]. Dizze resultaten suggerearje dat mossels frjemd DNA kinne filterje en opstapelje yn har floeistofkompartiminten.
Relative konsintraasjes fan plasmid-DNA yn seewetter yn oanwêzigens (A) of ôfwêzigens (B) fan mossels, metten troch ddPCR. Yn A wurde de resultaten útdrukt as persintaazjes, wêrby't de rânen fan 'e fakjes de 75e en 25e persintilen fertsjintwurdigje. De oanpaste logaritmyske kromme wurdt werjûn yn read, en it gebiet dat yn griis skaad is, fertsjintwurdiget it 95% fertrouwensynterval. Yn B fertsjintwurdiget de reade line it gemiddelde en de blauwe line fertsjintwurdiget it 95% fertrouwensynterval foar de konsintraasje. C Akkumulaasje fan plasmid-DNA yn 'e hemolymfe en klepfloeistof fan mossels op ferskate tiden nei de tafoeging fan plasmid-DNA. Resultaten wurde presintearre as absolute kopyen detektearre/mL (±SE).
Folgjende hawwe wy de oarsprong fan ccfDNA ûndersocht yn mossels dy't sammele binne út mosselsbanken op 'e Kerguelen-eilannen, in ôfgelegen groep eilannen mei beheinde antropogene ynfloed. Foar dit doel waard cccDNA fan mosselshemolymfen isolearre en suvere troch metoaden dy't gewoanlik brûkt wurde om minsklik cccDNA te suverjen [32, 33]. Wy fûnen dat gemiddelde hemolymfe-ccfDNA-konsintraasjes yn mossels yn it lege berik fan mikrogrammen per ml hemolymfe lizze (sjoch tabel S2, oanfoljende ynformaasje). Dit berik fan konsintraasjes is folle grutter as by sûne minsken (lege nanogrammen per milliliter), mar yn seldsume gefallen, by kankerpasjinten, kin it nivo fan ccfDNA ferskate mikrogrammen per milliliter berikke [34, 35]. In analyze fan 'e grutteferdieling fan hemolymfe-ccfDNA liet sjen dat dizze fragminten sterk fariearje yn grutte, fariearjend fan 1000 bp oant 1000 bp oant 5000 bp (ôfb. 2). Fergelykbere resultaten waarden krigen mei de op silika basearre QIAamp Investigator Kit, in metoade dy't faak brûkt wurdt yn forensyske wittenskip om genomysk DNA fluch te isolearjen en te suverjen út DNA-samples mei lege konsintraasje, ynklusyf ccfDNA [36].
Represintatyf ccfDNA-elektroforegram fan mosselhemolymfe. Ekstrahearre mei NucleoSnap Plasma Kit (boppe) en QIAamp DNA Investigator Kit. B Fioelplot dy't de ferdieling fan hemolymfe ccfDNA-konsintraasjes (±SE) yn mosselen sjen lit. De swarte en reade linen fertsjintwurdigje respektivelik de mediaan en de earste en tredde kwartielen.
Sawat 1% fan ccfDNA yn minsken en primaten hat in frjemde boarne [21, 37]. Mei it each op it healiepene sirkulaasjesysteem fan bivalven, mikrobiële-rike seewetter, en de grutteferdieling fan mossel-ccfDNA, hawwe wy de hypoteze opsteld dat mossel-hemolymfe-ccfDNA in rike en ferskaat oan mikrobiële DNA kin befetsje. Om dizze hypoteze te testen, hawwe wy hemolymfe-ccfDNA sekwinsjeare fan Aulacomya atra-monsters sammele fan 'e Kerguelen-eilannen, wat mear as 10 miljoen lêzingen oplevere, wêrfan 97,6% de kwaliteitskontrôle trochjûn hat. De lêzingen waarden doe klassifisearre neffens sels- en net-selsboarnen mei help fan 'e BLASTN- en NCBI-bivalve-databases (Fig. S1, Oanfoljende Ynformaasje).
By minsken kin sawol nukleêr as mitochondriaal DNA yn 'e bloedstream frijlitten wurde [38]. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje wie it lykwols net mooglik om it nukleêre genomyske DNA fan mossels yn detail te beskriuwen, sjoen it feit dat it A. atra-genoom net sekwinsjearre of beskreaun is. Wy koenen lykwols in oantal ccfDNA-fragminen fan ús eigen oarsprong identifisearje mei de bivalve bibleteek (Fig. S2, Oanfoljende Ynformaasje). Wy hawwe ek de oanwêzigens fan DNA-fragminen fan ús eigen oarsprong befêstige troch rjochte PCR-amplifikaasje fan dy A. atra-genen dy't sekwinsjearre binne (Fig. 3). Op deselde wize, sjoen it feit dat it mitochondriale genoom fan A. atra beskikber is yn iepenbiere databases, kin men bewiis fine foar de oanwêzigens fan mitochondriale ccfDNA-fragminen yn 'e hemolymfe fan A. atra. De oanwêzigens fan mitochondriale DNA-fragminen waard befêstige troch PCR-amplifikaasje (Fig. 3).
Ferskate mitochondriale genen wiene oanwêzich yn 'e hemolymfe fan A. atra (reade stippen - stocknûmer: SRX5705969) en M. platensis (blauwe stippen - stocknûmer: SRX5705968) amplifisearre troch PCR. Figuer oanpast fan Breton et al., 2011 B Amplifikaasje fan hemolymfe-supernatant fan A. atra Opslein op FTA-papier. Brûk in 3 mm perforator om direkt ta te foegjen oan 'e PCR-buis mei de PCR-mix.
Mei it each op de oerfloedige mikrobiële ynhâld yn seewetter, hawwe wy ús yn earste ynstânsje rjochte op 'e karakterisaasje fan mikrobiële DNA-sekwinsjes yn hemolymfe. Om dit te dwaan, brûke wy twa ferskillende strategyen. De earste strategy brûkte Kraken2, in algoritme-basearre sekwinsjeklassifikaasjeprogramma dat mikrobiële sekwinsjes kin identifisearje mei in krektens dy't te fergelykjen is mei BLAST en oare ark [28]. Mear as 6719 lêzingen waarden bepaald as fan baktearjele oarsprong, wylst 124 en 64 fan respektivelik archaea en firussen wiene (Fig. 4). De meast oerfloedige baktearjele DNA-fragminen wiene Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), en Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Dizze ferdieling is yn oerienstimming mei eardere stúdzjes fan it marine blauwe mosselmikrobioom [39, 40]. Gammaproteobacteria wiene de haadklasse fan Proteobacteria (44%), ynklusyf in protte Vibrionales (Fig. 4b). De ddPCR-metoade befêstige de oanwêzigens fan Vibrio DNA-fragminen yn it ccfDNA fan A. atra hemolymfe (Fig. 4c) [41]. Om mear ynformaasje te krijen oer de baktearjele oarsprong fan ccfDNA, waard in ekstra oanpak nommen (Fig. S2, Oanfoljende Ynformaasje). Yn dit gefal waarden lêzingen dy't oerlaapje gearstald as lêzingen mei pearen en waarden klassifisearre as fan sels (bivalven) of net-sels-oarsprong mei help fan BLASTN en in e-wearde fan 1e−3 en in cutoff mei >90% homology. Yn dit gefal waarden lêzingen dy't oerlaapje gearstald as lêzingen mei pearen en waarden klassifisearre as fan sels (bivalven) of net-sels-oarsprong mei help fan BLASTN en in e-wearde fan 1e−3 en in cutoff mei >90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами en были классивы (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN en значения e 1e-3 и отсегения> 0%. Yn dit gefal waarden oerlappende lêzingen sammele as lêzingen mei pearen en waarden klassifisearre as native (twalve) of net-orizjineel mei help fan BLASTN en e-wearde fan 1e-3 en in cutoff mei >90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和和叠3 皒e>值%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使焚 使焚 焚 焚 用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами en классианфициров (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN en 1e-3 и 0%. Yn dit gefal waarden oerlappende lêzingen sammele as lêzingen mei pearen en klassifisearre as eigen (bivalven) of net-orizjineel mei help fan e BLASTN- en 1e-3-wearden en in homologydrompel fan >90%.Omdat it A. atra-genoom noch net sekwinsjearre is, hawwe wy de de novo-assemblagestrategy fan 'e MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-assembler brûkt. Yn totaal binne 147.188 contigs identifisearre as ôfhinklike (tweekleppige) fan oarsprong. Dizze contigs waarden doe eksplodearre mei e-wearden fan 1e-10 mei help fan BLASTN en BLASTX. Dizze strategy liet ús ta om 482 net-tweekleppige fragminten te identifisearjen dy't oanwêzich binne yn A. atra ccfDNA. Mear as de helte (57%) fan dizze DNA-fragminten waarden krigen fan baktearjes, benammen fan kieuwsymbionten, ynklusyf sulfotrofe symbionten, en fan kieuwsymbionten Solemya velum (Fig. 5).
Relative oerfloed op typenivo. B Mikrobiële ferskaat fan twa haadphyla (Firmicutes en Proteobacteria). Represintative amplifikaasje fan ddPCR C Vibrio spp. A. Fragminten fan it 16S rRNA-gen (blau) yn trije atra-hemolymfen.
In totaal fan 482 sammele contigs waarden analysearre. Algemien profyl fan 'e taksonomyske ferdieling fan metagenomyske contig-annotaasjes (prokaryoten en eukaryoten). B Detaillearre ferdieling fan baktearjele DNA-fragminen identifisearre troch BLASTN en BLASTX.
Kraken2-analyze liet ek sjen dat mossel-ccfDNA argeale DNA-fragminen befette, ynklusyf DNA-fragminen fan Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), en Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). De oanwêzigens fan DNA-fragminen ôflaat fan Euryarchaeota en Crenarchaeota, earder fûn yn 'e mikrobiële mienskip fan Kalifornyske mossels, moat net as in ferrassing komme [42]. Hoewol Euryarchaeota faak assosjeare wurdt mei ekstreme omstannichheden, wurdt no erkend dat sawol Euryarchaeota as Crenarcheota ta de meast foarkommende prokaryoten yn 'e marine kryogene omjouwing hearre [43, 44]. De oanwêzigens fan metanogene mikroorganismen yn mossels is net ferrassend, sjoen resinte rapporten fan wiidweidige metaanlekkages fan boaiemlekkages op it Kerguelen Plateau [45] en mooglike mikrobiële metaanproduksje waarnommen foar de kust fan 'e Kerguelen-eilannen [46].
Us oandacht ferskode doe nei lêzingen fan DNA-firussen. Foar safier't wy witte, is dit de earste off-target-stúdzje fan 'e firusynhâld fan mossels. Lykas ferwachte fûnen wy DNA-fragminen fan bakteriofagen (Caudovirales) (Fig. 6b). It meast foarkommende firale DNA komt lykwols fan in fylum fan nukleocytovirussen, ek wol bekend as it nukleêre cytoplasmatyske grutte DNA-firus (NCLDV), dat it grutste genoom hat fan alle firussen. Binnen dizze fylum hearre de measte DNA-sekwinsjes ta de famyljes Mimimidoviridae (58%) en Poxviridae (21%), waans natuerlike gastheren wringedieren en arthropoden omfetsje, wylst in lyts part fan dizze DNA-sekwinsjes hearre ta bekende virologyske algen. Ynfektearret marine eukaryote algen. De sekwinsjes waarden ek krigen fan it Pandora-firus, it reuzefirus mei de grutste genoomgrutte fan alle bekende firale geslachten. Nijsgjirrich is dat it berik fan gastheren dat bekend is om ynfekteare te wêzen mei it firus, lykas bepaald troch hemolymfe ccfDNA-sekwinsje, relatyf grut wie (Figuer S3, Oanfoljende Ynformaasje). It omfettet firussen dy't ynsekten lykas Baculoviridae en Iridoviridae ynfektearje, lykas firussen dy't amoeben, algen en rêchbonkedieren ynfektearje. Wy hawwe ek sekwinsjes fûn dy't oerienkomme mei it genoom fan Pithovirus sibericum. Pitovirussen (ek wol bekend as "zombiefirussen") waarden earst isolearre út 30.000 jier âlde permafrost yn Sibearje [47]. Sa binne ús resultaten yn oerienstimming mei eardere rapporten dy't sjen litte dat net alle moderne soarten fan dizze firussen útstoarn binne [48] en dat dizze firussen oanwêzich kinne wêze yn ôflizzende subarktyske marine ekosystemen.
Uteinlik hawwe wy testen oft wy DNA-fragminen fan oare mearsellige bisten fine koene. In totaal fan 482 frjemde contigs waarden identifisearre troch BLASTN en BLASTX mei nt-, nr- en RefSeq-bibleteken (genomysk en proteïne). Us resultaten litte sjen dat ûnder de frjemde fragminen fan ccfDNA fan mearsellige bisten DNA fan bonkebonken oerhearsket (Fig. 5). DNA-fragminen fan ynsekten en oare soarten binne ek fûn. In relatyf grut part fan 'e DNA-fragminen is net identifisearre, mooglik fanwegen de ûnderfertsjintwurdiging fan in grut oantal marine soarten yn genomyske databases yn ferliking mei terrestryske soarten [49].
Yn dit artikel tapasse wy it LB-konsept op mossels, en stelle wy dat hemolymfe ccfDNA-shotsekwinsjearring ynsjoch kin jaan yn 'e gearstalling fan marine kustekosystemen. Yn it bysûnder fûnen wy dat 1) mosselhemolymfe relatyf hege konsintraasjes (mikrogramnivo's) fan relatyf grutte (~ 1-5 kb) sirkulearjende DNA-fragminen befettet; 2) dizze DNA-fragminen sawol ûnôfhinklik as net-ûnôfhinklik binne 3) Under de frjemde boarnen fan dizze DNA-fragminen fûnen wy baktearjeel, argeaal en firaal DNA, lykas DNA fan oare mearsellulêre bisten; 4) De opgarjen fan dizze frjemde ccfDNA-fragminen yn 'e hemolymfe bart rap en draacht by oan 'e ynterne filteraktiviteit fan mossels. Konklúzjend lit ús stúdzje sjen dat it konsept fan LB, dat oant no ta benammen tapast is op it mêd fan biomedisinen, in rike, mar ûnûndersochte boarne fan kennis kodearret dy't brûkt wurde kin om de ynteraksje tusken sentinelsoarten en harren omjouwing better te begripen.
Neist primaten is ccfDNA-isolaasje rapportearre by sûchdieren, ynklusyf mûzen, hûnen, katten en hynders [50, 51, 52]. Foar safier't wy witte, is ús stúdzje lykwols de earste dy't de deteksje en sekwinsjearring fan ccfDNA rapportearret yn marine soarten mei in iepen sirkulaasjesysteem. Dizze anatomyske funksje en filterfermogen fan mossels kinne, teminsten foar in part, de ferskillende grutte-karakteristiken fan sirkulearjende DNA-fragminen ferklearje yn ferliking mei oare soarten. By minsken binne de measte DNA-fragminen dy't yn it bloed sirkulearje lytse fragminen dy't fariearje yn grutte fan 150 oant 200 bp, mei in maksimale pyk fan 167 bp [34, 53]. In lyts mar wichtich diel fan DNA-fragminen is tusken de 300 en 500 bp grut, en sawat 5% is langer as 900 bp [54]. De reden foar dizze grutteferdieling is dat de wichtichste boarne fan ccfDNA yn plasma foarkomt as gefolch fan seldea, of troch seldea of ​​troch nekrose fan sirkulearjende hematopoëtyske sellen by sûne persoanen of troch apoptose fan tumorsellen by kankerpasjinten (bekend as sirkulearjend tumor-DNA, ctDNA). De grutteferdieling fan hemolymfe-ccfDNA dy't wy fûnen yn mossels fariearre fan 1000 oant 5000 bp, wat suggerearret dat mossels-ccfDNA in oare oarsprong hat. Dit is in logyske hypoteze, om't mossels in heal-iepen fasskulêr systeem hawwe en libje yn marine akwatyske omjouwings mei hege konsintraasjes mikrobieel genomysk DNA. Eins hawwe ús laboratoariumeksperiminten mei eksogeen DNA oantoand dat mossels DNA-fragminen yn seewetter sammelje, teminsten nei in pear oeren wurde se degradearre nei sellulêre opname en/of frijlitten en/of opslein yn ferskate organisaasjes. Mei it each op de seldsumheid fan sellen (sawol prokaryotysk as eukaryotysk), sil it gebrûk fan intravalvulêre kompartiminten de hoemannichte ccfDNA út eigen boarnen ferminderje, lykas út bûtenlânske boarnen. Mei it each op it belang fan oanberne ymmúniteit fan twakleppige organismen en it grutte oantal sirkulearjende fagocyten, hawwe wy fierder de hypoteze opsteld dat sels frjemd ccfDNA ferrike is mei sirkulearjende fagocyten dy't frjemd DNA sammelje by it opnimmen fan mikroorganismen en/of sellulêr pún. Mei-inoar litte ús resultaten sjen dat ccfDNA fan twakleppige hemolymfe in unike bewarplak is fan molekulêre ynformaasje en har status as in sentinel-soarte fersterket.
Us gegevens jouwe oan dat sekwinsjearring en analyze fan baktearje-ôflaatte hemolymfe ccfDNA-fragminen wichtige ynformaasje kinne jaan oer de gasthearbaktearjeflora en de baktearjes dy't oanwêzich binne yn it omlizzende marine ekosysteem. Shot-sekwinsjearringstechniken hawwe sekwinsjes fan 'e kommensale baktearje A. atra gill oan it ljocht brocht dy't mist wurde soene as konvinsjonele 16S rRNA-identifikaasjemetoaden brûkt wiene, foar in part fanwegen in referinsjebibleteekbias. Eins liet ús gebrûk fan LB-gegevens sammele fan M. platensis yn deselde mossellaach by Kerguelen sjen dat de gearstalling fan kieuw-assosjeare baktearjele symbionten itselde wie foar beide mosselsoarten (Fig. S4, Oanfoljende Ynformaasje). Dizze oerienkomst fan twa genetysk ferskillende mossels kin de gearstalling fan baktearjele mienskippen yn 'e kâlde, swevelrike en fulkanyske ôfsettings fan Kerguelen reflektearje [55, 56, 57, 58]. Hegere nivo's fan swevel-redusearjende mikroorganismen binne goed beskreaun by it rispjen fan mossels út bioturbearre kustgebieten [59], lykas de kust fan Port-au-France. In oare mooglikheid is dat de kommensale mosselflora beynfloede wurde kin troch horizontale oerdracht [60, 61]. Mear ûndersyk is nedich om de korrelaasje te bepalen tusken de marine omjouwing, it seeboaiem en de gearstalling fan symbiotyske baktearjes yn mossels. Dizze stúdzjes binne op it stuit oan 'e gong.
De lingte en konsintraasje fan hemolymfe ccfDNA, it gemak fan suvering, en de hege kwaliteit om rappe shotgun-sekwinsje mooglik te meitsjen binne guon fan 'e protte foardielen fan it brûken fan mossel-ccfDNA om biodiversiteit yn marine kustekosystemen te beoardieljen. Dizze oanpak is foaral effektyf foar it karakterisearjen fan firale mienskippen (viromen) yn in bepaald ekosysteem [62, 63]. Oars as baktearjes, archaea en eukaryoten befetsje firale genomen gjin fylogenetysk konservearre genen lykas 16S-sekwinsjes. Us resultaten jouwe oan dat floeibere biopsies fan yndikatorsoarten lykas mosselen brûkt wurde kinne om relatyf grutte oantallen ccfDNA-firusfragminen te identifisearjen dy't bekend binne om gastheren te ynfektearjen dy't typysk kustmarine-ekosystemen bewenne. Dit omfettet firussen dy't bekend binne om protozoa, arthropoden, ynsekten, planten en baktearjele firussen (bygelyks bakteriofagen) te ynfektearjen. In ferlykbere ferdieling waard fûn doe't wy it hemolymfe ccfDNA-viroom fan blauwe mosselen (M. platensis) ûndersochten dy't sammele wiene yn deselde mossellaach by Kerguelen (Tabel S2, Oanfoljende Ynformaasje). Shotgun-sekwinsjearring fan ccfDNA is yndie in nije oanpak dy't momentum krijt yn 'e stúdzje fan it viroom fan minsken of oare soarten [21, 37, 64]. Dizze oanpak is benammen nuttich foar it bestudearjen fan dûbelstrenge DNA-firussen, om't gjin inkele gen bewarre is ûnder alle dûbelstrenge DNA-firussen, dy't de meast ferskaat en brede klasse fan firussen yn Baltimore fertsjintwurdigje [65]. Hoewol de measte fan dizze firussen net klassifisearre bliuwe en firussen kinne omfetsje út in folslein ûnbekend diel fan 'e firale wrâld [66], hawwe wy fûn dat de viromen en gasthearberiken fan 'e mossels A. atra en M. platensis tusken de twa soarten falle. Op deselde wize (sjoch figuer S3, ekstra ynformaasje). Dizze oerienkomst is net ferrassend, om't it in gebrek oan selektiviteit yn 'e opname fan DNA oanwêzich yn' e omjouwing kin reflektearje. Takomstige stúdzjes mei suvere RNA binne op it stuit nedich om it RNA-viroom te karakterisearjen.
Yn ús stúdzje hawwe wy in tige strang pipeline brûkt, oanpast fan it wurk fan Kowarski en kollega's [37], dy't in twa-stapsferwidering fan gearfoege lêzingen en contigs brûkten foar en nei de gearstalling fan native ccfDNA, wat resultearre yn in hege proporsje fan net-kaarte lêzingen. Dêrom kinne wy ​​net útslute dat guon fan dizze net-kaarte lêzingen noch har eigen oarsprong hawwe kinne, benammen om't wy gjin referinsjegenoom hawwe foar dizze mosselsoart. Wy hawwe dizze pipeline ek brûkt om't wy soargen wiene oer de chimera's tusken sels- en net-selslêzingen en de lêzingslengten generearre troch de Illumina MiSeq PE75. In oare reden foar de mearderheid fan net-kaarte lêzingen is dat in grut part fan 'e marine mikroben, benammen yn ôfgelegen gebieten lykas Kerguelen, net annotearre binne. Wy hawwe Illumina MiSeq PE75 brûkt, útgeande fan ccfDNA-fragmintlengten fergelykber mei minsklik ccfDNA. Foar takomstige stúdzjes, sjoen ús resultaten dy't sjen litte dat hemolymfe ccfDNA langere lêzingen hat as minsken en/of sûchdieren, advisearje wy in sekwinsjearringsplatfoarm te brûken dat geskikter is foar langere ccfDNA-fragminen. Dizze praktyk sil it folle makliker meitsje om mear oanwizings te identifisearjen foar djippere analyze. It krijen fan 'e op it stuit net beskikbere folsleine A. atra-nukleêre genoomsekwinsje soe ek de ûnderskieding fan ccfDNA fan sels- en net-selsboarnen sterk fasilitearje. Mei it each op it feit dat ús ûndersyk him rjochte hat op 'e mooglikheid om it konsept fan floeibere biopsie ta te passen op mossels, hoopje wy dat as dit konsept brûkt wurdt yn takomstich ûndersyk, nije ark en pipelines ûntwikkele wurde sille om it potensjeel fan dizze metoade te fergrutsjen om de mikrobiële ferskaat fan mossels yn it marine ekosysteem te bestudearjen.
As in net-invasive klinyske biomarker binne ferhege minsklike plasmanivo's fan ccfDNA assosjeare mei ferskate sykten, weefselskea en stressomstannichheden [67,68,69]. Dizze tanimming wurdt assosjeare mei it frijkommen fan DNA-fragminen fan eigen oarsprong nei weefselskea. Wy hawwe dit probleem oanpakt mei help fan akute waarmtestress, wêrby't mossels koart waarden bleatsteld oan in temperatuer fan 30 °C. Wy hawwe dizze analyze útfierd op trije ferskillende soarten mossels yn trije ûnôfhinklike eksperiminten. Wy hawwe lykwols gjin feroaring fûn yn ccfDNA-nivo's nei akute waarmtestress (sjoch figuer S5, ekstra ynformaasje). Dizze ûntdekking kin, teminsten foar in part, it feit ferklearje dat mossels in heal-iepen sirkulaasjesysteem hawwe en grutte hoemannichten frjemd DNA sammelje fanwegen har hege filteraktiviteit. Oan 'e oare kant kinne mossels, lykas in protte ynvertebraten, mear resistint wêze foar stress-induzearre weefselskea, wêrtroch't de frijlitting fan ccfDNA yn har hemolymfe beheind wurdt [70, 71].
Oant no ta hat DNA-analyze fan biodiversiteit yn akwatyske ekosystemen him benammen rjochte op metabarcoding fan miljeu-DNA (eDNA). Dizze metoade is lykwols meastentiids beheind yn biodiversiteitsanalyze as primers brûkt wurde. It gebrûk fan shotgun-sekwinsjering omseilt de beheiningen fan PCR en de foaroardielde seleksje fan primersets. Sa is ús metoade, yn in sin, tichter by de koartlyn brûkte hege-trochput eDNA Shotgun-sekwinsjemetoade, dy't yn steat is om fragmintearre DNA direkt te sekwinsjearjen en hast alle organismen te analysearjen [72, 73]. D'r binne lykwols in oantal fûnemintele problemen dy't LB ûnderskiede fan standert eDNA-metoaden. Fansels is it wichtichste ferskil tusken eDNA en LB it gebrûk fan natuerlike filtergastheren. It gebrûk fan marine soarten lykas sponzen en bivalven (Dresseina spp.) as in natuerlik filter foar it bestudearjen fan eDNA is rapportearre [74, 75]. De stúdzje fan Dreissena brûkte lykwols weefselbiopsies wêrfan DNA waard ekstrahearre. Analyse fan ccfDNA fan LB fereasket gjin weefselbiopsie, spesjalisearre en soms djoere apparatuer en logistyk dy't ferbûn binne mei eDNA of weefselbiopsie. Eins hawwe wy koartlyn rapportearre dat ccfDNA fan LB opslein en analysearre wurde kin mei FTA-stipe sûnder in kâlde keten te behâlden, wat in grutte útdaging is foar ûndersyk yn ôflizzende gebieten [76]. De ekstraksje fan ccfDNA út floeibere biopsies is ek ienfâldich en leveret DNA fan hege kwaliteit foar shotgun-sekwinsje en PCR-analyze. Dit is in grut foardiel sjoen guon fan 'e technyske beheiningen dy't ferbûn binne mei eDNA-analyze [77]. De ienfâld en lege kosten fan 'e samplingmetoade binne ek benammen geskikt foar lange-termyn monitoringprogramma's. Neist har hege filterfermogen is in oar bekend skaaimerk fan bivalven de gemyske mukopolysaccharide-gearstalling fan har slym, dy't de opname fan firussen befoarderet [78, 79]. Dit makket bivalven in ideaal natuerlik filter foar it karakterisearjen fan biodiversiteit en de ynfloed fan klimaatferoaring yn in bepaald akwatysk ekosysteem. Hoewol de oanwêzigens fan DNA-fragminen ôflaat fan gasthear kin wurde sjoen as in beheining fan 'e metoade yn ferliking mei eDNA, binne de kosten dy't ferbûn binne mei it hawwen fan sa'n native ccfDNA yn ferliking mei eDNA tagelyk begryplik foar de enoarme hoemannichte ynformaasje dy't beskikber is foar sûnensstúdzjes dy't de offset fan gasthear binne. Dit omfettet de oanwêzigens fan firale sekwinsjes dy't yntegrearre binne yn it genoom fan 'e gasthear. Dit is foaral wichtich foar mossels, sjoen de oanwêzigens fan horizontaal oerdraachbere leukemyske retrovirussen yn bivalven [80, 81]. In oar foardiel fan LB boppe eDNA is dat it de fagocytyske aktiviteit fan sirkulearjende bloedsellen yn 'e hemolymfe eksploitearret, dy't mikroorganismen (en har genomen) opslokt. Fagocytose is de wichtichste funksje fan bloedsellen yn bivalven [82]. Uteinlik makket de metoade gebrûk fan 'e hege filterkapasiteit fan mossels (gemiddeld 1,5 l/oere seewetter) en twa-dagen sirkulaasje, dy't de minging fan ferskate lagen seewetter ferheegje, wêrtroch't heterolooch eDNA kin wurde fongen. [83, 84]. Dêrom is ccfDNA-analyze fan mossels in nijsgjirrige manier sjoen de fiedings-, ekonomyske en miljeu-ynfloeden fan mossels. Fergelykber mei de analyze fan LB sammele fan minsken, iepenet dizze metoade ek de mooglikheid om genetyske en epigenetyske feroaringen yn gasthear-DNA te mjitten as reaksje op eksogene stoffen. Bygelyks, tredde-generaasje sekwinsjetechnologyen kinne foarsteld wurde om genoomwide metylaasje-analyze út te fieren yn native ccfDNA mei help fan nanopoarsekwinsje. Dit proses moat fasilitearre wurde troch it feit dat de lingte fan 'e mossel-ccfDNA-fragminen ideaal kompatibel is mei lange-lêzen sekwinsjeplatfoarms dy't genoomwide DNA-metylaasje-analyze fanút ien sekwinsjerun tastean sûnder de needsaak foar gemyske transformaasjes.85,86] Dit is in nijsgjirrige mooglikheid, om't oantoand is dat DNA-metylaasjepatroanen in reaksje op miljeustress reflektearje en oer in protte generaasjes oanhâlde. Dêrom kin it weardefol ynsjoch jaan yn 'e ûnderlizzende meganismen dy't de reaksje regelje nei bleatstelling oan klimaatferoaring of fersmoargjende stoffen [87]. It gebrûk fan LB is lykwols net sûnder beheiningen. Needless te sizzen, dit fereasket de oanwêzigens fan yndikatorsoarten yn it ekosysteem. Lykas hjirboppe neamd, fereasket it brûken fan LB om de biodiversiteit fan in bepaald ekosysteem te beoardieljen ek in strange bioinformatika-pipeline dy't rekken hâldt mei de oanwêzigens fan DNA-fragminen fan 'e boarne. In oar grut probleem is de beskikberens fan referinsjegenomen foar marine soarten. Der wurdt hope dat inisjativen lykas it Marine Mammal Genomes Project en it koartlyn oprjochte Fish10k-projekt [88] sokke analyzes yn 'e takomst fasilitearje sille. De tapassing fan it LB-konsept op marine filterfiedende organismen is ek kompatibel mei de lêste foarútgong yn sekwinsjetechnology, wêrtroch it tige geskikt is foar de ûntwikkeling fan multi-ohm biomarkers om wichtige ynformaasje te jaan oer de sûnens fan marine habitats yn reaksje op miljeustress.
Genoomsekwinsjearringsgegevens binne opslein yn it NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ûnder Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Ynfloed fan klimaatferoaring op it libben yn it see en ekosystemen. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Beskôgje de kombineare ynfloeden fan klimaatferoaring en oare lokale stressfaktoaren op it marine miljeu. algemiene wittenskiplike omjouwing. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Wittenskip fan 'e earste maart. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Fermindere waarmtetolerânsje ûnder werhelle waarmtestressomstannichheden ferklearret de hege simmermortaliteit fan blauwe mossels. Wittenskiplik rapport 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Resinte feroarings yn 'e frekwinsje, oarsaken en omfang fan bistestjerfte. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Meardere net-soarte-spesifike patogenen kinne massale mortaliteit fan Pinna nobilis feroarsake hawwe. Libben. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potinsjele ynfloed fan klimaatferoaring op Arktyske zoönotyske sykten. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Blauwe mossels (Mytilus edulis spp.) as sinjaalorganismen yn 'e monitoring fan kustfersmoarging: in oersjoch. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Yntegraasje fan floeibere biopsie yn kankerbehanneling. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Ryping fan floeibere biopsie: Lit tumor-DNA sirkulearje. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleïne soeren yn minsklik plasma. Gearkomstnotulen fan dochterûndernimmingen fan Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. In nije rol foar seldrije DNA as molekulêre marker foar kankerbehanneling. Kwantifikaasje fan biomolêre analyze. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Floeibere biopsie komt yn 'e klinyk - ymplemintaasjeproblemen en takomstige útdagings. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW en oaren. Fetaal DNA is oanwêzich yn memlik plasma en serum. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Undersyk nei it ferrin fan 'e swangerskip en de komplikaasjes dêrfan mei help fan sirkulearjend ekstrasellulêr RNA yn it bloed fan froulju tidens de swangerskip. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Floeibere biopsie: donorselfrij DNA wurdt brûkt om allogene laesjes yn in niertransplantaat te detektearjen. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Ynnovaasjes yn prenatale diagnostyk: genoomsekwinsjearring fan it memmetsplasma. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Fluchge patogeendeteksje mei metagenomyske sekwinsje fan 'e folgjende generaasje fan ynfekteare lichemsfloeistoffen. Nat Medicine. 2021;27:115-24.