Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining riede wy jo oan om in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
Der is in needsaak foar in betrouber in vitro-systeem dat de fysiologyske omjouwing fan it hert foar medisyntests sekuer reprodusearje kin. De beheinde beskikberens fan minsklike hertweefselkultuersystemen hat laat ta ûnkrekte ynterpretaasjes fan kardiale medisyneffekten. Hjir hawwe wy in kardiale weefselkultuermodel (CTCM) ûntwikkele dat elektromechanysk hertplakjes stimulearret en fysiologyske stretch ûndergiet tidens de systolyske en diastolyske fazen fan 'e hertsyklus. Nei 12 dagen fan kultivaasje ferbettere dizze oanpak de leefberens fan hertseksjes foar in part, mar bewarre har strukturele yntegriteit net folslein. Dêrom fûnen wy nei screening fan lytse molekulen dat de tafoeging fan 100 nM triiodothyronine (T3) en 1 μM dexamethason (Dex) oan ús medium de mikrostruktuer fan 'e seksjes 12 dagen lang behâlde. Yn kombinaasje mei T3/Dex-behanneling behâlde it CTCM-systeem transkripsjonele profilen, leefberens, metabolike aktiviteit en strukturele yntegriteit op itselde nivo as farsk hertweefsel foar 12 dagen. Derneist feroarsaket oermjittich útrekken fan hertweefsel yn kultuer hypertrofyske hertsinjalearring, wat bewiis leveret foar it fermogen fan CTCM om hypertrofyske omstannichheden feroarsake troch hertútsjen nei te bootsen. Konklúzjend kin CTCM de fysiology en patofysiology fan it hert yn kultuer oer lange perioaden modellearje, wêrtroch betroubere medisynscreening mooglik is.
Foarôfgeand oan klinysk ûndersyk binne betroubere in vitro-systemen nedich dy't de fysiologyske omjouwing fan it minsklik hert sekuer reprodusearje kinne. Sokke systemen moatte feroare meganyske stretch, hertslach en elektrofysiologyske eigenskippen neidwaan. Diermodellen wurde faak brûkt as in screeningsplatfoarm foar kardiale fysiology mei beheinde betrouberens yn it reflektearjen fan 'e effekten fan medisinen yn it minsklik hert1,2. Uteinlik is it Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) in model dat heul gefoelich en spesifyk is foar ferskate terapeutyske en farmakologyske yntervinsjes, en de fysiology en patofysiology fan it minsklik hert3 sekuer reproduseart. De ôfwêzigens fan sa'n systeem beheint de ûntdekking fan nije behannelingen foar hertfalen4,5 en hat laat ta kardiotoksisiteit fan medisinen as in wichtige reden foar it ferlitten fan 'e merk6.
Yn 'e ôfrûne tsien jier binne acht net-kardiovaskulêre medisinen út klinysk gebrûk helle, om't se ferlinging fan it QT-ynterval feroarsaakje, wat liedt ta ventrikulêre aritmieën en hommelse dea7. Dêrom is der in tanimmende needsaak foar betroubere preklinyske screeningstrategyen om kardiovaskulêre effektiviteit en toksisiteit te beoardieljen. It resinte gebrûk fan minsklik-induzearre pluripotente stamsel-ôflaatte kardiomyocyten (hiPS-CM) yn medisynscreening en toksisiteitstests biedt in dielde oplossing foar dit probleem. De ûnrype aard fan hiPS-CM's en it gebrek oan mearsellulêre kompleksiteit fan hertweefsel binne lykwols wichtige beheiningen fan dizze metoade. Resinte stúdzjes hawwe oantoand dat dizze beheining foar in part oerwûn wurde kin troch iere hiPS-CM te brûken om hertweefselhydrogels te foarmjen koart nei it begjin fan spontane kontraksjes en de elektryske stimulearring stadichoan te ferheegjen yn 'e rin fan' e tiid. Dizze hiPS-CM-mikroweefsels misse lykwols de folwoeksen elektrofysiologyske en kontraktile eigenskippen fan it folwoeksen myokard. Derneist hat minsklik hertweefsel in kompleksere struktuer, besteande út in heterogene miks fan ferskate seltypen, ynklusyf endotheelzellen, neuronen en stromale fibroblasten, dy't mei-inoar ferbûn binne troch spesifike sets ekstrasellulêre matrixproteinen. Dizze heterogeniteit fan net-kardiomyocytpopulaasjes11,12,13 yn it hert fan in folwoeksen sûchdier is in wichtige barriêre foar it modellearjen fan hertweefsel mei yndividuele seltypen. Dizze wichtige beheiningen beklamje it belang fan it ûntwikkeljen fan metoaden foar it kultivearjen fan yntakt myokardweefsel ûnder fysiologyske en patologyske omstannichheden.
Kultivearre tinne (300 µm) seksjes fan it minsklik hert hawwe bliken dien in beloftefol model te wêzen fan yntakt minsklik myokardium. Dizze metoade jout tagong ta in folslein 3D mearsellulêr systeem fergelykber mei minsklik hertweefsel. Oant 2019 wie it gebrûk fan kultivearre hertseksjes lykwols beheind troch de koarte (24 oeren) kultueroerlibjen. Dit komt troch in oantal faktoaren, ynklusyf it gebrek oan fysyk-meganyske stretch, de loft-floeistof-ynterface, en it gebrûk fan ienfâldige media dy't net foldogge oan 'e behoeften fan hertweefsel. Yn 2019 hawwe ferskate ûndersyksgroepen oantoand dat it opnimmen fan meganyske faktoaren yn hertweefselkultuersystemen de kultuerlibbensduur kin ferlingje, de hertekspresje ferbetterje en hertpatology neimeitsje kin. Twa elegante stúdzjes 17 en 18 litte sjen dat uniaxiale meganyske lading in posityf effekt hat op it hertfenotype tidens kultuer. Dizze stúdzjes brûkten lykwols net de dynamyske trijediminsjonale fysyk-meganyske lading fan 'e hertsyklus, om't hertseksjes waarden laden mei isometryske trekkrêften 17 of lineêre auxotonyske lading 18. Dizze metoaden foar weefselútrekken resultearren yn 'e ûnderdrukking fan in protte hertgenen of de oerekspresje fan genen dy't ferbûn binne mei abnormale útrekreaksjes. Benammen Pitoulis et al. 19 ûntwikkelen in dynamysk hertsplakkweekbad foar hertsyklusrekonstruksje mei help fan krêfttransducerfeedback en spanningsdriuwen. Hoewol dit systeem in krekter in vitro hertsyklusmodellering mooglik makket, beheine de kompleksiteit en lege trochfier fan 'e metoade de tapassing fan dit systeem. Us laboratoarium hat koartlyn in ferienfâldige kweeksysteem ûntwikkele mei elektryske stimulearring en in optimalisearre medium om de leefberens fan seksjes fan bargen- en minsklik hertweefsel oant 6 dagen te behâlden 20,21.
Yn it hjoeddeiske manuskript beskriuwe wy in kardiale weefselkultuermodel (CTCM) mei gebrûk fan seksjes fan it bargehert dat humorale sinjalen omfettet om trijediminsjonale kardiale fysiology en patofysiologyske útwreiding tidens de kardiale syklus te rekapitulearjen. Dizze CTCM kin de krektens fan preklinyske medisynfoarsizzing ferheegje nei in nivo dat noch nea earder berikt is troch in kosteneffektyf, mid-throughput kardiale systeem te leverjen dat de fysiology/patofysiology fan it sûchdierhert neimakket foar preklinyske medisyntests.
Hemodynamyske meganyske sinjalen spylje in krúsjale rol by it behâlden fan kardiomyocytfunksje yn vitro 22,23,24. Yn it hjoeddeiske manuskript hawwe wy in CTCM ûntwikkele (figuer 1a) dy't de folwoeksen hertomjouwing kin neidwaan troch sawol elektryske as meganyske stimulearring te indusearjen by fysiologyske frekwinsjes (1.2 Hz, 72 slagen per minuut). Om oermjittige weefselútrekking tidens diastole te foarkommen, waard in 3D-printapparaat brûkt om de weefselgrutte mei 25% te fergrutsjen (figuer 1b). Elektryske pacing indusearre troch it C-PACE-systeem waard timed om 100 ms foar systole te begjinnen mei in gegevensakwisysjesysteem om de hertsyklus folslein te reprodusearjen. It weefselkultuersysteem brûkt in programmeerbere pneumatyske aktuator (LB Engineering, Dútslân) om in fleksibel silikonmembraan syklysk út te wreidzjen om útwreiding fan 'e hertskiven yn' e boppeste keamer te feroarsaakjen. It systeem wie ferbûn mei in eksterne loftlieding fia in druktransducer, wêrtroch it mooglik wie om de druk (± 1 mmHg) en tiid (± 1 ms) sekuer oan te passen (figuer 1c).
a Befestigje de weefselseksje oan 'e 7 mm stipering, werjûn yn blau, yn 'e kultuerkeamer fan it apparaat. De kultuerkeamer wurdt skieden fan 'e loftkeamer troch in tin fleksibel silikonmembraan. Plak in pakking tusken elke keamer om lekken te foarkommen. It deksel fan it apparaat befettet grafytelektroden dy't elektryske stimulearring leverje. b Skematyske werjefte fan it grutte weefselapparaat, liedingring en stipering. De weefselseksjes (brún) wurde op it grutte apparaat pleatst mei de liedingring pleatst yn 'e groef oan' e bûtenste râne fan it apparaat. Plak mei help fan 'e lieding foarsichtich de stipering bedekt mei weefselakryllijm oer de seksje hertweefsel. c Grafyk dy't de tiid fan elektryske stimulearring sjen lit as funksje fan loftkeamerdruk regele troch in programmeerbere pneumatyske aktuator (PPD). In gegevensakwisysje-apparaat waard brûkt om elektryske stimulearring te syngronisearjen mei druksensors. As de druk yn 'e kultuerkeamer de ynstelde drompel berikt, wurdt in pulssignaal nei de C-PACE-EM stjoerd om elektryske stimulearring te triggerjen. d Ofbylding fan fjouwer CTCM's pleatst op in ynkubatorplank. Fjouwer apparaten binne ferbûn mei ien PPD fia in pneumatyske sirkwy, en druksensors wurde ynfoege yn 'e hemostatyske klep om de druk yn it pneumatyske sirkwy te kontrolearjen. Elk apparaat befettet seis weefselseksjes.
Mei ien pneumatyske aktuator koene wy ​​4 CTCM-apparaten kontrolearje, dy't elk 6 weefselseksjes befetsje koene (Fig. 1d). Yn CTCM wurdt de loftdruk yn 'e loftkeamer omset yn syngroane druk yn' e floeistofkeamer en feroarsaket fysiologyske útwreiding fan 'e hertsplak (Ofbylding 2a en Oanfoljende Film 1). Evaluaasje fan weefselútrekking by 80 mm Hg. Art. liet in úttrekking fan weefselseksjes mei 25% sjen (Fig. 2b). Dit persintaazje úttrekking is oantoand te oerienkommen mei in fysiologyske sarkomeerlingte fan 2,2-2,3 µm foar normale kontraktiliteit fan 'e hertseksje17,19,25. Weefselbeweging waard beoardiele mei oanpaste kamera-ynstellingen (Oanfoljende Figuer 1). De amplitude en snelheid fan weefselbeweging (Fig. 2c, d) oerienkomme mei úttrekking tidens de hertsyklus en tiid tidens systole en diastole (Fig. 2b). Úttrekking en snelheid fan hertweefsel tidens kontraksje en ûntspanning bleauwen 12 dagen konstant yn kultuer (Fig. 2f). Om it effekt fan elektryske stimulearring op kontraktiliteit tidens kultuer te evaluearjen, hawwe wy in metoade ûntwikkele foar it bepalen fan aktive deformiteit mei in skaadalgoritme (Oanfoljende Fig. 2a,b) en koenen wy ûnderskied meitsje tusken deformiteiten mei en sûnder elektryske stimulearring. Itselde diel fan it hert (Fig. 2f). Yn it beweechbere gebiet fan 'e snede (R6-9) wie de spanning tidens elektryske stimulearring 20% ​​heger as yn 'e ôfwêzigens fan elektryske stimulearring, wat de bydrage fan elektryske stimulearring oan 'e kontraktiliteitsfunksje oanjout.
Represintative spoaren fan loftkeamerdruk, floeistofkeamerdruk en weefselbewegingsmjittingen befêstigje dat keamerdruk de floeistofkeamerdruk feroaret, wêrtroch in oerienkommende beweging fan 'e weefselplak feroarsake wurdt. b Represintative spoaren fan persintaazje útrekking (blau) fan weefselseksjes dy't oerienkomme mei persintaazje útrekking (oranje). c De mjitten beweging fan 'e hertplak komt oerien mei de mjitten bewegingssnelheid. (d) Represintative trajekten fan sykliske beweging (blauwe line) en snelheid (oranje stippele line) yn in plak fan it hert. e Kwantifikaasje fan syklustiid (n = 19 plakken per groep, fan ferskate bargen), kontraksjetiid (n = 19 plakken per groep), ûntspanningstiid (n = 19 plakken per groep, fan ferskate bargen), weefselbeweging (n = 25). plakken)/groep fan ferskate bargen), pyk systolyske snelheid (n = 24(D0), 25(D12) plakken/groep fan ferskate bargen) en pyk ûntspanningssnelheid (n=24(D0), 25(D12) plakken/groep fan ferskate bargen). Twasidige Student's t-test liet gjin signifikant ferskil sjen yn ien fan 'e parameters. f Represintative spanningsanalysespoaren fan weefselseksjes mei (read) en sûnder (blauwe) elektryske stimulearring, tsien regionale gebieten fan weefselseksjes út deselde seksje. De ûnderste panielen litte de kwantifikaasje sjen fan it persintaazje ferskil yn spanning yn weefselseksjes mei en sûnder elektryske stimulearring yn tsien gebieten út ferskate seksjes. (n = 8 plakjes/groep fan ferskate bargen, twasidige Student t-test wurdt útfierd; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 plakjes/groep fan ferskate bargen, twasidige Student t-test wurdt útfierd; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 kritearia / sûchdieren fan racing, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, **p<0,01,01,5). (n = 8 seksjes/groep fan ferskate bargen, twasidige Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 kritearia/gear, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seksjes/groep, fan ferskate bargen, twasidige Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Foutbalken fertsjintwurdigje it gemiddelde ± standertôfwiking.
Yn ús foarige statyske biomimetyske hertsplakjekultuersysteem [20, 21] hawwe wy de leefberens, funksje en strukturele yntegriteit fan hertsplakjes 6 dagen lang behâlden troch elektryske stimulearring ta te passen en de mediumkomposysje te optimalisearjen. Nei 10 dagen sakken dizze sifers lykwols skerp. Wy sille ferwize nei seksjes dy't kultivearre binne yn ús foarige statyske biomimetyske kultuersysteem 20, 21 kontrôlebetingsten (Ctrl) en wy sille ús earder optimalisearre medium brûke as MC-betingsten en kultuer ûnder simultane meganyske en elektryske stimulearring (CTCM). neamd . Earst hawwe wy bepaald dat meganyske stimulearring sûnder elektryske stimulearring net genôch wie om weefselleefberens 6 dagen te behâlden (Oanfoljende Fig. 3a, b). Nijsgjirrich is dat mei de ynfiering fan fysio-mechanyske en elektryske stimulearring mei STCM, de leefberens fan 12-dagen hertseksjes itselde bleau as yn farske hertseksjes ûnder MS-betingsten, mar net ûnder Ctrl-betingsten, lykas te sjen is troch MTT-analyze (Fig. 1). 3a). Dit suggerearret dat meganyske stimulearring en simulaasje fan 'e hertsyklus weefselseksjes twa kear sa lang libbensfetber kinne hâlde as rapportearre yn ús foarige statyske kultuersysteem. Beoardieling fan 'e strukturele yntegriteit fan weefselseksjes troch immunolabeling fan kardiale troponine T en connexine 43 liet lykwols sjen dat connexine 43-ekspresje signifikant heger wie yn MC-weefsels op dei 12 as yn kontrôles op deselde dei. Uniforme connexine 43-ekspresje en Z-skiiffoarming waarden lykwols net folslein hanthavene (Fig. 3b). Wy brûke in keunstmjittige yntelliginsje (KI) ramt om de strukturele yntegriteit fan weefsel te kwantifisearjen26, in ôfbyldingsbasearre djippe learpipeline basearre op troponine-T en connexine-kleuring43 om automatysk de strukturele yntegriteit en fluoreszinsje fan hertplakjes te kwantifisearjen yn termen fan sterkte fan lokalisaasje. Dizze metoade brûkt in Convolutional Neural Network (CNN) en in djip learramt om de strukturele yntegriteit fan kardiale weefsel betrouber te kwantifisearjen op in automatisearre en ûnpartidige manier, lykas beskreaun yn 'e referinsje.26. MC-weefsel liet ferbettere strukturele oerienkomst sjen mei dei 0 yn ferliking mei statyske kontrôleseksjes. Derneist liet Masson's trichrome-kleuring in signifikant leger persintaazje fibrose sjen ûnder MS-omstannichheden yn ferliking mei kontrôleomstannichheden op dei 12 fan kultuer (Fig. 3c). Wylst CTCM de leefberens fan hertweefselseksjes op dei 12 ferhege nei in nivo fergelykber mei dat fan fars hertweefsel, ferbettere it de strukturele yntegriteit fan 'e hertseksjes net signifikant.
In staafdiagram lit kwantifikaasje sjen fan 'e MTT-libbensfetberens fan farske hertplakjes (D0) of hertplakjeskultuer foar 12 dagen, of yn statyske kultuer (D12 Ctrl) of yn CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plakjes/groep fan ferskate bargen, ien manier ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en **p < 0.01 yn ferliking mei D12 Ctrl). In staafdiagram lit kwantifikaasje sjen fan 'e MTT-libbensfetberens fan farske hertplakjes (D0) of hertplakjeskultuer foar 12 dagen, of yn statyske kultuer (D12 Ctrl) of yn CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plakjes/groep fan ferskate bargen, ien manier wêrop de ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en **p < 0.01 yn ferliking mei D12 Ctrl).it histogram lit de kwantifikaasje sjen fan 'e leefberens fan MTT farske hertseksjes (D0) of kultuer fan hertseksjes foar 12 dagen yn statyske kultuer (D12-kontrôle) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrôle). ) ), 12 (D12 MC) seksjes/groep fan ferskate bargen, in ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en **p < 0.01 yn ferliking mei D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组卌 切片/绑卌AN，进测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，#####p < 0.0001D，Ctrl相比，**p.)histogram dat de kwantifikaasje fan MTT-libbensfetberens sjen lit yn farske hertseksjes (D0) of hertseksjes dy't 12 dagen kultivearre binne yn statyske kultuer (D12-kontrôle) of CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrôle)), 12 (D12 MC) seksjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test;####p < 0,0001 op D12 Ctrl). ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0, **p < 0.01 yn ferliking mei D12 Ctrl).b Troponine-T (grien), connexine 43 (read) en DAPI (blau) yn farsk isolearre hertseksjes (D0) of hertseksjes kultivearre ûnder statyske omstannichheden (Ctrl) of CTCM-omstannichheden (MC) foar 12 dagen) fan represintative immunofluoreszinsjeôfbyldings (blanke skaal = 100 µm). Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan hertweefsel mei keunstmjittige yntelliginsje (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep elk fan ferskillende bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl). Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan hertweefsel mei keunstmjittige yntelliginsje (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep elk fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 сD), пгов (D12 сD), пов (D12 сD), пов (D12 сD), от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan hertweefsel troch keunstmjittige yntelliginsje (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksjes/groepen fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test útfierd; ####p < 0.0001 vs. mei D0 en ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices/groep elk fan ferskillende pig, ien-wize ANOVA test <10#0;## 与0#0p;相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plakjes/groep elk fan ferskillende pigs, ien-wize ANO#.#0p <0##0p;与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D5D 2), 7 (D5D12), MC срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. Ctrl). Keunstmjittige yntelliginsje om de strukturele yntegriteit fan hertweefsel te kwantifisearjen (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksjes/groep elk fan ferskillende bargen, ienwegs ANOVA-test; ####p<0.0001 vs .D0 Foar ferliking ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl). c Represintative ôfbyldings (lofts) en kwantifikaasje (rjochts) foar hertplakjes kleurd mei Masson's trichrome-kleuring (Skala bleat = 500 µm) (n = 10 plakjes/groep elk fan ferskillende bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en ***p < 0.001 yn ferliking mei D12 Ctrl). c Represintative ôfbyldings (lofts) en kwantifikaasje (rjochts) foar hertplakjes kleurd mei Masson's trichrome-kleuring (Skaal bleat = 500 µm) (n = 10 plakjes/groep elk fan ferskillende bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; #### p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en ***p < 0.001 yn ferliking mei D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) en количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трисмихром (maksimaal registraasje = 500 mkm) (n = 10 krusen/sjinsten fan rjuchtfeardichheden, wachttiid op 0,00 n0;#0; сравнению с D0 en ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Represintative ôfbyldings (lofts) en kwantifikaasje (rjochts) fan hertseksjes kleurd mei Masson's trichrome-kleuring (ûnbeklaaide skaal = 500 µm) (n = 10 seksjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test útfierd; #### p < 0 .0001 yn ferliking mei D0 en ***p < 0.001 yn ferliking mei D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=尺）（裸=尺庼11 Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庰 裸壸庣 庰裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单嵑 单向##nova 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) en количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трисмихром (чистая шкала = 500 mkm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощогруппа дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Represintative ôfbyldings (lofts) en kwantifikaasje (rjochts) fan hertseksjes kleurd mei Masson's trichrome-kleuring (blank = 500 µm) (n = 10 seksjes/groep, elk fan in oar baarch, test troch ienwegs fariânsjeanalyse; ### # p < 0.0001 yn ferliking mei D0, ***p < 0.001 yn ferliking mei D12 Ctrl).Foutbalken fertsjintwurdigje it gemiddelde ± standertôfwiking.
Wy hawwe de hypoteze opsteld dat troch it tafoegjen fan lytse molekulen oan it kweekmedium, de yntegriteit fan kardiomyocyten ferbettere wurde koe en de ûntwikkeling fan fibrose fermindere wurde koe tidens CTCM-kweek. Wy hawwe dêrom screene op lytse molekulen mei ús statyske kontrôlekultueren20,21 fanwegen it lytse oantal betiizjende faktoaren. Dexamethason (Dex), triiodothyronine (T3), en SB431542 (SB) waarden keazen foar dizze screening. Dizze lytse molekulen binne earder brûkt yn hiPSC-CM-kultueren om de ryping fan kardiomyocyten te indusearjen troch de sarkomeerlingte, T-tubuli en geliedingssnelheid te fergrutsjen. Derneist is bekend dat sawol Dex (in glukokortikoïde) as SB ûntstekking ûnderdrukke29,30. Dêrom hawwe wy testen oft de opname fan ien of in kombinaasje fan dizze lytse molekulen de strukturele yntegriteit fan hertseksjes soe ferbetterje. Foar de earste screening waard de doasis fan elke ferbining selektearre op basis fan 'e konsintraasjes dy't gewoanlik brûkt wurde yn selkultuermodellen (1 μM Dex27, 100 nM T327, en 2,5 μM SB31). Nei 12 dagen fan kultivaasje resultearre de kombinaasje fan T3 en Dex yn optimale strukturele yntegriteit fan kardiomyocyten en minimale fezelfoarmige remodeling (Oanfoljende figueren 4 en 5). Derneist produsearre it gebrûk fan dûbele of dûbele dizze konsintraasjes fan T3 en Dex skealike effekten yn ferliking mei normale konsintraasjes (Oanfoljende figuer 6a, b).
Nei de earste screening hawwe wy in direkte ferliking útfierd fan 4 kultueromstannichheden (Ofbylding 4a): Ctrl: hertseksjes kultivearre yn ús earder beskreaune statyske kultuer mei ús optimalisearre medium; 20.21 TD: T3 en Ctrl s hawwe Dex tafoege op woansdei; MC: hertseksjes kultivearre yn CTCM mei ús earder optimalisearre medium; en MT: CTCM mei T3 en Dex tafoege oan it medium. Nei 12 dagen kultivaasje bleau de leefberens fan MS- en MT-weefsels itselde as yn farske weefsels beoardiele troch MTT-assay (Ofbylding 4b). Nijsgjirrich is dat de tafoeging fan T3 en Dex oan transwell-kultueren (TD) net resultearre yn in wichtige ferbettering fan leefberens yn ferliking mei Ctrl-omstannichheden, wat in wichtige rol fan meganyske stimulearring by it behâld fan 'e leefberens fan hertseksjes oanjout.
In eksperiminteel ûntwerpdiagram dat de fjouwer kultueromstannichheden werjout dy't brûkt waarden om de effekten fan meganyske stimulearring en T3/Dex-supplementaasje op medium foar 12 dagen te evaluearjen. b Staafdiagram lit kwantifikaasje sjen fan leefberens 12 dagen nei kultuer yn alle 4 kultueromstannichheden (Ctrl, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hertplakjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) plakjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 yn ferliking mei D0 en **p < 0.01 yn ferliking mei D12 Ctrl). b Staafdiagram lit kwantifikaasje sjen fan leefberens 12 dagen nei kultuer yn alle 4 kultueromstannichheden (Ctrl, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hertplakjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), 12 (D12 MC) plakjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 yn ferliking mei D0 en **p < 0.01 yn ferliking mei D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивированих культивирования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD), MC 12 TD, en D12) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнени; с D0 en **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b De staafdiagram lit de kwantifikaasje fan leefberens sjen 12 dagen nei kultuer yn alle 4 kultueromstannichheden (kontrôle, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hertseksjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, en D12 MT), 12 (D12 MC) seksjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 en **p < 0.01 yn ferliking mei D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (150)、12150、D (TD)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##p < 0.0001，##相比，**p < 0.01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC en MT) по сравнению со свежезими (D) = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA <0, ##0п.#0p; сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram dat alle 4 kultueromstannichheden (kontrôle, TD, MC en MT) sjen lit yn ferliking mei farske hertseksjes (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD en D12 MT), fan ferskate bargen 12 (D12 MC) seksjes/groep, ienwegs ANOVA-test; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. kontrôle D12). c Staafdiagram lit de kwantifikaasje fan glukoseflux 12 dagen nei kultuer sjen yn alle 4 kultueromstannichheden (Ctrl, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hertplakjes (D0) (n = 6 plakjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ###p < 0.001, yn ferliking mei D0 en ***p < 0.001 yn ferliking mei D12 Ctrl). c Staafdiagram lit de kwantifikaasje fan glukoseflux 12 dagen nei kultuer sjen yn alle 4 kultueromstannichheden (Ctrl, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hertplakjes (D0) (n = 6 plakjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ###p < 0.001, yn ferliking mei D0 en ***p < 0.001 yn ferliking mei D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис во 4 во 4 культивирования (контроль, TD, MC en MT) foar сравнению mei свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групзиот сердца односторонний Выполняется тест ANOVA; c Histogram lit kwantifikaasje sjen fan glukoseflux 12 dagen nei kultuer ûnder alle 4 kultueromstannichheden (kontrôle, TD, MC en MT) yn ferliking mei farske hertseksjes (D0) (n = 6 seksjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test útfierd; ###p < 0.001 yn ferliking mei D0 en ***p < 0.001 yn ferliking mei D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹兔弌吐12，吐天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0，D < 0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切缇 片 切培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис 4для культивированис культивирования (контроль, TD, MC en MT) foar сравнению mei свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групрапа, срезов, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram dat kwantifikaasje fan glukoseflux sjen lit 12 dagen nei kultuer foar alle 4 kultueromstannichheden (kontrôle, TD, MC, en MT) yn ferliking mei farske hertseksjes (D0) (n = 6 seksjes/groep, fan ferskate bargen, unilateraal wêr't ANOVA-tests waarden útfierd, ###p < 0.001 yn ferliking mei D0, ***p < 0.001 yn ferliking mei D12 (kontrôle).d Stammanalyseplots fan farske (blau), dei 12 MC (grien), en dei 12 MT (read) weefsels op tsien regionale weefselseksjepunten (n = 4 plakjes/groep, ienwegs ANOVA-test; der wie gjin signifikant ferskil tusken groepen). e Fulkaanplot dy't ferskillend útdrukte genen sjen lit yn farske hertseksjes (D0) yn ferliking mei hertseksjes dy't kultivearre binne ûnder statyske omstannichheden (Ctrl) of ûnder MT-omstannichheden (MT) foar 10-12 dagen. f Waarmtekaart fan sarkomeergenen foar hertseksjes dy't kultivearre binne ûnder elk fan 'e kultueromstannichheden. Foutbalken fertsjintwurdigje it gemiddelde ± standertôfwiking.
Metabolyske ôfhinklikens fan 'e oerskeakeling fan fetsoeroksidaasje nei glykolyse is in kenteken fan kardiomyocytdedifferinsjaasje. Unrype kardiomyocyten brûke primêr glukoaze foar ATP-produksje en hawwe hypoplastyske mitochondria mei in pear cristae5,32. Glukoazegebrûksanalyses lieten sjen dat ûnder MC- en MT-omstannichheden it glukoazegebrûk fergelykber wie mei dat yn weefsels fan dei 0 (figuer 4c). Ctrl-samples lieten lykwols in wichtige tanimming fan glukoazegebrûk sjen yn ferliking mei farsk weefsel. Dit jout oan dat de kombinaasje fan CTCM en T3/Dex de leefberens fan weefsel ferbetteret en it metabolike fenotype fan 12-dagen kultivearre hertseksjes behâldt. Derneist liet strainanalyse sjen dat strainnivo's itselde bleaunen as yn farsk hertweefsel foar 12 dagen ûnder MT- en MS-omstannichheden (figuer 4d).
Om de algemiene ynfloed fan CTCM en T3/Dex op it wrâldwide transkripsjonele lânskip fan hertweefsel te analysearjen, hawwe wy RNAseq útfierd op hertweefsels ûnder alle fjouwer ferskillende kultueromstannichheden (Oanfoljende gegevens 1). Nijsgjirrich is dat MT-seksjes in hege transkripsjonele oerienkomst lieten sjen mei farsk hertweefsel, mei mar 16 ferskillend útdrukt fan 13.642 genen. Lykas wy earder oantoand hawwe, lieten Ctrl-seksjes lykwols 1229 ferskillend útdrukte genen sjen nei 10-12 dagen yn kultuer (Fig. 4e). Dizze gegevens waarden befêstige troch qRT-PCR fan hert- en fibroblastgenen (Oanfoljende fig. 7a-c). Nijsgjirrich is dat de Ctrl-seksjes delregeling fan hert- en selsyklusgenen en aktivearring fan inflammatoire genprogramma's lieten sjen. Dizze gegevens suggerearje dat dedifferinsjaasje, dy't normaal foarkomt nei lange-termyn kultivaasje, folslein ferswakke is ûnder MT-omstannichheden (Oanfoljende fig. 8a,b). Soarchfâldige stúdzje fan sarkomeergenen liet sjen dat allinich ûnder MT-omstannichheden de genen dy't kodearje foar it sarkomeer (Fig. 4f) en ionkanaal (Oanfoljende Fig. 9) bewarre bliuwe, wêrtroch't se beskerme wurde tsjin ûnderdrukking ûnder Ctrl-, TD- en MC-omstannichheden. Dizze gegevens litte sjen dat mei in kombinaasje fan meganyske en humorale stimulearring (T3/Dex) it transkriptoom fan 'e hertplak nei 12 dagen yn kultuer fergelykber bliuwe kin mei farske hertplakken.
Dizze transkripsjonele befiningen wurde stipe troch it feit dat de strukturele yntegriteit fan kardiomyocyten yn hertseksjes it bêste bewarre wurdt ûnder MT-omstannichheden foar 12 dagen, lykas te sjen is troch yntakt en lokalisearre connexin 43 (Fig. 5a). Derneist wie fibrose yn hertseksjes ûnder MT-omstannichheden signifikant fermindere yn ferliking mei Ctrl en fergelykber mei farske hertseksjes (Fig. 5b). Dizze gegevens litte sjen dat de kombinaasje fan meganyske stimulearring en T3/Dex-behanneling de hertstruktuer yn hertseksjes yn kultuer effektyf behâldt.
in Represintative immunofluoreszinsjeôfbyldings fan troponine-T (grien), connexine 43 (read), en DAPI (blau) yn farsk isolearre hertseksjes (D0) of 12 dagen kultivearre yn alle fjouwer hertseksjekultueromstannichheden (skaalbalke = 100 µm). Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan it hertweefsel mei keunstmjittige yntelliginsje (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) plakjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en *p < 0.05, of ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl). Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan it hertweefsel mei keunstmjittige yntelliginsje (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) plakjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; #### p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en *p < 0.05, of ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl). (Dûbele yntellektuele struktueren dy't yn 'e ynterface (n = 7 (D12, Ctrl), n = 7 (D12, Ctrl) MC en D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan hertweefsel mei help fan keunstmjittige yntelliginsje (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) seksjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test útfierd; #### p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en *p < 0.05 of ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD, D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 帒*p < 0.0001 与D0 帒*p <0.0*p <0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 t12 mc） ， mc 廒人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p ****p < 0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比).Kwantifikaasje fan 'e strukturele yntegriteit fan hertweefsel mei help fan keunstmjittige yntelliginsje yn ferskate bargen (n = 7 (D0 en D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC en D12 MT) seksjes/groep) mei in ienwegs ANOVA-test;#### p < 0,0001 mei D0 en *p < 0,05 of ****p < 0,0001 mei D12 Ctrl). #### p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en *p < 0.05 of ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl). b Represintative ôfbyldings en kwantifikaasje foar hertplakjes kleurd mei Masson's trichrome-kleuring (Skaalbalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, en D12 MC), 9 (D12 MT) plakjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en ***p < 0.001, of ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl). b Represintative ôfbyldings en kwantifikaasje foar hertplakjes kleurd mei Masson's trichrome-kleuring (Skaalbalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, en D12 MC), 9 (D12 MT) plakjes/groep fan ferskate bargen, ienwegs ANOVA-test wurdt útfierd; ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0 en ***p < 0.001, of ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красимаслем линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выдонсолня ANOVA; ####p < 0,0001 op D0 en ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 op D12 Ctrl). b Represintative ôfbyldings en kwantifikaasje fan hertseksjes kleurd mei Masson's trichrome-kleuring (skaalbalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) seksjes/groep fan ferskate bargen, útfierd ienwegs ANOVA; ####p < 0.0001 vs. D0 en ***p < 0.001 of ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（D）㼁1（10（n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方垞###p#0.与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µn = 0（n 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；1.0###相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массаная = массона 5 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; #пою000 с D0, ***p < 0,001 of ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Represintative ôfbyldings en kwantifikaasje fan hertseksjes kleurd mei Masson's trichrome (skaalbalke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD en D12 MC), 9 (D12 MT) seksjes fan ferskate bargen/groep, ien ANOVA-metoade; ####p < 0.0001 yn ferliking mei D0, ***p < 0.001 of ****p < 0.0001 yn ferliking mei D12 Ctrl).Foutbalken fertsjintwurdigje it gemiddelde ± standertôfwiking.
Uteinlik waard it fermogen fan CTCM om hertlike hypertrofy nei te bootsen beoardiele troch it fergrutsjen fan 'e útrek fan hertweefsel. Yn CTCM naam de peakluchtkeamerdruk ta fan 80 mmHg nei 80 mmHg. Art. (normale útrek) oant 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Dit komt oerien mei in ferheging fan 32% yn útrek (Fig. 6b), wat earder werjûn waard as it oerienkommende persintaazje útrek dat nedich is foar hertseksjes om in sarkomeerlingte te berikken dy't fergelykber is mei dy sjoen yn hypertrofy. Útrek en snelheid fan hertweefsel tidens kontraksje en ûntspanning bleauwen konstant tidens seis dagen fan kultuer (Fig. 6c). Hertweefsel út MT-omstannichheden waard seis dagen ûnderwurpen oan normale útrek (MT (Normaal)) of oerútrek-omstannichheden (MT (OS)). Al nei fjouwer dagen yn kultuer wie de hypertrofyske biomarker NT-ProBNP signifikant ferhege yn it medium ûnder MT (OS)-omstannichheden yn ferliking mei MT (normale) omstannichheden (Fig. 7a). Derneist, nei seis dagen kultivaasje, naam de selgrutte yn MT (OS) (Fig. 7b) signifikant ta yn ferliking mei seksjes fan MT-hert (normaal). Derneist wie NFATC4-nukleêre translokaasje signifikant tanommen yn oerstrekke weefsels (Fig. 7c). Dizze resultaten litte de progressive ûntwikkeling sjen fan patologyske remodeling nei hyperdistensje en stypje it konsept dat it CTCM-apparaat brûkt wurde kin as in platfoarm om stretch-induzearre herthypertrofysignalisaasje te bestudearjen.
Represintative spoaren fan loftkeamerdruk, floeistofkeamerdruk en weefselbewegingsmjittingen befêstigje dat keamerdruk de floeistofkeamerdruk feroaret, wêrtroch in oerienkommende beweging fan 'e weefselplak feroarsake wurdt. b Represintative rekpersintaazje- en reksnelheidskurven foar normaal útrekte (oranje) en oerútrekte (blauwe) weefselseksjes. c Staafdiagram dat syklustiid toant (n = 19 plakjes per groep, fan ferskate bargen), kontraksjetiid (n = 18-19 plakjes per groep, fan ferskate bargen), ûntspanningstiid (n = 19 plakjes per groep, fan ferskate bargen)), amplitude fan weefselbeweging (n = 14 plakjes/groep, fan ferskate bargen), pyk systolyske snelheid (n = 14 plakjes/groep, fan ferskate bargen) en pyk ûntspanningssnelheid (n = 14 (D0), 15 (D6)) seksjes/groepen) fan ferskate bargen), twasidige Student's t-test liet gjin signifikant ferskil sjen yn ien fan 'e parameters, wat oanjout dat dizze parameters konstant bleaunen tidens 6 dagen fan kultuer mei oerspanning. Foutbalken fertsjintwurdigje it gemiddelde ± standertôfwiking.
in staafdiagramkwantifikaasje fan NT-ProBNP-konsintraasje yn kultuermedia fan hertplakjes kultivearre ûnder MT normale stretch (Norm) of oerstretching (OS) omstannichheden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4 MTOS) plakjes/groep fan ferskate bargen, twa-wei ANOVA wurdt útfierd; **p < 0.01 yn ferliking mei normale stretch). In staafdiagramkwantifikaasje fan NT-ProBNP-konsintraasje yn kultuermedia fan hertplakjes kultivearre ûnder MT normale stretch (Norm) of oerstretching (OS) omstannichheden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4 MTOS) plakjes/groep fan ferskate bargen, Two-way ANOVA wurdt útfierd; **p < 0.01 yn ferliking mei normale stretch).Kwantitative histogram fan NT-ProBNP-konsintraasje yn kultuermedium fan hertplakjes kultivearre ûnder omstannichheden fan normale MT-úitrekking (norm) of oerúitrekking (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, en D4).MTOS) plakjes /groep fan ferskate bargen, twa-faktor-fariânsjeanalyse wurdt útfierd;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 yn ferliking mei normale stretch). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01）. a Kwantifikaasje fan NT-ProBNP-konsintraasje yn hertplakken kweekt ûnder MT normale stretch (Norm) of overstretch (OS) betingsten (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS) fan ferskate猪的切片/组，可以双向方方发发动 **fergelike mei normale stretching, p <0.01).histogram Kwantifikaasje fan NT-ProBNP-konsintraasjes yn hertplakjes kultivearre ûnder omstannichheden fan normale MT-úitrekking (norm) of oerúitrekking (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) en D4 MTOS) plakjes/groep fan ferskate bargen, twa-wei fariânsjeanalyse;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 yn ferliking mei normale stretch). b Represintative ôfbyldings foar hertplakjes kleurd mei troponine-T en WGA (lofts) en selgrutte-kwantifikaasje (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sellen/groep fan 10 ferskillende plakjes fan ferskillende bargen, twasidige Student t-test wurdt útfierd; ****p < 0.0001 yn ferliking mei normale útrekking). b Represintative ôfbyldings foar hertplakjes kleurd mei troponine-T en WGA (lofts) en selgrutte-kwantifikaasje (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sellen/groep fan 10 ferskillende plakjes fan ferskillende bargen, twasidige Student t-test wurdt útfierd; ****p < 0.0001 yn ferliking mei normale útrekking). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т en АЗП (слева) en количестолениногого клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, двх- t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Represintative ôfbyldings fan hertseksjes kleurd mei troponine-T en AZP (lofts) en selgrutte kwantifikaasje (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sellen/groep fan 10 ferskillende seksjes fan ferskillende bargen, twasidige Student's t-test waard útfierd; ****p < 0.0001 yn ferliking mei normale stamme). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性 3（n MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甌检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）. b Represintative ôfbyldings fan hertplakjes kleurd mei calcareïne-T en WGA (lofts) en selgrutte (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 fan 10 ferskillende plakjes (D6 MTNorm)) Sellen/floeistof, standert analyze fan sellen t-test; fergelike mei normaal útrekken, ****p < 0.0001). a (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, дверусторонид; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Represintative ôfbyldings fan hertseksjes kleurd mei troponine-T en AZP (lofts) en kwantifikaasje fan selgrutte (rjochts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) fan 10 ferskillende seksjes fan ferskillende bargen) Sellen/groep, twasidich kritearium Student's t; ****p < 0.0001 yn ferliking mei normale stamme). c Represintative ôfbyldings foar dei 0 en dei 6 MTOS-hertplakjes immunolabele foar troponine-T en NFATC4 en kwantifikaasje fan 'e translokaasje fan NFATC4 nei de kearnen fan CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes/groep fan ferskate bargen, twasidige Student t-test wurdt útfierd; *p < 0.05). c Represintative ôfbyldings foar dei 0 en dei 6 MTOS-hertplakjes immunolabele foar troponine-T en NFATC4 en kwantifikaasje fan 'e translokaasje fan NFATC4 nei de kearnen fan CM's (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes/groep fan ferskate bargen, twasidige Student t-test wurdt útfierd; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 en 6 дней MTOS, иммуномеченых foar тропонина-Т en NFATC4, en ковости транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиняней , выпус t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Represintative ôfbyldings foar hertseksjes op 0 en 6 dagen MTOS, immunolabele foar troponine-T en NFATC4, en kwantifikaasje fan NFATC4-translokaasje yn 'e kearn fan kaverne sellen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes/groep fan ferskillende bargen) útfierde twasidige Student's t-test; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量匀3D) =、4（n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Representative bylden fan calcanin-T en NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS hertplakken, en NFATC4 fan ferskate NFATC4 易位至CM selkearnquantiteit化 (n = 4 (D0), 缤 刻 , 缇 , 焇 , 缇 , 焇 , 缇时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS op 0 en 6 dagen foar иммуномаркировки тропонинстином-Т en NFATC4 и коцич транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критеритер, 0); c Represintative ôfbyldings fan MTOS-hertplakjes op dei 0 en 6 foar troponine-T en NFATC4-immunolabeling en kwantifikaasje fan NFATC4-translokaasje yn 'e kearn fan CM fan ferskate bargen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plakjes/groep, twasidich t-kriterium Student's; *p < 0.05).Foutbalken fertsjintwurdigje gemiddelde ± standertôfwiking.
Translasjoneel kardiovaskulêr ûndersyk fereasket sellulêre modellen dy't de hertomjouwing sekuer reprodusearje. Yn dizze stúdzje waard in CTCM-apparaat ûntwikkele en karakterisearre dat ultratinne seksjes fan it hert kin stimulearje. It CTCM-systeem omfettet fysiologysk syngronisearre elektromechanyske stimulearring en T3- en Dex-floeistofferriking. Doe't hertseksjes fan bargen oan dizze faktoaren bleatsteld waarden, bleaune har leefberens, strukturele yntegriteit, metabolike aktiviteit en transkripsjonele ekspresje itselde as yn farsk hertweefsel nei 12 dagen kultuer. Derneist kin oermjittich útrekken fan hertweefsel hypertrofy fan it hert feroarsaakje feroarsake troch hyperekstinsje. Oer it algemien stypje dizze resultaten de krityske rol fan fysiologyske kultueromstannichheden by it behâld fan in normaal hertfenotype en leverje se in platfoarm foar medisynscreening.
In protte faktoaren drage by oan it skeppen fan in optimale omjouwing foar it funksjonearjen en oerlibjen fan kardiomyocyten. De meast foar de hân lizzende fan dizze faktoaren binne relatearre oan (1) yntersellulêre ynteraksjes, (2) elektromechanyske stimulearring, (3) humorale faktoaren, en (4) metabolike substraten. Fysiologyske sel-nei-sel-ynteraksjes fereaskje komplekse trijediminsjonale netwurken fan meardere seltypen dy't stipe wurde troch in ekstrasellulêre matrix. Sokke komplekse sellulêre ynteraksjes binne lestich yn vitro te rekonstruearjen troch ko-kultuer fan yndividuele seltypen, mar kinne maklik berikt wurde mei de organotypyske aard fan hertseksjes.
Mechanyske stretch en elektryske stimulearring fan kardiomyocyten binne kritysk foar it behâld fan it kardiale fenotype33,34,35. Wylst meganyske stimulearring in soad brûkt is foar hiPSC-CM-kondysjonearring en ryping, hawwe ferskate elegante stúdzjes koartlyn besocht meganyske stimulearring fan hertplakjes yn kultuer te dwaan mei uniaxiale lading. Dizze stúdzjes litte sjen dat 2D uniaxiale meganyske lading in posityf effekt hat op it fenotype fan it hert tidens kultuer. Yn dizze stúdzjes waarden seksjes fan it hert of laden mei isometryske trekkrêften17, lineêre auxotonyske lading18, of waard de kardiale syklus opnij makke mei krêfttransducerfeedback en spanningsdriuwen. Dizze metoaden brûke lykwols uniaxiale weefselstretch sûnder miljeu-optimalisaasje, wat resulteart yn 'e ûnderdrukking fan in protte kardiale genen of oerekspresje fan genen dy't ferbûn binne mei abnormale stretchreaksjes. De hjir beskreaun CTCM leveret in 3D elektromechanyske stimulus dy't de natuerlike kardiale syklus neimakket yn termen fan syklustiid en fysiologyske stretch (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, en 72 slagen per minuut). Hoewol dizze trijediminsjonale meganyske stimulearring allinnich net genôch is om de yntegriteit fan weefsel te behâlden, is in kombinaasje fan humorale en meganyske stimulearring mei T3/Dex nedich om de leefberens, funksje en yntegriteit fan weefsel adekwaat te behâlden.
Humorale faktoaren spylje in wichtige rol by it modulearjen fan it fenotype fan it folwoeksen hert. Dit waard markearre yn HiPS-CM-stúdzjes wêryn T3 en Dex waarden tafoege oan kultuermedia om selmaturaasje te fersnellen. T3 kin ynfloed hawwe op it transport fan aminosoeren, sûkers en kalsium oer selmembranen36. Derneist befoarderet T3 MHC-α-ekspresje en MHC-β-downregulation, wêrtroch't de foarming fan snelle myofibrillen yn folwoeksen kardiomyocyten befoardere wurdt yn ferliking mei stadige myofibrillen yn fetale CM. T3-tekoart by hypothyroïde-pasjinten resulteart yn it ferlies fan myofibrillêre bannen en in fermindere taryf fan tonusûntwikkeling37. Dex wurket op glukokortikoïde-receptors en it is oantoand dat it de myokardiale kontraktiliteit fergruttet yn isolearre perfusearre herten;38 dizze ferbettering wurdt tocht te wêzen relatearre oan it effekt op kalsiumôfsettings-oandreaune yngong (SOCE)39,40. Derneist bindt Dex oan syn receptors, wêrtroch't in brede yntrasellulêre reaksje feroarsake wurdt dy't ymmúnfunksje en ûntstekking ûnderdrukt30.
Us resultaten jouwe oan dat fysike meganyske stimulearring (MS) de algemiene kultuerprestaasjes ferbettere yn ferliking mei Ctrl, mar der net yn slagge om de leefberens, strukturele yntegriteit en kardiale ekspresje oer 12 dagen yn kultuer te behâlden. Yn ferliking mei Ctrl ferbettere de tafoeging fan T3 en Dex oan CTCM (MT) kultueren de leefberens en behâlde ferlykbere transkripsjeprofilen, strukturele yntegriteit en metabolike aktiviteit mei farsk hertweefsel foar 12 dagen. Derneist waard, troch it kontrolearjen fan 'e mjitte fan weefselútrekking, in hyperekstinsje-induzearre kardiale hypertrofymodel makke mei STCM, wat de alsidichheid fan it STCM-systeem yllustrearret. It moat opmurken wurde dat hoewol kardiale remodeling en fibrose meastentiids yntakte organen omfetsje wêrfan de sirkulearjende sellen de passende cytokines kinne leverje, lykas fagocytose en oare remodelingfaktoaren, seksjes fan it hert noch altyd it fibrotyske proses kinne imitearje yn reaksje op stress en trauma yn myofibroblasten. Dit is earder evaluearre yn dit kardiale slicemodel. It moat opmurken wurde dat CTCM-parameters modulearre wurde kinne troch druk/elektryske amplitude en frekwinsje te feroarjen om in protte omstannichheden te simulearjen lykas tachykardie, bradykardie en meganyske sirkulaasjestipe (meganysk ûntladen hert). Dit makket it systeem in middelgrutte trochfier foar it testen fan medisinen. It fermogen fan CTCM om troch oerspanning feroarsake herthypertrofy te modellearjen makket de wei frij foar it testen fan dit systeem foar personaliseare terapy. Konklúzjend lit de hjoeddeiske stúdzje sjen dat meganyske stretching en humorale stimulearring krúsjaal binne foar it behâld fan 'e kultuer fan hertweefselseksjes.
Hoewol't de hjir presintearre gegevens suggerearje dat CTCM in tige beloftefol platfoarm is foar it modellearjen fan yntakt myokard, hat dizze kultuermetoade wat beheiningen. De wichtichste beheining fan CTCM-kultuer is dat it trochgeande dynamyske meganyske stress op 'e plakjes opleit, wat de mooglikheid útslút om aktyf hertplakkontraksjes te kontrolearjen tidens elke syklus. Derneist is, fanwegen de lytse grutte fan hertseksjes (7 mm), de mooglikheid om systolyske funksje bûten kultuersystemen te evaluearjen mei tradisjonele krêftsensors beheind. Yn it hjoeddeiske manuskript hawwe wy dizze beheining foar in part oerwûn troch optyske spanning te evaluearjen as in yndikator fan kontraktile funksje. Dizze beheining sil lykwols fierder wurk fereaskje en kin yn 'e takomst oanpakt wurde troch metoaden yn te fieren foar optyske monitoring fan 'e funksje fan hertplakjes yn kultuer, lykas optyske mapping mei kalsium en spanningsgefoelige kleurstoffen. In oare beheining fan CTCM is dat it wurkmodel gjin fysiologyske stress manipulearret (foarbelêsting en neibelêsting). Yn CTCM waard druk yn tsjinoerstelde rjochtingen ynducearre om 25% fysiologyske stretch yn diastole (folsleine stretch) en systole (lingte fan kontraktile tidens elektryske stimulearring) te reprodusearjen yn tige grutte weefsels. Dizze beheining moat yn takomstige CTCM-ûntwerpen fuorthelle wurde troch foldwaande druk op it hertweefsel fan beide kanten en troch it tapassen fan 'e krekte druk-folume-relaasjes dy't foarkomme yn 'e keamers fan it hert.
De troch oerstrekking feroarsake remodeling dy't yn dit manuskript rapportearre wurdt, is beheind ta it neimakken fan hypertrofyske hyperstreksignalen. Sa kin dit model helpe by de stúdzje fan troch strekking feroarsake hypertrofyske sinjalearring sûnder de needsaak foar humorale of neurale faktoaren (dy't net besteane yn dit systeem). Fierdere stúdzjes binne nedich om de multiplisiteit fan CTCM te fergrutsjen, bygelyks it ko-kultivearjen mei ymmúnsellen, sirkulearjende plasma-humorale faktoaren, en ynnervaasje as ko-kultivearjen mei neuronale sellen de mooglikheden foar syktemodellering mei CTCM sil ferbetterje.
Trettjin bargen waarden brûkt yn dizze stúdzje. Alle bistprosedueres waarden útfierd neffens ynstitúsjonele rjochtlinen en waarden goedkard troch de Universiteit fan Louisville Institutional Animal Care and Use Committee. De aortabôge waard ôfklemd en it hert waard perfusearre mei 1 L sterile kardioplegie (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparine, pH oant 7.4); de herten waarden bewarre yn iiskâlde kardioplegyske oplossing oant se op iis nei it laboratoarium ferfierd waarden, wat meastal <10 minuten duorret. de herten waarden bewarre yn iiskâlde kardioplegyske oplossing oant se op iis nei it laboratoarium ferfierd waarden, wat meastal <10 minuten duorret. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10m. herten waarden opslein yn iiskâlde kardioplegyske oplossing oant se op iis nei it laboratoarium ferfierd waarden, wat meastentiids <10 minuten duorret.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Hâld herten op iis kardioplegie oant ferfier nei it laboratoarium op iis, meastal <10 min.
It CTCM-apparaat is ûntwikkele yn SolidWorks kompjûter-stipe ûntwerp (CAD) software. De kultuerkeamers, skieders en loftkeamers binne makke fan CNC dúdlik akryl plestik. De stipering mei in diameter fan 7 mm is makke fan hege tichtens polyetyleen (HDPE) yn it sintrum en hat in o-ringgroef om de silikon o-ring te ûnderbringen dy't brûkt wurdt om de media derûnder ôf te sluten. In tinne silika membraan skiedt de kultuerkeamer fan 'e skiedingsplaat. It silikon membraan is lasersnien út 0,02″ dik silikon plaat en hat in hurdens fan 35A. De ûnderste en boppeste silikon pakkingen binne lasersnien út 1/16″ dik silikon plaat en hawwe in hurdens fan 50A. 316L roestfrij stielen skroeven en wjukmoeren wurde brûkt foar it befestigjen fan it blok en it meitsjen fan in luchtdichte ôfsluting.
In spesjale printplaat (PCB) is ûntworpen om te yntegrearjen mei it C-PACE-EM-systeem. De Switserske masine-ferbiningssockets op 'e PCB binne ferbûn mei grafytelektroden troch sulveren koperen triedden en brûnzen 0-60-skroeven dy't yn 'e elektroden skroefd binne. De printplaat wurdt yn 'e omslach fan' e 3D-printer pleatst.
It CTCM-apparaat wurdt bestjoerd troch in programmearbere pneumatyske aktuator (PPD) dy't in kontroleare sirkulaasjedruk makket dy't fergelykber is mei in hertsyklus. As de druk yn 'e loftkeamer tanimt, wreidet it fleksibele silikonmembraan him nei boppen út, wêrtroch't it medium ûnder it weefselplak twongen wurdt. It weefselgebiet sil dan útrekt wurde troch dizze útstjit fan floeistof, wat de fysiologyske útwreiding fan it hert tidens diastole neimakket. Op it hichtepunt fan ûntspanning waard elektryske stimulearring tapast fia grafytelektroden, wat de druk yn 'e loftkeamer fermindere en krimp fan weefselseksjes feroarsake. Binnen de piip sit in hemostatyske klep mei in druksensor om de druk yn it loftsysteem te detektearjen. De druk dy't troch de druksensor waarnommen wurdt, wurdt tapast op in gegevenskollektor dy't ferbûn is mei de laptop. Dit makket trochgeande kontrôle fan 'e druk yn' e gaskeamer mooglik. Doe't de maksimale keamerdruk berikt waard (standert 80 mmHg, 140 mmHg OS), waard it gegevensakwisysjeapparaat opdracht jûn om in sinjaal nei it C-PACE-EM-systeem te stjoeren om in twafasig spanningssignaal te generearjen foar 2 ms, ynsteld op 4 V.
Hertseksjes waarden nommen en de kweekomstannichheden yn 6 putten waarden as folget útfierd: De rispe herten waarden oerdroegen fan it oerdrachtfet nei in bakje mei kâlde (4°C) kardioplegie. De linker ventrikel waard isolearre mei in sterile mes en yn stikken fan 1-2 cm3 snien. Dizze weefselblokken waarden mei weefsellijm oan weefselstipe befestige en yn in triljend mikrotoomweefselbad pleatst mei Tyrode's oplossing en kontinu soerstof krigen (3 g/L 2,3-butaandionmonooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M oplossing), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M oplossing), oant 1 L ddH2O). De vibrerende mikrotoom waard ynsteld om plakjes fan 300 µm dik te snijen mei in frekwinsje fan 80 Hz, in horizontale vibraasje-amplitude fan 2 mm, en in foarútgongssnelheid fan 0,03 mm/s. It weefselbad waard omjûn troch iis om de oplossing koel te hâlden en de temperatuer waard op 4 °C hâlden. Oerdrage weefselseksjes fan it mikrotoombad nei in ynkubaasjebad mei kontinu soerstofrike Tyrode-oplossing op iis oant genôch seksjes krigen binne foar ien kultuerplaat. Foar transwell-kultueren waarden weefselseksjes befestige oan sterile 6 mm brede polyurethaan-stipepunten en pleatst yn 6 ml optimalisearre medium (199 medium, 1x ITS-supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalysk en 2X antibiotika-antifungal). Elektryske stimulearring (10 V, frekwinsje 1,2 Hz) waard tapast op 'e weefselseksjes fia de C-Pace. Foar TD-omstannichheden waarden farske T3 en Dex tafoege mei 100 nM en 1 μM by elke mediumwikseling. It medium wurdt 3 kear deis mei soerstof verzadigd foardat it ferfongen wurdt. Weefselseksjes waarden kultivearre yn in ynkubator by 37 °C en 5% CO2.
Foar CTCM-kultueren waarden weefselseksjes pleatst op in oanpaste 3D-printer yn in petriskûtel mei modifisearre Tyrode-oplossing. It apparaat is ûntworpen om de grutte fan 'e plak fan it hert te fergrutsjen mei 25% fan it oerflak fan' e stipering. Dit wurdt dien sadat de seksjes fan it hert net útrekke nei't se oerdroegen binne fan Tyrode-oplossing nei it medium en tidens diastole. Mei histoacryllijm waarden seksjes fan 300 µm dik fêstmakke op in stipering fan 7 mm yn diameter. Nei it befestigjen fan 'e weefselseksjes oan' e stipering, snij de oerstallige weefselseksjes ôf en pleats de befestige weefselseksjes werom yn it bad mei Tyrode-oplossing op iis (4 °C) oant genôch seksjes taret binne foar ien apparaat. De totale ferwurkingstiid foar alle apparaten moat net mear as 2 oeren duorje. Nei't 6 weefselseksjes oan har stiperingen befestige wiene, waard it CTCM-apparaat gearstald. De CTCM-kultuerkeamer is foarôf fol mei 21 ml foarsoerstofryk medium. Oerdrage de weefselseksjes nei de kultuerkeamer en ferwiderje foarsichtich alle loftbellen mei in pipette. De weefselseksje wurdt dan yn it gat laat en sêft op syn plak drukt. Plak úteinlik de elektrodekap op it apparaat en bring it apparaat oer nei de ynkubator. Ferbine dan de CTCM mei de loftslange en it C-PACE-EM-systeem. De pneumatyske aktuator iepenet en de loftklep iepenet de CTCM. It C-PACE-EM-systeem wie konfigurearre om 4 V te leverjen by 1,2 Hz tidens bifasyske pacing foar 2 ms. It medium waard twa kear deis feroare en de elektroden waarden ien kear deis feroare om ophoping fan grafyt op 'e elektroden te foarkommen. As it nedich is, kinne weefselseksjes út har kweekputten helle wurde om alle loftbellen dy't derûnder fallen binne te ferdriuwen. Foar MT-behannelingsomstannichheden waard T3/Dex fris tafoege by elke mediumwikseling mei 100 nM T3 en 1 μM Dex. De CTCM-apparaten waarden kultivearre yn in ynkubator by 37 °C en 5% CO2.
Om útrekte trajekten fan hertstikken te krijen, waard in spesjaal kamerasysteem ûntwikkele. In SLR-kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) waard brûkt mei in Navitar Zoom 7000 18-108mm makrolens (Navitar, San Francisco, CA). Fisualisaasje waard útfierd by keamertemperatuer nei it ferfangen fan it medium troch fars medium. De kamera wurdt pleatst ûnder in hoeke fan 51° en fideo wurdt opnommen mei 30 frames per sekonde. Earst waard iepen boarne software (MUSCLEMOTION43) brûkt mei Image-J om de beweging fan hertstikken te kwantifisearjen. It masker waard makke mei MATLAB (MathWorks, Natick, MA, FS) om regio's fan belang te definiearjen foar kloppende hertstikken om rûs te foarkommen. Manuell segmintearre maskers wurde tapast op alle ôfbyldings yn in framesekwinsje en dan trochjûn oan de MUSCLEMOTION plug-in. Muscle Motion brûkt de gemiddelde yntensiteit fan 'e piksels yn elk frame om de beweging relatyf oan it referinsjeframe te kwantifisearjen. Gegevens waarden opnommen, filtere en brûkt om syklustiid te kwantifisearjen en weefselútrek te beoardieljen tidens de hertsyklus. De opnommen fideo waard neiferwurke mei in earste-oarder nulfase digitale filter. Om weefselútrekking te kwantifisearjen (peak-to-peak), waard peak-to-peak-analyze útfierd om ûnderskied te meitsjen tusken pieken en dalen yn it opnommen sinjaal. Derneist wurdt detrending útfierd mei in 6e-oarder polynoom om sinjaaldrift te eliminearjen. Programmakoade waard ûntwikkele yn MATLAB om globale weefselbeweging, syklustiid, ûntspanningstiid en kontraksjetiid te bepalen (Supplementary Program Code 44).
Foar spanningsanalyse hawwe wy, mei deselde fideo's dy't makke binne foar meganyske stretchbeoardieling, earst twa ôfbyldings tekene dy't bewegingspiken fertsjintwurdigje (de heechste (boppeste) en leechste (legste) bewegingspunten) neffens de MUSCLEMOTION-software. Wy hawwe doe de weefselregio's segmentearre en in foarm fan skaadalgoritme tapast op it segmentearre weefsel (Oanfoljende Fig. 2a). It segmentearre weefsel waard doe ferdield yn tsien ûnderflakken, en de spanning op elk oerflak waard berekkene mei de folgjende fergeliking: Spanning = (Sup-Sdown)/Sdown, wêrby't Sup en Sdown de ôfstannen fan 'e foarm fan' e boppeste en ûnderste skaden fan 'e stof binne, respektivelik (Oanfoljende Fig. .2b).
Hertseksjes waarden 48 oeren fêstmakke yn 4% paraformaldehyde. Fêstmakke weefsels waarden 1 oere dehydratisearre yn 10% en 20% sukrose, en dêrnei oernachtich yn 30% sukrose. De seksjes waarden doe ynbêde yn in optimale snijtemperatuerferbining (OCT-ferbining) en stadichoan beferzen yn in isopentaan/droech iisbad. Bewarje OCT-ynbêdingsblokken by -80 °C oant se skieden wurde. De objektglaasjes waarden taret as seksjes mei in dikte fan 8 μm.
Om OCT út hertseksjes te ferwiderjen, ferwaarmje de objektglaasjes 5 minuten op in ferwaarmingsblok by 95 °C. Foegje 1 ml PBS ta oan elke objektglaasje en ynkubearje 30 minuten by keamertemperatuer, en permeearje dan de seksjes troch 0,1% Triton-X 15 minuten by keamertemperatuer yn PBS te setten. Om te foarkommen dat net-spesifike antistoffen oan it stekproef bine, foegje 1 ml fan 3% BSA-oplossing ta oan de objektglaasjes en ynkubearje 1 oere by keamertemperatuer. De BSA waard doe fuorthelle en de objektglaasjes waarden wosken mei PBS. Markearje elk stekproef mei in potlead. Primêre antistoffen (ferdunde 1:200 yn 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) en troponine-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) waarden tafoege oer 90 minuten, doe sekundêre antistoffen (ferdunde 1:200 yn 1% BSA) tsjin mûs Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), tsjin knine Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) foar noch 90 minuten. 3 kear wosken mei PBS. Om doelkleuring te ûnderskieden fan 'e eftergrûn, hawwe wy allinich it sekundêre antistof as kontrôle brûkt. Uteinlik waard DAPI-nukleêre kleuring tafoege en waarden de objektglaasjes yn in vectashield (Vector Laboratories) pleatst en fersegele mei nagellak. (-x fergrutting) en Keyence-mikroskoop mei 40x fergrutting.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) mei 5 μg/ml yn PBS waard brûkt foar WGA-kleuring en 30 minuten by keamertemperatuer op fêste seksjes oanbrocht. De objektglaasjes waarden doe wosken mei PBS en Sudan-swart waard oan elke objektglaasje tafoege en 30 minuten ynkubearre. De objektglaasjes waarden doe wosken mei PBS en Vectashield-ynbêdingsmedium waard tafoege. De objektglaasjes waarden visualisearre op in Keyence-mikroskoop mei 40x fergrutting.
OCT waard út 'e samples helle lykas hjirboppe beskreaun. Nei it fuortheljen fan 'e OCT, wurde de objektglaasjes in nacht yn 'e oplossing fan Bouin ûnderdompele. De objektglaasjes waarden doe 1 oere mei destillearre wetter spield en doe 10 minuten yn in Bibrich-aloësoerfuchsine-oplossing pleatst. Dêrnei waarden de objektglaasjes wosken mei destillearre wetter en 10 minuten yn in oplossing fan 5% fosfomolybdeen/5% fosfowolfraamsoer pleatst. Sûnder te spieljen, wurde de objektglaasjes 15 minuten direkt yn 'e anilineblauwe oplossing oerbrocht. Dêrnei waarden de objektglaasjes wosken mei destillearre wetter en 2 minuten yn in 1% azijnsoer-oplossing pleatst. De objektglaasjes waarden droege yn 200 N ethanol en oerbrocht nei xyleen. Kleurde objektglaasjes waarden fisualisearre mei in Keyence-mikroskoop mei in 10x objektiv. It persintaazje fibrose-gebiet waard kwantifisearre mei de Keyence Analyzer-software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogusnûmer V13154, neffens it protokol fan 'e fabrikant mei wat oanpassingen. Yn it bysûnder waard in sjirurgyske pons mei in diameter fan 6 mm brûkt om in unifoarme weefselgrutte te garandearjen tidens MTT-analyze. Weefsels waarden yndividueel yn 'e putten fan in 12-putsplaat mei MTT-substraat pleatst neffens it protokol fan 'e fabrikant. De seksjes wurde 3 oeren by 37 °C ynkubearre en it libbene weefsel metabolisearret it MTT-substraat om in pearse formazanferbining te foarmjen. Ferfang de MTT-oplossing mei 1 ml DMSO en ynkubearje by 37 °C foar 15 minuten om pearse formazan út hertseksjes te ekstrahearjen. Monsters waarden 1:10 ferdund yn DMSO yn 96-puts dúdlike boaiemplaten en de pearse kleurintensiteit waard metten by 570 nm mei in Cytation-plaatlêzer (BioTek). De mjittingen waarden normalisearre nei it gewicht fan elke plak fan it hert.
Hertslice-media waard ferfongen troch media mei 1 μCi/ml [5-3H]-glukoaze (Moravek Biochemicals, Brea, CA, Feriene Steaten) foar glukoaze-gebrûkstest lykas earder beskreaun. Nei 4 oeren ynkubaasje, foegje 100 µl medium ta oan in iepen mikrosentrifugebuis mei 100 µl 0.2 N HCl. Dêrnei waard de buis yn in sintillaasjebuis pleatst mei 500 μl dH2O om [3H]2O 72 oeren by 37°C te ferdampen. Ferwiderje dan de mikrosentrifugebuis út 'e sintillaasjebuis en foegje 10 ml sintillaasjefloeistof ta. Scintillaasjetellingen waarden útfierd mei in Tri-Carb 2900TR floeibere sintillaasjeanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, Feriene Steaten). Glukoazegebrûk waard doe berekkene mei rekkening hâlden mei [5-3H]-glukoazespesifike aktiviteit, ûnfolslein lykwicht en eftergrûn, ferdunning fan [5-3H]-nei net-labelde glukoaze, en de effisjinsje fan 'e sintillaasjeteller. De gegevens binne normalisearre nei de massa fan seksjes fan it hert.
Nei weefselhomogenisaasje yn Trizol waard RNA isolearre út hertseksjes mei de Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 neffens it protokol fan 'e fabrikant. RNAsec-bibleteek tarieding, sekwinsjearring en gegevensanalyse waarden as folget útfierd:
1 μg RNA per stekproef waard brûkt as útgongsmateriaal foar de tarieding fan 'e RNA-bibleteek. Sekwinsjebibleteken waarden generearre mei de NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit foar Illumina (NEB, FS) neffens de oanbefellings fan 'e fabrikant, en yndekskoades waarden tafoege oan 'e attribútsekwinsjes foar elk stekproef. Koartsein, mRNA waard suvere fan totaal RNA mei magnetyske kralen dy't ferbûn wiene mei poly-T-oligonukleotiden. Fragmentaasje wurdt útfierd mei divalente kationen by hege temperatuer yn NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Earste string cDNA waard synthetisearre mei willekeurige hexameerprimers en M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). De twadde string cDNA wurdt dan synthetisearre mei DNA-polymerase I en RNase H. De oerbleaune oerhangen wurde omset yn stompe einen troch eksonuklease/polymerase-aktiviteit. Nei adenylaasje fan it 3'-ein fan it DNA-fragment wurdt in NEBNext Adapter mei in hierspeldlusstruktuer deroan fêstmakke om it ta te rieden op hybridisaasje. Foar seleksje fan cDNA-fragminen fan foarkarslingte 150-200 bp. bibleteekfragminten waarden suvere mei it AMPure XP-systeem (Beckman Coulter, Beverly, Feriene Steaten). Dêrnei waard 3 μl USER Enzyme (NEB, Feriene Steaten) mei grutte-selektearre cDNA ligearre mei in adapter brûkt foar 15 minuten by 37 °C en dêrnei foar 5 minuten by 95 °C foar PCR. PCR waard doe útfierd mei Phusion High-Fidelity DNA-polymerase, universele PCR-primers en Index (X)-primers. Uteinlik waarden PCR-produkten suvere (AMPure XP-systeem) en de bibleteekkwaliteit beoardiele op in Agilent Bioanalyzer 2100-systeem. De cDNA-bibleteek waard doe sekwinsjeare mei in Novaseq-sequencer. Rauwe ôfbyldingsbestannen fan Illumina waarden omset yn rûge lêzingen mei CASAVA Base Calling. Rauwe gegevens wurde opslein yn FASTQ(fq)-formaatbestannen dy't lêzingssekwinsjes en oerienkommende basiskwaliteiten befetsje. Selektearje HISAT2 om filterde sekwinsjearringslêzingen te passen by it Sscrofa11.1-referinsjegenoom. Yn 't algemien stipet HISAT2 genomen fan elke grutte, ynklusyf genomen grutter as 4 miljard basen, en standertwearden binne ynsteld foar de measte parameters. Splicing-lêzingen fan RNA Seq-gegevens kinne effisjint ôfstimd wurde mei HISAT2, it rapste systeem dat op it stuit beskikber is, mei deselde of bettere krektens as elke oare metoade.
De oerfloed fan transkripten reflektearret direkt it nivo fan genekspresje. Genekspresjenivo's wurde beoardiele troch de oerfloed fan transkripten (sekwinsjetelling) dy't assosjeare binne mei it genoom of eksons. It oantal lêzingen is evenredich mei genekspresjenivo's, genlingte en sekwinsjedjipte. FPKM (fragminten per tûzen basepearen fan transkriptsekwinsje per miljoen basepearen) waarden berekkene en P-wearden fan differinsjele ekspresje waarden bepaald mei it DESeq2-pakket. Wy hawwe doe it falske ûntdekkingsrate (FDR) foar elke P-wearde berekkene mei de Benjamini-Hochberg-metoade9 basearre op de ynboude R-funksje "p.adjust".
RNA isolearre út hertseksjes waard omset yn cDNA by in konsintraasje fan 200 ng/μl mei de SuperScript IV Vilo Master mix fan Thermo (Thermo, kat. nr. 11756050). Kwantitative RT-PCR waard útfierd mei in Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparante reaksjeplaat (Thermo, kat. nr. 4483319) en microamp optyske kleefstof (Thermo, kat. nr. 4311971). It reaksjemingsel bestie út 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, kat. nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer en 3,5 µl H2O mingd per put. Standert qPCR-syklusen waarden útfierd en CT-wearden waarden metten mei in Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR-ynstrumint (384-well module; produkt nr. A28135). Taqman-primers waarden kocht fan Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). De CT-wearden fan alle samples waarden normalisearre nei it húshâldingsgen GAPDH.
Mediafrijlitting fan NT-ProBNP waard beoardiele mei de NT-ProBNP-kit (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) neffens it protokol fan 'e fabrikant. Koartsein, 250 µl fan elke stekproef en standert waard yn duplikaat tafoege oan elke put. Direkt nei it tafoegjen fan 'e stekproef, foegje 50 µl Assay Reagent A ta oan elke put. Skodzje de plaat foarsichtich en fersegelje mei sealant. Dêrnei waarden de tabletten 1 oere by 37 °C ynkubearre. Aspirearje dan de oplossing en waskje de putten 4 kear mei 350 µl fan 1X waskoplossing, wêrby't de waskoplossing elke kear 1-2 minuten ynkubearre waard. Foegje dan 100 µl Assay Reagent B ta per put en fersegelje mei plaatsealant. De tablet waard foarsichtich skodde en 30 minuten by 37 °C ynkubearre. Aspirearje de oplossing en waskje de putten 5 kear mei 350 µl fan 1X waskoplossing. Foegje 90 µl substraatoplossing ta oan elke putte en fersegelje de plaat. Ynkubearje de plaat by 37 °C foar 10-20 minuten. Foegje 50 µl stopoplossing ta oan elke putte. De plaat waard fuortendaliks metten mei in Cytation (BioTek) plaatlêzer ynsteld op 450 nm.
Machtsanalyses waarden útfierd om de groepsgruttes te kiezen dy't >80% krêft leverje om in absolute feroaring fan 10% yn 'e parameter te detektearjen mei in type I-flaterrate fan 5%. Machtsanalyses waarden útfierd om de groepsgruttes te kiezen dy't >80% krêft leverje om in absolute feroaring fan 10% yn 'e parameter te detektearjen mei in type I-flaterrate fan 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80% мощности foar баружения 10% параметра с 5% частотой ошибок типа I. Machtsanalyse waard útfierd om groepsgruttes te selektearjen dy't >80% krêft soene leverje om 10% absolute parameterferoaring te detektearjen mei in type I-flaterrate fan 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы 80% мощности для обнаружения изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. In krêftanalyse waard útfierd om in groepgrutte te selektearjen dy't >80% krêft soe leverje om 10% absolute parameterferoaring en 5% type I-flaterrate te detektearjen.Weefselseksjes waarden willekeurich selektearre foar it eksperimint. Alle analyses wiene kondysjeblind en de samples waarden pas dekodearre nei't alle gegevens analysearre wiene. GraphPad Prism-software (San Diego, CA) waard brûkt om alle statistyske analyses út te fieren. Foar alle statistiken waarden p-wearden as signifikant beskôge by wearden <0.05. Foar alle statistiken waarden p-wearden as signifikant beskôge by wearden <0,05. Для всей статистики <0,05. Foar alle statistiken waarden p-wearden as signifikant beskôge by wearden <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики <0,05. Foar alle statistiken waarden p-wearden as signifikant beskôge by wearden <0,05.De twasidige Student's t-test waard útfierd op 'e gegevens mei mar 2 fergelikingen. Ien- of twa-weg ANOVA waard brûkt om de betsjutting tusken meardere groepen te bepalen. By it útfieren fan post-hoc-tests waard Tukey's korreksje tapast om rekken te hâlden mei meardere fergelikingen. RNAsec-gegevens hawwe spesjale statistyske oerwagings by it berekkenjen fan FDR en p.adjust lykas beskreaun yn 'e seksje Metoaden.
Foar mear ynformaasje oer stúdzjeûntwerp, sjoch de gearfetting fan it Nature Research Report dy't keppele is oan dit artikel.