Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is in peulplant dy't brûkt wurdt foar itenproduksje en boaiemferbettering.De wrâldwide útwreiding fan NLL as gewaaks hat in protte pathogene skimmels oanlutsen, ynklusyf lupine anthracnose, dy't de ferneatigjende anthracnose sykte feroarsaket.Twa allelen, Lanr1 en AnMan, dy't ferhege ferset jouwe, binne brûkt yn NLL-fokken, mar de ûnderlizzende molekulêre meganismen bliuwe ûnbekend.Yn dizze stúdzje waarden de Lanr1- en AnMan-markers brûkt om Jeropeeske NLL-samples te skermjen.Testen fan it faksin yn in kontroleare omjouwing befêstige de effektiviteit fan beide resistente donateurs.Differinsjaal gene ekspresje profilearring waard útfierd op represintative resistente en gefoelige rigels.Anthracnose-resistinsje waard ferbûn mei oerekspresje fan 'e gene-ontologyske termen "GO: 0006952 Defense Response", "GO: 0055114 Redox Process", en "GO: 0015979 Photosynthesis".Derneist toande de Lanr1 (83A: 476) line signifikante transkriptoom-herprogrammearring rap nei ynokulaasje, wylst de oare rigels in fertraging yn dit antwurd mei sawat 42 oeren sjen litte.Definsje-antwurden binne assosjeare mei de TIR-NBS, CC-NBS-LRR en NBS-LRR genen, 10 proteïnen belutsen by pathogenesis, lipide oerdrachtproteinen, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glycine-rike selwandproteinen, en genen fan reaktyf paad fan soerstof.Iere reaksjes op 83A: 476, ynklusyf soarchfâldige ûnderdrukking fan genen dy't ferbûn binne mei fotosynteze, foelen gear mei suksesfolle beskerming tidens de fegetative groeifaze fan fungal biology, wat suggerearret dat in effektor ymmuniteit trigger.De Mandeloop-reaksje wurdt fertrage, lykas de algemiene horizontale slepen.
De smelle-leaved lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is in proteïne granen fan oarsprong yn it westlike Middellânske Seegebiet1,2.It wurdt op it stuit ferboud as fiedingsgewaaks foar bisten en minsken.It wurdt ek beskôge as griene dong yn gewaaksrotaasjesystemen fanwegen stikstoffixaasje troch symbiotyske stikstoffixearjende baktearjes en algemiene ferbettering fan boaiemstruktuer.NLL hat yn 'e lêste ieu in rap proses fan domestikaasje ûndergien en is noch altyd ûnder hege fokdruk3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Mei de wiidferspraat teelt fan NLL ûntwikkele de opienfolging fan pathogene skimmels nije agraryske nissen en soarge foar nije gewaaks-ferneatigjende sykten. It opfallendste foar lupineboeren en fokkers wie it optreden fan anthracnose, feroarsake troch de patogene fungus Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. It opfallendste foar lupineboeren en fokkers wie it optreden fan anthracnose, feroarsake troch de patogene fungus Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогныго люпина , Feiler & Hagedorn13. It meast opfallend foar lupineboeren en fokkers wie it ûntstean fan anthracnose feroarsake troch de patogene fungus Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由眅, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眵它是由眵Harren. 1 ( Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого партимого партинг ) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. It opfallendst foar lupineboeren en fokkers is it ûntstean fan anthracnose feroarsake troch de pathogene fungus Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.De ierste rapporten fan 'e sykte kamen út Brazylje en de Feriene Steaten, mei typyske symptomen dy't ferskine yn respektivelik 1912 en 1929.Lykwols, nei sa'n 30 jier waard it patroan oanwiisd as Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph fan Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .en H. Schrenk. & H.施伦克,. & H.施伦克,.en H. Schlenk,.Preliminêre sykte fenotyping yn 'e mids 20e iuw liet wat ferset sjen yn nll en giele lupine (L. Luteus L.), mar alle wite lupine (L. ALBUS L.) TESTEDERS WURD WURDT WURDE WURDE WURDE.Stúdzjes hawwe sjen litten dat de ûntwikkeling fan anthracnose wurdt assosjearre mei ferhege delslach (loftvochtigheid) en temperatuer (yn it berik fan 12-28 ° C), dy't liedt ta in oertrêding fan ferset by hegere temperatueren17, 18. Yn feite, de tiid nedich foar conidia te germinate en de sykte om te begjinnen , wie fjouwer kear koarter op 24 ° C (12 oeren) hege vochtigheid (12 oeren) as 12 oeren.Sa hat de oanhâldende opwaarming fan de ierde laat ta de fersprieding fan antraknose.De sykte waard lykwols yn Frankryk (1982) en Oekraïne (1983) waarnommen as in foarboade fan in driigjende bedriging, mar waard blykber negearre troch de lupine-yndustry doe20,21.In pear jier letter ferspraat dizze ferneatigjende sykte oer de hiele wrâld en beynfloede ek grutte lupine-produsearjende lannen lykas Austraalje, Poalen en Dútslân22,23,24.Nei in anthracnose-útbraak yn 'e midden fan' e 1990's resultearre wiidweidige screening yn 'e identifikaasje fan ferskate resistente donateurs yn NLL19-samples.NLL ferset tsjin anthracnose wurdt kontrolearre troch twa aparte dominante allelen fûn yn ferskate germplasma boarnen: Lanr1 yn cultivar Tanjil en Wonga en AnMan yn cultivar.Mandalay 25, 26. Dizze allelen komplementearje de molekulêre markers dy't de seleksje fan resistente germplasma stypje yn fokkenprogramma's25,26,27,28,29,30.De resistinte briedline 83A:476 dy't it Lanr1-allele drage, waard krúst mei de gefoelige wylde line P27255 om in RIL-populaasje te krijen dy't segregearre foar anthracnose-resistinsje, wat it mooglik makke om de Lanr1-lokus te tawizen oan chromosoom NLL-1131, 32, 33. Alignaasje fan in flank-ferset-marker-frame-ôfstimming fan in flank-ferset-frame-frame LL iepenbiere de lokaasje fan alle trije allelen op itselde chromosoom (NLL-11), mar yn ferskate posysjes29,34,35.Troch it lytse oantal RIL's en de grutte genetyske ôfstân tusken markers en oerienkommende allelen kinne lykwols gjin betroubere konklúzjes lutsen wurde oer har ûnderlizzende genen.Oan 'e oare kant is it gebrûk fan omkearde genetika yn lupinen lestich fanwege har heul lege regeneraasjepotinsjeel, wat genetyske manipulaasje omslachtich makket37.
De ûntwikkeling fan domestisearre germplasma dy't it winske allele yn 'e homozygote steat drage, lykas 83A: 476 (Lanr1) en Mandelup (AnMan), hat de doar iepene om anthracnose-resistinsje te studearjen yn it gesicht fan 'e oanwêzigens fan tsjinoerstelde kombinaasjes fan allelen yn wylde populaasjes.Mooglikheden fan molekulêre meganismen.Fergelykje ferdigeningsantwurden generearre troch spesifike genotypen.Dizze stúdzje evaluearre de iere transkriptoom-antwurd fan NLL nei C. lupini-faksinaasje.Earst waard in Jeropeesk NLL-germplasmapaniel mei 215 rigels screened mei molekulêre markers dy't de Lanr1- en AnMan-alleles markearje.Anthracnose phenotyping waard doe útfierd op 50 NLL rigels, earder selektearre foar molekulêre markers, ûnder kontrolearre omstannichheden.Op grûn fan dizze eksperiminten waarden fjouwer rigels dy't ferskille yn anthracnose-resistinsje en Lanr1 / AnMan allelike komposysje selekteare foar profilearjen fan differinsjaal ferdigening-gen-ekspresje mei twa komplemintêre oanpakken: RNA-sekwinsje mei hege trochset en real-time PCR-kwantifikaasje.
Screening fan in set fan NLL kiemplasma (N = 215) mei markers Lanr1 (Anseq3 en Anseq4) en AnMan (Anseq4) en AnMan (AnManM1) die bliken dat mar ien line (95726, tichtby Salamanca-b) it "resistinsje" allel fersterket foar alle merkers fan alle merkers fan '~ sus fûn yn 'e allele merkers' (8 73,5%) rigels.Trettjin rigels produsearren twa "resistinte" allelen fan 'e Lanr1-marker, en 8 rigels produsearren "resistinte" allelen fan Lanr1.marker.It "ferset" allele fan 'e AnMan-marker (oanfoljende tabel S1).Twa rigels wiene heterozygoot foar de Anseq3 marker en ien heterozygoot foar de AnManM1 marker.42 rigels (19.5%) droegen tsjinoerstelde fazen fan 'e Anseq3 en Anseq4 alleles, wat oanjout op in hege frekwinsje fan rekombinaasje tusken dizze twa loci.Anthracnose-fenotypen ûnder kontroleare omstannichheden (oanfoljende tabel S2) iepenbiere fariabiliteit yn 'e wjerstân fan' e teste genotypen, dy't wjerspegele waard yn 'e earnst fan anthracnose.Ferskillen yn gemiddelde skoares rûnen fan 1,8 (middels resistint) oant 6,9 (feardich) en plantgewichtferskillen rûnen fan 0,62 (gefoel) oant 4,45 g (resistint). D'r wie in signifikante korrelaasje tusken wearden beoardiele yn twa replikaasjes fan it eksperimint (0.51 foar sykte-swierens, P = 0.00017 en 0.61 foar plantgewicht, P <0.0001) en ek tusken dizze twa parameters (- 0.59 en -0.77, P <0.0001). D'r wie in signifikante korrelaasje tusken wearden waarnommen yn twa replikaasjes fan it eksperimint (0.51 foar skoares foar sykte earnst, P = 0.00017 en 0.61 foar plantgewicht, P <0.0001) en ek tusken dizze twa parameters (- 0.59 en -0.77, P <0.0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента = 0,51 poal 0,00017 en 0,61 foar массы растения, P < 0,0001), а также между этими двуми параметрами (-0,59 en -0,77, 0,00 < 0,01)). In signifikante korrelaasje waard fûn tusken de wearden waarnommen yn twa werhellingen fan it eksperimint (0.51 foar skoares foar sykte earnst, P = 0.00017 en 0.61 foar plantgewicht, P <0.0001), lykas tusken dizze twa parameters (- 0.59 en -0.77, P <0.000)).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分,0,0,0,51︺.物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈庆 诟 0 5. 1 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（–5.9.和– 0,59 和 0,77，P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (oценколи тяжя, = 0, 0, 0, 0, 0, 0 0017 и масса растения 0,61, P <0,0001), en между этими двумя параметрами (-0,59 en -0,0001) 0,77, P <0,0001. D'r wie in signifikante korrelaasje tusken de wearden waarnommen yn duplikaat (score fan 'e earnst fan' e sykte 0.51, P = 0.00017 en plantgewicht 0.61, P <0.0001) en tusken dizze twa parameters (-0.59 en -0.0001) 0.77, P <0.001. ).Typyske symptomen dy't sjoen wurde yn gefoelige planten omfetsje kinking en draaien fan 'e stâle dy't liket op in "herdersbôge" struktuer, folge troch ovale lesions mei oranje/rôze sporozoiten (oanfoljende fig. 1).Australyske oankomsten dy't de genen Lanr1 (83A: 476 en Tanjil) en AnMan (Mandelup) drage, binne matig resistint, 0.0331 en 0.0036.Guon rigels dy't ek "resistinte" Lanr1 en / of AnMan alleles drage litte symptomen fan 'e sykte sjen.
Nijsgjirrich is dat in pear NLL-rigels dy't gjin "resistinte" marker-allele ûntbrekke, in heech nivo fan anthracnose-resistinsje iepenbiere (fergelykber of heger as foar Lanr1- as AnMan-genotypen), lykas Boregine (P-wearde <0.0001 foar beide parameters), Bojar (P-wearde <0.0001 foar skoare en 0.001 B-plantgewicht) (0.001 foar B-5-plantgewicht) en <0/9b-plantwearde (0.001). 1 foar skoare en net-signifikant foar gewicht). Nijsgjirrich is dat in pear NLL-rigels dy't gjin "resistinte" marker-allele ûntbrekke, in heech nivo fan anthracnose-resistinsje iepenbiere (fergelykber of heger as foar Lanr1- as AnMan-genotypen), lykas Boregine (P-wearde <0.0001 foar beide parameters), Bojar (P-wearde <0.0001 foar skoare en 0.001 B-plantgewicht) (0.001 foar B-5-plantgewicht) en <0/9b-plantwearde (0.001). 1 foar skoare en net-signifikant foar gewicht). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасусаливыки антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (ûntwerp P <0,0001 мечение), 0,0001 foar оценки en 0,001 для массы растения) en популяции B-549/79b (ûntwerp P <0,0001 foar оценки en незначим). Nijsgjirrich is dat ferskate NLL-rigels dy't gjin 'resistinte' marker-allele ûntbrekke, in heech nivo fan wjerstân tsjin anthracnose toande (fergelykber mei of heger as foar Lanr1- of AnMan-genotypen), lykas Boregine (P-wearde <0.0001 foar beide parameters), Bojar (P-wearde <0.0001 foar evaluaasje fan gewicht <0.0001 foar evaluaasje fan gewicht en B-9b) en B-9b-wearde en B-9b-wearde en B-9b. .0001 foar evaluaasje en net signifikant foar gewicht).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的瀅疽1基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值高高鸏鸏鸏鸉鸇0.0.0.0.0.0. 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）. It is nijsgjirrich dat guon NLL-systemen dy't gjin "antigenyske" markers hawwe in hege horizontale wjerstân sjen litte (lykweardich oan Lanr1- of AnMan-genen of heger), lykas Boregine (beide parameters P <0.0001), Bojar (P-wearde <0.0001, plantgewicht 0.001) en stam B-549 / 70.000-wearde <1,0001 (betsjuttingstich). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазалич антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (foar P обоих параметров <0,000,000 1), (p. а растения 0,001) en популяция B-549/79b (P-ûntwerp <0,0001, масса незначительна). Nijsgjirrich is dat guon NLL-rigels dy't gjin 'resistinsje'-markerallelen ûntbrekke, hege nivo's fan anthracnose-resistinsje sjen litte (fergelykber mei of heger as Lanr1- of AnMan-genotypen), lykas Boregine (P-wearde foar beide parameters <0.0001), Bojar (P-wearde <0.0001, plantgewicht <0.0001, plantgewicht 0.09e (0.004) / 0.009b. 1, gewicht net signifikant).Dit ferskynsel suggerearret de mooglikheid fan in nije genetyske boarne fan ferset, it ferklearjen fan it waarnommen gebrek oan korrelaasje tusken markergenotypen en syktefenotypen (P-wearden fan ~0.42 oant ~0.98).Sa liet de Kolmogorov-Smirnov-test sjen dat de gegevens oer anthracnose-resistinsje sawat normaal ferdield wiene foar skoares (P-wearden 0.25 en 0.11) en plantmassa (P-wearden 0.47 en 0.55), wat suggerearret dat ik hypoteze dat mear allelen dan Lanr1 en AnMan belutsen binne.
Op grûn fan de resultaten fan anthracnose ferset screening, waarden 4 rigels selektearre foar transcriptome analyze: 83A: 476, Boregine, Mandelup, en Population 22660. Dizze rigels waarden opnij hifke foar anthrax ferset yn ynokulaasje eksperiminten troch RNA sequencing, foarsafier't se wiene itselde as yn 'e foarige test.De skoarewearden wiene as folget: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) en befolking 22660 (6,11 ± 1,29).
It Illumina NovaSeq 6000-protokol berikte in gemiddelde fan 40.5 Mread-pearen per stekproef (29.7 oant 54.4 Mreads) (oanfoljende tabel S3).Alignment skoares yn de referinsje folchoarder fariearre fan 75,5% oan 88,6%.De gemiddelde korrelaasje fan gegevens foar lêzen tellen tusken eksperimintele farianten tusken biologyske replikaten rûn fan 0.812 oant 0.997 (gemiddelde 0.959). Fan 'e 35,170 genen analysearre, 2917 iepenbiere gjin ekspresje, en de oare 4785 genen waarden útdrukt op negligible nivo (basis gemiddelde <5). Fan 'e 35,170 genen analysearre, 2917 iepenbiere gjin ekspresje, en de oare 4785 genen waarden útdrukt op negligible nivo (basis gemiddelde <5). (Ôf 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировалисне зовое среднее <5). Fan 'e 35.170 genen analysearre, 2917 lieten gjin ekspresje, en de oerbleaune 4785 genen waarden útdrukt op in negligible nivo (basis gemiddelde <5).2917值< 5).35.170 Nei 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначировались нее значение <5). Fan 'e 35.170 genen analysearre, 2917 waarden net útdrukt en de oerbleaune 4785 genen hie negligible ekspresje (basis gemiddelde <5).Sa wie it oantal genen beskôge as útdrukt (basisgemiddelde ≥ 5) tidens it eksperimint 27.468 (78.1%) (oanfoljende tabel S4).
Fan it earste tiidpunt reagearren alle NLL-rigels op 'e ynokulaasje fan C. lupini (stam Col-08) troch it reprogrammearjen fan it transkriptoom (tabel 1), lykwols waarden signifikante ferskillen tusken de rigels waarnommen.Sa toande de fersetline 83A: 476 (draacht it Lanr1-gen) wichtige transkriptoom-herprogrammearring op it earste tiidpunt (6 hpi) mei in 31-69-fâldige ferheging fan it oantal isolearre op- en omleechgenen yn ferliking mei oare tiidpunten op dit stuit.Dêrnjonken wie dizze peak koart libbe, om't de ekspresje fan mar in pear genen signifikant feroare bleau op it twadde tiidpunt (12 hpi).Opfallend is dat Boregine, dy't ek in heech nivo fan wjerstân yn 'e grafttest toande, net sa'n massive transkripsje-herprogrammearring ûndergien tidens it eksperimint.It oantal differinsjaal útdrukte genen (DEG) wie lykwols itselde foar Boregine en 83A: 476 by 12 HPI.Sawol Mandelup en befolking 22660 toande DEG-pieken op it lêste tiidpunt (48 l / s), wat oanjout op in relative fertraging yn definsje-antwurden.
Om't 83A: 476 massive transkriptome-herprogrammearring ûndergie yn antwurd op C. lupini by 6 HPI yn ferliking mei alle oare rigels, wiene ~ 91% fan 'e DEG's dy't op dit stuit beoardiele lineage-spesifyk (figuer 1).D'r wie lykwols wat oerlaap yn 'e iere antwurden tusken stúdzjerigels, om't 68,5%, 50,9% en 52,6% DEG yn respektivelik Boregine, Mandelup en befolking 22660 oerlappe mei dy fûn yn 83A:476 op bepaalde punten yn 'e tiid.Dizze DEG's makken lykwols mar in lytse fraksje (0.97-1.70%) fan alle DEG's op it stuit ûntdutsen mei 83A:476.Dêrnjonken wiene 11 DEG's fan alle rigels op dit stuit gearhingjend (oanfoljende tabellen S4-S6), ynklusyf mienskiplike komponinten fan plantdefinsje-antwurden: lipide-oerdrachtprotein (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glucoside-enzyme (TanjilG_23382) (TanjilG_23382-proteïne lykas T2AMjil-proteïne lykas T2AMjil- en Tanjil-proteïne lykas T2AMjil en Tanjil G_31531), basis lateksprotein (TanjilG_32352), en twa glycine-rike strukturele selwandproteinen (TanjilG_19701 en TanjilG_19702).D'r wie ek in relatyf hege oerlap yn transkriptom-antwurden tusken 83A: 476 en Boregine by 24 HPI (totaal 16-38% DEG) en tusken Mandelup en Population 22660 by 48 HPI (totaal 14-20% DEG).
Venn-diagram dat it oantal differinsjaal útdrukte genen (DEG) toant yn smel-leaved lupine (NLL) linen ynokulearre mei Colletotrichum lupini (stam Col-08 krigen fan lupinefjilden yn Wierzhenice, Poalen, 1999).De NLL-rigels analysearre wiene: 83A: 476 (resistint, mei it Lanr1-allele), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), Mandelup (middels resistint, mei it AnMan-allele) en populaasje 22660 (tige gefoelich).De ôfkoarting hpi stiet foar oeren nei faksinaasje.Nulwearden binne fuortsmiten om de grafyk te ferienfâldigjen.
De set fan oerútdrukte genen by 6 hpi waard analysearre foar de oanwêzigens fan kanonike R-gendomeinen (oanfoljende tabel S7).Dizze stúdzje iepenbiere transkriptoominduksje fan klassike sykteresistinsjegenen mei NBS-LRR-domeinen allinich op 83A:476.Dizze set bestie út ien TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), fiif CC-NBS-LRR-genen (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, en tanjilg_16162), en tanjilg_16162), en Fjouwer Nlg_16162, Tanjilg_16162, en Fjouwer Nlg-LR, 1BS, Tanjilg_16162, 16162) lykas fjouwer NBS-Lrr (tanjilg_16162) en fjouwer NBS-LRR (TANJILG_16162).Al dizze genen hawwe kanonike domeinen arranzjearre yn bewarre sekwinsjes.Njonken de NBS-LRR-domeingenen waarden ferskate RLL-kinases aktivearre by 6 hpi, nammentlik ien yn Boregine (TanjilG_19877), twa yn Mandelup (TanjilG_07141 en TanjilG_19877) en yn befolking 22660 (TanjilG_07A 1 in TanjilG_07G en twa yn TanjilG_07A) :476.
Genen mei signifikant feroare ekspresje yn antwurd op ynokulaasje mei C. lupini (stam Col-08) waarden ûnderwurpen oan Gene Ontology (GO) ferrikingsanalyse (oanfoljende tabel S8). De meast foarkommende oerfertsjintwurdige biologyske prosesterm wie "GO: 0006952 ferdigeningsantwurd" dy't ferskynde yn 6 fan 16 (tiid × line) kombinaasjes mei hege betsjutting (P wearde <0.001) (figuer 2). De meast foarkommende oerfertsjintwurdige biologyske prosesterm wie "GO: 0006952 ferdigeningsantwurd" dy't ferskynde yn 6 fan 16 (tiid × line) kombinaasjes mei hege betsjutting (P wearde <0.001) (figuer 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнетый» отвятный из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (ûntwerp P <0,001) (рис. 2). De meast oerfertsjintwurdige biologyske prosesterm wie 'GO: 0006952 ferdigeningsantwurd', dy't ferskynde yn 6 fan 16 (tiid × lineage) kombinaasjes mei hege betsjutting (P wearde <0.001) (fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现圴圴圴庴庴庐＄组庐＄绉个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. De meast represintative biologyske prosesterm is "GO: 0006952 ferdigeningsantwurd", dy't ferskynt yn 6 fan 'e 16 (时间×线) kombinaasjes, mei hege betsjutting (P wearde <0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», косторыв 16 косторыв инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). De meast oerfertsjintwurdige biologyske proses term wie 'GO: 0006952 Definsje Response', dy't ferskynde yn 6 fan 16 kombinaasjes (tiid × line) mei hege betsjutting (P wearde <0.001) (Fig. 2).Dizze term waard oerfertsjintwurdige op twa tiidpunten yn 83A: 476 en Boregine (6 en 24 hpi) en op in stuit yn Mandelup en Population 22660 (resp. 12 en 6 hpi).Dit is in ferwachte resultaat, en markearret de antifungale reaksje fan 'e resistinte linen.Dêrnjonken reagearre 83A:476 op C. lupini troch fluch inducing genen relatearre oan de oksidative burst fertsjintwurdige troch de term "GO: 0055114 redox proses", wat oanjout in spesifyk ferdigeningsantwurd, wylst Boregine iepenbiere spesifike ferdigening antwurden, ferbân mei de term 'GO'.:0006950 Stress antwurd".Befolking 22660 aktivearre de horizontale ferset antwurd wêrby't sekundêre metabolites, markearje it oerstallige oantal termen "GO: 0016104 Proses fan triterpene biosynthesis" en "GO: 0006722 Proses fan triterpene metabolisme" (beide termen hearre ta deselde set fan genen), rekken hâldend mei term de resultaten fan 'e populaasje 2-6-ferriking fan' e populaasje 6 0. Dêrneist betiid reaksje 83A: 476 (6 hpi) en fertrage reaksje Mandelup en Population 22660 befetsje de term GO: 0015979 'fotosynteze' en oare besibbe biologyske prosessen.
De termen foar bioprocessgen-ontology selektearre yn 'e annotaasje fan differinsjaal útdrukte genen tidens transkriptoom-antwurden fan smel-leaved lupine (NLL) ynokulearre mei miltvuurlupine (Col-08-stam krigen fan lupinefjilden yn Wierzhenice, Poalen, yn 1999) binne sterk oerdreaun.De NLL-rigels analysearre wiene: 83A:476 (resistint, mei it homozygote Lanr1-allele), Boregine (resistint, ûnbekende genetyske eftergrûn), Mandelup (middels resistint, mei it homozygote AnMan-allele) en populaasje 22660 (gefoelber).
Om't dizze stúdzje fan doel wie om genen te identifisearjen dy't bydrage oan anthracnose-resistinsje, waarden de genen tawiisd oan 'e termen GO "GO: 0006952 Defensive antwurden" en "GO: 0055114 Redox-prosessen" analysearre mei cut-offs sûnt baseline betsjut ≥ 30 mei op syn minst ien line.× punt yn 'e tiid kombinearret statistysk signifikante wearden fan log2 (fold feroaring).It oantal genen dy't oan dizze kritearia foldwaan wie 65 foar GO:0006952 en 524 foar GO:0055114.
83A: 476 iepenbiere twa DEG-pieken annotearre mei de term GO: 0006952, de earste by 6 genen per inch (64 genen, op- en delregulaasje) en de twadde by 24 genen per inch (15 genen, allinich upregulaasje).Boregine toande ek dat GO: 0006952 peak op deselde tiid punt, mar mei minder DEG (11 en 8) en foarkar aktivearring.Mandeloop toande twa peaks fan GO: 0006952 by 12 en 48 HPI, beide drage 12 genen (de earste mei aktivearjende genen, en de twadde mei allinich ûnderdrukkende genen), wylst de 22660-befolking by 6 HPI (13 genen) in grutter oerwicht hie fan 'e ferhegingspiek.regeljouwing.Dêrby moat opmurken wurde dat 96,4% fan GO: 0006952 DEG yn dizze toppen hie itselde type antwurd (op of del), wat oanjout in signifikante oerlaap yn definsje antwurden nettsjinsteande ferskillen yn it oantal genen belutsen.De grutste groep fan sekwinsjes yn ferbân mei de term GO: 0006952 kodearret de Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), dy't heart ta de klasse 10 pathogenesis-assosjearre protein (PR-10) protein clade en de kearnprotein latex.ferlykbere (MLP-like) proteïne) proteïne (fig. 3).De twa groepen ferskille yn 'e aard fan' e ekspresje en de rjochting fan 'e reaksje.De genen dy't kodearje foar SAM22-like proteïnen lieten konsekwint en signifikante yndeksje sjen op iere tiidpunten (6 of 12 hpi) en wiene oer it generaal net reageare oan 'e ein fan it eksperimint (48 hpi), wylst MLP-like proteïnen koördinaasje op 6 hpi sjen litte.hpi.83A: 476 en Mandelup op 48 hp / yn, hast alle oare gegevens punten wiene unresponsive.Dêrnjonken folgen ferskillen yn ekspresjeprofilen fan SAM22-like proteïne-genen observearre fariabiliteit yn anthracnose-resistinsje, om't mear resistinte linen mear tiidpunten hiene dy't dizze genen signifikant inducearje as mear gefoelige genen.In oar LlR18A / B-like PR-10-gen liet in heul ferlykber ekspresjepatroan sjen as it SAM22-like proteïngen.
De haadkomponinten fan 'e biologyske prosesterm "GO: 0006952 Defense Response" en de ekspresjepatroanen fan kandidaatgenen fan 'e Lanr1- en AnMan-alleles waarden identifisearre.De Log2-skaal stiet foar log2-wearden (foldwiziging) tusken ynokulearre (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden, Wizhenica, Poalen, 1999) en kontrôle (sham-inokulearre) planten op itselde tiidpunt.De folgjende narrowleaf lupine rigels waarden analysearre: 83A: 476 (resistint, mei it homozygote Lanr1 allele), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), Mandelup (middels resistint, mei it homozygote AnMan allele), en Population 22660 (gefoelber).
Dêrnjonken waarden de ekspresjeprofilen fan RNA-seq kandidaatgenen Lanr1 (TanjilG_05042) en AnMan (TanjilG_12861) evaluearre (figuer 3).It TanjilG_05042-gen toande in signifikante reaksje (aktivearring) op 83A:476 allinich op it earste tiidpunt (6 hpi), wylst TanjilG_12861 allinich signifikant wie yn Mandeloop op twa tiidpunten: 6 hpi (downregulaasje) en 24 hpi (6 hpi).Mei.).ferstelber)).
De meast overexpressed genen yn de term GO: 0055114 "redox proses" wiene genen kodearjen cytochrome P450 aaiwiten en peroxidase (figuer 4).Foar samples isolearre fan 83A:476 by 6 HPI, waarden maksimale as minimale log2 (fold feroaring) wearden (foar 86.6% fan genen) oer it algemien waarnommen tusken ynokulearre en kontrôleplanten, en markearje de hege reaksje fan dit genotyp op ynokulearjen fan seks.83A: 476 toande de meast wichtige GO: 0055114 DEG by 6 hpi (503 genen), wylst de rest fan 'e rigels op 48 hpi (Boregine, 31 genen; Mandelup, 85 genen; en Population 22660, 78 genen)).Yn 'e measte genen fan' e GO: 0055114-famylje waarden twa soarten antwurden op faksinaasje (aktivearring en ynhibysje) waarnommen.Ynteressant, oant 97,6% fan 'e Degs identifisearre foar de term gean: 0055114 yn Mandelupe suggerearje dat dizze observearre transkripmale antwurden fan mandeloup foar antelynose is gelyk oan it iere antwurd fan 833.Yn Boregine en Population 22660 is dizze konverginsje leger op 51,6% en 75,6%, respektivelik.
De patroanen fan ekspresje fan 'e haadkomponinten fan' e term fan it biologyske proses "GO: 0055114 Redox-proses" waarden iepenbiere.De Log2-skaal stiet foar log2-wearden (foldwiziging) tusken ynokulearre (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden, Wizhenica, Poalen, 1999) en kontrôle (sham-inokulearre) planten op itselde tiidpunt.De folgjende narrowleaf lupine rigels waarden analysearre: 83A: 476 (resistint, mei it homozygote Lanr1 allele), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), Mandelup (middels resistint, mei it homozygote AnMan allele), en Population 22660 (gefoelber).
83A: 476 Transkriptomyske antwurden op ynokulaasje mei C. lupini (stam Col-08) omfette ek koördinearre stilte fan genen taskreaun oan 'e term GO: 0015979 "fotosynteze" en oare relatearre biologyske prosessen (Fig. 5).Dizze GO: 0015979 DEG set befette 105 genen dy't signifikant ûnderdrukt waarden by 6 hpi by 83A:476.Yn dizze subset waarden 37 genen ek downregulearre yn Mandelup op 48 HPI en 35 tagelyk yn 'e 22660-befolking, ynklusyf 19 DEG's mienskiplik foar beide genotypen.Gjin DEGs yn ferbân mei term GO: 0015979 waarden signifikant aktivearre yn eltse kombinaasje (line x tiid).
De patroanen fan ekspresje fan 'e haadkomponinten fan' e term fan it biologyske proses "GO: 0015979 Photosynthesis" waarden iepenbiere.De Log2-skaal stiet foar log2-wearden (foldwiziging) tusken ynokulearre (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden, Wizhenica, Poalen, 1999) en kontrôle (sham-inokulearre) planten op itselde tiidpunt.De folgjende narrowleaf lupine rigels waarden analysearre: 83A: 476 (resistint, mei it homozygote Lanr1 allele), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), Mandelup (middels resistint, mei it homozygote AnMan allele), en Population 22660 (gefoelber).
Op grûn fan 'e resultaten fan differinsjaal ekspresje-analyze en nei alle gedachten belutsen by definsje-antwurden tsjin patogene skimmels, waard dizze set fan sân genen selektearre foar kwantifikaasje fan ekspresjeprofilen troch real-time PCR (oanfoljende tabel S9).
It putative proteïngen TanjilG_10657 waard signifikant feroarsake yn alle studearre rigels en tiidpunten yn ferliking mei kontrôle (mimic) planten (oanfoljende tabellen S10, S11).Derneist toande it ekspresjeprofyl fan TanjilG_10657 in tanimmende trend yn 'e rin fan it eksperimint foar alle rigels.Befolking 22660 toande de heechste gefoelichheid fan TanjilG_10657 foar ynokulaasje mei 114-fâldige aktivearring en it heechste relative ekspresjenivo (4.4 ± 0.4) by 24 HPI (fig. 6a).It PR10 LlR18A-protein-gen TanjilG_27015 liet ek aktivearring sjen oer alle rigels en tiidpunten, mei statistyske betsjutting op de measte gegevenspunten (fig. 6b).Fergelykber mei TanjilG_10657 waard it heechste relative ekspresjenivo fan TanjilG_27015 waarnommen yn 'e 22660-ynokulearre populaasje by 24 HPI (19.5 ± 2.4).De soere endohitinase gen TanjilG_04706 waard signifikant upregulated yn alle rigels en op alle tiid punten útsein Boregine 6 hpi (fig. 6c).It waard op it earste tiidpunt (6 HPI) sterk opwekke op 83A: 476 (troch 10.5 kear) en matig ferhege yn oare rigels (troch 6.6-7.5 kear).Tidens it eksperimint bleau de ekspresje fan TanjilG_04706 op ferlykbere nivo's yn 83A:476 en Boregine, wylst it yn Mandelup en Population 22660 signifikant tanommen, en berikte relatyf hege wearden (5,9 ± 1,5 en 6,2 ± 1,5, respektivelik).De endoglucan-1,3-β-glucosidase-like gen TanjilG_23384 toande hege aktivearring op de earste twa tiid punten (6 en 12 hpi) yn alle rigels útsein befolking 22660 (fig. 6d).De heechste relative ekspresjenivo's fan TanjilG_23384 waarden waarnommen op it twadde tiidpunt (12 hpi) yn Mandelup (2.7 ± 0.3) en 83A: 476 (1.5 ± 0.1).By 24 HPI wie TanjilG_23384-ekspresje relatyf leech yn alle studearre rigels (fan 0.04 ± 0.009 oant 0.44 ± 0.12).
Ekspresjeprofilen fan selekteare genen (ag) iepenbiere troch kwantitative PCR.De nûmers 6, 12 en 24 fertsjintwurdigje oeren nei faksinaasje.De LanDExH7- en LanTUB6-genen waarden brûkt foar normalisaasje en LanTUB6 waard brûkt foar kalibraasje tusken searjes.Flaterbalken fertsjintwurdigje de standertdeviaasje basearre op trije biologyske replikaten, elk fan dat is it gemiddelde fan trije technyske replikaten. De statistyske betsjutting fan ferskillen yn 'e ekspresjenivo's tusken de ynokulearre (Colletotrichum lupini, strain Col-08, krigen yn 1999 fan it lupinefjild yn Wierzenica, Poalen) en kontrôle (mock-inokulearre) planten binne markearre boppe gegevenspunten (*P wearde <0.05, **P wearde ≤ .01, **P wearde ≤ .01). De statistyske betsjutting fan ferskillen yn 'e ekspresjenivo's tusken de ynokulearre (Colletotrichum lupini, strain Col-08, krigen yn 1999 fan it lupinefjild yn Wierzenica, Poalen) en kontrôle (mock-inokulearre) planten binne markearre boppe gegevenspunten (*P wearde <0.05, **P wearde ≤ .01, **P wearde ≤ .01). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, 9 пгв 19 mei Col-09. юпина в Верженице, Польша) en контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данными (5, ** 0 данными) ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistysk signifikante ferskillen yn ekspresjenivo's tusken ynokulearre (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen yn 1999 fan in lupinefjild yn Wierzhenice, Poalen) en kontrôle (sham-inokulearre) planten wurde oanjûn boppe de gegevenspunten (*P wearde <0.05, **P-wearde ≤,***0.0.0.0).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对慧（騡种羽扇豆田获得）和对照（騡种缉（模种缉接水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值)接种 （colletotrichum lupini ， colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤。0.001) Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, пвых Верженице, Польша, в 1999 г.) en контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над тонтрольными (lожно инокулированными) растениями отмечены над тонтрольными (p. начение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistysk signifikante ferskillen yn ekspresjenivo's tusken ynokulearre (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden yn Verzhenice, Poalen, yn 1999) en kontrôle (sham-inokulearre) planten wurde oanjûn boppe de gegevenspunten (*P wearde <0.05, **P-wearde ≤.***e 0.0.0).De NLL-rigels analysearre wiene: 83A:476 (resistint, mei it homozygote Lanr1-allele), Mandelup (middels resistint, mei it homozygote AnMan-allele), Boregine (resistint, ûnbekende genetyske eftergrûn) en populaasje 22660 (gefoelber).
It kandidaat-gen TanjilG_05042 op 'e Lanr1-lokus liet in merkber oare ekspresjepatroan sjen fan' e profilen krigen fan RNA-seq-stúdzjes (Fig. 6e).Wichtige aktivearring fan dit gen waard waarnommen yn Mandelup en de 22660-befolking (oant 39,7 en 11,7 kear, respektivelik), wat resultearre yn relatyf hege ekspresjenivo's (oant 1,4 ± 0,14 en 7,2 ± 1,3, respektivelik).83A: 476 iepenbiere ek wat opregulaasje fan it TanjilG_05042-gen (oant 3.8-fâld), lykwols, de relative ekspresjenivo's berikt (0.044 ± 0.002) wiene mear as 30-fâld leger as dy waarnommen yn Mandelup en de 22660-befolking.analysearre troch qPCR toande signifikante ferskillen yn ekspresje nivo tusken genotypes yn mock-faksinearre (kontrôle) farianten, it berikken fan in 58-fold ferskil tusken populaasjes 22660 en 83A: 476, likegoed as tusken populaasjes 22660 en 22660. In twa-fold ferskil waard berikt tusken Boregine en Mandalup.
It kandidaat-gen op 'e AnMan-lokus, TanjilG_12861, waard aktivearre as antwurd op faksinaasje yn 83A: 476 en Mandelup, wie neutraal yn' e 22660-befolking, en waard downregulearre yn Boregine (fig. 6f).De relative ekspresje fan it TanjilG_12861-gen wie de heechste yn ynokulearre 83A: 476 (0.14±0.01).De 17.4 kDa klasse I heat shock protein gen TanjilG_05080 HSP17.4 toande legere relative ekspresjenivo's yn alle studearre stammen en tiidpunten (fig. 6g).De heechste wearde waard beoardiele by 24 HPI yn 'e 22660-befolking (0.14 ± 0.02, in achtfâldige ferheging yn antwurd op faksinaasje).
Fergeliking fan gene ekspresje profilen (figuer 7) die bliken in hege korrelaasje tusken TanjilG_10657 en fjouwer oare genen: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,6_0, en 4 = 0,80), en.Sokke resultaten kinne oanjaan op ko-regulaasje fan dizze genen tidens definsje-antwurden.De TanjilG_12861- en TanjilG_23384-genen lieten ferskate ekspresjeprofilen sjen mei legere Pearson-korrelaasjekoëffisjintwearden (fan respektivelik 0.08 oant 0.43 en -0.19 oant 0.28) yn ferliking mei oare genen.
Korrelaasjes tusken gene ekspresjeprofilen waarden ûntdutsen mei kwantitative PCR.De folgjende narrowleaf lupine linen waarden analysearre: 83A: 476 (resistint, mei it homozygote Lanr1 allele), Mandelup (middels resistint, mei it homozygote AnMan allele), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), en Population 22660 (gefoelber).Trije tiidpunten waarden berekkene (6, 12 en 24 oeren nei ynokulaasje), ynklusyf ynokulearre (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden yn Wierzhenice, Poalen, yn 1999) en kontrôle (sham-inokulearre) planten.De skaal toant de wearde fan 'e Pearson-korrelaasjekoëffisjint.
Op grûn fan gegevens krigen op 6 pk per inch, waard WGCNA útfierd op 9981 DEG identifisearre troch fergelykjen fan ynokulearre en kontrôleplanten om te fokusjen op iere ferdigeningsresponsen (oanfoljende tabel S12).Twaentweintich genmodules (klusters) waarden fûn mei korrelearre (positive of negative) ekspresjeprofilen tusken genotypen en eksperimintele farianten. Yn trochsneed wiene gen-ekspresjenivo's ôfnimmend yn folchoarder 83A:476> Mandelup> Boregine> Befolking 22660 (yn beide farianten wie dizze trend lykwols sterker yn kontrôleplanten). Yn trochsneed wiene gen-ekspresjenivo's ôfnimmend yn folchoarder 83A:476> Mandelup> Boregine> Befolking 22660 (yn beide farianten wie dizze trend lykwols sterker yn kontrôleplanten). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolking 22660 (в обоих вариантах, боих вариантах, ла сильнее у контрольных растений). Yn trochsneed fermindere gen-ekspresjenivo's yn 'e folchoarder 83A: 476 > Mandelup > Boregine > Befolking 22660 (yn beide farianten wie dizze trend lykwols sterker yn kontrôleplanten).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolking 22660在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> befolking 22660 的 顺序 下降 （， 県 県在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolking 22660 ильнее у контрольных растений). Yn trochsneed fermindere gen-ekspresjenivo's yn 'e searje 83A: 476 > Mandelup > Boregine > Befolking 22660 (lykwols yn beide farianten wie dizze trend sterker yn kontrôleplanten).Faksinaasje resultearre yn opregulaasje fan genekspresje, benammen yn modules 18, 19, 14, 6 en 1 (yn ôfnimmende folchoarder fan effekt), negative regeling (bgl. modules 9 en 20) of mei neutrale effekten (bgl. modules 11, 22, 8 en 13).GO-term ferrikingsanalyse (oanfoljende tabel S13) iepenbiere "GO: 0006952 Beskermende antwurden" foar de ynokulearre module (18) mei maksimale aktivearring, ynklusyf genen analysearre troch qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_105ilG_1055, TanjilG_1055 likegoed as in protte suppressed), fotosynteze modules (9).Module 18-konsintrator (fig. 8) waard identifisearre as it TanjilG_26536-gen dat it PR-10-like LlR18B-protein kodearret, en module 9-konsintrator waard identifisearre as it TanjilG_28955-gen dat it fotosysteem II PsbQ-protein kodearret.In kandidaat anthracnose ferset gen Lanr1, TanjilG_05042, waard fûn yn module 22 (figuer 9) en is ferbûn mei de termen "GO: 0044260 Cellular macromolecular metabolic prosessen" en "GO: 0006355 Transcriptional regeljouwing, DNA sjabloanen" drage de Tann212_hub.it gen kodearret waarmtestress transkripsjefaktor A-4a (HSFA4a).
Gewogen netwurk analyze fan gene co-ekspresje fan modules mei oerfertsjintwurdige biologyske proses termen "GO: 0006952 Definsje antwurden".Ligaasje waard ferienfâldige om de fjouwer genen te markearjen analysearre troch qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015).
Gewogen netwurk analyze fan gen co-ekspresje fan in module mei in overrepresented biologyske proses term "GO: 0006355: Transcriptional regeljouwing, DNA sjabloanen" en it dragen fan in kandidaat anthracnose ferset gen Lanr1 TanjilG_05042.Ligaasje waard ferienfâldige om it TanjilG_05042-gen en it sintrale TanjilG_01212-gen te isolearjen.
Anthracnose ferset screening sammele yn Austraalje die bliken dat de measte fan 'e iere frijlitten cultivars wiene gefoelich;Kalya, Coromup en Mandelup binne beskreaun as matig resistint, wylst Wonga, Tanjil en 83A:476 binne beskreaun as tige resistint26,27,31.hie itselde ferset allel, oanwiisd Lanr1, en Coromup en Mandelup hiene in oar allel, oantsjutten AnMan10, 26, 39, wylst Kalya trochjûn op in oar allel., Lanr2.Screening foar anthracnose ferset yn Dútslân resultearre yn de identifikaasje fan in resistente line Bo7212 mei in kandidaat allele oars as Lanr1, oantsjutte LanrBo36.
Us stúdzje die bliken in heul lege frekwinsje (sawat 6%) fan 'e Lanr1-allele yn' e hifke germplasma.Dizze observaasje komt oerien mei de resultaten fan screening fan East-Jeropeeske kiemplasma mei de Anseq3- en Anseq4-markers, dy't sjen litte dat it Lanr1-allele yn mar twa Wyt-Russyske rigels oanwêzich is.Dit suggerearret dat it Lanr1-allel noch net in soad brûkt wurdt troch pleatslike fokprogramma's, yn tsjinstelling ta Austraalje, dêr't it ien fan 'e wichtichste allelen is foar troch marker-assistearre fokkerij.Dit kin wêze troch it legere nivo fan wjerstân levere troch de Lanr1 allele yn Europeeske fjildbetingsten yn ferliking mei it Australyske rapport.Dêrnjonken hawwe ûndersiken fan anthracnose yn gebieten mei hege delslach yn Austraalje sjen litten dat fersetreaksjes bemiddele troch it Lanr1-allele miskien net effektyf wêze yn waarsomstannichheden dy't groei en rappe ûntwikkeling fan 'e pathogen favorisearje19,42.Yn feite, yn 'e hjoeddeiske stúdzje, waarden guon symptomen fan anthracnose ek waarnommen yn genotypen dy't it Lanr1-allele drage, wat suggerearret dat ferset ferdwine kin ûnder optimale omstannichheden foar de ûntwikkeling fan C. lupini.Dêrnjonken binne falske positive ynterpretaasjes fan 'e oanwêzigens fan Anseq3- en Anseq4-markers, dy't sawat 1 cM binne fan' e Lanr1-lokus, mooglik 28,30,43.
Us stúdzje liet sjen dat 83A: 476, mei it Lanr1-allele, reagearre op C. lupini-ynokulaasje mei grutskalige transkriptome-herprogrammearring op it earste analysearre tiidpunt (6 hpi), wylst yn Mandelup, mei it AnMan-allele, transkriptomyske antwurden folle letter waarnommen.(fan 24 oant 48 pk).Dizze tydlike fariaasjes yn definsje-antwurden binne ferbûn mei ferskillen yn syktesymptomen, en markearje it belang fan iere erkenning fan patogenen foar in suksesfolle reaksje op ferset.Om plantweefsel te ynfektearjen, moatte miltvokssporen troch ferskate ûntwikkelingsstadia gean op it oerflak fan 'e host, ynklusyf kieming, seldieling en formaasje fan in appressorium.In appendage is in ynfekteare struktuer dy't hechtet oan it oerflak fan 'e host en fasilitearret penetraasje yn' e hostweefsels.Sa lieten sporen fan C. gloeosporioides yn earte-ekstrakt de earste divyzje fan 'e kearn sjen nei 75-90 minuten fan ynkubaasje, de foarming fan in kiembuis nei 90-120 minuten, en ûnderdrukking nei 4 oeren 45 .Mango C. gloeosporioides toande mear as 40% conidial kieming nei 3 oeren fan incubation en oer 20% formaasje fan appressors nei 4 oeren.De virulence-assosjearre CAP20-gen fan C. gloeosporioides toande transkripsjonele aktiviteit yn epiphyte-foarmjende conidia nei 3.5 h ynkubaasje yn avokado-oerflakwaks mei hege konsintraasjes fan CAP20-protein nei 4 h 46 min.Likemin waard de aktiviteit fan Melanin Biosynteze Genes yn C. TRIFOLII induzeare yn in 2-oere ynkubaasje folge troch de formaasje fan in appreskerium nei 1 oere.Stúdzjes fan Leaf-weefsels hawwe sjen litten dat Aanbehearûnen opknapte mei C. Acutatum hawwe earst ûnderdrukking, wylst tomaten inaturige mei C. Coccodes earst ûnderdrukking hawwe op 4 HPI48,49.foar it grutste part oerien mei de tiidskaal fan Colletotrichum spp.besmetlike proses.Snelle definsje-antwurden op 83A: 476 suggerearje belutsenens fan plantresistinsje en effektor-triggered immuniteit (ETI) genen yn dizze line, wylst Mandelup's fertrage antwurden de mikro-assosjearre molekulêre patroan-triggered immuniteit (MTI) hypoteze stypje 50. Iere antwurden op 83A: 476 en Mandelup.De diel oerlaapje tusken omheech- of down-reguleare genen stipet dit konsept ek, om't Eti wurdt beskôge as MTI-reaksje yn programmeare sel yn 'e side fan ynfeksje, bekend as anafylaktyske skok 51,52.
De measte fan 'e genen taskreaun oan' e oerfertsjintwurdige term Gene Ontology GO: 0006952 "Defense Response" binne de 11 homologen fan it stress-induzearre fêste berjocht 22-protein (lykas SAM22) en de sân grutte lateksprotein-likes (MLP's).-like aaiwiten 31, 34, 43 en 423 lieten folchoarderlikens.SAM22-like genen lieten signifikante aktivearring sjen dy't langer duorre, en toande ferhege nivo's fan anthracnose-resistinsje (83A: 476 en Boregine).MLP-like genen waarden lykwols allinich downregulearre yn rigels dy't it kandidaatresistinsje allele droegen (83A: 476 / Lanr1 by 6 hpi en Mandelup / AnMan by 24 hpi).It moat opmurken wurde dat alle identifisearre SAM22-like homologen ûntsteane út in gencluster dy't sawat 105 kb spant, wylst MLP-like genen ûntsteane út aparte regio's fan it genom.Koördinearre aktivearring fan sokke SAM22-like genen waard ek fûn yn ús foarige stúdzje fan NLL-resistinsje tsjin Diaporthetoxica-ynokulaasje, wat suggerearret dat se belutsen binne by de horizontale komponinten fan 'e ferdigeningsantwurd.Dizze konklúzje wurdt ek stipe troch rapporten fan in positive reaksje fan SAM22-like genen op blessueres of behanneling mei salicylic acid, fungal inducers, of hydrogen peroxide.
MLP-like genen hawwe bliken dien te reagearjen op ferskate abiotyske en biotyske stressen, ynklusyf baktearjele, virale en pathogene fungal ynfeksjes yn in protte plantesoarten55.De oanwizings fan reaksje op bepaalde ynteraksjes tusken planten en sykteferwekkers rûnen fan sterk tanimmend (dat wol sizze, by besmetting fan katoen mei Verticillium dahliae) oant signifikant ôfnimmend (dus nei ynfeksje fan appelbeam mei Alternaria spp.)56,57.Signifikante downregulation fan it MLP-like 423-gen is waarnommen tidens avokado-defensjes foar F. niger-ynfeksje en by ynfeksje fan 'e appelbeam Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola en Alternaria alternata binne appelpatotypen58,59.Dêrnjonken hie appelcalli dy't it MLP-like 423-gen oerekspresje, legere ekspresje fan ferset-assosjearre genen en wiene gefoeliger foar fungal ynfeksje59.Nei Fusarium oxysporum f waard it MLP-like 423-gen ek ûnderdrukt yn resistente gewoane bean-kiemplasma.cn.Beanynfeksje 60.
Oare leden fan 'e PR-10-famylje identifisearre yn ús RNA-seq-stúdzje wiene de LlR18A- en LlR18B-genen yn antwurd op opregulaasje, lykas ek it opregulearre (1-gen) of downregulearre (3-genen) gen foar it lipidetransferprotein DIR1..Derneist markeart WGCNA it LlR18B-gen as in hub yn dizze module, dy't heul gefoelich is foar faksinaasje en ferskate beskermjende antwurdgenen draacht.De LlR18A en LlR18B genen waarden induced yn giele lupine blêden yn reaksje op pathogene baktearjes, likegoed as yn NLL stammen nei D. toxica ynokulaasje, wylst de rys homolooch fan dizze genen, RSOsPR10, waard fluch induced troch in fungal ynfeksje nei alle gedachten belutsen by de jasmonic acid gen 532,6, 1,6, 1,6, 6,6, 6,6,6,6,6,6; id-transportproteinen dy't nedich binne foar it begjin fan systemic Acquisition Resistance (SAR).Mei de ûntwikkeling fan beskermjende reaksjes wurdt it DIR1-proteïne ferfierd fan 'e fokus fan ynfeksje troch it floëem om SAR yn fiere organen te inducearjen.Ynteressant waard it TanjilG_02313 DIR1-gen signifikant opwekke op it earste tiidpunt yn rigels 84A: 476 en Population 22660, mar anthracnose-resistinsje ûntwikkele allinich suksesfol yn line 84A: 476.Dit kin wat subfunksjonalisaasje fan it DIR1-gen yn NLL oanjaan, om't de oerbleaune trije homologen allinich reageare op ynokulaasje yn 'e 83A: 476-line by 6 hpi, en dit antwurd waard nei ûnderen rjochte.
Yn ús stúdzje wiene de meast foarkommende komponinten dy't oerienkomme mei it biologyske proses neamd "GO: 0055114 Redox-proses" cytochrome P450-proteïne, peroxidase, linoleic acid 9S-/13S-lipoxygenase, en 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase.Derneist definieart ús WGCNA de HSFA4a-homolooch as in hub-dragende modules lykas de Lanr1-resistinsjegenkandidaat TanjilG_05042.HSFA4a is in komponint fan 'e redox-ôfhinklike regeling fan nukleêre transkripsje yn planten.
Cytochrome P450 proteïnen binne oksidorearre nadf en / of o2-ôfhinklike hydroxylen, sterolen, sterels, en de bioskonten, en de bioosyten, en de biosynskiedende ferbiningen 69. Yn ús yn in stúdzje, de fariabiliteit yn plant Cytochrome P450-funksje waard fermindere fan -10.6 Log2 (fold feroaring) oant 5,7 fanwege in grut oantal feroare homologen (37) en ferskillen yn 'e reaksjepatroanen tusken spesifike genen, reflektearje..Mei help fan allinich RNA-SEQ-gegevens om de PUTATIKE BIOLOGLE FUNKSJE FAN DE NLL GENES YN IN SIN A GREEN PROTEIN SUPFAMILJE WURDE WURDE WURKE.It is lykwols de muoite wurdich op te merken dat guon cytochrome P450-genen ferbûn binne mei ferhege ferset tsjin patogene skimmels of baktearjes, ynklusyf in bydrage oan allergyske reaksjes69,70,71.
Klasse III peroxidases binne multyfunksjonele plantenzymen belutsen by in breed oanbod fan metabolike prosessen tidens plantgroei en -ûntwikkeling, lykas ek yn reaksje op miljeu-stressen lykas salinity, droechte, hege ljochtintensiteit, en patogenoanfal72.Peroxidases binne belutsen by de ynteraksje fan ferskate plant soarten mei Anthracis, ynklusyf Stylosanthes humilis en C. gloeosporioides, Lens culinaris en C. truncatum, Phaseolus vulgaris en C. lindemuthianum, Cucumis sativus en C. lagenarium73,74,75,76.It antwurd is tige fluch, soms sels by 4 HPI, foardat de fungus it plantweefsel penetreart73.It peroxidase-gen reagearre ek op D. toxica NLL-ynokulaasje.Njonken har typyske funksjes om oksidative burst te regeljen of oksidative stress te eliminearjen, kinne peroxidases ynterferearje mei pathogengroei troch fysike barrières te meitsjen basearre op fersterking fan selwanden tidens lignifikaasje, subunit of cross-linking fan spesifike ferbiningen.Dizze funksje kin wurde taskreaun yn Silico nei it Tanjilg_03329 Gene kodearjen fan in putative Lignin-foarm yn ús stúdzje yn 'e 836: 476 Bestante line op 6 HPI, mar net yn oare straffen en tiidpunten dy't net reageare.
9S-/13S-lipoxygenase fan linoleic acid is de earste stap yn 'e oksidative paad fan lipide biosynthesis78.De produkten fan dit paad hawwe meardere funksjes yn plant ferdigening, ynklusyf sel muorre fersterking troch de formaasje fan callose en pektine ôfsettings, en regeling fan oksidative stress troch de produksje fan reaktive soerstof soarten79,80,81,82,83.Yn 'e hjoeddeiske stúdzje waard de ekspresje fan linoleïnezuur 9S-/13S-lipoxygenase feroare yn alle stammen, mar yn' e gefoelige befolking 22660 hearske upregulaasje op ferskate tiidpunten, wylst yn stammen dy't resistinte Lanr1 en it AnMan-allele drage, it beklammet de diversifikaasje fan 'e oxythlipintypaks yn' e reaksje tusken dizze genotypen.
De 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) homolooch waard signifikant upregulated (9 genen) of downregulated (2 genen) doe't ynokulearre mei lupine.Mei twa útsûnderingen barden al dizze antwurden op 6 hp.op 83A:476.De enzymatyske reaksje bemiddele troch ACO-proteïnen is de snelheidsbeheinende stap yn etyleenproduksje en is dêrom tige regele84.Ethyleen is in planthormoan dat in ferskaat oan rollen spilet by it regeljen fan plantûntwikkeling en reaksje op abiotyske en biotyske stressbetingsten.De yndeksje fan ACO-transkripsje en aktivearring fan it ethylene-sinjaalpaad binne belutsen by it fergrutsjen fan it ferset fan rys tsjin de hemibiotropyske fungus oryzae oryzae troch it regeljen fan de produksje fan reaktive soerstofsoarten en phytoalexins.In heul ferlykber proses fan blêdynfeksje fûn tusken M. oryzae en C. lupini88,89, tsjin 'e eftergrûn fan in signifikante upregulaasje fan ACO-homologen yn' e 83A: 476-line dy't yn dizze stúdzje rapporteare, ferpleatst de mooglikheid om ferset te jaan oan NLL anthracnose Ethylene in sinjalearjende sintrale stap yn molekulêre paden.
Yn 'e hjoeddeiske stúdzje waard grutskalige ûnderdrukking fan in protte genen ferbûn mei fotosynteze waarnommen by 6 hpi yn 83A:476 en op 48 hpi yn Mandeloop en de 22660 befolking.De omfang en foarútgong fan dizze feroarings is evenredich mei it nivo.Anthracnose ferset waard waarnommen yn dit eksperimint.Koartlyn is sterke en betide ûnderdrukking fan fotosynteze-relatearre transkrippen rapportearre yn ferskate modellen fan plant-pathogen-ynteraksjes, ynklusyf pathogene baktearjes en fungi.Haast (fan 2 HPI yn guon ynteraksjes) en wrâldwide ûnderdrukking fan genen ferbûn mei fotosynteze yn reaksje op ynfeksje kinne plantimmuniteit útlizze op basis fan 'e ynset fan reaktive soerstofsoarten en har ynteraksje mei it paad fan salisylsûr om allergyske reaksjes te bemiddeljen 90,94.
Mei konklúzje, ferdigeningsmeganismen foarsteld foar it meast resistint lineage (83a: 476) omfetsje rappe argewaasje troch it R-genopyske soere en etyleen-sinjaal, folge troch oprjochting fan Long-Range Sar.aksje wurdt stipe troch de DIR-1 proteïne.Dêrby moat opmurken wurde dat de biotrophic perioade foar C. lupini ynfeksje is hiel koart (likernôch 2 dagen), folge troch necrotic groei95.De oergong tusken dizze stadia kin wurde assosjearre mei nekrose en ekspresje fan ethylene-inducible proteïnen dy't fungearje as triggers foar hypersensitiviteitsreaksjes yn hostplanten.Dêrom is it tiidfinster foar suksesfolle fangen fan C. lupini op it biotrofyske stadium tige smel.De werprogrammearring fan genen ferbûn mei redox en fotosynteze waarnommen yn 83A: 476 by 6 hpi is konsekwint mei de foarútgong fan fungal hyfen en heralds de ûntwikkeling fan in suksesfolle beskermjende reaksje op it biotrophic poadium.De transkriptomyske antwurden fan Mandelup en de 22660-befolking kinne te fertrage wêze om de fungus te fangen foardat it oerstapt nei nekrotyske groei, lykwols kin Mandelup effektiver wêze as de 22660-befolking, om't de relatyf rappe regeling fan it PR-10-protein horizontaal ferset befoarderet.
ETI, dreaun troch it kanonike R-gen, liket in mienskiplik meganisme te wêzen foar beanresistinsje tsjin anthracnose.Sa is yn 'e Model Legume Medico Truncatula, ferset tsjin Anthracnose wurdt konferred troch it RCT1 Gene, lid fan' e TIR-NBS-LRR97 Plant Rene Gene Class.Dit gen jout ek breedspektrum anthracnose-resistinsje yn alfalfa as oerdroegen oan gefoelige planten.Yn 'e gewoane bean (P. vulgaris) binne oant no ta mear as twa tsientallen anthracnose-resistinsjegenen identifisearre.Guon fan dizze genen wurde fûn yn regio's dy't gjin kanonyske R-genen hawwe, binne in protte oaren lykwols yn 'e kanten fan chromosomen dy't it NBS-lrr gen-gen-cluster drage, ynklusyf tir-nbs-lrrrs99.De genome-wide SSR-stúdzje befêstige ek de assosjaasje fan it NBS-LRR-gen mei anthracnose-resistinsje yn 'e mienskiplike bean.It kanonike R-gen waard ek fûn yn 'e genomyske regio dy't de grutte anthracnose-resistinsjelokus yn wyt lupine 101 drage.
Us wurk lit sjen dat in direkte ferset dat is aktivearre op in iere stadium fan planten dy't net letter as 12 HPI), effektyf beskermje fan smel-leaved lupine út anthracnose feroarsake troch de pathogene skimmel collelotrichum lupini.Mei help fan hege theipput-sequencing oantoand, bewize wy differinsjele ekspresjeprofilen fan antwurden foar antytrasifist yn NLL-planten bemiddeld troch de Lanr1 en Anman Vestage Genes.Súksesfolle ferdigening giet oer it ûntwerpen fan 'e genen foar proteïne oanbelanget yn Redox, fotosynteze, en patogenesis binnen oeren fan' e earste kontaktpersoanen fan 'e plant.Fergelykbere beskermjende reaksjes, mar fertrage yn 'e tiid, binne folle minder effektyf yn it beskermjen fan planten fan sykten.Anthrax-resistinsje bemiddele troch it Lanr1-gen liket op de typyske rappe reaksje fan it R-gen (effektor-triggered immuniteit), wylst it AnMan-gen nei alle gedachten in horizontale antwurd leveret (immuniteit trigger troch in mikrobe-assosjearre molekulêre patroan), en leveret in matig nivo fan duorsumens.
De 215 NLL-rigels brûkt foar it skerm foar anthracnose-markers bestie út 74 kultivars, 60 rigels krigen troch oerstekke of fokkerij, 5 mutanten, en 76 wylde as orizjinele gierplasmen.De rigels kamen út 17 lannen, foaral út Poalen (58), Spanje (47), Dútslân (27), Ruslân (19), Wyt-Ruslân (7), Italië (5) en oare rigels.út 10 lannen.De set omfettet ek referinsjebestindige rigels: 83A:476, Tanjil, Wonga mei it Lanr1-allele, en Mandelup mei it AnMan-allele.De rigels waarden krigen fan 'e Jeropeeske Lupine Genetic Resource Database ûnderhâlden troch Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poalen (oanfoljende tabel S1).
Planten waarden groeid ûnder kontrolearre omstannichheden (fotoperioade 16 oeren, temperatuer 25 ° C oerdeis en 18 ° C nachts).Twa biologyske replikaten waarden analysearre.DNA waard isolearre fan trije wike âlde blêden mei de DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Dútslân) neffens it protokol.De kwaliteit en konsintraasje fan it isolearre DNA waard beoardiele troch spektrofotometryske metoaden (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).De AnManM1 marker dy't it anthracnose ferset gen AnMan markearret (ôflaat fan cv. Mandelup) en de markers Anseq3 en Anseq4 flankearjend it gen Lanr1 (ôflaat fan cv. Tanjil) waarden analysearre 11,26,28.Homozygoten foar it resistente allele waarden skoard as "1", gefoelich - as "0", en heterozygoten - as 0,5.
Op grûn fan 'e resultaten fan screening foar markers AnManM1, AnSeq3 en AnSeq4 en de beskikberens fan sieden foar definitive ferfolcheksperiminten, waarden 50 NLL-rigels selektearre foar anthracnose-resistinsje fenotyping.De analyse waard útfierd yn duplikaat yn in komputer kontrolearre glêstúnbou mei in 14 oeren photoperiod mei in temperatuer berik fan 22 ° C oerdeis en 19 ° C nachts.Siedingen wurde bekrast (it siedmantel oan 'e tsjinoerstelde kant fan it embryo ôfsnije mei in skerpe lem) foar it siedjen om foar te kommen dat de sieddoarmansje te hurd is en om unifoarme kieming te garandearjen.Planten waarden groeid yn potten (11 × 11 × 21 sm) mei sterile boaiem (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsjau, Poalen).Ynokulaasje waard útfierd mei de Colletotrichum lupini Col-08-stam, groeid yn 1999 út 'e stielen fan smelle-leaved lupine planten groeid yn in fjild yn Verzhenitsa, Greater Poalen (52 ° 27' 42' N 17 ° 04' E 05').Krij in gebiet.De isolaten waarden yn SNA-medium by 20 ° C. ûnder swart ljocht foar 21 dagen kultivearre om sporulaasje te stimulearjen.Fjouwer wiken nei it siedjen, doe't de planten it 4-6-blêdstadium berikten, waard ynokulaasje útfierd troch spuiten mei in suspensje fan conidia yn in konsintraasje fan 0,5 x 106 conidia per ml.Nei ynokulaasje waarden de planten 24 oeren yn it tsjuster hâlden by in fochtigens fan sa'n 98% en in temperatuer fan 25 °C om de kieming fan conidia en it ynfeksjeproses te fasilitearjen.De planten waarden doe groeid ûnder in 14-oere fotoperioade op 22 ° C dei / 19 ° C nacht en 70% vochtigheid.De sykteskoare waard makke 22 dagen nei ynokulaasje en rûn fan 0 (immune) oant 9 (tige gefoelich) ôfhinklik fan de oanwêzigens of ôfwêzigens fan nekrotyske lesions op stielen en blêden.Dêrneist waard nei it skoaren it gewicht fan de planten metten.Relaasjes tusken marker genotypen en sykte fenotypen waarden berekkene as punt twa-sekwinsje korrelaasjes (ôfwêzigens fan heterozygote markers yn de set fan rigels foar analyze fan it anthracnose ferset fenotype).