Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá tacaíocht theoranta do CSS sa leagan brabhsálaí atá in úsáid agat. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó mód comhoiriúnachta a mhúchadh in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánfaimid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Bunaíonn moirfeiginéis gut an duine gnéithe cripte-villus de mhicrea-ailtireacht eipitéiliam 3T agus eagrú spásúil. Tá an struchtúr uathúil seo riachtanach chun homeostasis gut a choinneáil trí nideoige na gascheall sa chripte bonn a chosaint ó antaiginí miocróbacha eisigineacha agus a meitibilítí. Ina theannta sin, cuireann villi intestinal agus múcas secreting cealla eipitéiliam difreáilte go feidhmiúil i láthair le bacainn chosanta ar dhromchla mhúcóis an intestinal. Dá bhrí sin, tá athchruthú struchtúr eipitéiliam 3T ríthábhachtach chun samhlacha gut in vitro a thógáil. Is suntasach gur féidir leis an gut-ar-sliseanna mímeatach orgánach moirfeiginéis 3T spontáineach den eipitéiliam intestinal a spreagadh le feidhmeanna fiseolaíocha agus bithmheicnic fheabhsaithe. Anseo, soláthraímid prótacal in-athchruthaithe chun moirfeiginéis intestinal a spreagadh go láidir sa gut ar sliseanna micrishreabhach chomh maith le sliseanna hibrideach leabaithe Transwell. Déanaimid cur síos mionsonraithe ar mhodhanna maidir le monarú gléasanna, saothrú Caco-2 nó cealla eipitéiliam orgánóideacha intestinal i suíomhanna traidisiúnta chomh maith le hardán micrishreabhach, ionduchtú moirfeiginéis 3T, agus tréithriú. d'eipiteiliam 3T seanbhunaithe ag baint úsáide as ilmhódúlachtaí íomháithe. Baintear amach athghiniúint micrea-ailtireacht fheidhmiúil an ghoile leis an bprótacal seo trí shreabhadh sreabhán basolateral a rialú ar feadh 5 lá. Úsáideann ár modh morfogenesis in vitro strus lomadh atá ábhartha ó thaobh na fiseolaíochta de agus gluaiseacht mheicniúil agus ní gá innealtóireacht nó ionramháil chasta cille a dhéanamh uaidh, a d'fhéadfadh teicnící eile atá ann cheana a shárú. Samhlaímid go bhféadfadh impleachtaí leathana a bheith ag ár bprótacal atá beartaithe don phobal taighde bithleighis, ag soláthar modh chun sraitheanna eipitéiliacha intestinal 3T a athghiniúint in vitro le haghaidh feidhmeanna bithleighis, cliniciúla agus cógaisíochta.
Léiríonn turgnaimh gur féidir le cealla Caco-2 eipitéiliacha intestinal a shaothraítear i ngut-ar-sliseanna1,2,3,4,5 nó i bhfeistí micrishreabhach déchiseal6,7 moirfeigineas 3T spontáineach a dhéanamh in vitro gan tuiscint shoiléir ar an meicníocht bhunúsach. Inár staidéar le déanaí, fuarthas amach go bhfuil sé riachtanach agus leordhóthanach antagonists moirfige a rúnaítear go basolateral a bhaint as feistí cultúir chun moirfeigineas eipitéiliach 3T a spreagadh in vitro, rud a léiríodh le Caco-2 agus orgánóidigh intestinal díorthaithe ó othair. Rinneadh bailíochtú ar chealla eipitéiliacha. Sa staidéar seo, dhírigh muid go sonrach ar tháirgeadh cille agus dáileadh tiúchana antagonist Wnt cumhachtach, Dickkopf-1 (DKK-1), i ngléasanna gut-ar-sliseanna agus micrishreabhach modhnaithe ina bhfuil iontrálacha Transwell, ar a dtugtar "Sliseanna Hibrideacha". Léirímid go gcuireann cur antagonists Wnt eisgéineacha (amhail DKK-1, Wnt repressor 1, frizzled-related protein 1 secreted, nó Soggy-1) leis an gut ar an sliseanna cosc ​​ar mhórfeigineas nó go gcuireann sé isteach ar an tsraith eipitéiliach 3D réamhstruchtúrtha, rud a thugann le fios gurb é strus antagonach le linn cultúir atá freagrach as mórfeigineas intestinal in vitro. Dá bhrí sin, is cur chuige praiticiúil chun mórfeigineas láidir a bhaint amach ag an gcomhéadan eipitéiliach ná leibhéil antagonists Wnt san urrann basolateral a bhaint nó a choinneáil ar a laghad trí shruthlú gníomhach (m.sh., in ardáin gut-ar-sliseanna nó hibrideach-ar-sliseanna) nó idirleathadh. Meáin basolateral (m.sh., ó iontrálacha Transwell isteach i dtaiscumair mhóra basolateral i tobair).
Sa phrótacal seo, cuirimid modh mionsonraithe ar fáil chun micreaghléasanna gut-ar-sliseanna agus sceallóga hibrideacha inchurtha Transwell (céimeanna 1-5) a mhonarú chun cealla eipitéiliacha intestinal a chultúr ar scannáin scagacha bunaithe ar pholaidéiméitilsilocsán (PDMS) (céimeanna 6A, 7A, 8, 9) nó scannáin poileistear de shuíocháin Transwell (céimeanna 6B, 7B, 8, 9) agus spreagamar moirfeigineas 3T in vitro (céim 10). Chomh maith leis sin, shainaithin muid gnéithe ceallacha agus móilíneacha a léiríonn histeigineas fíocháin-shonrach agus difreáil cheallach atá ag brath ar shliocht trí mhodhanna íomháithe iolracha a chur i bhfeidhm (céimeanna 11-24). Spreagaimid moirfeigineas ag baint úsáide as cealla eipitéiliacha intestinal daonna, amhail Caco-2 nó orgánóidigh intestinal, i ndá fhormáid chultúir le sonraí teicniúla lena n-áirítear modhnú dromchla scannáin scagacha, cruthú mona-shraitheanna 2T, agus bithcheimiceach intestinal agus atáirgeadh an mhicri-thimpeallachta bithmheicniúil in vitro. Chun moirfeigineas 3T a spreagadh ó mhona-shraitheanna eipitéiliacha 2T, bhaineamar moirfeigin as. antagonists sa dá fhoirm chultúrtha tríd an meán a shreabhadh isteach sa urrann basolateral den chultúr. Mar fhocal scoir, cuirimid léiriú ar fáil ar úsáideacht ciseal eipitéiliach 3T in-athghiniúna is féidir a úsáid chun fás eipitéiliach atá ag brath ar mhórfóigean, comhchultúir fhadtéarmacha óstach-micribhithe, ionfhabhtú pataigin, díobháil athlastach, mífheidhm bhacainn eipitéiliach, agus teiripí bunaithe ar phróibhitheacha Sampla.tionchair.
D’fhéadfadh ár bprótacal a bheith úsáideach do raon leathan eolaithe i dtaighde bunúsach (m.sh., bitheolaíocht mhúcóis na n-intinne, bitheolaíocht gascheall, agus bitheolaíocht fhorbartha) agus i dtaighde feidhmeach (m.sh., tástáil réamhchliniciúil ar dhrugaí, samhaltú galair, innealtóireacht fíocháin, agus gastraenterolaíocht) tionchar leathan a bheith aige. Mar gheall ar atáirgtheacht agus stóinseacht ár bprótacail chun moirfeiginéis 3T an eipitéiliam intestinal a spreagadh in vitro, táimid ag súil gur féidir ár straitéis theicniúil a scaipeadh ar lucht féachana atá ag déanamh staidéir ar dhinimic chomharthaíochta cille le linn forbairt, athghiniúint nó homeostasis intestinal. Ina theannta sin, tá ár bprótacal úsáideach chun ionfhabhtú a cheistiú faoi ghníomhairí tógálacha éagsúla amhail Norovirus 8, Siondróm Géarmhíochaine Tromchúiseach Coróinvíreas 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 nó Vibrio cholerae. Tá lucht féachana paiteolaíochta agus pataiginéis galair úsáideach freisin. Féadfaidh úsáid córas micrifiseolaíochta gut ar sliseanna comhchultúr fadaimseartha a cheadú 10 agus measúnú ina dhiaidh sin ar chosaint óstach, freagairtí imdhíonachta agus deisiú díobhála a bhaineann le pataiginí sa chonair gastraistéigeach (GI) 11. Is féidir neamhoird GI eile a bhaineann le siondróm gut sceite, galar céiliach, galar Crohn, colitis othrasach, pouchitis, nó siondróm bputóg irritable a insamhladh nuair a ullmhaítear sraitheanna eipitéiliacha intestinal 3T ag baint úsáide as sraitheanna eipitéiliacha intestinal 3T an othair, lena n-áirítear atrophy villous, giorrú cripte, damáiste múcóis, nó bacainn eipitéiliach lagaithe. Bithóipse nó orgánóidigh intestinal díorthaithe ó chealla gas 12,13. Chun castacht níos airde thimpeallacht an ghalair a shamhaltú níos fearr, féadfaidh léitheoirí smaoineamh ar chineálacha cealla ábhartha don ghalar, amhail cealla mononuclear fola imeallacha othair (PBMCanna), a chur le samhlacha ina bhfuil micrea-ailtireachtaí villus-cripte intestinal 3T. cealla imdhíonachta fíocháin-shonracha, 5.
Ós rud é gur féidir micreastruchtúr eipitéiliach 3T a shocrú agus a léirshamhlú gan an próiseas rannóige, d'fhéadfadh go mbeadh suim ag lucht féachana atá ag obair ar thrascríptóimic spásúil agus íomháú ardtaifigh nó sártaifigh inár mapáil ar dhinimic spásama géinte agus próitéiní ar nideoga eipitéiliacha. Suim sa teicneolaíocht. Freagairt do spreagthaigh mhiocróbacha nó imdhíonachta. Ina theannta sin, is féidir croschaint fhadtéarmach óstach-micribhitheoma 10, 14 a chomhordaíonn homeostasis gut a bhunú sa chiseal múcasach intestinal 3T trí chomh-chultúr a dhéanamh ar speicis mhiocróbacha éagsúla, pobail mhiocróbacha nó micribhithe fecala, go háirithe sa gut-ar-sliseanna. san ardán. Tá an cur chuige seo thar a bheith tarraingteach do lucht féachana atá ag déanamh staidéir ar imdhíoneolaíocht mhúcóis, gastraenterolaíocht, micribhitheam daonna, cultúrómaíocht agus micribhitheamaíocht chliniciúil atá ag iarraidh micribhitheam gut nár saothraíodh roimhe seo a shaothrú sa tsaotharlann. Más féidir ár bprótacal morfóiginéise in vitro a oiriúnú do fhormáidí cultúir inscálaithe, amhail iontrálacha il-tobair i plátaí 24, 96 nó 384 tobar a athlíonann urranna basolateral go leanúnach, is féidir an prótacal a scaipeadh freisin chuig na daoine atá ag forbairt ardáin scagthástála nó bailíochtaithe cógaisíochta, bithleighis nó ard-thráchtála don tionscal bia. Mar chruthúnas prionsabal, léirigh muid le déanaí indéantacht chóras morfóiginéise ilphléacs ard-thráchtála atá inscálaithe go formáid pláta 24 tobar. Ina theannta sin, tá táirgí ilorgán-ar-sliseanna tráchtálaithe16,17,18. Dá bhrí sin, is féidir bailíochtú ár modh morfóiginéise in vitro a luathú agus a ghlacadh go féideartha ag go leor saotharlanna taighde, tionscail nó rialtais agus gníomhaireachtaí rialála chun athchlárú ceallach morfóiginéise gut in vitro a thuiscint ag an leibhéal transcriptómach chun drugaí nó biththeiripigh a thástáil An ionsú agus Rinneadh measúnú ar iompar iarrthóirí drugaí ag baint úsáide as ionadaithe gut 3T nó ag baint úsáide as samhlacha orgán-ar-sliseanna saincheaptha nó tráchtála chun in-atáirgtheacht phróiseas moirfeiginéise na gut a mheas.
Úsáideadh líon teoranta samhlacha turgnamhacha ábhartha don duine chun moirfeigineas eipitéiliach intestinal a staidéar, den chuid is mó mar gheall ar easpa prótacail inchurtha chun moirfeigineas 3T a spreagadh in vitro. Déanta na fírinne, tá cuid mhór den eolas reatha faoi moirfeigineas gut bunaithe ar staidéir ainmhithe (m.sh., iasc séabra20, lucha21 nó sicíní22). Mar sin féin, tá siad dian ó thaobh saothair agus costais de, is féidir leo a bheith amhrasach ó thaobh na heitice de, agus níos tábhachtaí fós, ní chinneann siad próisis forbartha an duine go beacht. Tá na samhlacha seo an-teoranta freisin ina gcumas a bheith tástáilte ar bhealach inscálaithe ilbhealach. Dá bhrí sin, sáraíonn ár bprótacal chun struchtúir fíocháin 3T a athghiniúint in vitro samhlacha ainmhithe in vivo chomh maith le samhlacha cultúir cille statach 2T traidisiúnta eile. Mar a thuairiscíodh roimhe seo, thug úsáid struchtúr eipitéiliach 3T deis dúinn scrúdú a dhéanamh ar shuíomh spásúil cealla difreáilte in ais an chripte-villus mar fhreagairt ar spreagthaigh mhúcóiseacha nó imdhíonachta éagsúla. Is féidir le sraitheanna eipitéiliacha 3T spás a sholáthar chun staidéar a dhéanamh ar an gcaoi a ndéanann cealla miocróbacha iomaíocht chun nideoga spásúla agus éabhlóid éiceolaíoch a fhoirmiú mar fhreagairt ar fhachtóirí óstacha (m.sh., sraitheanna múcas istigh i gcoinne seachtracha, secretion IgA agus peiptídí frithmhiocróbacha). Ina theannta sin, is féidir le moirfeolaíocht eipitéiliach 3T ligean dúinn tuiscint a fháil ar an gcaoi a struchtúraíonn micribhithe an ghoile a phobail agus a tháirgeann sé meitibilítí miocróbacha go sineirgisteach (m.sh., aigéid shailleacha gearrshlabhra) a mhúnlaíonn eagrú ceallach agus nideoga gaschealla sna cripteanna bonnacha. Ní féidir na gnéithe seo a léiriú ach amháin nuair a bhunaítear sraitheanna eipitéiliacha 3T in vitro.
Chomh maith lenár modh chun struchtúir eipitéiliacha intestinal 3T a chruthú, tá roinnt modhanna in vitro ann. Is teicníc innealtóireachta fíocháin den scoth é cultúr orgánóideach intestinal atá bunaithe ar shaothrú gaschealla intestinal faoi choinníollacha sonracha moirfóigine23,24,25. Mar sin féin, is minic a bhíonn sé dúshlánach samhlacha orgánóideacha 3T a úsáid le haghaidh anailíse iompair nó comhchultúir óstach-micribhióim toisc go bhfuil lumen na intestine faoi iamh laistigh den orgánóideach agus, dá bhrí sin, tá tabhairt isteach comhpháirteanna luminal amhail cealla miocróbacha nó antaiginí eisigineacha teoranta. Is féidir rochtain ar lumens orgánóideacha a fheabhsú trí mhicrea-insteallóir a úsáid,26,27 ach tá an modh seo ionrach agus dian ar shaothar agus teastaíonn eolas speisialaithe chun é a dhéanamh. Ina theannta sin, ní léiríonn cultúir thraidisiúnta orgánóideacha a choimeádtar i scafall hidrigéil faoi choinníollacha statach bithmheicnic ghníomhach in vivo go cruinn.
Úsáideann cur chuige eile a úsáideann roinnt grúpaí taighde scafall hidrigéil réamhstruchtúrtha 3T chun struchtúr eipitéiliach an ghoile a aithris trí chealla intestinal daonna scoite a shaothrú ar dhromchla an ghóil. Déan scafall hidrigéil a mhonarú ag baint úsáide as múnlaí atá priontáilte 3T, micrea-mhuilte, nó litagrafach. Taispeánann an modh seo socrú féin-eagraithe cealla eipitéiliacha scoite in vitro le grádáin mhórfóigin atá ábhartha ó thaobh na fiseolaíochta de, ag bunú struchtúr eipitéiliach cóimheas gné ard agus traschaint stróma-eipiteiliach trí chealla strómacha a áireamh sa scafall. Mar sin féin, d'fhéadfadh nádúr na scafall réamhstruchtúrtha cosc ​​a chur ar thaispeántas an phróisis mhórfeigineach spontáineach féin. Ní sholáthraíonn na samhlacha seo sreabhadh dinimiciúil luminal nó idirmheánach, agus níl an strus lomadh sreabhach ann a theastaíonn ó chealla intestinal chun moirfeigineas a dhéanamh agus feidhm fhiseolaíoch a fháil. Bhain staidéar eile le déanaí úsáid as scafall hidrigéil in ardán micrishreabhach agus struchtúir eipitéiliacha intestinal patrúnaithe ag baint úsáide as teicnící greanta léasair. Leanann orgánóidigh intestinal lucha patrúin eitseáilte chun struchtúir fheadánacha intestinal a fhoirmiú, agus is féidir sreabhadh sreabhach intraluminal a athchruthú ag baint úsáide as a modúl micrishreabhach. Mar sin féin, ní thaispeánann an tsamhail seo próisis mhórfaighinéiteacha spontáineacha ná ní chuimsíonn sí gluaiseachtaí meicnibhitheolaíocha an ghoile. Bhí teicnící priontála 3D ón ngrúpa céanna in ann feadáin mhionsonraithe gut a chruthú le próisis mhórfaighinéiteacha spontáineacha. In ainneoin an mhonarú casta ar chodanna éagsúla den ghoile laistigh den fheadán, níl sreabhadh sreabhach lonrach ná dífhoirmiú meicniúil sa tsamhail seo ach an oiread. Ina theannta sin, d’fhéadfadh inoibritheacht an tsamhail a bheith teoranta, go háirithe tar éis an próiseas bithphriontála a bheith críochnaithe, rud a chuireann isteach ar dhálaí turgnamhacha nó ar idirghníomhaíochtaí cille go cille. Ina áit sin, soláthraíonn ár bprótacal atá beartaithe mórfogenesis gut spontáineach, strus lomadh atá ábhartha ó thaobh na fiseolaíochta de, bithmheicnic a dhéanann aithris ar shoghluaisteacht an ghoile, inrochtaineacht urranna apical agus basolateral neamhspleácha, agus athchruthú micri-thimpeallachtaí bitheolaíocha casta modúlach. Dá bhrí sin, féadfaidh ár bprótacal mórfogenesis 3D in vitro cur chuige comhlántach a sholáthar chun dul i ngleic le dúshláin na modhanna atá ann cheana féin.
Tá ár bprótacal dírithe go hiomlán ar mhórfeiginéis eipitéiliach 3T, agus níl ach cealla eipitéiliacha i gcultúr agus gan aon chineálacha eile cealla máguaird amhail cealla meiseinceimeacha, cealla inchríneacha, agus cealla imdhíonachta. Mar a thuairiscíodh roimhe seo, is é croílár ár bprótacail ná ionduchtú mhórfeiginéise eipitéiliach trí choscóirí mórfaigin atá secreted ag an taobh basolateral den mheán a tugadh isteach a bhaint. Cé go gceadaíonn modúlacht láidir ár gut-ar-sliseanna agus hibrideach-ar-sliseanna dúinn an ciseal eipitéiliach 3T tonnach a athchruthú, tá castachtaí bitheolaíocha breise amhail idirghníomhaíochtaí eipitéiliach-meiseinceimeacha33,34, taisceadh Maitrís eachtarcheallach (ECM)35 agus, inár samhail, gnéithe cripte-villus a iompraíonn nideoga gascheall i gcripteanna basal le breithniú tuilleadh fós. Tá ról lárnach ag cealla strómacha (m.sh., fibroblasts) sa mheiseincím i dtáirgeadh próitéiní ECM agus i rialáil mhórfeiginéis intestinal in vivo35,37,38. Breiseadh cealla meiseinceimeacha dár samhail, feabhsaíodh an próiseas moirfeigineach agus éifeachtúlacht cheangail cille. Tá ról tábhachtach ag an gciseal endothelial (i.e., ribeadáin nó limfeacha) i rialáil iompair mhóilíneach39 agus earcaíocht cealla imdhíonachta40 sa mhicri-thimpeallacht gut. Ina theannta sin, is réamhriachtanas iad comhpháirteanna soithíoch is féidir a nascadh idir samhlacha fíocháin nuair a bhíonn samhlacha fíocháin deartha chun idirghníomhaíochtaí ilorgán a léiriú. Dá bhrí sin, b’fhéidir go mbeadh gá cealla endothelial a áireamh chun gnéithe fiseolaíocha níos cruinne a shamhaltú le réiteach ar leibhéal orgáin. Tá cealla imdhíonachta díorthaithe ó othair riachtanach freisin chun freagairtí imdhíonachta dúchasacha, cur i láthair antaigin, traschaint imdhíonachta oiriúnaitheach dúchasach, agus díolúine fíocháin-shonrach a thaispeáint i gcomhthéacs aithris a dhéanamh ar ghalar intestinal.
Tá úsáid sceallóga hibrideacha níos simplí ná gut-ar-sliseanna toisc go bhfuil socrú an fheiste níos simplí agus go gceadaíonn úsáid iontrálacha Transwell cultúr inscálaithe eipitéiliam an ghoile. Mar sin féin, níl iontrálacha Transwell atá ar fáil go tráchtála le scannáin poileistear leaisteacha agus ní féidir leo gluaiseachtaí cosúil le peristaltacha a insamhladh. Ina theannta sin, d'fhan urrann apical an iontrála Transwell a cuireadh sa tslis hibrideach ina stad gan aon strus lomadh ar an taobh apical. Is léir nach gcuireann na hairíonna statach san urrann apical comhchultúr baictéarach fadtéarmach ar chumas i sceallóga hibrideacha. Cé gur féidir linn moirfeigineas 3D a spreagadh go láidir in iontrálacha Transwell agus sceallóga hibrideacha in úsáid againn, d'fhéadfadh an easpa bithmheicnic atá ábhartha ó thaobh na fiseolaíochta de agus sreabhadh sreabhán apical indéantacht ardáin sceallóga hibrideacha a theorannú le haghaidh feidhmeanna féideartha.
Níl atógálacha lánscála ar ais an chripte-villus dhaonna i gcultúir gut-ar-sliseanna agus hibrideach-ar-sliseanna bunaithe go hiomlán fós. Ós rud é go dtosaíonn moirfeigineas ó mhonachiseal eipitéiliach, ní gá go soláthraíonn micrea-ailtireachtaí 3T cosúlacht moirfeolaíoch le cripteanna in vivo. Cé gur shainigh muid an daonra cille atá ag iomadú in aice leis an bhfearann ​​cripte bonn san eipitéiliam 3T micrea-innealtóireachta, níor deighilteadh na réigiúin cripte agus villi go soiléir. Cé go mbíonn airde mhéadaithe an eipitéiliam micrea-innealtóireachta mar thoradh ar chainéil uachtaracha níos airde ar an tslis, tá an airde uasta teoranta fós do ~300–400 µm. Is é ~135 µm agus ~400 µm, faoi seach, doimhneacht iarbhír chripte intestinal an duine sna stéig bheaga agus mhóra, agus is é ~600 µm airde na villi beaga intestinal41.
Ó thaobh íomháithe de, d'fhéadfadh íomháú sár-réitigh in situ de mhicrea-ailtireachtaí 3T a bheith teoranta don ghoile ar sliseanna, ós rud é go bhfuil an t-achar oibre riachtanach ón lionsa cuspóireach go dtí an ciseal eipitéiliach thart ar chúpla milliméadar. Chun an fhadhb seo a shárú, d'fhéadfadh go mbeadh gá le cuspóir i bhfad i gcéin. Ina theannta sin, is dúshlánach codanna tanaí a dhéanamh le haghaidh ullmhú eiseamal íomháithe mar gheall ar leaisteachas ard PDMS. Ina theannta sin, ós rud é go mbíonn greamaitheacht bhuan idir gach ciseal i gceist le micrea-dhéanamh ciseal ar chiseal an ghoile ar sliseanna, is dúshlánach an ciseal uachtarach a oscailt nó a bhaint chun struchtúr dromchla na ciseal eipitéiliach a scrúdú. Mar shampla, trí mhicreascóp leictreon scanála (SEM) a úsáid.
Is fachtóir teorannaithe é hidreafóibeacht PDMS i staidéir mhicrishreabhach a dhéileálann le móilíní beaga hidreafóbacha, ós rud é gur féidir le PDMS na móilíní hidreafóbacha sin a ionsú go neamhshonrach. Féadfar roghanna eile seachas PDMS a mheas le hábhair pholaiméireacha eile. Nó, is féidir modhnú dromchla PDMS (m.sh., sciath le hábhair lipifileacha 42 nó polai(eitiléin glycol) 43) a mheas chun ionsú móilíní hidreafóbach a íoslaghdú.
Ar deireadh, níor tréithríodh ár modh go maith i dtéarmaí scagthástáil ard-tréchur nó ardán turgnamhach “méid amháin a oireann do chách” atá furasta le húsáid a sholáthar. Éilíonn an prótacal reatha caidéal steallaire in aghaidh an mhicreaghléas, rud a thógann spás i ngorlann CO2 agus a chuireann cosc ​​ar thurgnaimh mhórscála. Is féidir an teorannú seo a fheabhsú go suntasach trí inmhéadaitheacht formáidí cultúir nuálacha (m.sh., iontrálacha scagach 24-tobar, 96-tobar, nó 384-tobar a cheadaíonn athlánú leanúnach agus baint meán basolateral).
Chun moirfeiginéis 3T eipitéiliam intestinal an duine a spreagadh in vitro, d'úsáideamar gléas intestinal sliseanna micrishreabhach ina raibh dhá mhicreachainéal comhthreomhara agus scannán scagach leaisteach eatarthu chun comhéadan lumen-ribeadán a chruthú. Léirímid freisin úsáid gléas micrishreabhach aonchainéil (sliseanna hibrideach) a sholáthraíonn sreabhadh basolateral leanúnach faoi shraitheanna eipitéiliacha polaraithe a fhásann ar iontrálacha Transwell. Sa dá ardán, is féidir moirfeiginéis cealla eipitéiliacha intestinal daonna éagsúla a léiriú trí ionramháil threorach sreabhadh a chur i bhfeidhm chun antagonists moirfigein a bhaint as an urrann basolateral. Tá cúig chuid sa nós imeachta turgnamhach iomlán (Fíor 1): (i) micrea-dhéanamh an tslis gut nó an tslis hibrideach in-iontráilte Transwell (céimeanna 1-5; Bosca 1), (ii) ullmhú cealla eipitéiliacha intestinal (cealla Caco-2) nó orgánóidigh intestinal daonna; boscaí 2-5), (iii) cultúr cealla eipitéiliacha intestinal ar sceallóga intestinal nó sceallóga hibrideacha (céimeanna 6-9), (iv) ionduchtú moirfeiginéis 3T in vitro (céim 10) agus (v)) chun micreastruchtúr eipitéiliach 3T a shainiú (céimeanna 11-24). Ar deireadh, dearadh grúpa rialaithe cuí (pléitear tuilleadh thíos) chun éifeachtacht moirfeiginéis in vitro a bhailíochtú trí moirfeiginéis eipitéiliach a chur i gcomparáid le rialuithe spásúla, ama, coinníollach nó nós imeachta.
D'úsáideamar dhá ardán cultúir éagsúla: gut-ar-sliseanna le bealaí díreacha nó bealaí casta neamhlíneacha, nó sceallóga hibrideacha ina bhfuil iontrálacha Transwell (TW) i bhfeiste micrishreabhach, monaraithe mar a thuairiscítear i mBosca 1, agus céim 1-5. Taispeánann “Déantúsaíocht Feiste” na príomhchéimeanna i ndéanamh slise aonair nó slise hibrideach. Míníonn “Cultúr Cealla Eipitéiliacha Intestinal Daonna” foinse na gcealla (Caco-2 nó orgánóidigh intestinal daonna) agus an nós imeachta cultúir a úsáidtear sa phrótacal seo. Taispeánann “Morfogenesis in vitro” na céimeanna foriomlána ina ndéantar cealla eipitéiliacha díorthaithe ó Caco-2 nó orgánóidigh a shaothrú ar shlis intestinal nó ar iontrálacha Transwell de shlis hibrideach, agus ina dhiaidh sin ionduchtú moirfogenesis 3D agus foirmiú struchtúir eipitéiliach tréithrithe. Taispeántar uimhir chéim an chláir nó uimhir an bhosca faoi gach saighead. Soláthraíonn an feidhmchlár samplaí de conas is féidir sraitheanna eipitéiliacha intestinal atá bunaithe a úsáid, mar shampla, i tréithriú difreála cille, staidéir fhiseolaíochta gut, bunú éiceachóras óstach-micribhithe, agus samhaltú galair. Imdhíonfhluaraiseacht Íomhánna i “Difreáil Cealla” a thaispeánann núicléis, F-actin agus MUC2 atá léirithe sa chiseal eipitéiliach 3D Caco-2 a ghintear ar an sliseanna gut. Tá comharthaíocht MUC2 i láthair i gcealla goblet agus i múcas a scaoiltear ó dhromchlaí múcasacha. Taispeánann íomhánna fluaraiseacha i Gut Physiology múcas a tháirgtear trí dhaiteadh le haghaidh iarmhair aigéad sialach agus N-aicéitilglúcósamín ag baint úsáide as agglutinin geirm cruithneachta fluaraiseach. Taispeánann an dá íomhá fhorluiteacha i “Comhchultúir Óstach-Mhiocrób” comhchultúir ionadaíocha óstach-micribhióim sa gut ar sliseanna. Taispeánann an painéal ar chlé comhchultúr E. coli a léiríonn próitéin fluaraiseach glas (GFP) le cealla eipitéiliacha 3D Caco-2 micrea-innealtóireachta. Taispeánann an painéal ar dheis suíomh GFP E. coli comhchultúrtha le cealla eipitéiliacha 3D Caco-2, agus ina dhiaidh sin daiteadh imdhíonfhluaraiseachta le F-actin (dearg) agus núicléis (gorm). Léiríonn samhaltú galair gut sláintiúil i gcoinne gut sceite i sliseanna athlasadh gut faoi dhúshlán fiseolaíoch le hantaiginí baictéaracha (m.sh., lipopolysaccharide, LPS) agus cealla imdhíonachta (m.sh., PBMC; glas). Saothraíodh cealla Caco-2 chun ciseal eipitéiliach 3T a bhunú. Barra scála, 50 µm. Íomhánna sa tsraith bun: “Difreáil cealla” oiriúnaithe le cead ó thagairt.2. Oxford University Press; Atáirgeadh le cead ó Thagairt 5. NAS; “Comhchultúr Óstach-Miocrób” oiriúnaithe le cead ó thagairt 3. NAS; “Samhaltú Galar” oiriúnaithe le cead ó thagairt 5. NAS.
Rinneadh sceallóga gut-ar-sliseanna agus sceallóga hibrideacha araon ag baint úsáide as macasamhla PDMS a baineadh as múnlaí sileacain trí litagrafaíocht bhog1,44 agus a ndearnadh patrún orthu le SU-8. Cinntear dearadh na micreachainéil i ngach sliseanna trí hidridinimic amhail strus lomadh agus brú hidridinimic1,4,12 a chur san áireamh. Tá an dearadh gut-ar-sliseanna bunaidh (Fíor Sonraí Leathnaithe 1a), a raibh dhá mhicreachainéil dhíreacha comhthreomhara taobh le taobh ann, tar éis teacht chun cinn ina gut-ar-sliseanna casta (Fíor Sonraí Leathnaithe 1b) lena n-áirítear péire micreachainéil cuartha chun am cónaithe sreabhach méadaithe, patrúin sreafa neamhlíneacha, agus dífhoirmiú il-aiseach cealla saothraithe a spreagadh (Fíor 2a-f)12.Nuair is gá bithmheicnic gut níos casta a athchruthú, is féidir gut-ar-sliseanna casta a roghnú.Tá sé léirithe againn go spreagann an Gut-Chip casta moirfeiginéis 3T go láidir i bhfráma ama cosúil le céim fhás eipitéiliach cosúil leis an mbunleagan. Gut-Chip, beag beann ar an gcineál cille saothraithe. Dá bhrí sin, chun moirfeigineas 3T a spreagadh, is féidir dearaí gut líneacha agus casta ar an sliseanna a mhalartú. Thug macasamhla PDMS a leigheasadh ar mhúnlaí sileacain le patrúin SU-8 gnéithe diúltacha tar éis dímhúnlaithe (Fíor 2a). Chun an gut ar sliseanna a mhonarú, nascadh an ciseal uachtarach PDMS ullmhaithe go seicheamhach le scannán PDMS scagach agus ansin ailíníodh é leis an gciseal íochtarach PDMS trí nascadh neamh-inchúlghairthe ag baint úsáide as cóireálaí corónach (Fíor 2b–f). Chun sliseanna hibrideacha a mhonarú, nascadh macasamhla PDMS leigheasta le sleamhnáin ghloine chun gléasanna micrishreabhach aonchainéil a chruthú a d'fhéadfadh freastal ar iontrálacha Transwell (Fíor 2h agus Sonraí Leathnaithe Fíor 2). Déantar an próiseas nasctha trí dhromchlaí an mhacasamhail PDMS agus an ghloine a chóireáil le plasma ocsaigine nó cóireáil corónach. Tar éis steiriliú na feiste micrea-mhonaraithe atá ceangailte leis an bhfeadán silicone, bhí an socrú feiste réidh chun moirfeigineas 3T den eipitéiliam intestinal a dhéanamh (Fíor 2g).
a, Léaráid sceitseach ar ullmhú páirteanna PDMS ó mhúnlaí sileacain patrúnacha SU-8. Doirteadh an tuaslagán PDMS neamhleigheasta ar mhúnla sileacain (ar chlé), leigheasadh é ag 60 °C (lár) agus dímhúnlaíodh é (ar dheis). Gearradh an PDMS dímhúnlaithe ina phíosaí agus glanadh é lena úsáid a thuilleadh.b, Grianghraf den mhúnla sileacain a úsáideadh chun an ciseal uachtarach PDMS a ullmhú.c, Grianghraf den mhúnla sileacain a úsáideadh chun an scannán scagach PDMS a mhonarú.d, Sraith grianghraf de na comhpháirteanna PDMS uachtaracha agus íochtaracha agus an fheiste intestinal ar-slis cóimeáilte.e, Sceitseach d'ailíniú na gcomhpháirteanna PDMS uachtaracha, scannáin agus íochtaracha. Tá gach ciseal nasctha go neamh-inchúlghairthe le cóireáil plasma nó corónach.f, Sceitseach den fheiste gut-ar-slis monaraithe le micreachainéil casta forshuite agus seomraí folúis.g, Socrú gut-ar-slis le haghaidh cultúr cealla micrishreabhach. Cuireadh an gut monaraithe ar slis cóimeáilte le feadán silicone agus steallaire ar chlúdach-shleamhnán. Cuireadh an fheiste slise ar an clúdach mhias Petri 150 mm le haghaidh próiseála. Úsáidtear an ceanglóir chun an feadán silicone a dhúnadh.h, Pictiúir amhairc de mhonarú sliseanna hibrideacha agus moirfeigineas 3T ag baint úsáide as sliseanna hibrideacha. Cuireadh iontrálacha Transwell a ullmhaíodh go neamhspleách chun sraitheanna monai 2T de chealla eipitéiliacha intestinal a shaothrú isteach sa tslis hibrideach chun moirfeigineas 3T intestinal a spreagadh. Déantar an meán a phéireáil trí mhicreachainéil faoin tsraith chealla atá bunaithe ar an iontráil Transwell. Barra scála, 1 cm.h Athchlóite le cead ó thagairt.4. Elsevier.
Sa phrótacal seo, úsáideadh líne cille Caco-2 agus orgánóidigh intestinal mar fhoinsí eipitéiliacha (Fíor 3a). Saothraíodh an dá chineál cealla go neamhspleách (Bosca 2 agus Bosca 5) agus úsáideadh iad chun na micreachainéil brataithe le ECM de na hionchuir gut ar an sliseanna nó Transwell a shíolrú. Nuair a bhíonn na cealla comhshreabhach (clúdach >95% i bhfleascáin), baintear cealla Caco-2 a shaothraítear go rialta (idir pasáistí 10 agus 50) i bhfleascáin T chun fionraí cille dícheangailte a ullmhú trí shreabhán trypsiniúcháin (bosca 2). Saothraíodh orgánóidigh intestinal daonna ó bhithóipsí intestinal nó ó athghearradh máinliachta i gcruinneacháin scafall Matrigel i bplátaí 24-tobair chun tacú leis an micri-thimpeallacht struchtúrach. Cuireadh meán ina raibh moirfigíní riachtanacha (mar shampla Wnt, R-spondin, agus Noggin) agus fachtóirí fáis ullmhaithe mar a thuairiscítear i mBosca 3 gach dara lá go dtí gur fhás na horgánóidigh go ~500 µm ar trastomhas. Bailítear orgánóidigh lánfhásta agus dícheangailtear iad i gcealla aonair le haghaidh... síolú ar iontrálacha gut nó Transwell ar sliseanna (Bosca 5). Mar a thuairiscigh muid roimhe seo, is féidir idirdhealú a dhéanamh idir é de réir cineál galair12,13 (m.sh. colitis othrasach, galar Crohn, ailse cholaireicteach, nó deontóir gnáth), suíomh léasain (m.sh., léasain i gcoinne limistéar neamh-léasainithe) agus suíomh gastraistéigeach sa chonair (m.sh., duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, nó rectum). Soláthraímid prótacal optamaithe i mBosca 5 chun orgánóidigh choilíneacha (coloids) a shaothrú a bhfuil tiúchain níos airde morfoiginí ag teastáil uathu de ghnáth ná orgánóidigh stéigeacha beaga.
a, Sreabhadh oibre le haghaidh ionduchtú moirfeiginéis gut sa sliseanna gut. Úsáidtear eipitéiliam intestinal daonna Caco-2 agus orgánóidigh intestinal sa phrótacal seo chun moirfeiginéis 3T a léiriú. Cuireadh na cealla eipitéiliacha scoite sa fheiste gut-ar-sliseanna ullmhaithe (ullmhúchán sliseanna). Nuair a chuirtear síol ar na cealla agus nuair a cheanglaítear iad leis an scannán scagach PDMS ar lá 0 (D0), cuirtear tús le sreabhadh apical (AP) agus coinnítear é don chéad 2 lá (sreabhadh, AP, D0-D2). Cuirtear tús le sreabhadh basolateral (BL) freisin mar aon le gluaiseachtaí síneadh timthriallacha (síneadh, sreabhadh, AP agus BL) nuair a chruthaítear aonchiseal 2T iomlán. Tharla moirfeiginéis 3T intestinal go spontáineach tar éis 5 lá de chultúr micrishreabhach (moirfeiginéis, D5). Taispeánann íomhánna codarsnachta céime moirfeolaíocht ionadaíoch cealla Caco-2 ag gach céim nó pointe ama turgnamhach (graf barra, 100 µm). Ceithre léaráid scéimeacha a léiríonn na heasghluaiseachtaí comhfhreagracha de moirfeiginéis gut (barr ar dheis). An stróicthe Léiríonn saigheada sa scéimeach treo an tsreafa sreabhach.b, Íomhá SEM a thaispeánann toipeolaíocht dhromchla an eipitéiliam Caco-2 3T atá bunaithe (ar chlé). Taispeánann an t-ionchur a aibhsíonn an limistéar formhéadaithe (bosca bán poncaithe) na micreavilli athghinte ar an tsraith Caco-2 3T (ar dheis).c, Radharc tosaigh cothrománach de Caco-2 3T atá bunaithe, claudin (ZO-1, dearg) agus scannáin imeall scuaibe leanúnacha lipéadaithe F-actin (glas) agus núicléis (gorm) Amharcléiriú comhfhócasach imdhíonfhluaraiseachta ar chealla eipitéiliacha ar sceallóga intestinal. Léiríonn saigheada ag pointeáil chuig an scéimeach lár suíomh an eitleáin fhócasach do gach radharc comhfhócasach.d, Cúrsa ama athruithe moirfeolaíocha in orgánóidigh a shaothraítear ar shlis a fhaightear trí mhicreascópacht codarsnachta céime ar laethanta 3, 7, 9, 11, agus 13. Taispeánann an t-ionchur (barr ar dheis) formhéadú ard na híomhá a cuireadh ar fáil.e, Fótamicreagraf DIC d'eipitéiliam orgánóideach 3T atá bunaithe sa ghoile ar shlis a tógadh ar lá 7.f, Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta forleagtha ag taispeáint marcóirí do chealla gas (LGR5; magenta), cealla goblet (MUC2; glas), F-actin (liath) agus núicléis (cian) a fhástar ar sceallóga gut ar feadh 3 lá, faoi seach (Ar Chlé) agus orgánóidigh 13 lá (lár) ar an gciseal eipitéiliach.Féach freisin Fíor 3 de na Sonraí Leathnaithe, a aibhsíonn comharthaíocht LGR5 gan comharthaíocht MUC2.Íomhánna fluaraiseachta a thaispeánann micreastruchtúr eipitéiliach (ar dheis) d'eipitéiliam orgánóideach 3T a bunaíodh sa gut ar sceallóg tríd an scannán plasma a dhaite le ruaim CellMask (ar dheis) ar lá 13 den chultúr.Is é 50 μm an barra scála mura ndeirtear a mhalairt.b Athchlóite le cead ó thagairt.2. Oxford University Press; c Oiriúnaithe le cead ó Thagairt.2. Oxford University Press; e agus f oiriúnaithe le cead trí thagairt.12 Faoi Cheadúnas Creative Commons CC BY 4.0.
Sa ghoile ar shliseog, is gá dromchla hidreafóbach an scannáin scagach PDMS a mhodhnú le haghaidh sciath ECM rathúil. Sa phrótacal seo, cuirimid dhá mhodh éagsúla i bhfeidhm chun hidreafóibeacht scannáin PDMS a mhodhnú. Chun cealla Caco-2 a shaothrú, bhí gníomhachtú dromchla trí chóireáil UV/ózóin ina aonar leordhóthanach chun hidreafóibeacht dhromchla PDMS a laghdú, an ECM a chóta agus cealla Caco-2 a cheangal leis an scannán PDMS. Mar sin féin, éilíonn cultúr micrishreabhach eipitéiliam orgánóideach feidhmiúlacht dromchla bunaithe ar cheimiceáin chun taisceadh éifeachtach próitéiní ECM a bhaint amach trí phoileitiléinímín (PEI) agus glutaraldehyde a chur i bhfeidhm go seicheamhach ar mhicreachainéil PDMS. Tar éis modhnú dromchla, taiscíodh próitéiní ECM chun dromchla feidhmiúil an PDMS a chlúdach agus ansin tugadh isteach san eipitéiliam orgánóideach scoite iad. Tar éis na cealla a cheangal, tosaíonn an cultúr cealla micrishreabhach tríd an meán amháin a phéireáil isteach sa mhicreachainéal uachtarach go dtí go bhfoirmíonn na cealla aonchiseal iomlán, agus coinníonn an micreachainéal íochtarach coinníollacha statach. Cuireann an modh optamaithe seo le haghaidh gníomhachtú dromchla agus sciath ECM ar chumas ceangaltán orgánóideach. eipitéiliam chun moirfeiginéis 3T a spreagadh ar dhromchla an PDMS.
Éilíonn cultúir Transwell sciath ECM freisin roimh shíolrú cealla; áfach, ní gá céimeanna réamhchóireála casta a bheith ag teastáil ó chultúir Transwell chun dromchla na n-ionchur scagach a ghníomhachtú. Chun cealla Caco-2 a fhás ar ionchuir Transwell, luasghéaraíonn sciath ECM ar ionchuir scagacha ceangaltán cealla Caco-2 scagtha (<1 uair an chloig) agus foirmiú bacainní acomhal daingean (<1-2 lá). Chun orgánóidigh a shaothrú ar ionchuir Transwell, cuirtear orgánóidigh scoite ar ionchuir atá brataithe le ECM, ceanglaítear iad le dromchla an scannáin (<3 uair an chloig) agus coinnítear iad go dtí go bhfoirmíonn na horgánóidigh aonchiseal iomlán le sláine bhacainn. Déantar cultúir Transwell i plátaí 24 tobar gan sceallóga hibrideacha a úsáid.
Is féidir moirfeiginéis 3T in vitro a thionscnamh trí shreabhadh sreabhach a chur i bhfeidhm ar an ngné basolateral de shraith eipitéiliach atá bunaithe. Sa ghoile ar shliseog, thosaigh moirfeiginéis eipitéiliach nuair a rinneadh an meán a phéireáil isteach sna micreachainéil uachtaracha agus íochtaracha (Fíor 3a). Mar a thuairiscíodh roimhe seo, tá sé ríthábhachtach sreabhadh sreabhach a thabhairt isteach san urrann íochtarach (basolateral) chun coscairí moirfige rúnda treorach a bhaint go leanúnach. Chun cothaithigh agus serum leordhóthanach a sholáthar do chealla atá ceangailte ar scannáin scagacha agus strus lomadh luminal a ghiniúint, is gnách go gcuirimid sreabhadh dúbailte i bhfeidhm sa ghoile ar shliseog. I sliseanna hibrideacha, cuireadh iontrálacha Transwell ina raibh mona-shraitheanna eipitéiliacha isteach sna sliseanna hibrideacha. Ansin, cuireadh an meán i bhfeidhm faoin taobh basolateral den iontráil scagach Transwell tríd an micreachainéal. Tharla moirfeiginéis intestinal 3-5 lá tar éis thús an tsreafa basolateral sna hardáin chultúir araon.
Is féidir gnéithe moirfeolaíocha sraitheanna eipitéiliacha 3T micrea-innealtóireachta a anailísiú trí mhodhanna íomháithe éagsúla a chur i bhfeidhm, lena n-áirítear micreascópacht codarsnachta céime, micreascópacht codarsnachta trasnaíochta difreálach (DIC), SEM, nó micreascópacht chomhfhócasach imdhíonfhluaraiseachta (Fíor 3 agus 4). Is féidir íomháú codarsnachta céime nó DIC a dhéanamh go héasca ag am ar bith le linn an chultúir chun cruth agus easnamh sraitheanna eipitéiliacha 3T a mhonatóiriú. Mar gheall ar thrédhearcacht optúil PDMS agus scannán poileistear, is féidir leis na hardáin gut-ar-sliseanna agus sliseanna hibrideacha íomháú fíor-ama in situ a sholáthar gan gá le rannóg nó díchóimeáil an fheiste. Agus íomháú imdhíonfhluaraiseachta á dhéanamh (Fíor 1, 3c, f agus 4b, c), socraítear cealla de ghnáth le 4% (meáchan/toirt) paraformaldehyde (PFA), agus ina dhiaidh sin Triton X-100 agus 2% (meáchan/toirt) ) albaimin séiream bólachta (BSA), in ord. Ag brath ar an gcineál cille, is féidir socraitheoirí, tréscaoilteoirí agus gníomhairí blocála éagsúla a úsáid. Antashubstaintí príomhúla ag díriú Úsáidtear marcóirí cille nó réigiúin atá ag brath ar shliocht chun aird a tharraingt ar chealla atá imghluaiste in situ ar an sliseanna, agus ina dhiaidh sin úsáidtear antashubstaintí tánaisteacha mar aon le ruaim frithshainithe a dhíríonn ar núicléas (m.sh., 4′,6-diamidino-2-feiniléin) indól, DAPI) nó F-aictin (m.sh., falloidin lipéadaithe go fluaraiseach). Is féidir íomháú beo bunaithe ar fhluaraiseacht a dhéanamh in situ freisin chun táirgeadh múcas a bhrath (Fíor 1, “Difreáil cille” agus “Fiseolaíocht gut”), coilíniú randamach cealla miocróbach (Fíor 1, “Comhchultúr óstach-miocrób”), earcú cealla imdhíonachta (Fíor 1, 'Samhaltú Galar') nó imlínte moirfeolaíochta eipitéiliach 3T (Fíor 3c,f agus 4b,c). Agus an gut á mhodhnú ar an sliseanna chun an ciseal uachtarach a dheighilt ón gciseal micreachainéil íochtarach, mar a thuairiscítear i dtagairt. Mar a thaispeántar i bhFíor 2, is féidir moirfeolaíocht eipitéiliach 3T chomh maith leis na micreavilli ar an teorainn scuaibe apical a shamhlú le SEM. (Fíor 3b). Is féidir measúnú a dhéanamh ar léiriú marcóirí difreála trí PCR5 cainníochtúil nó seicheamhú RNA aoncheallach a dhéanamh. Sa chás seo, baintear sraitheanna 3T de chealla eipitéiliacha a fhásann i sceallóga gut nó sceallóga hibrideacha trí thrípsíniú agus úsáidtear iad ansin le haghaidh anailíse móilíní nó géiniteach.
a, Sreabhadh oibre le haghaidh ionduchtú moirfeiginéis intestinal i sliseanna hibrideach. Úsáidtear Caco-2 agus orgánóidigh intestinal sa phrótacal seo chun moirfeiginéis 3T a léiriú in ardán sliseanna hibrideach. Cuireadh síolta ar chealla eipitéiliacha scartha i n-ionchuir Transwell ullmhaithe (ullmhúchán TW; féach an figiúr thíos). Nuair a cuireadh síolta ar na cealla agus nuair a ceanglaíodh iad le scannáin poileistear i n-ionchuir Transwell, saothraíodh na cealla go léir faoi choinníollacha statach (cultúr TW). Tar éis 7 lá, comhtháthaíodh iontráil Transwell aonair ina raibh ciseal monolateral 2T de chealla eipitéiliacha i sliseanna hibrideach chun sreabhadh basolateral a thabhairt isteach (Flow, BL), rud a d'fhág go raibh ciseal eipitéiliach 3T (moirfeiginéis) ginte sa deireadh. Micreagraif chodarsnachta céime a thaispeánann gnéithe moirfeolaíocha de chealla eipitéiliacha orgán daonna díorthaithe ó ghnáth-dheontóra (líne C103) ag dul suas colon ag gach céim nó pointe ama turgnamhach. Léiríonn na sceitseacha sna sraitheanna uachtaracha an chumraíocht turgnamhach do gach céim.b, Is féidir le sceitseacha hibrideacha (sceitseach ar chlé) moirfeiginéis 3T de chealla eipitéiliacha orgánóideacha a bheith mar thoradh orthu le Radharcanna micreascópachta comhfhócasacha barr-síos a tógadh ag suíomhanna Z éagsúla (uachtarach, lár, agus íochtarach; féach an sceitseamrach ar dheis agus na línte poncaithe comhfhreagracha). léirigh siad tréithe moirfeolaíocha soiléire. F-actin (cian), núicléas (liath). c, Micreaghraif chomhfhócasacha fluaraiseachta (radharc uilleach 3T) de chealla eipitéiliacha díorthaithe ó orgánóidigh a saothraíodh i Transwell statach (TW; iontráil laistigh den bhosca bán poncaithe) i gcoinne sliseanna hibrideach (an urchar iomlán is mó) ag comparáid idir moirfeolaíocht 2T agus 3T, faoi seach. Taispeánann péire radharcanna tras-ghearrtha ingearacha 2T (iontráil sa chúinne uachtarach ar dheis; “XZ”) gnéithe 2T agus 3T freisin. Barra scála, 100 µm. c Athchlóite le cead ó thagairt. 4. Elsevier.
Is féidir rialuithe a ullmhú trí na cealla céanna (Caco-2 nó cealla eipitéiliacha orgánóideacha intestinal) a shaothrú i sraitheanna monach dháthoiseacha faoi choinníollacha saothraithe statach traidisiúnta. Is suntasach go bhféadfadh ídiú cothaitheach a bheith mar thoradh ar acmhainn toirte teoranta na micreachainéil (i.e. ~4 µL sa chainéal barr ar an dearadh sliseanna gut bunaidh). Dá bhrí sin, is féidir moirfeolaíocht eipitéiliach roimh agus tar éis cur i bhfeidhm sreabhadh basolateral a chur i gcomparáid freisin.
Ba chóir an próiseas litagrafaíochta bog a dhéanamh i seomra glan. I gcás gach ciseal ar an sliseanna (sraitheanna uachtaracha agus íochtaracha agus seicní) agus sceallóga hibrideacha, úsáideadh fótamaisc éagsúla agus monaraíodh iad ar shliseoga sileacain ar leithligh toisc go raibh airde na micreachainéil difriúil. Is iad 500 µm agus 200 µm, faoi seach, airde sprice na micreachainéil uachtaracha agus íochtaracha den ghoile ar an sliseanna. Is é 200 µm airde sprice an chainéil don sliseanna hibrideach.
Cuir sceallóg sileacain 3 orlach i mias le haicéatón. Corraigh an pláta go réidh ar feadh 30 soicind, ansin triomaigh an sceallóg san aer. Aistrigh an sceallóg go pláta le IPA, ansin rothlaigh an pláta ar feadh 30 soicind le glanadh.
Is féidir tuaslagán piranha (meascán de shárocsaíd hidrigine agus aigéad sulfarach tiubhaithe, 1:3 (toirt/toirt)) a úsáid go roghnach chun an oiread iarmhair orgánacha agus is féidir a bhaint as dromchla an sceallóige sileacain.
Tá tuaslagán piranha thar a bheith creimneach agus gineann sé teas. Tá réamhchúraimí sábháilteachta breise riachtanach. Chun dramhaíl a dhiúscairt, lig don tuaslagán fuarú agus aistrigh go coimeádán dramhaíola glan, tirim é. Bain úsáid as coimeádáin thánaisteacha agus lipéadaigh coimeádáin dramhaíola i gceart. Lean treoirlínte sábháilteachta na saoráide le haghaidh nósanna imeachta níos mionsonraithe.
Díhiodráitigh na vaiféir trí iad a chur ar phláta te 200 °C ar feadh 10 nóiméad. Tar éis díhiodráitithe, croitheadh ​​an vaiféir cúig huaire san aer le fuarú.
Doirt ~10 g de fhótafhriotaíocht SU-8 2100 ar lár an tsliabh sileacain glanta. Bain úsáid as tweezers chun an fhótafhriotaíocht a scaipeadh go cothrom ar an slabh. Ó am go ham, cuir an slabh ar phláta te 65°C chun an fhótafhriotaíocht a dhéanamh níos lú greamaitheach agus níos éasca a scaipeadh. Ná cuir an slabh go díreach ar an pláta te.
Dáileadh SU-8 go cothrom ar an vaiféar trí sciath sníomha a rith. Cláraigh rothlú isteach an SU-8 ar feadh 5–10 soicind chun é a iomadú ag 500 rpm ag luasghéarú 100 rpm/s. Socraigh an príomh-sníomh le haghaidh patrúnú tiús 200 µm ag 1,500 rpm, nó bain amach tiús 250 µm (ag déanamh airde 500 µm don tsraith uachtarach den ghoile ar an sliseanna; féach “Céimeanna criticiúla” thíos) socraithe ag luasghéarú 300 rpm/s 30 soicind ag 1,200 rpm.
Is féidir an príomhluas sníomha a choigeartú de réir thiús sprice an phatrúin SU-8 ar an sceallóg sileacain.
Chun patrúin SU-8 de 500 µm ar airde a mhonarú don tsraith uachtarach den ghoile ar an sliseanna, rinneadh na céimeanna sciath sníomha agus bácála bog den Bhosca seo (céimeanna 7 agus 8) arís agus arís eile go seicheamhach (féach céim 9) chun dhá shraith de shraith 250 µm tiubh de SU-8 a tháirgeadh, ar féidir iad a shraitheadh ​​agus a cheangal le chéile trí nochtadh UV i gcéim 12 den bhosca seo, rud a chruthaíonn sraith 500 µm ar airde.
Bácáil na vaiféir atá brataithe le SU-8 go bog trí na vaiféir a chur go cúramach ar phláta te ag 65 °C ar feadh 5 nóiméad, ansin aistrigh an socrú go 95 °C agus gorlaigh ar feadh 40 nóiméad breise.
Chun airde 500 μm den phatrún SU-8 a bhaint amach sa mhicreachainéal uachtarach, déan céimeanna 7 agus 8 arís chun dhá shraith SU-8 250 μm ar tiús a ghiniúint.
Ag baint úsáide as an Ailínitheoir Masc UV, déan tástáil lampa de réir threoracha an mhonaróra chun am nochta an tsaiféir a ríomh. (am nochta, ms) = (dáileog nochta, mJ/cm2)/(cumhacht lampa, mW/cm2).
Tar éis an t-am nochta a chinneadh, cuir an fótamasc ar shealbhóir masc an ailíneora masc UV agus cuir an fótamasc ar an vaiféar brataithe SU-8.
Cuir dromchla clóite an fhóta-mhaisc go díreach ar an taobh den sceallóg sileacain atá brataithe le SU-8 chun scaipeadh UV a íoslaghdú.
Nochtaigh an vaiféar brataithe SU-8 agus an fótamasc go hingearach do 260 mJ/cm2 de sholas UV don am nochta réamhchinntithe (féach céim 10 den bhosca seo).
Tar éis nochtadh UV, bácáileadh sliseáin sileacain atá brataithe le SU-8 ag 65°C ar feadh 5 nóiméad agus 95°C ar feadh 15 nóiméad ar gach pláta te chun patrúin a mhonarú le hairde 200 μm. Síneadh an t-am iar-bhácála ag 95°C go 30 nóiméad chun patrúin a mhonarú le hairde 500 µm.
Doirttear an forbróir isteach i mias gloine, agus cuirtear an vaiféar bácáilte sa mhias. Féadfaidh méid an fhorbróra SU-8 athrú ag brath ar mhéid an phláta gloine. Déan cinnte go n-úsáideann tú go leor forbróra SU-8 chun SU-8 neamhnochtaithe a bhaint go hiomlán. Mar shampla, agus mias gloine 150 mm ar trastomhas agus toilleadh 1 L á úsáid agat, bain úsáid as ~300 mL de fhorbróir SU-8. Forbair an múnla ar feadh 25 nóiméad le rothlú réidh ó am go chéile.
Sruthlaigh an múnla forbartha le ~10 mL de fhorbróir úr agus ina dhiaidh sin IPA tríd an tuaslagán a spraeáil ag baint úsáide as pipéad.
Cuir an vaiféar i nglantóir plasma agus nochtaigh é do phlasma ocsaigine (gás atmaisféarach, brú sprice 1 × 10−5 Torr, cumhacht 125 W) ar feadh 1.5 nóiméad.
Cuir an vaiféar i dtriomadóir folúis le sleamhnán gloine istigh ann. Is féidir vaiféir agus sleamhnáin a chur taobh le taobh. Má tá an triomadóir folúis roinnte ina roinnt sraitheanna le pláta, cuir na sleamhnáin sa seomra íochtarach agus na vaiféir sa seomra uachtarach. Doirt 100 μL de thuaslagán tríchlóra(1H, 1H, 2H, 2H-peirfhluairoctil)siláin ar shleamhnán gloine agus cuir folús i bhfeidhm le haghaidh silanúcháin.
Leáigh fial de chealla Caco-2 reoite i ndabhach uisce 37°C, ansin aistrigh na cealla leáite go fleascán T75 ina bhfuil 15 mL de mheán Caco-2 réamhthéite 37°C.
Chun cealla Caco-2 a rith ag comhshreabhadh ~90%, téigh meán Caco-2, PBS, agus 0.25% trypsin/1 mM EDTA i ndabhach uisce 37°C ar dtús.
Súigh an meán trí shú folúis. Nigh na cealla faoi dhó le 5 mL de PBS te trí shú folúis a athdhéanamh agus PBS úr a chur leis.