Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining riede wy jo oan om in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
De fruchtberens fan fûgels hinget ôf fan harren fermogen om genôch libbensfetbere sperma foar in langere perioade op te slaan yn 'e sperma-opslachtubuli (SST). It krekte meganisme wêrmei't spermatozoa de SST yngeane, deryn ferbliuwe en ferlitte bliuwt kontroversjeel. It sperma fan sharkasi-hinnen liet in hege oanstriid ta agglutinaasje sjen, wêrby't mobile filamenteuze bondels foarme waarden mei in protte sellen. Fanwegen de muoite om de beweeglikheid en it gedrach fan spermatozoa yn in ûntrochsichtige eileider te observearjen, hawwe wy in mikrofluidysk apparaat brûkt mei in mikrokanaal-dwersdoorsnede fergelykber mei dy fan spermatozoa om spermatozoa-agglutinaasje en beweeglikheid te bestudearjen. Dizze stúdzje besprekt hoe't spermabondels foarmje, hoe't se bewege, en harren mooglike rol by it ferlingjen fan sperma-ferbliuw yn 'e SST. Wy hawwe spermasnelheid en reologysk gedrach ûndersocht doe't floeistofstream generearre waard binnen in mikrofluidysk kanaal troch hydrostatyske druk (streamsnelheid = 33 µm/s). De spermatozoa hawwe de neiging om tsjin 'e stream yn te swimmen (positive reology) en de snelheid fan 'e spermabondel is signifikant fermindere yn ferliking mei ienige spermatozoa. Spermabondels binne waarnommen te bewegen yn in spiraal en tanimme yn lingte en dikte as mear inkele sperma rekrutearre wurde. Spermabondels waarden waarnommen dy't de sydwanden fan 'e mikrofluidyske kanalen benaderden en deroan fêsthâlden om te foarkommen dat se mei floeistofstreamsnelheid > 33 µm/s meispield waarden. Spermabondels waarden waarnommen dy't de sydwanden fan 'e mikrofluidyske kanalen benaderden en deroan fêsthâlden om te foarkommen dat se mei floeistofstreamsnelheid > 33 µm/s meispield waarden. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 mkm / с. Spermabondels binne waarnommen dy't de sydmuorren fan 'e mikrofluidyske kanalen benaderje en deroan hechte om te foarkommen dat se meifierd wurde by floeistofstreamsnelheden > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 sタ33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, прилипают избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 mkm/s. Spermabondels binne waarnommen dy't de sydmuorren fan it mikrofluidyske kanaal benaderje en deroan hechte om te foarkommen dat se meifierd wurde troch floeistofstream fan >33 µm/s.Skennende en transmissie-elektronenmikroskopie lieten sjen dat de spermabondels stipe waarden troch in oerfloedich ticht materiaal. De krigen gegevens litte de unike mobiliteit fan Sharkazi-hinnespermatozoa sjen, lykas it fermogen fan spermatozoa om te agglutinearjen en mobile bondels te foarmjen, wat bydraacht oan in better begryp fan 'e lange-termyn opslach fan spermatozoa yn SMT.
Om befruchting te berikken by minsken en de measte bisten, moatte sperma en aaien op it juste momint op it plak fan befruchting oankomme. Dêrom moat paring plakfine foar of op it momint fan ovulaasje. Oan 'e oare kant bewarje guon sûchdieren, lykas hûnen, en ek net-sûchdiersoarten, lykas ynsekten, fisken, reptilen en fûgels, sperma yn har fuortplantingsorganen foar in langere perioade oant har aaien klear binne foar befruchting (asynchrone befruchting 1 ). Fûgels binne yn steat om de libbensfetberens fan spermatozoa dy't aaien kinne befruchtsje foar 2-10 wiken te behâlden 2.
Dit is in unike funksje dy't fûgels ûnderskiedt fan oare bisten, om't it in hege kâns op befruchting biedt nei ien ynseminaasje foar ferskate wiken sûnder simultane paring en ovulaasje. It wichtichste sperma-opslachorgaan, de sperma-opslachtubulus (SST) neamd, leit yn 'e ynterne mucosale plooien by de uterovaginale oergong. Oant no ta binne de meganismen wêrmei't sperma de spermabank yngiet, ferbliuwt en ferlit net folslein begrepen. Op basis fan eardere stúdzjes binne in protte hypotezen nei foaren brocht, mar gjinien dêrfan is befêstige.
Forman4 stelde de hypoteze dat spermatozoa har ferbliuw yn 'e SST-holte behâlde troch trochgeande oscillerende beweging tsjin 'e rjochting fan 'e floeistofstream troch proteïnekanalen dy't lizze op SST-epitheelzellen (reology). ATP wurdt útput troch de konstante flagellêre aktiviteit dy't nedich is om it sperma yn it SST-lumen te hâlden en de motiliteit nimt úteinlik ôf oant it sperma troch floeistofstream út 'e spermabank wurdt droegen en in nije reis del de opstigende eileider begjint om it sperma te befruchtsjen. Aai (Forman4). Dit model fan spermaopslach wurdt stipe troch de deteksje troch immunocytochemy fan aquaporinen 2, 3 en 9 oanwêzich yn SST-epitheelzellen. Oant no ta ûntbrekke stúdzjes oer de reology fan hinnesperma en syn rol yn SST-opslach, faginale spermaseleksje en spermakompetysje. By hinnen komt sperma de fagina yn nei natuerlike paring, mar mear as 80% fan 'e spermatozoa wurde koart nei de paring út 'e fagina smiten. Dit suggerearret dat de fagina de primêre plak is foar spermaseleksje by fûgels. Derneist is rapportearre dat minder as 1% fan spermatozoa dy't yn 'e fagina befruchte wurde, yn SST's telâne komme2. By keunstmjittige ynseminaasje fan kuikens yn 'e fagina nimt it oantal spermatozoa dat SST berikt 24 oeren nei ynseminaasje ta. Oant no ta is it meganisme fan spermaseleksje tidens dit proses ûndúdlik, en spermmotiliteit kin in wichtige rol spylje yn 'e opname fan SST-sperma. Fanwegen de dikke en ûntrochsichtige muorren fan 'e eileiders is it lestich om de spermmotiliteit yn 'e eileiders fan fûgels direkt te kontrolearjen. Dêrom misse wy basiskennis oer hoe't spermatozoa nei befruchting oergeane nei SST.
Reology is koartlyn erkend as in wichtige faktor dy't it spermatransport yn 'e geslachtsdielen fan sûchdieren kontrolearret. Op basis fan it fermogen fan beweechbere spermatozoa om tsjin de stream yn te migrearjen, brûkten Zaferani et al8 in corra-mikrofluidysk systeem om beweechbere spermatozoa passyf te isolearjen út opsleine spermamonsters. Dit type spermasortering is essensjeel foar medyske ûnfruchtberensbehanneling en klinysk ûndersyk, en hat de foarkar boppe tradisjonele metoaden dy't tiid- en arbeidsyntinsyf binne en de morfology en strukturele yntegriteit fan 'e sperma kinne kompromittearje. Oant no ta binne der lykwols gjin stúdzjes útfierd nei it effekt fan sekreten út 'e geslachtsorganen fan hinnen op 'e beweechberens fan sperma.
Nettsjinsteande it meganisme dat sperma opslein hâldt yn 'e SST, hawwe in protte ûndersikers waarnommen dat residente spermatozoa kop-oan-kop agglutinearje yn 'e SST fan hinnen 9, 10, kwartels 2 en kalkoenen 11 om agglutinearre spermabondels te foarmjen. De auteurs suggerearje dat der in ferbân is tusken dizze agglutinaasje en lange-termyn opslach fan spermatozoa yn 'e SST.
Tingari en Lake12 rapportearren in sterke assosjaasje tusken spermatozoa yn 'e sperma-ûntfangende klier fan 'e hin en fregen har ôf oft fûgelspermatozoa op deselde wize agglutinearje as sûchdierspermatozoa. Se leauwe dat de djippe ferbiningen tusken sperma yn 'e zaadleider mooglik te tankjen binne oan 'e stress feroarsake troch de oanwêzigens fan in grut oantal sperma yn in lytse romte.
By it evaluearjen fan it gedrach fan spermatozoa op farske hingjende glêzen objektglaasjes kinne tydlike tekens fan agglutinaasje sjoen wurde, benammen oan 'e rânen fan' e spermadruppels. Agglutinaasje waard lykwols faak fersteurd troch de rotaasjeaksje dy't ferbûn is mei trochgeande beweging, wat de tydlike aard fan dit ferskynsel ferklearret. De ûndersikers hawwe ek opmurken dat doe't it ferdunningsmiddel oan it sperma tafoege waard, langwerpige "triedfoarmige" selaggregaten ferskynden.
Iere pogingen om in spermatozoa nei te bootsen waarden dien troch in tinne tried út in hingjende drip te heljen, wat resultearre yn in langwerpige sperma-eftige vesikel dy't út 'e spermadrop útstekt. De spermatozoa stiene fuortendaliks parallel op elkoar yn 'e vesikel, mar de hiele ienheid ferdwûn al gau fanwegen de 3D-beperking. Dêrom is it, om spermatozoa-agglutinaasje te bestudearjen, needsaaklik om de beweeglikheid en it gedrach fan spermatozoa direkt yn isolearre sperma-opslachtubuli te observearjen, wat lestich te berikken is. Dêrom is it needsaaklik om in ynstrumint te ûntwikkeljen dat spermatozoa neimakket om stúdzjes fan sperma-motiliteit en agglutinaasjegedrach te stypjen. Brillard et al13 rapportearren dat de gemiddelde lingte fan sperma-opslachtubuli by folwoeksen kuikens 400-600 µm is, mar guon SST's kinne wol 2000 µm lang wêze. Mero en Ogasawara14 ferdielden de seminifereuze klieren yn fergrutte en net-fergrutte sperma-opslachbuizen, dy't beide itselde wiene yn lingte (~ 500 µm) en nekkebreedte (~ 38 µm), mar de gemiddelde lumendiameter fan 'e buizen wie 56,6 en 56,6 µm. . , respektivelik 11,2 μm. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje brûkten wy in mikrofluidysk apparaat mei in kanaalgrutte fan 200 µm × 20 µm (B × H), wêrfan de dwersdoorsnede wat ticht by dy fan 'e fersterke SST leit. Derneist ûndersochten wy de beweeglikheid en agglutinaasjegedrach fan sperma yn streamende floeistof, wat oerienkomt mei de hypoteze fan Foreman dat floeistof produsearre troch SST-epitheelzellen sperma yn it lumen hâldt yn in tsjinstream (reologyske) rjochting.
It doel fan dizze stúdzje wie om de problemen fan it observearjen fan sperma-motiliteit yn 'e eileider te oerwinnen en de swierrichheden fan it bestudearjen fan 'e reology en it gedrach fan sperma yn in dynamyske omjouwing te foarkommen. In mikrofluidysk apparaat waard brûkt dat hydrostatyske druk makket om sperma-motiliteit yn 'e geslachtsdielen fan in hin te simulearjen.
Doe't in dripke fan in ferdund spermamonster (1:40) yn it mikrokanaalapparaat laden waard, koene twa soarten spermamotiliteit identifisearre wurde (isolearre sperma en bûn sperma). Derneist hienen spermatozoa de neiging om tsjin de stream yn te swimmen (positive reology; fideo 1, 2). Hoewol spermabondels in legere snelheid hienen as dy fan iensume sperma (p < 0.001), fergrutte se it persintaazje sperma mei positive rheotaxis (p < 0.001; Tabel 2). Hoewol spermabondels in legere snelheid hienen as dy fan iensume sperma (p < 0.001), fergrutte se it persintaazje sperma mei positive rheotaxis (p < 0.001; Tabel 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), ливцич сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; tabel 2). Hoewol't de spermatozoa-bondels in legere snelheid hienen as dy fan ienkelde spermatozoa (p < 0.001), fergrutten se it persintaazje spermatozoa dy't positive rheotaxis sjen lieten (p < 0.001; Tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 昧 倧倲礧 昳百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。）)）)) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелитичив сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; tabel 2). Hoewol't de snelheid fan spermabondels leger wie as dy fan ienkele spermatozoa (p < 0.001), fergrutte se it persintaazje spermatozoa mei positive reology (p < 0.001; Tabel 2).Positive reology foar ienkele spermatozoa en tufts wurdt rûsd op respektivelik sawat 53% en 85%.
It is waarnommen dat de spermatozoa fan sharkashi-hinnen direkt nei ejakulaasje lineêre bondels foarmje, besteande út tsientallen yndividuen. Dizze plukjes nimme yn 'e rin fan' e tiid ta yn lingte en dikte en kinne ferskate oeren yn vitro bliuwe foardat se ferdwine (fideo 3). Dizze filamenteuze bondels binne foarme as echidna-spermatozoa dy't foarmje oan 'e ein fan' e epididymis. Sharkashi-hinnesperma is fûn om in hege oanstriid te hawwen om te agglutinearjen en in netfoarmige bondel te foarmjen yn minder dan ien minút nei it sammeljen. Dizze balken binne dynamysk en kinne oan alle tichtby lizzende muorren of statyske objekten plakke. Hoewol spermabondels de snelheid fan spermasellen ferminderje, is it dúdlik dat se makroskopysk har lineariteit ferheegje. De lingte fan 'e bondels ferskilt ôfhinklik fan it oantal sperma dat yn bondels sammele is. Twa dielen fan 'e bondel waarden isolearre: it earste diel, ynklusyf de frije kop fan it agglutinearre sperma, en it terminale diel, ynklusyf de sturt en it heule distale ein fan it sperma. Mei in hege-snelheidskamera (950 fps) waarden frije koppen fan agglutinearre spermatozoa waarnommen yn it earste diel fan 'e bondel, ferantwurdlik foar de beweging fan 'e bondel fanwegen har oscillerende beweging, wêrby't de oerbleaune mei in spiraalfoarmige beweging yn 'e bondel sleept waarden (Fideo 4). Yn lange plukjes is lykwols waarnommen dat guon frije spermakoppen oan it lichem fêsthâlde en it ein fan 'e pluk fungearret as skobben om de pluk te helpen oandriuwen.
Wylst se yn in stadige stream fan floeistof binne, bewege de spermabondels parallel oan elkoar, mar se begjinne inoar te oerlaapjen en te plakjen oan alles dat stil stiet, sadat se net troch de stream fuortspield wurde as de streamsnelheid tanimt. De bondels foarmje as in hantsjefol spermasellen byinoar komme, se begjinne syngroan te bewegen en om elkoar hinne te wikkeljen, en plakke dan oan in kleverige substânsje. Figueren 1 en 2 litte sjen hoe't de sperma byinoar komme, en in ferbining foarmje as de sturten om elkoar hinne wikkelje.
De ûndersikers pasten hydrostatyske druk ta om floeistofstream te meitsjen yn in mikrokanaal om de reology fan sperma te bestudearjen. In mikrokanaal mei in grutte fan 200 µm × 20 µm (B × H) en in lingte fan 3,6 µm waard brûkt. Brûk mikrokanalen tusken konteners mei spuiten oan 'e úteinen. Kleurstof foar iten waard brûkt om de kanalen sichtberder te meitsjen.
Bind ûnderlinge kabels en accessoires oan 'e muorre. De fideo is makke mei in fazekontrastmikroskoop. By elke ôfbylding wurde fazekontrastmikroskopie en mappingôfbyldings presintearre. (A) De ferbining tusken twa streamen wjerstean de stream fanwegen spiraalfoarmige beweging (reade pylk). (B) De ferbining tusken de buisbondel en de kanaalwand (reade pylken), tagelyk binne se ferbûn mei twa oare bondels (giele pylken). (C) Spermabondels yn it mikrofluidyske kanaal begjinne mei-inoar te ferbinen (reade pylken), wêrtroch in gaas fan spermabondels ûntstiet. (D) Formaasje fan in netwurk fan spermabondels.
Doe't in dripke ferdunde sperma yn it mikrofluidyske apparaat laden waard en in stream makke waard, waard waarnommen dat de spermastriel tsjin de rjochting fan 'e stream yn beweegde. De bondels pasten strak tsjin 'e muorren fan 'e mikrokanalen, en de frije koppen yn it earste diel fan 'e bondels pasten strak tsjin har oan (fideo 5). Se plakke ek oan alle stilsteande dieltsjes yn har paad, lykas pún, om te wjerstean dat se troch de stream meifierd wurde. Mei de tiid wurde dizze plukjes lange filamenten dy't oare ienige spermatozoa en koartere plukjes fange (fideo 6). As de stream begjint te fertragen, begjinne lange linen sperma in netwurk fan spermalinen te foarmjen (fideo 7; figuer 2).
By hege streamsnelheid (V > 33 µm/s) wurde de spiraalfoarmige bewegingen fan triedden fergrutte as in besykjen om in protte yndividuele sperma-foarmjende bondels te fangen om de driuwende krêft fan 'e stream better te wjerstean. By hege streamsnelheid (V > 33 µm/s) wurde de spiraalfoarmige bewegingen fan triedden fergrutte as in besykjen om in protte yndividuele sperma-foarmjende bondels te fangen om de driuwende krêft fan 'e stream better te wjerstean. При высокой скорости потока (V > 33 mkm/s) множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующих силей. By hege streamingsnelheden (V > 33 µm/s) nimme de spiraalfoarmige bewegingen fan 'e strengen ta as se besykje in protte yndividuele spermatozoa te fangen, wêrtroch bondels foarmje dy't better yn steat binne om de driuwende krêft fan 'e stream te wjerstean.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 缸徍从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 mkm/s) спиральное движение нитей увеличивается в попытке зах отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. By hege streamingsnelheden (V > 33 µm/s) nimt de spiraalfoarmige beweging fan 'e filamenten ta yn in besykjen om in protte yndividuele spermatozoa te fangen dy't bondels foarmje om de driftkrêften fan 'e stream better te wjerstean.Se hawwe ek besocht mikrokanalen oan 'e sydmuorren te befestigjen.
Spermabondels waarden identifisearre as klusters fan spermakoppen en krulsturten mei ljochtmikroskopie (LM). Spermabondels mei ferskate aggregaten binne ek identifisearre as ferdraaide koppen en flagellêre aggregaten, meardere fusearre spermasturten, spermakoppen dy't oan in sturt fêstmakke binne, en spermakoppen mei bûgde kearnen as meardere fusearre kearnen. transmissie-elektronenmikroskopie (TEM). Skennende elektronenmikroskopie (SEM) liet sjen dat de spermabondels omhulde aggregaten fan spermakoppen wiene en de spermaaggregaten lieten in oanhingjend netwurk fan ynpakte sturten sjen.
De morfology en ultrastruktuer fan spermatozoa, de foarming fan spermatozoabondels waarden bestudearre mei ljochtmikroskopie (heale seksje), scanning-elektronenmikroskopie (SEM) en transmissie-elektronenmikroskopie (TEM), sperma-útstrijkjes waarden kleurd mei akridinenoranje en ûndersocht mei epifluoreszinsjemikroskopie.
Sperma-útstrijkkleuring mei akridine-oranje (Fig. 3B) liet sjen dat de spermakoppen oaninoar plakt wiene en bedekt wiene mei sekretorysk materiaal, wat late ta de foarming fan grutte plukjes (Fig. 3D). De spermabondels bestienen út sperma-aggregaten mei in netwurk fan oanhingjende sturten (Fig. 4A-C). Spermabondels binne gearstald út de sturten fan in protte spermatozoa dy't oaninoar plakt binne (Fig. 4D). Geheimen (Fig. 4E,F) bedekten de koppen fan spermatozoabondels.
Formaasje fan 'e spermabondel Mei help fan fazekontrastmikroskopie en sperma-útstrijkjes kleurd mei akridinenoranje, waard oantoand dat de koppen fan sperma oan elkoar plakke. (A) Iere sperma-tuftfoarming begjint mei in sperma (wite sirkel) en trije sperma (giele sirkel), wêrby't de spiraal begjint by de sturt en einiget by de kop. (B) Fotomikrografie fan in sperma-útstrijkje kleurd mei akridinenoranje dy't oanhingjende spermakoppen sjen lit (pylken). De ûntlading bedekt de kop(pen). Fergrutting × 1000. (C) Untwikkeling fan in grutte striel dy't troch stream transportearre wurdt yn in mikrofluidysk kanaal (mei in hegesnelheidskamera by 950 fps). (D) Mikroografie fan in sperma-útstrijkje kleurd mei akridinenoranje dy't grutte plukjes (pylken) sjen lit. Fergrutting: ×200.
Skennende elektronenmikrograaf fan in spermabeam en in sperma-útstryk kleurd mei akridine-oranje. (A, B, D, E) binne digitale kleuren-skennende elektronenmikrograaf fan spermatozoa, en C en F binne mikrograaf fan akridine-oranje kleurde sperma-útstryk dy't de oanhechting sjen litte fan meardere spermatozoa dy't it caudale web wikkelje. (AC) Sperma-aggregaten wurde werjûn as in netwurk fan oanhechte sturten (pylken). (D) Adhesje fan ferskate spermatozoa (mei klevende stof, rôze omtrek, pylk) dy't om 'e sturt wikkelje. (E en F) Spermakopaggregaten (pointers) bedekt mei klevend materiaal (pointers). De spermatozoa foarmen bondels mei ferskate vortex-achtige struktueren (F). (C) ×400 en (F) ×200 fergruttings.
Mei help fan transmissie-elektronenmikroskopie hawwe wy fûn dat spermabondels oan sturten fêstmakke hiene (Fig. 6A, C), koppen oan sturten (Fig. 6B), of koppen oan sturten (Fig. 6D). De koppen fan 'e spermatozoa yn 'e bondel binne krom, en presintearje yn seksje twa kearnregio's (Fig. 6D). Yn 'e ynsnijdingsbondel hiene de spermatozoa in ferdraaide kop mei twa kearnregio's en meardere flagellêre regio's (Fig. 5A).
Digitale kleuren-elektronenmikrograaf dy't de ferbinende sturten yn 'e spermabondel en it agglutinearjende materiaal sjen lit dat de spermakoppen ferbynt. (A) Oanhingjende sturt fan in grut oantal spermatozoa. Let op hoe't de sturt derút sjocht yn sawol portret- (pylk) as lânskips- (pylk) projeksjes. (B) De kop (pylk) fan it sperma is ferbûn mei de sturt (pylk). (C) Meardere spermasturten (pylkjes) binne oanhingjend. (D) Agglutinaasjemateriaal (AS, blau) ferbynt fjouwer spermakoppen (pears).
Skennende elektronenmikroskopie waard brûkt om spermakoppen te detektearjen yn spermabondels bedekt mei sekreten of membranen (figuer 6B), wat oanjout dat de spermabondels ferankere wiene troch ekstrasellulêr materiaal. It agglutinearre materiaal wie konsintrearre yn 'e spermakop (kwallenkop-eftige gearstalling; fig. 5B) en útwreide distaal, wêrtroch't in briljant giel uterlik ûntstie ûnder fluoreszinsjemikroskopie as it kleurd waard mei akridinenoranje (fig. 6C). Dizze stof is dúdlik sichtber ûnder in skennende mikroskoop en wurdt beskôge as in binder. Heal-tinne seksjes (fig. 5C) en sperma-útstrijkjes kleurd mei akridinenoranje lieten spermabondels sjen mei ticht opinoar pakte koppen en krulde sturten (fig. 5D).
Ferskate fotomikrografen dy't aggregaasje fan spermakoppen en opfolde sturten sjen litte mei ferskate metoaden. (A) Dwarsdoorsnede digitale kleurentransmissie-elektronenmikrograf fan in spermabondel dy't in oprolde spermakop sjen lit mei in twadielige kearn (blau) en ferskate flagellêre dielen (grien). (B) Digitale kleuren-scan-elektronenmikrograf dy't in kluster fan kwal-eftige spermakoppen (pylken) sjen lit dy't bedekt lykje te wêzen. (C) Heal-tinne seksje dy't aggregearre spermakoppen (pylken) en oprolde sturten (pylken) sjen lit. (D) Mikrograf fan in sperma-útstrijk kleurd mei akridine-oranje dy't aggregaten fan spermakoppen (pylken) en oprolde oanhingjende sturten (pylken) sjen lit. Tink derom dat in kleverige substânsje (S) de kop fan 'e spermatozoön bedekt. ​​(D) × 1000 fergrutting.
Mei help fan transmissie-elektronenmikroskopie (Fig. 7A) waard ek opmurken dat de spermakoppen ferdraaid wiene en de kearnen in spiraalfoarm hienen, lykas befêstige troch sperma-útstrijkjes kleurd mei akridinenoranje en ûndersocht mei fluoreszinsjemikroskopie (Fig. 7B).
(A) Digitale kleurentransmissie-elektronenmikrograaf en (B) mei akridine-oranje kleurde sperma-útstryk dy't oprolde koppen en oanhechting fan spermakoppen en -sturten sjen lit (pylken). (B) × 1000 fergrutting.
In nijsgjirrige fynst is dat it sperma fan Sharkazi aggregeart om mobile filamenteuze bondels te foarmjen. De eigenskippen fan dizze bondels litte ús har mooglike rol yn 'e opname en opslach fan spermatozoa yn 'e SST begripe.
Nei de paring komt it sperma de fagina yn en ûndergiet in yntins seleksjeproses, wêrtroch't mar in beheind oantal sperma de SST yngiet15,16. Oant no ta binne de meganismen wêrmei't sperma de SST yngiet en ferlit ûndúdlik. By plomfee wurde spermatozoa foar in langere perioade fan 2 oant 10 wiken yn 'e SST opslein, ôfhinklik fan 'e soarte6. Der bliuwt kontroverse oer de tastân fan it sperma tidens opslach yn 'e SST. Binne se yn beweging of yn rêst? Mei oare wurden, hoe behâlde spermasellen har posysje yn 'e SST sa lang?
Forman4 suggerearre dat SST-ferbliuw en útstjit ferklearre wurde kinne yn termen fan spermamotiliteit. De auteurs stelle de hypoteze dat sperma har posysje behâlde troch te swimmen tsjin de floeistofstream dy't makke wurdt troch it SST-epitheel en dat sperma út 'e SST útstjitten wurdt as har snelheid ûnder it punt falt wêrop se begjinne efterút te bewegen fanwegen gebrek oan enerzjy. Zaniboni5 befêstige de oanwêzigens fan aquaporinen 2, 3 en 9 yn it apikale diel fan SST-epitheelzellen, wat yndirekt it spermaopslachmodel fan Foreman kin stypje. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje fûnen wy dat hast de helte fan Sharkashi's spermatozoa positive reology sjen litte yn 'e streamende floeistof, en dat agglutinearre spermabondels it oantal spermatozoa ferheegje dat positive reology sjen lit, hoewol agglutinaasje se fertraget. Hoe spermazellen omheech reizgje yn 'e eileider fan' e fûgel nei de plak fan befruchting wurdt net folslein begrepen. By sûchdieren lûkt de follikulêre floeistof chemoattraktive spermatozoa oan. Lykwols wurdt leaud dat chemoattraktanten spermatozoa liede om lange ôfstannen te benaderjen7. Dêrom binne oare meganismen ferantwurdlik foar spermatransport. It fermogen fan sperma om te oriïntearjen en te streamen tsjin de eileiderfloeistof dy't frijkomt nei de paring is rapportearre as in wichtige faktor by it rjochtsjen op sperma by mûzen. Parker17 suggerearre dat spermatozoa de aaidukten oerstekke troch te swimmen tsjin de siliêre stream yn fûgels en reptilen. Hoewol it net eksperiminteel oantoand is yn fûgels, wie Adolphi18 de earste dy't ûntduts dat fûgelsperma positive resultaten jout as in tinne laach floeistof tusken in dekglaasje en in dia makke wurdt mei in strip filterpapier. Reology. Hino en Yanagimachi [19] pleatsten in mûseierstok-eileiter-baarmoederkompleks yn in perfúzjering en ynjektearren 1 µl inket yn 'e isthmus om floeistofstream yn 'e eileiders te visualisearjen. Se seagen in heul aktive beweging fan krimp en ûntspanning yn 'e eileider, wêryn alle inketballen stadichoan nei de ampulla fan 'e eileider beweegden. De auteurs beklamje it belang fan 'e stream fan eileidersfloeistof fan 'e ûnderste nei de boppeste eileiders foar it optillen en befruchtsjen fan sperma. Brillard20 melde dat by hinnen en kalkoenen spermatozoa migrearje troch aktive beweging fan 'e faginale yngong, dêr't se opslein wurde, nei de utero-vaginale oergong, dêr't se opslein wurde. Dizze beweging is lykwols net fereaske tusken de uterovaginale oergong en it infundibulum, om't de spermatozoa troch passive ferpleatsing ferfierd wurde. Mei dizze eardere oanbefellings en de resultaten dy't yn 'e hjoeddeiske stúdzje binne krigen, kin oannommen wurde dat it fermogen fan spermatozoa om stroomopwaarts te bewegen (reology) ien fan 'e eigenskippen is wêrop it seleksjeproses basearre is. Dit bepaalt de passaazje fan spermatozoa troch de fagina en har yngong yn 'e CCT foar opslach. Lykas Forman4 suggerearre, kin dit ek it proses fan sperma fasilitearje dat de SST en syn habitat foar in perioade yngiet en dan wer fuortgiet as har snelheid begjint te fertragen.
Oan 'e oare kant suggerearren Matsuzaki en Sasanami 21 dat fûgelspermatozoa bewegingsferoarings ûndergeane fan sliepperioade nei beweging yn 'e manlike en froulike fuortplantingskanalen. Remming fan 'e beweeglikheid fan 'e sperma yn 'e SST is foarsteld om de lange opslachtiid fan sperma en dan ferjonging nei it ferlitten fan 'e SST te ferklearjen. Under hypoxyske omstannichheden rapportearren Matsuzaki et al. 1 hege produksje en frijlitting fan laktaat yn 'e SST, wat kin liede ta remming fan 'e beweeglikheid fan 'e sperma. Yn dit gefal wurdt it belang fan spermareology wjerspegele yn 'e seleksje en opname fan sperma, en net yn har opslach.
It sperma-agglutinaasjepatroan wurdt beskôge as in plausibele ferklearring foar de lange opslachperioade fan sperma yn 'e SST, om't dit in gewoan patroan is fan spermabehâld by plomfee2,22,23. Bakst et al. 2 observearren dat de measte spermatozoa oan elkoar plakten, fascikulêre aggregaten foarmen, en ienkele spermatozoa waarden selden fûn yn kwartel-CCM. Oan 'e oare kant observearren Wen et al. 24 mear fersprate spermatozoa en minder spermatozoa-tufts yn it SST-lumen by hinnen. Op basis fan dizze observaasjes kin oannommen wurde dat de oanstriid ta sperma-agglutinaasje ferskilt tusken fûgels en tusken spermatozoa yn itselde ejakulaat. Derneist suggerearren Van Krey et al. 9 dat willekeurige dissosiaasje fan agglutinearre spermatozoa ferantwurdlik is foar de stadige penetraasje fan spermatozoa yn it lumen fan 'e eileider. Neffens dizze hypoteze moatte spermatozoa mei in legere agglutinaasjekapasiteit earst út 'e SST ferdreaun wurde. Yn dizze kontekst kin it fermogen fan spermatozoa om te agglutinearjen in faktor wêze dy't ynfloed hat op 'e útkomst fan spermakompetysje yn smoarge fûgels. Derneist, hoe langer it agglutinearre sperma dissosiearret, hoe langer de fruchtberens behâlden bliuwt.
Hoewol spermatozoa-aggregaasje en aggregaasje yn bondels binne waarnommen yn ferskate stúdzjes2,22,24, binne se net yn detail beskreaun fanwegen de kompleksiteit fan har kinematyske observaasje binnen de SST. Ferskate pogingen binne dien om sperma-agglutinaasje yn vitro te bestudearjen. Útwreide, mar tydlike aggregaasje waard waarnommen doe't de tinne tried út 'e hingjende sieddrip waard fuorthelle. Dit liedt ta it feit dat in langwerpige bubbel út 'e drip stekt, dy't de seminale klier imitearret. Fanwegen 3D-beperkingen en koarte dripdroegtiden rekke it heule blok fluch yn ferfal9. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje, mei Sharkashi-kippen en mikrofluidyske chips, koene wy ​​​​beskriuwe hoe't dizze plukjes foarmje en hoe't se bewege. Spermabondels foarmen har direkt nei sperma-kolleksje en bleken yn in spiraal te bewegen, wat positive rheology sjen liet as se oanwêzich wiene yn 'e stream. Fierder, by makroskopysk besjoen, is waarnommen dat spermabondels de lineariteit fan motiliteit ferheegje yn ferliking mei isolearre spermatozoa. Dit suggerearret dat sperma-agglutinaasje kin foarkomme foar SST-penetraasje en dat spermaproduksje net beheind is ta in lyts gebiet fanwegen stress lykas earder suggerearre (Tingari en Lake12). Tidens tuftfoarming swimme de spermatozoa syngroan oant se in ferbining foarmje, dan wikkelje har sturten om elkoar hinne en bliuwt de kop fan 'e spermatozoa frij, mar de sturt en it distale diel fan 'e spermatozoa plakke oaninoar mei in kleverige substânsje. Dêrom is de frije kop fan it ligament ferantwurdlik foar de beweging, wêrby't de rest fan it ligament meisleept. Skennende elektronenmikroskopie fan 'e spermabondels liet oanhingjende spermakoppen sjen dy't bedekt wiene mei in protte kleverich materiaal, wat suggerearret dat de spermakoppen yn rêstende bondels oanhingje, wat mooglik bard is nei it berikken fan 'e opslachplak (SST).
As in sperma-útstrijkje kleurd wurdt mei akridine-oranje, kin ekstrasellulêr kleefmateriaal om 'e spermasellen hinne sjoen wurde ûnder in fluoreszinte mikroskoop. Dizze stof lit spermabondels ta om te hechten oan en te kleven oan alle omlizzende oerflakken of dieltsjes, sadat se net mei de omlizzende stream meidriuwe. Sa litte ús waarnimmings de rol sjen fan spermatozoa-adhesion yn 'e foarm fan mobile bondels. Harren fermogen om tsjin 'e stream yn te swimmen en te hechten oan tichtby lizzende oerflakken lit sperma langer yn 'e SST bliuwe.
Rothschild25 brûkte in hemocytometrykamera om de driuwende ferdieling fan rundersperma yn in dripke suspensje te bestudearjen, troch fotomikrografyen te meitsjen fia in kamera mei sawol fertikale as horizontale optyske as fan 'e mikroskoop. De resultaten lieten sjen dat de spermatozoa oanlutsen waarden troch it oerflak fan 'e keamer. De auteurs suggerearje dat der hydrodynamyske ynteraksjes kinne wêze tusken it sperma en it oerflak. Rekken hâldend mei dit, tegearre mei it fermogen fan Sharkashi-kypsperma om kleverige plukjes te foarmjen, kin it de kâns ferheegje dat sperma oan 'e SST-wand sil hechte en foar lange perioaden opslein wurdt.
Bccetti en Afzeliu26 rapportearren dat de sperma-glykokalyx nedich is foar gameet-erkenning en agglutinaasje. Forman10 observearren dat hydrolyse fan α-glykosidyske biningen yn glykoproteïne-glykolipide-coatings troch it behanneljen fan fûgelsperma mei neuraminidase resultearre yn fermindere fruchtberens sûnder ynfloed te hawwen op de spermamotiliteit. De auteurs suggerearje dat it effekt fan neuraminidase op 'e glykokalyx de spermasekwestraasje by de utero-vaginale oergong beheind, wêrtroch't de fruchtberens ferminderet. Harren observaasjes kinne de mooglikheid net negearje dat neuraminidase-behanneling de erkenning fan sperma en aaicellen kin ferminderje. Forman en Engel10 fûnen dat de fruchtberens fermindere doe't hinnen intravaginaal ynseminearre waarden mei sperma behannele mei neuraminidase. IVF mei neuraminidase-behannele sperma hie lykwols gjin ynfloed op 'e fruchtberens yn ferliking mei kontrôlekippen. De auteurs konkludearren dat feroarings yn 'e glycoproteïne-glykolipide-coating om it spermamembraan it fermogen fan sperma om te befruchtsjen fermindere troch de sekwestraasje fan sperma by de utero-vaginale oergong te beheinen, wat op syn beurt it spermaferlies fergrutte troch de snelheid fan 'e utero-vaginale oergong, mar gjin ynfloed hat op 'e erkenning fan sperma en aaien.
By kalkoenen fûnen Bakst en Bauchan 11 lytse fesikels en membraanfragminen yn it lumen fan 'e SST en observearren dat guon fan dizze granules fusearre wiene mei it spermamembraan. De auteurs suggerearje dat dizze relaasjes kinne bydrage oan 'e lange-termyn opslach fan spermatozoa yn SST. De ûndersikers hawwe lykwols de boarne fan dizze dieltsjes net spesifisearre, oft se útskieden wurde troch CCT-epitheelsellen, produsearre en útskieden wurde troch it manlike fuortplantingssysteem, of produsearre wurde troch it sperma sels. Ek binne dizze dieltsjes ferantwurdlik foar agglutinaasje. Grützner et al27 rapportearren dat epididymale epitheelsellen in spesifyk proteïne produsearje en útskiede dat nedich is foar de foarming fan ienpoarige seminale traktaten. De auteurs rapportearje ek dat de fersprieding fan dizze bondels ôfhinklik is fan 'e ynteraksje fan epididymale proteïnen. Nixon et al28 fûnen dat de adnexa in proteïne útskiede, it soere cysteine-rike osteonektine; SPARC is belutsen by de foarming fan spermatufts yn koartsnavelige echidna's en platypussen. De fersprieding fan dizze strielen is assosjeare mei it ferlies fan dit proteïne.
Yn 'e hjoeddeiske stúdzje liet ultrastrukturele analyze mei elektronenmikroskopie sjen dat de spermatozoa oan in grutte hoemannichte ticht materiaal fêstplakten. Dizze stoffen wurde tocht ferantwurdlik te wêzen foar de agglutinaasje dy't kondinsearret tusken en om 'e oanhingjende koppen, mar by legere konsintraasjes yn 'e sturtregio. Wy nimme oan dat dizze agglutinearjende stof út it manlike fuortplantingssysteem (epididymis of vas deferens) tegearre mei sperma útskieden wurdt, om't wy faak sperma observearje dat skiedt fan lymfe en seminaal plasma tidens ejakulaasje. Der is rapportearre dat as fûgelspermatozoa troch de epididymis en vas deferens geane, se rypingsrelatearre feroarings ûndergeane dy't har fermogen stypje om aaiwiten te binen en plasma-lemma-assosjeare glycoproteïnen te krijen. De oanhâldendheid fan dizze aaiwiten op residente spermamembranen yn 'e SST suggerearret dat dizze aaiwiten de fermogen om spermamembraanstabiliteit te krijen 30 kinne beynfloedzje en har fruchtberens 31 kinne bepale. Ahammad et al32 rapportearren dat spermatozoa dy't út ferskate dielen fan it manlike fuortplantingssysteem (fan 'e testikels oant de distale vas deferens) krigen waarden, in progressive tanimming fan 'e libbensfetberens lieten sjen ûnder floeibere opslachomstannichheden, ûnôfhinklik fan 'e opslachtemperatuer, en de libbensfetberens by hinnen nimt ek ta yn 'e eileiders nei keunstmjittige ynseminaasje.
Sharkashi-hinnespermabosken hawwe oare skaaimerken en funksjes as oare soarten lykas echidna's, platypussen, boskmûzen, reeërotten en cavia's. By sharkasi-hinnen fermindere de foarming fan spermabondels har swimsnelheid yn ferliking mei ienkele spermatozoa. Dizze bondels fergrutten lykwols it persintaazje rheologysk positive spermatozoa en fergrutten it fermogen fan spermatozoa om harsels te stabilisearjen yn in dynamyske omjouwing. Sa befêstigje ús resultaten de foarige suggestje dat sperma-agglutinaasje yn SST assosjeare is mei lange-termyn spermaopslach. Wy stelle ek de hypoteze dat de oanstriid fan sperma om bosken te foarmjen de snelheid fan spermaferlies yn SST kin kontrolearje, wat de útkomst fan spermakompetysje kin feroarje. Neffens dizze oanname frijlitte spermatozoa mei lege agglutinaasjekapasiteit earst SST, wylst spermatozoa mei hege agglutinaasjekapasiteit it measte fan it neiteam produsearje. De foarming fan ienpoare spermabondels is foardielich en beynfloedet de âlder-bernferhâlding, mar brûkt in oar meganisme. By echidna's en platypussen binne de spermatozoa parallel oan elkoar rangearre om de foarútgongssnelheid fan 'e striel te ferheegjen. Bundels fan echidna's bewege sawat trije kear rapper as ienkele spermatozoa. Der wurdt leaud dat de foarming fan sokke sperma-tufts yn echidna's in evolúsjonêre oanpassing is om dominânsje te behâlden, om't wyfkes promisku binne en meastentiids mei ferskate mantsjes pare. Dêrom konkurrearje spermatozoa fan ferskate ejakulaten fûl om de befruchting fan it aai.
Agglutinearre spermatozoa fan sharkasi-hinnen binne maklik te visualisearjen mei fazekontrastmikroskopie, wat as foardielich beskôge wurdt, om't it maklike stúdzje fan it gedrach fan spermatozoa yn vitro mooglik makket. It meganisme wêrmei't sperma-tuftfoarming de fuortplanting befoarderet yn sharkasi-hinnen is ek oars as dat sjoen by guon placenta-sûchdieren dy't gearwurkjend sperma-gedrach fertsjintwurdigje, lykas houtmûzen, wêrby't guon spermatozoa de aaien berikke, wêrtroch oare besibbe yndividuen har aaien berikke en beskeadigje. om josels te bewizen. altruïstysk gedrach. Selsbefruchting 34. In oar foarbyld fan gearwurkjend gedrach yn spermatozoa waard fûn by reeëmûzen, wêrby't spermatozoa yn steat wiene om de meast genetysk besibbe spermatozoa te identifisearjen en te kombinearjen en gearwurkjende groepen te foarmjen om har snelheid te ferheegjen yn ferliking mei net-besibbe spermatozoa 35.
De resultaten dy't yn dizze stúdzje krigen binne, binne net yn striid mei de teory fan Foman oer lange-termyn opslach fan spermatozoa yn SWS. De ûndersikers melde dat spermasellen in langere perioade trochgean te bewegen yn 'e stream fan epitheelzellen dy't de SST beklaaie, en nei in bepaalde perioade binne de enerzjyfoarrieden fan 'e spermasellen útput, wat resulteart yn in ôfname fan snelheid, wêrtroch't stoffen mei lyts molekulêr gewicht kinne wurde útstjoerd. enerzjy fan spermatozoa mei de stream fan floeistof út it lumen fan 'e SST De holte fan 'e eileider. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje hawwe wy waarnommen dat de helte fan 'e ienige sperma it fermogen sjen liet om tsjin streamende floeistoffen yn te swimmen, en har adhesion yn 'e bondel fergrutte har fermogen om positive rheology te sjen litten. Fierder binne ús gegevens yn oerienstimming mei dy fan Matsuzaki et al. 1 dy't rapportearren dat ferhege laktaatsekresje yn SST de beweechlike spermamotiliteit kin remje. Us resultaten beskriuwe lykwols de foarming fan sperma-beweeglike ligamen en har rheologysk gedrach yn 'e oanwêzigens fan in dynamyske omjouwing binnen in mikrokanaal yn in besykjen om har gedrach yn SST te ferdúdlikjen. Takomstich ûndersyk kin him rjochtsje op it bepalen fan 'e gemyske gearstalling en oarsprong fan it agglutinearjende middel, wat ûndersikers sûnder mis sil helpe om nije manieren te ûntwikkeljen om floeibere sperma op te slaan en de doer fan fruchtberens te fergrutsjen.
Fyftjin 30 wiken âlde manlike sharkasi mei bleate nekken (homozygote dominante; NaNa) waarden selektearre as spermadonoren yn 'e stúdzje. De fûgels waarden grutbrocht op 'e Research Poultry Farm fan 'e Fakulteit Lânbou, Ashit Universiteit, Ashit Governorate, Egypte. De fûgels waarden ûnderbrocht yn yndividuele koaien (30 x 40 x 40 sm), ûnderwurpen oan in ljochtprogramma (16 oeren ljocht en 8 oeren tsjuster) en krigen in dieet mei 160 g rûge proteïne, 2800 kcal metabolisearbere enerzjy, 35 g kalsium elk, en 5 gram beskikber fosfor per kilogram dieet.
Neffens gegevens 36, 37 waard sperma sammele fan mantsjes troch abdominale massaazje. Yn totaal waarden 45 spermamonsters sammele fan 15 manlju oer 3 dagen. Sperma (n = 15/dei) waard fuortendaliks 1:1 (v:v) ferdund mei Belsville Poultry Semen Diluent, dat kaliumdifosfaat (1,27 g), mononatriumglutamaatmonohydraat (0,867 g), fruktose (0,5 d), wetterfrije natriumasetaat (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethaan (0,195 g), kaliumsitraatmonohydraat (0,064 g), kaliummonofosfaat (0,065 g), magnesiumchloride (0,034 g) en H2O (100 ml) befettet, pH = 7, 5, osmolariteit 333 mOsm/kg38. Ferdunde spermamonsters waarden earst ûndersocht ûnder in ljochtmikroskoop om goede spermakwaliteit (focht) te garandearjen en doe opslein yn in wetterbad by 37 °C oant gebrûk binnen in heal oere nei it sammeljen.
De kinematika en reology fan spermatozoa wurde beskreaun mei in systeem fan mikrofluidyske apparaten. Spermamonsters waarden fierder ferdund ta 1:40 yn Beltsville Avian Semen Diluent, laden yn in mikrofluidysk apparaat (sjoch hjirûnder), en kinetyske parameters waarden bepaald mei in Computerized Semen Analysis (CASA) systeem dat earder ûntwikkele wie foar mikrofluidika-karakterisaasje oer de mobiliteit fan spermatozoa yn floeibere media (Department of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Assiut University, Egypte). De plugin kin downloade wurde op: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Krommesnelheid (VCL, μm/s), lineêre snelheid (VSL, μm/s) en gemiddelde trajektsnelheid (VAP, μm/s) waarden metten. Fideo's fan spermatozoa waarden makke mei in omkearde Optika XDS-3 faze kontrastmikroskoop (mei 40x objektiv) ferbûn mei in Tucson ISH1000 kamera op 30 fps foar 3 s. Brûk de CASA-software om teminsten trije gebieten en 500 spermatrajekten per stekproef te bestudearjen. De opnommen fideo waard ferwurke mei in selsmakke CASA. De definysje fan motiliteit yn 'e CASA-plug-in is basearre op 'e swimsnelheid fan it sperma yn ferliking mei de streamsnelheid, en omfettet gjin oare parameters lykas syd-oan-syd-beweging, om't dit betrouberder bliken docht te wêzen yn floeistofstream. Reologyske beweging wurdt omskreaun as de beweging fan spermasellen tsjin 'e rjochting fan 'e floeistofstream yn. Spermatozoa mei reologyske eigenskippen waarden dield troch it oantal beweechlike spermatozoa; spermatozoa dy't yn rêst wiene en konvektyf bewegende spermatozoa waarden útsletten fan 'e telling.
Alle brûkte gemikaliën waarden krigen fan Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egypte), útsein as oars oanjûn. It apparaat waard produsearre lykas beskreaun troch El-sherry et al. 40 mei wat oanpassingen. De materialen dy't brûkt waarden om de mikrokanalen te meitsjen wiene glêzen platen (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negative resist (MicroChem, Newton, CA), diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Dútslân), en polyaceton. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanalen wurde makke mei sêfte litografy. Earst waard in dúdlik beskermjend gesichtsmasker mei it winske mikrokanaalûntwerp printe op in printer mei hege resolúsje (Prismatic, Cairo, Egypt en Pacific Arts and Design, Markham, ON). De masters waarden makke mei glêzen platen as substraten. De platen waarden skjinmakke yn aceton, isopropanol en deionisearre wetter en doe bedekt mei in 20 µm laach fan SU8-25 troch spincoating (3000 rpm, 1 min). De SU-8-lagen waarden doe sêft droege (65 °C, 2 min en 95 °C, 10 min) en 50 sekonden bleatsteld oan UV-strieling. Nei bleatstelling bakke by 65 °C en 95 °C foar 1 min en 4 minuten om bleatstelde SU-8-lagen te ferbinen, folge troch ûntwikkeling yn diacetonalkohol foar 6,5 minuten. Bak de wafels hurd (200 °C foar 15 minuten) om de SU-8-laach fierder te ferhurdzjen.
PDMS waard taret troch it mingen fan 'e monomeer en ferhurder yn in gewichtsferhâlding fan 10:1, doe ûntgast yn in fakuüm-eksikator en getten op it SU-8 haadframe. It PDMS waard úthard yn in oven (120 °C, 30 min), doe waarden de kanalen útsnien, skieden fan 'e master, en perforearre om buizen te befestigjen oan 'e yn- en útgong fan it mikrokanaal. Uteinlik waarden PDMS-mikrokanalen permanint befestige oan mikroskoopglaasjes mei in draachbere koronaprosessor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) lykas earne oars beskreaun. It mikrokanaal dat yn dizze stúdzje brûkt waard, mjit 200 µm × 20 µm (B × H) en is 3,6 sm lang.
De floeistofstream dy't feroarsake wurdt troch hydrostatyske druk yn it mikrokanaal wurdt berikt troch it floeistofnivo yn it ynlaatreservoir boppe it hichteferskil Δh39 yn it útlaatreservoir te hâlden (Fig. 1).
wêrby't f de wriuwingskoëffisjint is, definiearre as f = C/Re foar laminêre stream yn in rjochthoekich kanaal, wêrby't C in konstante is dy't ôfhinklik is fan 'e aspektferhâlding fan it kanaal, L de lingte fan it mikrokanaal is, Vav de gemiddelde snelheid binnen it mikrokanaal is, Dh de hydraulyske diameter fan it kanaal is, g - swiertekrêftfersnelling. Mei dizze fergeliking kin de gemiddelde kanaalsnelheid berekkene wurde mei de folgjende fergeliking: