Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
D'r is ferlet fan in betrouber in vitro-systeem dat de fysiologyske omjouwing fan it hert sekuer kin reprodusearje foar drugstesten.De beheinde beskikberens fan minsklike hertweefselkultuersystemen hat laat ta ûnkrekte ynterpretaasjes fan hertlike medisyneffekten.Hjir hawwe wy in hertweefselkultuermodel (CTCM) ûntwikkele dat elektromeganysk hertplakken stimulearret en fysiologyske stretch ûndergiet tidens de systolike en diastolike fazen fan 'e hertsyklus.Nei 12 dagen fan kultuer ferbettere dizze oanpak foar in part de leefberens fan hertseksjes, mar behâlde har strukturele yntegriteit net folslein.Dêrom, nei lytse molekule-screening, fûnen wy dat de tafoeging fan 100 nM triiodothyronine (T3) en 1 μM dexamethasone (Dex) oan ús medium de mikrostruktuer fan 'e seksjes foar 12 dagen behâlde.Yn kombinaasje mei T3 / Dex-behanneling bewarre it CTCM-systeem transkripsjonele profilen, leefberens, metabolike aktiviteit en strukturele yntegriteit op itselde nivo as frisse hertweefsel foar 12 dagen.Dêrnjonken bringt oermjittich streken fan hertweefsel yn 'e kultuer hypertrofyske kardiale sinjalearring, en jout bewiis foar it fermogen fan CTCM om hypertrofyske betingsten te mimikjen dy't feroarsake binne troch hertstreek.Ta beslút, CTCM kin modellearje de fysiology en patofysiology fan it hert yn kultuer oer lange perioaden fan tiid, wêrtroch betroubere drug screening.
Foarôfgeand oan klinysk ûndersyk binne betroubere in vitro-systemen nedich dy't de fysiologyske omjouwing fan it minsklik hert sekuer kinne reprodusearje.Sokke systemen moatte feroare meganyske stretch, hertslach en elektrofysiologyske eigenskippen mimikearje.Diermodellen wurde faak brûkt as in screeningplatfoarm foar kardiale fysiology mei beheinde betrouberens by it reflektearjen fan de effekten fan medisinen yn it minsklik hert1,2.Uteinlik is it Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) in model dat heul gefoelich en spesifyk is foar ferskate therapeutyske en farmakologyske yntervinsjes, en de fysiology en patofysiology fan it minsklik hert sekuer reprodusearje3.It ûntbrekken fan sa'n systeem beheint de ûntdekking fan nije behannelingen foar hertfalen4,5 en hat laat ta medisynkardiotoksisiteit as in wichtige reden foar it ferlitten fan 'e merk6.
Yn 'e ôfrûne desennia binne acht net-kardiovaskulêre medisinen weromlutsen út klinysk gebrûk, om't se ferlinging fan QT-ynterval feroarsaakje dy't liede ta ventrikulêre arrhythmias en hommelse dea7.Sa is d'r in tanimmend ferlet fan betroubere preklinyske screeningstrategyen om kardiovaskulêre effektiviteit en toxiciteit te beoardieljen.It resinte gebrûk fan minsklik-induzearre pluripotinte stamsel-ôflaat cardiomyocytes (hiPS-CM) yn drug screening en toxicity testen jout in parsjele oplossing foar dit probleem.De ûnfoldwaande aard fan hiPS-CM's en it ûntbrekken fan mearsellige kompleksiteit fan hertweefsel binne lykwols wichtige beheiningen fan dizze metoade.Resinte stúdzjes hawwe oantoand dat dizze beheining foar in part oerwûn wurde kin troch it brûken fan iere hiPS-CM om kardiale weefselhydrogels te foarmjen koart nei it begjin fan spontane kontrakten en stadichoan tanimmende elektryske stimulearring oer de tiid.Dizze hiPS-CM mikrotissues misse lykwols de folwoeksen elektrofysiologyske en kontraktile eigenskippen fan it myokardium fan folwoeksenen.Dêrnjonken hat minsklik hertweefsel in kompleksere struktuer, besteande út in heterogene mingsel fan ferskate seltypen, ynklusyf endotheliale sellen, neuroanen en stromale fibroblasten, meiinoar ferbûn troch spesifike sets fan ekstrazellulêre matrixproteinen.Dizze heterogeniteit fan net-kardiomyocyte-populaasjes11,12,13 yn it hert fan folwoeksen sûchdieren is in wichtige barriêre foar it modellearjen fan hertweefsel mei yndividuele seltypen.Dizze grutte beheiningen beklamje it belang fan it ûntwikkeljen fan metoaden foar it kultivearjen fan yntakt myokardiale weefsel ûnder fysiologyske en patologyske omstannichheden.
Kultuerde tinne (300 µm) seksjes fan it minsklik hert hawwe bewiisd in kânsryk model te wêzen fan yntakt minsklik myokardium.Dizze metoade jout tagong ta in folslein 3D multicellular systeem fergelykber mei minsklik hert weefsel.Oant 2019 waard it gebrûk fan kweekte hertseksjes lykwols beheind troch it koarte (24 h) kultueroerlibjen.Dit is te tankjen oan in oantal faktoaren, ynklusyf it ûntbrekken fan fysyk-meganyske stretch, de loft-flüssige ynterface, en it brûken fan ienfâldige media dy't de behoeften fan hertweefsel net stypje.Yn 2019 hawwe ferskate ûndersyksgroepen oantoand dat it opnimmen fan meganyske faktoaren yn hertweefselkultuersystemen it kultuerlibben kin ferlingje, hertekspresje ferbetterje en kardiale patology neikomme.Twa elegante stúdzjes 17 en 18 litte sjen dat uniaxiale meganyske laden in posityf effekt hat op kardiale fenotype tidens kultuer.Dizze stúdzjes brûkten lykwols net de dynamyske trijediminsjonale fysyk-meganyske laden fan 'e hertlike syklus, om't hertseksjes laden waarden mei isometryske trekkrêften 17 of lineêre auxotoanyske laden 18 .Dizze metoaden fan tissue-stretsjen resultearren yn 'e ûnderdrukking fan in protte hertgenen as de overekspresje fan genen dy't ferbûn binne mei abnormale stretch-antwurden.Notably, Pitoulis et al.19 ûntwikkele in dynamysk hert slice kultuer bad foar hert syklus rekonstruksje mei help fan krêft transducer feedback en spanning driuwfearren.Hoewol dit systeem in krekter modeling fan in vitro-hertsyklus mooglik makket, beheint de kompleksiteit en lege trochstreaming fan 'e metoade de tapassing fan dit systeem.Us laboratoarium hat koartlyn in ferienfâldige kultuersysteem ûntwikkele mei elektryske stimulearring en in optimalisearre medium om de leefberens fan seksjes fan porcine en minsklik hertweefsel oant 6 dagen te behâlden20,21.
Yn it hjoeddeistige manuskript beskriuwe wy in hertweefselkultuermodel (CTCM) mei gebrûk fan seksjes fan it porcine hert dat humorale oanwizings omfettet om trijediminsjonale kardiale fysiology en pathofysiologyske distinsje yn 'e hertsyklus te recapituleren.Dizze CTCM kin de krektens fan pre-klinyske medisynfoarsizzing ferheegje nei in nivo nea earder berikt troch it leverjen fan in kosten-effektyf, mid-throughput hertsysteem dat de fysiology / patofysiology fan it sûchdierhert neimakket foar pre-klinyske medisyntesten.
Hemodynamyske meganyske sinjalen spylje in krityske rol by it behâld fan kardiomyocytefunksje in vitro 22,23,24.Yn it hjoeddeistige manuskript hawwe wy in CTCM ûntwikkele (figuer 1a) dy't de folwoeksen hertlike omjouwing kin mimike troch sawol elektryske as meganyske stimulearring te yndusearjen by fysiologyske frekwinsjes (1.2 Hz, 72 beats per minuut).Om oermjittige tissue-stretch by diastole te foarkommen, waard in 3D-printapparaat brûkt om tissuegrutte mei 25% te fergrutsjen (Fig. 1b).Elektryske pacing feroarsake troch it C-PACE-systeem waard timed om 100 ms te begjinnen foardat systole mei in data-akwisysjesysteem om de kardiale syklus folslein te reprodusearjen.It weefselkultuersysteem brûkt in programmabele pneumatyske aktuator (LB Engineering, Dútslân) om in fleksibele silikonmembraan syklik út te wreidzjen om útwreiding fan 'e hertplakken yn' e boppeste keamer te feroarjen.It systeem waard ferbûn mei in eksterne lucht line troch in druk transducer, dat makke it mooglik om sekuer oanpasse de druk (± 1 mmHg) en tiid (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Befestigje de weefselseksje oan 'e 7 mm-stipering, werjûn yn blau, yn' e kultuerkeamer fan it apparaat.De kultuerkeamer wurdt skieden fan 'e loftkeamer troch in tinne fleksibele silikonmembraan.Plak in pakking tusken elke keamer om lekken te foarkommen.It lid fan it apparaat befettet grafytelektroden dy't elektryske stimulearring leverje.b Skematyske foarstelling fan it grutte weefsel apparaat, gids ring en stipe ring.De weefsel seksjes (brún) wurde pleatst op de te grutte apparaat mei de gids ring pleatst yn de groove oan de bûtenste râne fan it apparaat.Pleatst mei de gids de stipering foarsichtich bedekt mei tissue-acrylkleefstof oer de seksje fan hertweefsel.c Grafyk toant de tiid fan elektryske stimulearring as funksje fan lucht keamer druk regele troch in programmabel pneumatyske actuator (PPD).In apparaat foar gegevenswinning waard brûkt om elektryske stimulearring te syngronisearjen mei druksensors.As de druk yn 'e kultuerkeamer de ynstelde drompel berikt, wurdt in pulssinjaal nei de C-PACE-EM stjoerd om elektryske stimulearring te triggerjen.d Ofbylding fan fjouwer CTCM's pleatst op in ynkubatorplank.Fjouwer apparaten binne ferbûn mei ien PPD fia in pneumatyske sirkwy, en druk sensors wurde ynfoege yn de hemostatic fentyl te kontrolearjen de druk yn de pneumatyske circuit.Elk apparaat befettet seis weefselseksjes.
Mei in inkele pneumatyske actuator koenen wy 4 CTCM-apparaten kontrolearje, elk fan dy koe 6 tissue-seksjes hâlde (fig. 1d).Yn CTCM wurdt de loftdruk yn 'e loftkeamer omboud ta syngroane druk yn' e floeistofkeamer en feroarsaket fysiologyske útwreiding fan 'e hertslach (figuer 2a en oanfoljende film 1).Evaluaasje fan tissue stretch by 80 mm Hg.Keunst.toande stretching fan weefsel seksjes mei 25% (Fig. 2b).Dit persintaazje stretch is oantoand om oerien te kommen mei in fysiologyske sarcomere-lingte fan 2.2-2.3 µm foar normale kontraktiliteit fan hertseksje17,19,25.Tissuebeweging waard beoardiele mei oanpaste kamera-ynstellingen (oanfoljende figuer 1).De amplitude en snelheid fan weefsel beweging (Fig. 2c, d) oerien mei stretch yn 'e cardiac syklus en tiid yn systole en diastole (Fig. 2b).Stretch en snelheid fan kardiale weefsel tidens kontrakt en ûntspanning bleau konstant foar 12 dagen yn kultuer (Fig. 2f).Om it effekt fan elektryske stimulearring op kontraktiliteit yn 'e kultuer te evaluearjen, hawwe wy in metoade ûntwikkele foar it bepalen fan aktive deformiteit mei in skaadalgoritme (Supplementary Fig. 2a, b) en kinne ûnderskiede tusken deformiteiten mei en sûnder elektryske stimulearring.Itselde diel fan it hert (fig. 2f).Yn 'e beweechbere regio fan' e besuniging (R6-9) wie de spanning by elektryske stimulearring 20% ​​heger as by it ûntbrekken fan elektryske stimulearring, wat de bydrage fan elektryske stimulearring oanjout oan kontraktile funksje.
Fertsjintwurdige spoaren fan lucht keamer druk, fluid keamer druk, en tissue beweging mjittingen befêstigje dat keamer druk feroaret fluid keamer druk, wêrtroch in oerienkommende beweging fan it weefsel slice.b Representative spoaren fan persintaazje stretch (blau) fan weefselseksjes dy't oerienkomme mei persintaazje stretch (oranje).c De mjitten beweging fan it hertplak is konsistint mei de mjitten snelheid fan beweging.(d) Representative trajekten fan sykliske beweging (blauwe line) en snelheid (oranje stippelline) yn in plak fan it hert.e Kwantifikaasje fan syklustiid (n = 19 slices per groep, fan ferskate pigs), contraction time (n = 19 slices per groep), ûntspanningstiid (n = 19 slices per groep, fan ferskate pigs), tissuebeweging (n = 25 ).plakjes) / groep fan ferskate bargen), pyk systolyske snelheid (n = 24 (D0), 25 (D12) plakjes / groep fan ferskate bargen) en peak ûntspanningsrate (n = 24 (D0), 25 (D12) plakjes / groep fan ferskate bargen).Twa-tailed Student's t-test liet gjin signifikant ferskil sjen yn elke parameter.f Representative strain analyze spoaren fan weefsel seksjes mei (read) en sûnder (blauwe) elektryske stimulearring, tsien regionale gebieten fan weefsel seksjes út deselde seksje.De ûnderste panielen litte de kwantifikaasje sjen fan it persintaazje ferskil yn spanning yn tissue-seksjes mei en sûnder elektryske stimulearring yn tsien gebieten fan ferskate seksjes. (n = 8 plakjes / groep fan ferskate bargen, Two-tailed Student t-test wurdt útfierd; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 plakjes / groep fan ferskate bargen, Two-tailed Student t-test wurdt útfierd; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 kritearia / sûchdieren fan racing, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, **p<0,01,01,5). (n = 8 seksjes / groep fan ferskate bargen, twa-tailed Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 kritearia/gear, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seksjes / groep, fan ferskate bargen, twa-tailed Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Flaterbalken fertsjintwurdigje de gemiddelde ± standertdeviaasje.
Yn ús foarige statyske biomimetyske hertslice-kultuersysteem [20, 21], behâlden wy de leefberens, funksje en strukturele yntegriteit fan hertplakken foar 6 dagen troch elektryske stimulearring oan te passen en de mediumkomposysje te optimalisearjen.Nei 10 dagen binne dizze sifers lykwols flink sakke.Wy sille ferwize nei seksjes yn kultuer brocht yn ús foarige statyske biomimetic kultuer systeem 20, 21 kontrôle betingsten (Ctrl) en wy sille brûke ús earder optimalisearre medium as MC betingsten en kultuer ûnder simultane meganyske en elektryske stimulearring (CTCM).neamd.Earst hawwe wy bepaald dat meganyske stimulearring sûnder elektryske stimulearring net genôch wie om tissue-libbensfetberens foar 6 dagen te behâlden (Supplementary Fig. 3a,b).Ynteressant, mei de ynfiering fan fysio-meganyske en elektryske stimulearring mei STCM, bleau de leefberens fan 12-dagen hertseksjes itselde as yn frisse hertseksjes ûnder MS-betingsten, mar net ûnder Ctrl-betingsten, lykas sjen litten troch MTT-analyze (Fig. 1).3a).Dit suggerearret dat meganyske stimulearring en simulaasje fan 'e kardiale syklus weefselseksjes twa kear sa lang libbensfetber hâlde kinne as rapportearre yn ús foarige statyske kultuersysteem.Beoardieling fan 'e strukturele yntegriteit fan tissue-seksjes troch immunolabeling fan herttroponine T en connexin 43 liet lykwols sjen dat connexin 43-ekspresje signifikant heger wie yn MC-weefsels op dei 12 dan yn kontrôles op deselde dei.Uniforme konnexin 43-ekspresje en Z-disc-formaasje waarden lykwols net folslein bewarre (fig. 3b).Wy brûke in ramt foar keunstmjittige yntelliginsje (AI) om strukturele yntegriteit fan weefsel te kwantifisearjen26, in ôfbyldingsbasearre djippe learpipeline basearre op troponin-T en connexin-kleuring43 om de strukturele yntegriteit en fluoreszinsje fan hertplakken automatysk te kwantifisearjen yn termen fan sterkte fan lokalisaasje.Dizze metoade brûkt in Convolutional Neural Network (CNN) en in djippe learkader om de strukturele yntegriteit fan hertweefsel betrouber te kwantifisearjen op in automatisearre en ûnbidige manier, lykas beskreaun yn 'e referinsje.26. MC-weefsel toande ferbettere strukturele oerienkomst mei dei 0 yn ferliking mei statyske kontrôleseksjes.Dêrnjonken die Masson's trichrome kleuring in signifikant legere persintaazje fibrosis ûnder MS-betingsten yn ferliking mei kontrôlebetingsten op dei 12 fan kultuer (fig. 3c).Wylst CTCM de leefberens fan hertweefselseksjes op dei 12 fergrutte nei in nivo fergelykber mei dat fan farsk hertweefsel, ferbettere it de strukturele yntegriteit fan 'e hertseksjes net signifikant.
in staafdiagram toant kwantifikaasje fan 'e MTT-leaftberens fan farske hertplakken (D0) of hertplakkultuer foar 12 dagen, itsij yn statyske kultuer (D12 Ctrl) of yn CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) slices / test, # 0 fan in oare wize ANO pig, # 0; 01 fergelike mei D0 en **p <0.01 fergelike mei D12 Ctrl). in staafdiagram toant kwantifikaasje fan 'e MTT-leaftberens fan farske hertplakken (D0) of hertplakkultuer foar 12 dagen, itsij yn statyske kultuer (D12 Ctrl) of yn CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) 12 (D12 MC) slices / # test ien manier ANO pig /# 0; 001 fergelike mei D0 en **p <0.01 fergelike mei D12 Ctrl).it histogram toant de kwantifikaasje fan 'e leefberens fan MTT farske hertseksjes (D0) of kultuer fan hertseksjes foar 12 dagen yn beide statyske kultuer (D12-kontrôle) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrôle). ) ), 12 (D12 MC) seksjes / NO, in test útfierd A- VA-seksjes / groep;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 fergelike mei D0 en **p < 0.01 fergelike mei D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测踎测踎缔缔缔缔缯#0#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**phistogram toant de kwantifikaasje fan MTT leefberens yn farske hert seksjes (D0) of hert seksjes yn kultuer brocht foar 12 dagen yn statyske kultuer (D12 kontrôle) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrôle)), 12 (D12 MC) seksjes / groep út ferskate ANO pigs, ien-way VA;####p < 0,0001 op D12 Ctrl). ####p < 0.0001 fergelike mei D0, **p < 0.01 fergelike mei D12 Ctrl).b Troponin-T (grien), connexin 43 (read) en DAPI (blau) yn nij isolearre hertseksjes (D0) as hertseksjes kultivearre ûnder statyske omstannichheden (Ctrl) of CTCM-betingsten (MC) foar 12 dagen) fan represintative immunofluorescence-ôfbyldings (blanke skaal = 100 µm). Kwantifikaasje fan keunstmjittige yntelliginsje fan 'e strukturele yntegriteit fan' e hertweefsel (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes / groep elk fan ferskate pig, ienwize ANOVA-test wurdt útfierd; ####p <0.0001 fergelike mei D0 en D100p <1 Ctrl. Kwantifikaasje fan keunstmjittige yntelliginsje fan 'e strukturele yntegriteit fan' e hertweefsel (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes / groep elk fan ferskate bargen, ien-wize ANOVA-test wurdt útfierd; ####p <0.0001 fergelike mei D0 en ****p <10. Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 сD), пурег (D12 сD), пра (D12 сD), пра (D12 сD), зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 by сравнению с D0 en ****p < 0,0001 op D12ю сравни). Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan hertweefsel troch keunstmjittige yntelliginsje (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksjes / groepen fan ferskate bargen, ien-wei ANOVA-test útfierd; ####p <0.0001 vs.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groepen elk fan ferskillende pig, ien-wize ANO00 甔甸#0;##; ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groepen elk fan ferskillende pigs, ien-wize .###0VA test <0 ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 пуков) аждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнения 12 Ctrl). Keunstmjittige yntelliginsje om de strukturele yntegriteit fan hertweefsel te kwantifisearjen (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksjes / groep elk fan ferskate pigs, ien-wize ANOVA-test; ####p<0.0001 vs .D0 <fergeliking mei D****0201 foar ferliking .****0201). c Representative ôfbyldings (lofts) en kwantifikaasje (rjochts) foar hertplakken ferkleurd mei Masson's trichrome stain (Skaal keal = 500 µm) (n = 10 plakjes / groep elk fan ferskate pig, ien-wize ANOVA-test wurdt útfierd; ####p <0.0001 fergelike mei D0 en D*** Ctrl). c Representative ôfbyldings (lofts) en kwantifikaasje (rjochts) foar hertplakken bekleurd mei Masson's trichrome-flekke (Skaal kaal = 500 µm) (n = 10 plakjes / groep elk fan ferskate pigs, ien-wize ANOVA-test wurdt útfierd; #### p <0.0001 fergelike mei D0 en D Ctrl***p <D0 en D0. c Репрезентативные изображения (слева) en количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных тримихрос штаб без покрытия = 500 mkm) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тесносторонний тесно ###0; D0 en ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representative ôfbyldings (lofts) en kwantifikaasje (rjochts) fan hertseksjes ferkleurd mei Masson's trichrome stain (uncoated skaal = 500 µm) (n = 10 seksjes / groep fan ferskate bargen, ien-wei ANOVA-test útfierd; #### p <0 .0001 fergelike mei D0 en .***0p Ctrl < 0 en .***0p Ctrl). d切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 与D0 相比，01 Ctrl <0.***0p . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庰庰 裸壸庰度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 0##0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) en количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трисмихром я шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью одинофагон ;### #p < 0,0001 op сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representative ôfbyldings (links) en kwantifikaasje (rjochts) fan hertseksjes bevlekt mei Masson's trichrome stain (blank = 500 µm) (n = 10 seksjes / groep, elk fan in oare pig, hifke troch ien-wize analyze fan fariânsje ;### # p <0.0001 fergelike mei D0, Ctrl***1 fergelike mei D0, .Flaterbalken fertsjintwurdigje de gemiddelde ± standertdeviaasje.
Wy hypoteze dat troch it tafoegjen fan lytse molekulen oan it kultuermedium, cardiomyocyte-yntegriteit koe wurde ferbettere en fibrosis-ûntwikkeling fermindere tidens CTCM-kultuer.Wy screene dêrom foar lytse molekulen mei ús statyske kontrôlekultueren20,21 fanwegen it lytse oantal ferrifeljende faktoaren.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), en SB431542 (SB) waarden keazen foar dit skerm.Dizze lytse molekulen binne earder brûkt yn hiPSC-CM-kultueren om maturaasje fan cardiomyocytes te stimulearjen troch it fergrutsjen fan sarcomere-lingte, T-tubules, en konduksjesnelheid.Derneist binne sawol Dex (in glukokortikoïde) as SB bekend om ûntstekking te ûnderdrukke29,30.Dêrom hawwe wy hifke oft it opnimmen fan ien of in kombinaasje fan dizze lytse molekulen de strukturele yntegriteit fan hertseksjes soe ferbetterje.Foar inisjele screening waard de dosis fan elke ferbining selektearre op basis fan 'e konsintraasjes dy't gewoanlik brûkt wurde yn selkultuermodellen (1 μM Dex27, 100 nM T327, en 2.5 μM SB31).Nei 12 dagen fan kultuer resultearre de kombinaasje fan T3 en Dex yn optimale kardiomyocyte strukturele yntegriteit en minimale fibrous remodeling (Supplementary Figures 4 en 5).Dêrnjonken produsearre gebrûk fan dûbele of dûbele dizze konsintraasjes fan T3 en Dex skealike effekten yn ferliking mei normale konsintraasjes (Supplementary Fig. 6a, b).
Nei inisjele screening hawwe wy in kop-oan-kop-fergeliking fan 4-kultuerbetingsten útfierd (figuer 4a): Ctrl: hertseksjes kultivearre yn ús earder beskreaune statyske kultuer mei ús optimisearre medium;20.21 TD: T3 en Ctrl s Added Dex op woansdei;MC: hertseksjes kultivearre yn CTCM mei ús earder optimalisearre medium;en MT: CTCM mei T3 en Dex tafoege oan it medium.Nei 12 dagen fan kultivaasje bleau de leefberens fan MS- en MT-weefsels itselde as yn frisse weefsels beoardiele troch MTT-assay (Fig. 4b).Ynteressant hat de tafoeging fan T3 en Dex oan transwell-kultueren (TD) net resultearre yn in signifikante ferbettering fan leefberens yn ferliking mei Ctrl-betingsten, wat oanjout in wichtige rol fan meganyske stimulearring yn it behâld fan de leefberens fan hertseksjes.
in eksperiminteel ûntwerpdiagram dat de fjouwer kultuerbetingsten ôfbyldet dy't brûkt wurde om de effekten fan meganyske stimulearring en T3 / Dex-oanfolling op medium foar 12 dagen te evaluearjen. b Bar grafyk toant kwantifikaasje fan leefberens 12 dagen nei kultuer yn alle 4 kultuer betingsten (Ctrl, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hert plakjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) slices / groep, # is útfierd ien-pig 0, # 0; 001, ###p < 0.001 fergelike mei D0 en **p < 0.01 fergelike mei D12 Ctrl). b Bar grafyk toant kwantifikaasje fan leefberens 12 dagen nei kultuer yn alle 4 kultuer betingsten (Ctrl, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hert plakjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) slices / groep, # is útfierd ien-pig 0, # 0; 001, ###p < 0.001 fergelike mei D0 en **p < 0.01 fergelike mei D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку. ования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12) пур (D12) сов (D12) т разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 op сравнению с D0 en **p <по 0, 01s. b De staafgrafyk toant de kwantifikaasje fan leefberens op 12 dagen nei kultuer yn alle 4 kultuerbetingsten (kontrôle, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hertseksjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, en D12 MT), 12 (D12 MC) fan ferskate seksjes A-NO, # 0; 001, ###p < 0.001 tsjin D0 en **p < 0.01 yn fergeliking mei D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 150がD 12 150) 、 TD MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，，，，，，，，，，#**#p < 0.000与D12控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежезимц (1 = 0) D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), fan разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; #сра###p <0,#0#0p <0,#0#p <0,#0#p с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram mei alle 4 kultuerbetingsten (kontrôle, TD, MC en MT) yn ferliking mei farske hertseksjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), fan ferskate pigs 12 (D12 MC) seksjes / groep, ien-way ANOVAp1-test; #.#0#0p1, #0.0##0, #0. , **p<0.01 tsjin kontrôle D12). c Bar graph lit de kwantifikaasje fan glukoaze flux 12 dagen post kultuer yn alle 4 kultuer betingsten (Ctrl, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hert plakjes (D0) (n = 6 plakjes / groep fan ferskate bargen, ien-way ANOVA test wurdt útfierd; ### p <0.001, ferlike mei D0 en D0.***p <D0 en D0.***p 1). c Bar graph lit de kwantifikaasje fan glukoaze flux 12 dagen post kultuer yn alle 4 kultuer betingsten (Ctrl, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hert plakjes (D0) (n = 6 plakjes / groep fan ferskate bargen, ien-way ANOVA test wurdt útfierd; ### p <0.001, ferlike mei D0 en D0.***p <D0 en D0.***p 1). d ания (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных сердца, УН ся тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 en ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram toant kwantifikaasje fan glukoseflux 12 dagen post-kultuer ûnder alle 4 kultuerbetingsten (kontrôle, TD, MC en MT) yn ferliking mei farske hertseksjes (D0) (n = 6 seksjes / groep fan ferskate bargen, ien-wei ANOVA-test útfierd; ###p <0.001 fergelike mei D0 en .***01 <Ctrl fergelike mei D0 en .***01). c.通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与***D0 盌 ，与***D0 盌 Ctrl相比). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切 缟养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 定量测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированив 4 для культивированив рования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению от свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от развиных, развиных роведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram toant kwantifikaasje fan glukoazeflux op 12 dagen post-kultuer foar alle 4 kultuerbetingsten (kontrôle, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hertseksjes (D0) (n = 6 seksjes / groep, fan ferskate bargen, iensidich wiene ANOVA-tests útfierd, ###p <0.001.***0 fergelike mei D <0.001.***0 fergelike mei D <0.001.***0).d Strain analyze plots fan farske (blau), dei 12 MC (grien), en dei 12 MT (read) weefsels op tsien regionale weefsel seksje punten (n = 4 plakjes / groep, ien-way ANOVA test; der wie gjin signifikant ferskil tusken groepen).e Volcano-plot dy't differinsjaal útdrukte genen yn farske hertseksjes (D0) toant yn ferliking mei hertseksjes dy't ûnder statyske omstannichheden (Ctrl) of ûnder MT-betingsten (MT) foar 10-12 dagen kultivearre binne.f Heatmap fan sarcomere genen foar hert seksjes kweekt ûnder elk fan de kultuer betingsten.Flaterbalken fertsjintwurdigje de gemiddelde ± standertdeviaasje.
Metabolike ôfhinklikens fan 'e skeakel fan fatty acid oksidaasje nei glycolyse is in skaaimerk fan kardiomyocyte dedifferentiaasje.Unrypke cardiomyocytes brûke primêr glukose foar ATP-produksje en hawwe hypoplastyske mitochondria mei in pear cristae5,32.Analysen fan glukose-gebrûk lieten sjen dat ûnder MC- en MT-betingsten, glukose-gebrûk fergelykber wie mei dat yn weefsels fan dei 0 (figuer 4c).Ctrl-monsters lieten lykwols in signifikante ferheging sjen yn glukose-gebrûk yn ferliking mei farsk weefsel.Dit jout oan dat de kombinaasje fan CTCM en T3 / Dex de leefberens fan tissue ferbettert en it metabolike fenotype fan 12-dagen kultivearre hertseksjes behâldt.Dêrnjonken liet strain-analyze sjen dat stammennivo's itselde bleaun as yn frisse hertweefsel foar 12 dagen ûnder MT- en MS-betingsten (Fig. 4d).
Om de algemiene ynfloed fan CTCM en T3 / Dex te analysearjen op it wrâldwide transkripsjelânskip fan hertlik plakweefsel, hawwe wy RNAseq útfierd op hertplakken fan alle fjouwer ferskillende kultuerbetingsten (oanfoljende gegevens 1).Ynteressant lieten MT-seksjes hege transkripsjonele oerienkomst sjen mei farsk hertweefsel, mei allinich 16 differinsjaal útdrukt út 13,642 genen.Lykwols, lykas wy earder sjen lieten, toane Ctrl-plakken 1229 differinsjaal útdrukte genen nei 10-12 dagen yn kultuer (Fig. 4e).Dizze gegevens waarden befêstige troch qRT-PCR fan hert- en fibroblastgenen (Supplementary Fig. 7a-c).Ynteressant lieten de Ctrl-seksjes downregulaasje sjen fan hert- en selsyklusgenen en aktivearring fan inflammatoare genprogramma's.Dizze gegevens suggerearje dat dedifferentiaasje, dy't normaal bart nei langduorjende kultivaasje, folslein fermindere wurdt ûnder MT-betingsten (oanfoljende Fig. 8a, b).Soarchûndersyk fan sarcomere-genen die bliken dat allinich ûnder MT-betingsten de genen dy't kodearje foar de sarcomere (Fig. 4f) en ionkanaal (Supplementary Fig. 9) bewarre wurde, en beskermje se fan ûnderdrukking ûnder Ctrl-, TD- en MC-betingsten.Dizze gegevens litte sjen dat mei in kombinaasje fan meganyske en humorale stimulearring (T3 / Dex), it hertslice-transkriptoom nei 12 dagen yn kultuer fergelykber bliuwe kin mei farske hertplakken.
Dizze transkripsjonele fynsten wurde stipe troch it feit dat de strukturele yntegriteit fan cardiomyocytes yn hertseksjes it bêste bewarre bleaun is ûnder MT-betingsten foar 12 dagen, lykas sjen litten troch yntakt en lokalisearre konnexin 43 (fig. 5a).Dêrnjonken waard fibrosis yn hertseksjes ûnder MT-betingsten signifikant fermindere yn ferliking mei Ctrl en fergelykber mei frisse hertseksjes (Fig. 5b).Dizze gegevens litte sjen dat de kombinaasje fan meganyske stimulearring en T3 / Dex-behanneling effektyf de kardiale struktuer yn hertseksjes yn kultuer behâldt.
a Representative immunofluorescence-ôfbyldings fan troponin-T (grien), connexin 43 (read), en DAPI (blau) yn nij isolearre hertseksjes (D0) as 12 dagen yn kultuer brocht yn alle fjouwer hertseksjekultuerbetingsten (skaalbalke = 100 µm).). Kwantifikaasje fan keunstmjittige yntelliginsje fan 'e strukturele yntegriteit fan' e hertweefsel (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) plakjes / groep fan ferskate bargen, ien-wei ANOVA-test wurdt útfierd; ####p <0.00001 fergelike mei D0.****p 0,0001 fergelike mei D0.****p 0. 12 Ctrl). Keunstmjittige yntelliginsje kwantifikaasje fan it hert weefsel strukturele yntegriteit (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) plakjes / groep út ferskate bargen, ien-way ANOVA test wurdt útfierd; #### p <0.00001 fergelike mei D0.****p 0,0001 fergelike mei D0.****p 0. 12 Ctrl). (Dûbele yntellektuele ynstellings dy't yn 'e ynterne ynterface (n = 7 (D12D, D12D, D1TD, 5) en D12D, 5 (D12D, 5) 2 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с сравнению с 0л и 0 и *0p **** внению с D12 Ctrl). Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan hertweefsel mei help fan keunstmjittige yntelliginsje (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) seksjes / groep fan ferskate pigs, ien-wei ANOVA-test útfierd; #### p <0.0001 fergelike mei D02.0.0001 en *0.0001 <0. Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和片忇ﺛ衉缇忇ﺛ艈 MTﺛ工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.000 Ctrl对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 td 、 t12 mc 廒智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 缌 0.0****D 1 缌斔相比).Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan kardiale weefsel mei help fan keunstmjittige yntelliginsje yn ferskate bargen (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) seksjes / groep) mei in ienwize ANOVA-test;#### p < 0,0001 mei D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 mei D12 Ctrl). #### p < 0,0001 fergelike mei D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 fergelike mei D12 Ctrl). b Representative bylden en kwantifikaasje foar hert plakjes kleurde mei Masson syn trichrome stain (Skaalbalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, en D12 MC), 9 (D12 MT) plakjes / groep fan ferskate pigs, test wurdt útfierd ien-wei ANO. p < 0,001, of ****p < 0,0001 fergelike mei D12 Ctrl). b Representative bylden en kwantifikaasje foar hert plakjes kleurde mei Masson syn trichrome stain (Skaalbalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, en D12 MC), 9 (D12 MT) plakjes / groep fan ferskate pigs, test wurdt útfierd ien-wei ANO. p < 0,001, of ****p < 0,0001 fergelike mei D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красимаслем = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одни0##; 1 по сравнению с D0 en ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representative ôfbyldings en kwantifikaasje fan hertseksjes bekleurd mei Masson syn trichrome stain (skaalbalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) seksjes / groep út ferskate pigs, útfierd ien-way DANO 0 #0pVA <.#0pVA; #***0pVA; 01 of ****p < 0,0001 tsjin D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm！D（10！D、10（n和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分枸0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 、 1）（n = 500 µ（n trl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差４！0#林#0；D ***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Ûntsteanberens en berekkening fan evaluaasje fan 'e begrutting, yn' e perioade fan 'e moanne 0,000 mânske n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; #####p < 0,0,0p < 0,0 001 of ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representative ôfbyldings en kwantifikaasje fan hertseksjes dy't ferkleurd binne mei Masson's trichrome (skaalbalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) seksjes fan ferskate pigs / groep, ien ANOVA-metoade; ###0,1 of ****0 0.*** 0,1 of D****0. p < 0,0001 fergelike mei D12 Ctrl).Flaterbalken fertsjintwurdigje de gemiddelde ± standertdeviaasje.
Uteinlik waard it fermogen fan CTCM om herthypertrophy te mimikjen beoardiele troch it fergrutsjen fan hertweefsel stretch.Yn CTCM, peak lucht keamer druk ferhege fan 80 mmHg nei 80 mmHg.Keunst.(normale stretch) oant 140 mmHg Art.(ôfb. 6a).Dit komt oerien mei in ferheging fan 32% yn stretch (fig. 6b), dy't earder toand wie as de oerienkommende persintaazje stretch dy't nedich is foar hertseksjes om in sarcomere-lingte te berikken dy't fergelykber is mei dy te sjen yn hypertrophy.Stretch en snelheid fan hertweefsel tidens kontraktearjen en ûntspanning bleaunen konstant yn seis dagen fan kultuer (Fig. 6c).Kardiale weefsel fan MT-betingsten waard ûnderwurpen oan normale stretch (MT (normaal)) of overstretch-betingsten (MT (OS)) foar seis dagen.Al nei fjouwer dagen yn kultuer waard de hypertrofyske biomarker NT-ProBNP signifikant ferhege yn it medium ûnder MT (OS) betingsten yn ferliking mei MT (normale) betingsten (Fig. 7a).Dêrnjonken, nei seis dagen fan kultivaasje, waard de selgrutte yn MT (OS) (Fig. 7b) signifikant ferhege yn ferliking mei seksjes fan MT-hert (normaal).Dêrnjonken waard NFATC4 nukleêre translokaasje signifikant ferhege yn overstretched weefsels (Fig. 7c).Dizze resultaten litte de progressive ûntwikkeling fan patologyske remodeling nei hyperdistensje sjen en stypje it konsept dat it CTCM-apparaat kin wurde brûkt as platfoarm om stretch-induzearre herthypertrophy-sinjalearring te studearjen.
Fertsjintwurdige spoaren fan lucht keamer druk, fluid keamer druk, en tissue beweging mjittingen befêstigje dat keamer druk feroaret fluid keamer druk, wêrtroch in oerienkommende beweging fan it weefsel slice.b Representative stretch persintaazje en stretch rate curves foar normaal stretched (oranje) en overstretched (blau) weefsel seksjes.c Staafgrafyk dy't syklustiid sjen lit (n = 19 plakjes per groep, fan ferskate bargen), kontraktytiid (n = 18-19 plakjes per groep, fan ferskate bargen), ûntspanningstiid (n = 19 plakjes per groep, fan ferskate bargen)), amplitude fan weefselbeweging (n = 14 plakjes / groep snelheid, fan ferskate slûzen / groep, fan ferskate slûzen / groep, fan ferskate slûzen / groep, fan ferskate slûzen / groep), ferskillende bargen) en peak ûntspanning rate (n = 14 (D0), 15 (D6) ) seksjes / groepen) út ferskillende bargen), twa-tailed Student syn t-test liet gjin signifikante ferskil yn eltse parameter, wat oanjout dat dizze parameters bleau konstant yn 6 dagen fan kultuer mei overvoltage.Flaterbalken fertsjintwurdigje de gemiddelde ± standertdeviaasje.
a Bar graph kwantifikaasje fan NT-ProBNP konsintraasje yn kultuer media út hert plakjes kultivearre ûnder MT normale stretch (Norm) of overstretching (OS) betingsten (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4 MTOS) plakjes / groep út ferskillende pigs, twa-way stretch ** fergelike mei normale . in staafgrafyk kwantifikaasje fan NT-ProBNP-konsintraasje yn kultuermedia fan hertplakken kultivearre ûnder MT normale stretch (Norm) of overstretching (OS) betingsten (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4 MTOS) plakjes / groep fan ferskillende A** pigs, twa-wei útfierd.Kwantitative histogram fan NT-ProBNP konsintraasje yn kultuer medium út hert plakjes kultivearre ûnder betingsten fan normale MT stretch (noarm) of overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4). MTOS) plakjes / groep út ferskillende pigs, twa-faktor analyze fan variânsje wurdt útfierd;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 fergelike mei normale stretch). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 絢度n (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方帎帛刣**析，p < 0.01）. a Kwantifikaasje fan NT-ProBNP-konsintraasje yn hertplakken kweekt ûnder MT normale stretch (Norm) of overstretch (OS) betingsten (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS) fan ferskate 猪暄切䉇 幏双幏双动; ** fergelike mei normale stretching, p <0.01).histogram Kwantifikaasje fan NT-ProBNP-konsintraasjes yn hertplakken kultivearre ûnder betingsten fan normale MT-stretch (noarm) of overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) en D4 MTOS) plakjes / groep fan ferskate pigs, twa-wize analyze fan fariânsje;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 fergelike mei normale stretch). b Representative bylden foar hert plakjes kleurde mei troponin-T en WGA (lofts) en sel grutte kwantifikaasje (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sellen / groep út 10 ferskillende plakjes út ferskillende pigs, Two-tailed Student t-test wurdt fergelike mei 0; ****0 <br>1. b Representative bylden foar hert plakjes kleurde mei troponin-T en WGA (lofts) en sel grutte kwantifikaasje (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sellen / groep út 10 ferskillende plakjes út ferskillende pigs, Two-tailed Student t-test wurdt útfierd fergelike mei 0; ****001 stretch. (b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количестолениногос права) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- провохдитю ента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Representative bylden fan hert seksjes kleurde mei troponin-T en AZP (lofts) en sel grutte kwantifikaasje (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sellen / groep út 10 ferskillende seksjes út ferskillende bargen, twa-tailed Student syn t-test <wad fergelike mei 0; ****0p1 < waard útfierd nei .****0p1). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代胏n ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有鸀进行有鸀与季生比,****p < 0,0001). b Representative bylden fan hertplakken bekleurd mei calcarein-T en WGA (lofts) en selgrutte (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 fan 10 ferskate plakjes (D6 MTNorm)) Sellen/组，两方法有埾学缛 ，，两方法有埾学缛；par test４ 0 ****ed mei normaal stretching 0****ed. 1). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количестравенная (слева) n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двустороСние крита, 0,0p ****; сравнению с нормальным растяжением). b Representative bylden fan hert seksjes kleurde mei troponin-T en AZP (lofts) en kwantifikaasje fan sel grutte (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) út 10 ferskillende seksjes út ferskillende pigs) Sellen / groep, twa-tailed kritearium Student syn t;****p <0,0001 fergelike mei normale strain). c Representative bylden foar dei 0 en dei 6 MTOS hert plakjes immunolabeled foar troponin-T en NFATC4 en kwantifikaasje fan de translocation fan NFATC4 nei de kearnen fan CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes / groep út ferskillende pigs, Two-tailed Student ; * .-p test wurdt útfierd 0 . c Representative ôfbyldings foar dei 0 en dei 6 MTOS-hertplakken immunolabele foar troponin-T en NFATC4 en kwantifikaasje fan 'e translokaasje fan NFATC4 nei de kearnen fan CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes / groep fan ferskate bargen, Twa-tailed Student .5-p; c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 en 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т en NFATC4, en косней ции NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется та; *p < 0,05). c Representative bylden foar hert seksjes op 0 en 6 dagen MTOS, immunolabeled foar troponin-T en NFATC4, en kwantifikaasje fan NFATC4 translocation yn 'e kearn fan cavernous sellen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes / groep út ferskillende pigs) útfierd twa-tailed Student';*p < 0,05). c.的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟 「t ＀0*5) 。) c Representative bylden fan calcanin-T en NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS hertplakken, en NFATC4 fan ferskate NFATC4 易位至CM selkearn 的quantity化 (n = 4 (D0), 缗 鈻OS, 缗 刻 , 缇 , 缇 , 缌 缌 , 缇 , 崌尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS op 0 en 6 dagen foar иммуномаркировки тропонистином-Т en NFATC4 и коцича ции NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюю; 0;5). c Representative bylden fan MTOS hert plakjes op dei 0 en 6 foar troponin-T en NFATC4 immunolabeling en kwantifikaasje fan NFATC4 translocation yn 'e kearn fan CM út ferskillende bargen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes / groep, twa-tailed <'t -scriterion;Flaterbalken fertsjintwurdigje gemiddelde ± standertdeviaasje.
Translationeel kardiovaskulêr ûndersyk fereasket sellulêre modellen dy't de hertlike omjouwing sekuer reprodusearje.Yn dizze stúdzje waard in CTCM-apparaat ûntwikkele en karakterisearre dat ultratinne dielen fan it hert stimulearje kin.It CTCM-systeem omfettet fysiologysk syngronisearre elektromechanyske stimulearring en T3- en Dex-fluidferriking.Doe't porcine hert seksjes waarden bleatsteld oan dizze faktoaren, harren leefberens, strukturele yntegriteit, metabolic aktiviteit, en transkripsje útdrukking bleau itselde as yn farsk hert weefsel nei 12 dagen fan kultuer.Dêrnjonken kin oermjittige stretching fan hertweefsel hypertrophy fan it hert feroarsaakje troch hyperekstensje.Oer it algemien stypje dizze resultaten de krityske rol fan fysiologyske kultuerbetingsten by it behâld fan in normaal hertlik fenotype en jouwe in platfoarm foar medisynscreening.
In protte faktoaren drage by oan it kreëarjen fan in optimale omjouwing foar it funksjonearjen en oerlibjen fan cardiomyocytes.De meast foar de hân lizzende fan dizze faktoaren binne relatearre oan (1) ynterzellulêre ynteraksjes, (2) elektromechanyske stimulearring, (3) humorale faktoaren, en (4) metabolike substraten.Fysiologyske sel-nei-sel-ynteraksjes fereaskje komplekse trijediminsjonale netwurken fan meardere seltypen stipe troch in ekstrazellulêre matrix.Sokke komplekse sellulêre ynteraksjes binne lestich te rekonstruearjen yn vitro troch ko-kultuer fan yndividuele seltypen, mar kinne maklik wurde berikt mei it organotypyske karakter fan hertseksjes.
Mechanyske stretch en elektryske stimulearring fan kardiomyozyten binne kritysk foar it behâld fan kardiale fenotype33,34,35.Wylst meganyske stimulearring in protte brûkt is foar hiPSC-CM-kondysje en maturaasje, hawwe ferskate elegante stúdzjes koartlyn besocht meganyske stimulearring fan hertplakken yn kultuer mei uniaxiale laden.Dizze stúdzjes litte sjen dat 2D uniaxiale meganyske lading in posityf effekt hat op it fenotype fan it hert tidens kultuer.Yn dizze stúdzjes waarden seksjes fan it hert of laden mei isometryske trekkrêften17, lineêre auxotonic laden18, of de hertsyklus waard opnij makke mei help fan krêfttransducer feedback en spanningsdriuwen.Dizze metoaden brûke lykwols uniaxiale tissue-stretch sûnder miljeu-optimalisaasje, wat resulteart yn 'e ûnderdrukking fan in protte hertgenen as oerekspresje fan genen ferbûn mei abnormale stretch-antwurden.De hjir beskreaune CTCM leveret in 3D elektromeganyske stimulus dy't de natuerlike hertsyklus mimiket yn termen fan syklustiid en fysiologyske stretch (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, en 72 beats per minuut).Hoewol dizze trijediminsjonale meganyske stimulearring allinich net genôch is om tissue-yntegriteit te behâlden, is in kombinaasje fan humorale en meganyske stimulearring mei T3 / Dex nedich om adekwaat te behâlden weefsel leefberens, funksje en yntegriteit.
Humorale faktoaren spylje in wichtige rol by it modulearjen fan it folwoeksen hertfenotype.Dit waard markearre yn HiPS-CM-stúdzjes wêrby't T3 en Dex waarden tafoege oan kultuermedia om sel maturaasje te fersnellen.T3 kin ynfloed op it ferfier fan aminosoeren, sûkers en kalzium oer selmembranen36.Dêrnjonken befoarderet T3 MHC-α-ekspresje en MHC-β-downregulaasje, it befoarderjen fan de formaasje fan snelle twitch myofibrils yn reade cardiomyocytes yn ferliking mei stadige twitch myofibrils yn fetale CM.T3-tekoart yn hypothyroïde pasjinten resultearret yn it ferlies fan myofibrillêre bands en in fermindere taryf fan toanûntwikkeling37.Dex wurket op glukokortikoïde receptors en is oantoand om myokardiale kontraktiliteit te ferheegjen yn isolearre perfuseare herten;38 dizze ferbettering wurdt nei alle gedachten relatearre oan it effekt op kalsiumdepot-oandreaune yngong (SOCE) 39,40.Derneist bynt Dex oan har receptors, wêrtroch in brede intrazellulêre reaksje feroarsaket dy't ymmúnfunksje en ûntstekking ûnderdrukt30.
Us resultaten jouwe oan dat fysike meganyske stimulearring (MS) de algemiene kultuerprestaasjes ferbettere yn ferliking mei Ctrl, mar net slagge om leefberens, strukturele yntegriteit en hertlike ekspresje oer 12 dagen yn kultuer te behâlden.Yn ferliking mei Ctrl, tafoeging fan T3 en Dex oan CTCM (MT) kultueren ferbettere leefberens en behâlde ferlykbere transkripsjeprofilen, strukturele yntegriteit, en metabolike aktiviteit mei farsk hertweefsel foar 12 dagen.Derneist, troch it kontrolearjen fan de mjitte fan tissue-stretch, waard in hyperextension-induzearre kardiale hypertrophy-model makke mei STCM, wat de veelzijdigheid fan it STCM-systeem yllustrearret.It moat opmurken wurde dat hoewol hertferbouwing en fibrosis meastentiids yntakte organen belûke wêrfan de sirkulearjende sellen de passende cytokines kinne leverje, lykas phagocytosis en oare ferbouwingsfaktoaren, seksjes fan it hert kinne it fibrotyske proses noch imitearje yn reaksje op stress en trauma.yn myofibroblasten.Dit is earder evaluearre yn dit hertslicemodel.It moat opmurken wurde dat CTCM-parameters kinne wurde modulearre troch feroarjen fan druk / elektryske amplitude en frekwinsje om in protte betingsten te simulearjen lykas tachycardia, bradycardia, en meganyske sirkulaasje-stipe (meganysk ûntladen hert).Dit makket it systeem in medium trochfier foar drug testen.It fermogen fan CTCM om troch overexertion-induzearre kardiale hypertrophy te modellearjen makket it paad foar it testen fan dit systeem foar personaliseare terapy.Ta beslút, de hjoeddeiske stúdzje toant dat meganyske stretch en humorale stimulearring kritysk binne foar it behâld fan de kultuer fan hertweefsel seksjes.
Hoewol de hjir presintearre gegevens suggerearje dat CTCM in heul kânsryk platfoarm is foar it modelleren fan yntakt myokardium, hat dizze kultuermetoade wat beheiningen.De wichtichste beheining fan CTCM-kultuer is dat it kontinuze dynamyske meganyske spanningen op 'e plakjes opleit, dy't de mooglikheid útslút om aktyf te kontrolearjen fan hertslachkontrakten yn elke syklus.Derneist, troch de lytse grutte fan hertseksjes (7 mm), is de mooglikheid om systolike funksje bûten kultuersystemen te evaluearjen mei tradisjonele krêftsensors beheind.Yn it hjoeddeistige manuskript oerwinne wy ​​dizze beheining foar in part troch optyske spanning te evaluearjen as in yndikator fan kontraktile funksje.Dizze beheining sil lykwols fierder wurk fereaskje en kin yn 'e takomst oanpakt wurde troch metoaden yn te fieren foar optyske tafersjoch fan' e funksje fan hertplakken yn 'e kultuer, lykas optyske mapping mei help fan kalsium en spanningsgefoelige kleurstoffen.In oare beheining fan CTCM is dat it wurkmodel gjin fysiologyske stress manipulearret (preload en afterload).Yn CTCM waard druk yn tsjinoerstelde rjochtingen feroarsake om 25% fysiologyske stretch te reprodusearjen yn diastole (folsleine stretch) en systole (lingte fan kontraktearring by elektryske stimulearring) yn heul grutte weefsels.Dizze beheining moat fuortsmiten wurde yn takomstige CTCM-ûntwerpen troch adekwate druk op it hertweefsel fan beide kanten en troch it tapassen fan de krekte druk-folume relaasjes dy't foarkomme yn 'e keamers fan it hert.
De overstretch-induzearre ferbouwing rapporteare yn dit manuskript is beheind ta it mimikjen fan hypertrofyske hyperstretch-sinjalen.Sa kin dit model helpe by de stúdzje fan stretch-induzearre hypertrofyske sinjalearring sûnder de needsaak foar humorale of neurale faktoaren (dy't net yn dit systeem besteane).Fierdere ûndersiken binne nedich om de mearfâldichheid fan CTCM te fergrutsjen, bygelyks ko-kultuer mei ymmúnsellen, sirkulearjende plasma humorale faktoaren, en innervaasje by ko-kultueren mei neuronale sellen sil de mooglikheden fan syktemodellering mei CTCM ferbetterje.
Trettjin bargen waarden brûkt yn dizze stúdzje.Alle dierprosedueres waarden útfierd yn oerienstimming mei ynstitúsjonele rjochtlinen en waarden goedkard troch de Universiteit fan Louisville Ynstitúsjonele Komitee foar Animal Care and Use.De aorta-bôge waard klemd en it hert waard perfuseare mei 1 L fan sterile kardioplegie (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparine, pH oant 7.4); de herten waarden bewarre yn iiskâlde cardioplegic oplossing oant ferfierd nei it laboratoarium op iis dat is meastal <10 min. de herten waarden bewarre yn iiskâlde cardioplegic oplossing oant ferfierd nei it laboratoarium op iis dat is meastal <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10m. herten waarden bewarre yn iiskâlde cardioplegic oplossing oant ferfier nei it laboratoarium op iis, dat meastal duorret <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Hâld herten op iis cardioplegie oant ferfier nei it laboratoarium op iis, meast <10 min.
It CTCM-apparaat is ûntwikkele yn SolidWorks kompjûter-stipe ûntwerp (CAD) software.De kultuer keamers, dividers en lucht keamers binne makke fan CNC dúdlik acryl plestik.De reservering fan 7 mm yn diameter is makke fan polyetyleen mei hege tichtheid (HDPE) yn it sintrum en hat in o-ringgroef om de silikono-ring oan te passen dy't brûkt wurdt om de media derûnder te segeljen.In tinne silica membraan skiedt de kultuer keamer fan de skieding plaat.It silikonmembraan is lasersnijd fan 0,02 ″ dik silikonblêd en hat in hurdens fan 35A.De ûnderste en boppeste silikonpakkingen binne lasersnijd fan 1/16 ″ dik silikonblêd en hawwe in hurdens fan 50A.316L roestfrij stiel skroeven en wjukmoeren wurde brûkt foar it befestigjen fan it blok en it meitsjen fan in luchtdichte seal.
In tawijd printe circuit board (PCB) is ûntworpen om te yntegrearjen mei it C-PACE-EM-systeem.De Switserske masine Connector sockets op 'e PCB binne ferbûn mei grafyt elektroden troch sulver-plated koperen triedden en brûnzen 0-60 screws geschroefd yn de elektroden.It printe circuit board wurdt pleatst yn 'e omslach fan' e 3D printer.
It CTCM-apparaat wurdt regele troch in programmabele pneumatyske aktuator (PPD) dy't in kontroleare sirkulaasjedruk skept dy't fergelykber is mei in hertsyklus.As de druk yn 'e loftkeamer ferheget, wreidet it fleksibele silikonmembraan nei boppen út, en twingt it medium ûnder de weefselside.It gebiet fan weefsel sil dan útwreide wurde troch dizze ferdriuwing fan floeistof, it mimikjen fan de fysiologyske útwreiding fan it hert tidens diastole.Op it hichtepunt fan ûntspanning waard elektryske stimulearring tapast troch grafytelektroden, dy't de druk yn 'e loftkeamer fermindere en feroarsaakje fan weefselseksjes.Binnen de piip is in hemostatyske fentyl mei in druksensor om de druk yn it loftsysteem te detektearjen.De druk waarnommen troch de druksensor wurdt tapast op in gegevenssamler dy't ferbûn is mei de laptop.Dit makket it mooglik kontinu tafersjoch op de druk binnen de gas keamer.Doe't de maksimale keamerdruk waard berikt (standert 80 mmHg, 140 mmHg OS), waard it apparaat foar gegevenswinning besteld om in sinjaal te stjoeren nei it C-PACE-EM-systeem om in bifasysk spanningsinjaal foar 2 ms te generearjen, ynsteld op 4 V.
Heart-seksjes waarden krigen en kultuerbetingsten yn 6-putten waarden as folget útfierd: Ferpleatse de rispe herten fan it oerdrachtskip nei in bak mei kâld (4 ° C.) kardioplegie.De linker ventrikel waard isolearre mei in sterile blêd en snijde yn stikken fan 1-2 cm3.Dizze weefselblokken waarden fêstmakke oan weefselstipe mei weefselkleefstof en pleatst yn in vibrearjend mikrotome-weefselbad mei Tyrode's oplossing en kontinu oxygenearre (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), .010 mM lucose (0.447 g), .010 mM (DEM) .38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M oplossing), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M oplossing), oant 1 L ddH2O).It vibrearjende mikrotoom waard ynsteld om 300 µm dikke plakjes te snijen op in frekwinsje fan 80 Hz, in horizontale trillingsamplitude fan 2 mm, en in foarútgong fan 0.03 mm / s.It tissuebad waard omjûn troch iis om de oplossing koel te hâlden en de temperatuer waard hâlden op 4 ° C.Oermeitsje weefsel seksjes út de microtome bad nei in incubation bad befettet kontinu oxygenated Tyrode oplossing op iis oant genôch seksjes wurde krigen foar ien kultuer plaat.Foar transwell-kultueren waarden weefselseksjes oan sterile 6 mm brede polyurethane-stipes befette en pleatst yn 6 ml optimisearre medium (199 medium, 1x ITS-oanfolling, 10% FBS, 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml FGF-alkaline en 2X antibiotika-antifungale).Elektryske stimulearring (10 V, frekwinsje 1.2 Hz) waard tapast op de tissue-seksjes troch de C-Pace.Foar TD-betingsten waarden frisse T3 en Dex tafoege by 100 nM en 1 μM by elke mediumferoaring.It medium wurdt verzadigd mei soerstof foardat ferfanging 3 kear deis.Tissue-seksjes waarden yn in ynkubator op 37 ° C en 5% CO2 kweekt.
Foar CTCM-kultueren waarden weefselseksjes pleatst op in op maat makke 3D-printer yn in Petri-skûtel mei modifisearre Tyrode's oplossing.It apparaat is ûntworpen om de grutte fan it plak fan it hert te fergrutsjen mei 25% fan it gebiet fan 'e stipe ring.Dit wurdt dien sadat de seksjes fan it hert net strekke nei't se oerbrocht binne fan 'e oplossing fan Tyrode nei it medium en tidens diastole.Mei help fan histoacryllym waarden seksjes 300 µm dik fêstmakke op in stipering 7 mm yn diameter.Nei it befestigjen fan de weefselseksjes oan 'e stipering, snijje de oerstallige weefselseksjes ôf en pleatse de taheakke weefselseksjes werom yn it bad fan Tyrode-oplossing op iis (4 ° C) oant genôch seksjes binne taret foar ien apparaat.De totale ferwurkingstiid foar alle apparaten moat net mear as 2 oeren wêze.Nei't 6 tissue-seksjes oan har stiperingen befette waarden, waard it CTCM-apparaat gearstald.De CTCM-kultuerkeamer is foarôf ynfold mei 21 ml pre-oxygenearre medium.Oerstapje de weefselseksjes nei de kultuerkeamer en ferwiderje alle luchtbellen foarsichtich mei in pipet.De weefselseksje wurdt dan yn it gat liede en sêft op syn plak drukke.As lêste, pleatse de elektrodekap op it apparaat en oerdrage it apparaat nei de incubator.Ferbine dan de CTCM mei de loftbuis en it C-PACE-EM-systeem.De pneumatyske aktuator iepenet en de loftklep iepenet de CTCM.It C-PACE-EM-systeem is konfigureare om 4 V by 1.2 Hz te leverjen tidens bifasyske pacing foar 2 ms.It medium waard twa kear deis feroare en de elektroden waarden ien kear deis feroare om akkumulaasje fan grafyt op 'e elektroden te foarkommen.As it nedich is, kinne weefselseksjes út har kultuerputten fuortsmiten wurde om alle loftbellen dy't mooglik ûnder har fallen binne te ferdriuwen.Foar MT-behannelingsbetingsten waard T3 / Dex fris tafoege mei elke mediumferoaring mei 100 nM T3 en 1 μM Dex.De CTCM-apparaten waarden yn in ynkubator yn kultuer brocht by 37 ° C en 5% CO2.
Om útwreide trajekten fan hertplakken te krijen, waard in spesjaal kamerasysteem ûntwikkele.In SLR-kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) waard brûkt mei in Navitar Zoom 7000 18-108mm makrolens (Navitar, San Francisco, CA).Fisualisaasje waard útfierd by keamertemperatuer nei it ferfangen fan it medium mei farsk medium.De kamera is pleatst yn in hoeke fan 51 ° en fideo wurdt opnommen mei 30 frames per sekonde.Earst waard iepen boarne software (MUSCLEMOTION43) brûkt mei Image-J om de beweging fan hertplakken te kwantifisearjen.It masker is makke mei MATLAB (MathWorks, Natick, MA, FS) om regio's fan belang te definiearjen foar slaan fan hertplakken om lûd te foarkommen.Hânmjittich segmentearre maskers wurde tapast op alle ôfbyldings yn in frame folchoarder en dan trochjûn oan de MUSCLEMOTION plug-in.Muscle Motion brûkt de gemiddelde yntinsiteit fan de piksels yn elk frame om de beweging te kwantifisearjen relatyf oan it referinsjeframe.Gegevens waarden opnommen, filtere en brûkt om de syklustiid te kwantifisearjen en weefselstretch te beoardieljen tidens de hertsyklus.De opnommen fideo waard post-ferwurke mei in earste-order nul-fase digitaal filter.Om tissue stretch (peak-to-peak) te kwantifisearjen, waard peak-to-peak-analyze útfierd om ûnderskied te meitsjen tusken peaks en troughs yn it opnommen sinjaal.Derneist wurdt detrending útfierd mei in polynoom fan 6e folchoarder om sinjaaldrift te eliminearjen.Programmakoade waard ûntwikkele yn MATLAB om globale weefselbeweging, syklustiid, ûntspanningstiid en kontraktytiid te bepalen (Supplementary Program Code 44).
Foar strain-analyze, mei deselde fideo's makke foar meganyske stretch-beoardieling, trace wy earst twa ôfbyldings dy't bewegingspeaks fertsjintwurdigje (de heechste (boppeste) en leechste (legere) bewegingspunten) neffens de MUSCLEMOTION-software.Wy segmentearre dan de weefselregio's en tapaste in foarm fan skaadalgoritme oan it segmentearre weefsel (Supplementary Fig. 2a).De segmented weefsel waard dan ferdield yn tsien subsurfaces, en de stress op elk oerflak waard berekkene mei help fan de folgjende fergeliking: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, dêr't Sup en Sdown binne de ôfstannen fan 'e foarm fan' e boppeste en ûnderste skaden fan 'e stof, respektivelik (oanfoljende fig. .2b).
Heart seksjes waarden fêst yn 4% paraformaldehyde foar 48 oeren.Fêste weefsels waarden dehydratisearre yn 10% en 20% sukrose foar 1 h, dan yn 30% sukrose oernachtich.De seksjes waarden doe ynbêde yn optimale cutting temperatuer compound (OCT compound) en stadichoan beferzen yn in isopentane / droech iis bad.Bewarje OCT ynbêde blokken by -80 ° C oant skieding.Dia's waarden taret as seksjes mei in dikte fan 8 μm.
Om OCT fan hertseksjes te ferwiderjen, ferwaarmje de dia's op in ferwaarmingsblok op 95 ° C foar 5 min.Foegje 1 ml PBS ta oan elke slide en ynkubearje foar 30 minuten by keamertemperatuer, dan permeate de seksjes troch it ynstellen fan 0.1% Triton-X yn PBS foar 15 minuten by keamertemperatuer.Om foar te kommen dat net-spesifike antylders bine oan it probleem, foegje 1 ml 3% BSA-oplossing ta oan dia's en ynkubearje foar 1 oere by keamertemperatuer.De BSA waard doe fuortsmiten en de dia's waarden wosken mei PBS.Markearje elk probleem mei in potlead.Primêre antykladen (1:200 verdund yn 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) en troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) waarden tafoege oer 90 minuten, dan 200% tsjin flubodies (20000 yn 1 1). of 488 (Thermo Scientific; #A16079), tsjin rabbit Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) foar in ekstra 90 minuten Washed 3 kear mei PBS Om ûnderskied te meitsjen fan doelwyt kleuring út eftergrûn, wy brûkten allinnich de sekundêre antybody as in kontrôle. Ta beslút, DAPI waard tafoege yn in seedoarn en shieldes (Lactories) mei nagellak. -x fergrutting) en Keyence mikroskoop mei 40x fergrutting.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) by 5 μg / ml yn PBS waard brûkt foar WGA-kleuring en tapast op fêste seksjes foar 30 minuten by keamertemperatuer.De dia's waarden doe wosken mei PBS en Sudan swart waard tafoege oan elke slide en ynkubeare foar 30 minuten.De dia's waarden doe wosken mei PBS en vectashield ynbêde medium waard tafoege.Dia's waarden visualisearre op in Keyence-mikroskoop by 40x fergrutting.
OCT waard fuortsmiten fan 'e samples lykas hjirboppe beskreaun.Nei it fuortheljen fan de OCT, dompelje de dia's oernachtsje yn Bouin's oplossing.De dia's waarden dan 1 oere mei destillearre wetter wosken en dan pleatst yn in Bibrich aloë acid fuchsin oplossing foar 10 minuten.Dêrnei waarden de dia's wosken mei destillearre wetter en pleatst yn in oplossing fan 5% phosphomolybdenum / 5% phosphotungstic acid foar 10 minuten.Sûnder spoelen, oerdrage de dia's direkt yn 'e aniline blauwe oplossing foar 15 minuten.Dêrnei waarden de dia's wosken mei destillearre wetter en pleatst yn in 1% acetic acid oplossing foar 2 minuten.Slides waarden droege yn 200 N ethanol en oerbrocht nei xyleen.Stained dia's waarden fisualisearre mei help fan in Keyence mikroskoop mei in 10x objektiv.Fibrosis gebiet persintaazje waard kwantifisearre mei help fan Keyence Analyzer software.
CyQUANT ™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogus nûmer V13154, neffens it protokol fan de fabrikant mei wat oanpassings.Benammen in sjirurgyske punch mei in diameter fan 6 mm waard brûkt om unifoarme weefselgrutte te garandearjen tidens MTT-analyse.Tissues waarden yndividueel plated yn 'e putten fan in 12-well plaat mei MTT substraat neffens it protokol fan de fabrikant.De seksjes wurde ynkubeare by 37 ° C. foar 3 oeren en it libbene tissue metabolisearret it MTT-substrat om in pearse formazan-ferbining te foarmjen.Ferfange de MTT-oplossing mei 1 ml DMSO en ynkubearje by 37 ° C foar 15 minuten om pearse formazan út hertseksjes te ekstrahearjen.Samples waarden verdund 1:10 yn DMSO yn 96-goed dúdlike boaiemplaten en pearse kleurintensiteit mjitten op 570 nm mei in Cytation plaatlêzer (BioTek).Lêzingen waarden normalisearre nei it gewicht fan elke plak fan it hert.
Heart slice media waard ferfongen troch media befetsjende 1 μCi / ml [5-3H] -glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) foar glukoaze utilisaasje assay lykas earder beskreaun.Nei 4 oeren fan ynkubaasje, foegje 100 µl medium ta oan in iepen mikrosentrifugebuis mei 100 µl 0,2 N HCl.Dêrnei waard de buis pleatst yn in scintillaasjebuis mei 500 μl dH2O om [3H]2O foar 72 oeren by 37 ° C te ferdampen.Fuortsmite dan de mikrocentrifugebuis út 'e scintillaasjebuis en foegje 10 ml scintillaasjefluid ta.Scintillaasjetellingen waarden útfierd mei in Tri-Carb 2900TR floeibere scintillaasjeanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, FS).Glukoaze-gebrûk waard doe berekkene mei rekken hâldend mei [5-3H]-glucose-spesifike aktiviteit, ûnfolslein lykwicht en eftergrûn, ferwidering fan [5-3H] - oant unlabele glukoaze, en effisjinsje fan scintillaasjeteller.De gegevens wurde normalisearre nei de massa fan seksjes fan it hert.
Nei weefselhomogenisaasje yn Trizol waard RNA isolearre fan hertseksjes mei de Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 neffens it protokol fan 'e fabrikant.RNAsec bibleteek tarieding, sequencing en gegevens analyze waarden útfierd as folget:
1 μg RNA per stekproef waard brûkt as útgongsmateriaal foar de tarieding fan 'e RNA-bibleteek.Sequencing bibleteken waarden oanmakke mei help fan de NEBNext Ultra TM RNA Library Preparation Kit foar Illumina (NEB, Feriene Steaten) nei oanbefellings fan de fabrikant, en yndeks koades waarden tafoege oan de attribút sekwinsjes foar eltse stekproef.Koartsein, mRNA waard suvere út totaal RNA mei help fan magnetyske kralen taheakke mei poly-T oligonucleotides.Fragmentaasje wurdt útfierd mei divalente kationen by hege temperatuer yn NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Earste strân cDNA waard synthesized mei help fan willekeurige hexamer primers en M-MuLV reverse transkriptase (RNase H-).De twadde strân cDNA wurdt dan synthesized mei help fan DNA polymerase I en RNase H. De oerbleaune overhangs wurde omboud ta stompe einen troch exonuclease / polymerase aktiviteit.Nei adenylaasje fan it 3′-ein fan it DNA-fragmint wurdt in NEBNext Adapter mei in haarspjelde-lusstruktuer deroan hechte om it te meitsjen foar hybridisaasje.Foar seleksje fan cDNA-fragminten fan foarkommende lingte 150-200 bp.biblioteekfragminten waarden suvere mei it AMPure XP-systeem (Beckman Coulter, Beverly, FS).Dan, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) mei grutte selekteare cDNA ligearre mei in adapter waard brûkt foar 15 minuten by 37 ° C en dan foar 5 minuten by 95 ° C foar PCR.PCR waard doe útfierd mei Phusion High-Fidelity DNA-polymerase, universele PCR-primers, en Index (X) primers.Uteinlik waarden PCR-produkten suvere (AMPure XP-systeem) en biblioteekkwaliteit beoardiele op in Agilent Bioanalyzer 2100-systeem.De cDNA-bibleteek waard doe sequearre mei in Novaseq-sequencer.Raw ôfbyldingsbestannen fan Illumina waarden omboud ta rau lêzen mei CASAVA Base Calling.Raw gegevens wurde opslein yn FASTQ (fq) formaat triemmen dy't befetsje lêzen sekwinsjes en oerienkommende basis kwaliteiten.Selektearje HISAT2 om gefilterde sequencing-lêzingen te passen oan it Sscrofa11.1-referinsjegenoom.Yn 't algemien stipet HISAT2 genomen fan elke grutte, ynklusyf genomen grutter dan 4 miljard basen, en standertwearden binne ynsteld foar de measte parameters.Splicing-lêzen fan RNA Seq-gegevens kinne effisjint wurde ôfstimd mei HISAT2, it rapste systeem dat op it stuit beskikber is, mei deselde of bettere krektens as elke oare metoade.
De oerfloed fan transkripsjes wjerspegelet direkt it nivo fan gene-ekspresje.Gen-ekspresjenivo's wurde beoardiele troch de oerfloed fan transkrippen (sekwinsjetelling) assosjearre mei it genom of exons.It oantal lêzings is evenredich mei gen-ekspresje-nivo's, gen-lingte en sekwinsjedjipte.FPKM (fragminten per tûzen basispearen fan transkript sequearre per miljoen basispearen) waarden berekkene en P-wearden fan differinsjaal ekspresje waarden bepaald mei it DESeq2-pakket.Wy berekkene dan de falske ûntdekkingsrate (FDR) foar elke P-wearde mei de Benjamini-Hochberg-metoade9 basearre op de ynboude R-funksje "p.adjust".
RNA isolearre út hert seksjes waard omboud ta cDNA by in konsintraasje fan 200 ng / μl mei help fan de SuperScript IV Vilo Master mix fan Thermo (Thermo, cat. no. 11756050).Kwantitative RT-PCR waard útfierd mei help fan in Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparant reaksje plaat (Thermo, cat. No. 4483319) en microamp optyske adhesive (Thermo, cat. No. 4311971).It reaksjegemik bestie út 5 µl Taqman Fast Advanced Master-mix (Thermo, kat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer en 3,5 µl H2O mingd per put.Standert qPCR-syklusen waarden útfierd en CT-wearden waarden mjitten mei in Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR-ynstrumint (384-well module; produkt # A28135).Taqman-primers waarden kocht fan Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss8906_010m1), RGL1 (Ss8906_06001s1 (Ss8906_0601s1), mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1s waarden normalisearre fan GDH)
Media release fan NT-ProBNP waard beoardiele mei help fan de NT-ProBNP kit (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) neffens de fabrikant syn protokol.Koartsein, 250 µl fan elke stekproef en standert waard yn duplikaat tafoege oan elke put.Fuort nei it tafoegjen fan it monster, foegje 50 µl Assay Reagens A ta oan elke put.Foarsichtich skodzje de plaat en ôfslute mei sealant.Dêrnei waarden de tabletten 1 oere by 37 ° C ynkubeare.Aspirearje dan de oplossing en waskje de putten 4 kear mei 350 µl fan 1X waskoplossing, en ynkubearje de waskoplossing foar 1-2 minuten elke kear.Foegje dan 100 µl Assay Reagens B per put ta en fersegelje mei plaatsealant.De tablet waard sêft skodde en ynkubeare by 37 ° C foar 30 minuten.Aspirearje de oplossing en waskje de putten 5 kear mei 350 µl fan 1X waskoplossing.Foegje 90 µl substraatoplossing oan elke put en fersegelje de plaat.Inkubearje de plaat op 37 ° C foar 10-20 minuten.Foegje 50 µl stopoplossing ta oan elke put.De plaat waard fuortendaliks mjitten mei in Cytation (BioTek) plaatlêzer set op 450 nm.
Machtanalyses waarden útfierd om de groepsgrutte te kiezen dy't> 80% macht sille leverje om in 10% absolute feroaring yn 'e parameter te detektearjen mei in 5% Type I flaterrate. Machtanalyses waarden útfierd om de groepsgrutte te kiezen dy't> 80% macht sille leverje om in 10% absolute feroaring yn 'e parameter te detektearjen mei in 5% Type I flaterrate. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат> 80% мощности foar баружения 10% тра с 5% частотой ошибок типа I. Power-analyze waard útfierd om groepgrutte te selektearjen dy't > 80% macht soene leverje om 10% absolute parameterferoaring te detektearjen mei in 5% Type I flaterrate.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄嚰嚄嚏进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄嚰嚄嚏 Был проведен анализ мощности foar выбора размера группы, который обеспечил бы 80% мощности для обнаружения параметров и 5% частоты ошибок типа I. In krêftanalyse waard útfierd om in groepgrutte te selektearjen dy't> 80% macht soe leverje om 10% absolute parameterferoaring en 5% type I flaterrate te detektearjen.Tissue seksjes waarden willekeurich selektearre foar it eksperimint.Alle analyzes wiene tastân blyn en samples waarden dekodearre pas neidat alle gegevens waarden analysearre.GraphPad Prism software (San Diego, CA) waard brûkt om alle statistyske analyzes út te fieren. Foar alle statistiken waarden p-wearden signifikant beskôge by wearden <0.05. Foar alle statistiken waarden p-wearden as signifikant beskôge by wearden <0,05. Для всей статистики <0,05. Foar alle statistiken waarden p-wearden as signifikant beskôge by wearden <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики <0,05. Foar alle statistiken waarden p-wearden as signifikant beskôge by wearden <0,05.Twa-tailed Student's t-test waard útfierd op 'e gegevens mei allinich 2 fergelikingen.Ien- of twa-wei ANOVA waard brûkt om betsjutting te bepalen tusken meardere groepen.By it útfieren fan post-hoc-tests waard Tukey's korreksje tapast om meardere fergelikingen te rekkenjen.RNAsec gegevens hat spesjale statistyske ôfwagings by it berekkenjen fan FDR en p.adjust sa't beskreaun yn de metoaden seksje.
Foar mear ynformaasje oer stúdzjeûntwerp, sjoch it Nature Research Report abstract keppele oan dit artikel.