Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tacaíocht teoranta ag an leagan brabhsálaí atá in úsáid agat do CSS. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó modh comhoiriúnachta a mhúchadh in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánfaimid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Bunaíonn morphogenesis gut daonna gnéithe crypt-villus de microarchitecture epithelial 3D agus eagraíocht spásúil.Tá an struchtúr uathúil seo ag teastáil chun homeostasis gut a chothabháil tríd an nideoige gascheall sa crypt basal a chosaint ó antaiginí miocróbach exogenous agus a gcuid meitibilítí. Ina theannta sin, villi intestinal agus secreting mucus láthair, feidhmiúil difreáilte cealla epithelial cealla epithelial cosanta le haghaidh epithelial cealla epithelial cosanta ar dhromchla na cealla epithelial intestinal difreáilte. Tá struchtúir ríthábhachtach chun samhlacha gut in vitro a thógáil.Go háirithe, is féidir leis an gut-ar-a-sliseanna mimetic orgánach a chothódh morphogenesis 3D spontáineach den epithelium intestinal le feidhmeanna fiseolaíocha feabhsaithe agus biomechanics.Seo, a chuirimid ar fáil prótacal inatáirgthe a aslú go láidir morphogenesis sa gut ar gléas microfluidic trasdultach mionsonraithe. comh-2 nó cealla epithelial orgánaí intestinal i suímh traidisiúnta chomh maith le ar ardán microfluidic, ionduchtú morphogenesis 3D, agus a thréithriú epithelia 3D bunaithe ag baint úsáide as módúlachtaí íomháithe iolracha .This prótacal a bhaint amach athghiniúint microarchitecture gut feidhme trí rialú sreabhadh sreabhach basthaobhach do 5 d. .Táimid ag súil go bhféadfadh impleachtaí leathana a bheith ag ár bprótacal molta don phobal taighde bithleighis, ag soláthar modh chun sraitheanna epithelial intestinal 3D a athnuachan in vitro le haghaidh feidhmeanna bithleighis, cliniciúla agus cógaisíochta.
Léiríonn turgnaimh gur féidir le cealla epithelial intestinal Caco-2 saothraithe i gut-on-a-sliseanna1,2,3,4,5 nó feistí micreashreabhán déchiseal6,7 dul faoi morphogenesis 3D spontáineach in vitro gan tuiscint shoiléir ar an meicníocht bhunúsach. Tá sé léirithe ag Caco-2 agus orgánaigh stéigeach a dhíorthaigh othar.Sa staidéar seo, dhíríomar go sonrach ar tháirgeadh cille agus dáileadh comhchruinnithe antagonist Wnt cumhachtach, Dickkopf-1 (DKK-1), i gut-ar-a-sliseanna agus gléasanna micreashreabhach mionathraithe ina bhfuil Ionsáigh Transwell, ar a dtugtar "Hibrid Chip". Coscann Soggy-1 go dtí an gut ar-sliseanna morphogenesis nó cuireann sé isteach ar an gciseal epithelial réamhstruchtúrtha 3D , rud a thugann le tuiscint go bhfuil strus freasúla le linn cultúir freagrach as morphogenesis intestinal in vitro. Dá bhrí sin, is é cur chuige praiticiúil chun morphogenesis láidir a bhaint amach ag an gcomhéadan epithelial ná leibhéil antagonists Wnt a bhaint nó a chothabháil sa chuid baso-thaobhach nó guthaonach gníomhach sa chuid baso-taobhach nó gutagonish. -a-sliseanna ardáin) nó idirleathadh .Basolateral media (m.sh., ó Transwell isteach i taiscumair basolateral móra i toibreacha).
In this protocol, we provide a detailed method for fabricating gut-on-a-chip microdevices and Transwell-insertable hybrid chips (steps 1-5) to culture intestinal epithelial cells on polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membranes (steps 6A, 7A, 8, 9) or polyester membranes of Transwell inserts (steps 6B, 7B, 8, 9) and induced 3D morphogenesis in vitro (step 10).We also identified cellular and molecular features indicative of tissue-specific histogenesis and lineage-dependent cellular differentiation by applying multiple imaging modalities (steps 11-24).We induce morphogenesis using human intestinal epithelial cells, such as Caco-2 or intestinal organoids, in two culture formats with technical details including surface modification of porous membranes, creation of 2D monolayers, and intestinal biochemical and Reproduction of the biomechanical microenvironment.in vitro.To induce 3D morphogenesis from 2D epithelial monolayers, we removed morphogen antagonists in both cultured forms by flowing the medium into the basolateral compartment of the culture.Finally, we provide a representation of the utility of a regenerable 3D epithelial layer that can be used to model morphogen-dependent epithelial growth, longitudinal host-microbiome co-cultures, pathogen infection, inflammatory injury, epithelial barrier dysfunction, and probiotic-based therapies Example.influences.
D'fhéadfadh ár bprótacal a bheith úsáideach do raon leathan eolaithe i mbun-thionchar leathan (m.sh., bitheolaíocht mucosal stéigeach, bitheolaíocht gascheall, agus bitheolaíocht forbraíochta) agus taighde feidhmeach (m.sh., tástáil drugaí réamhchliniciúil, samhaltú galair, innealtóireacht fíocháin, agus gaistreintreolaíocht). comharthaí le linn forbairt stéigeach, athghiniúint nó homeostasis. Chomh maith leis sin, tá ár bprótacal úsáideach chun ionfhabhtú a cheistiú faoi oibreáin thógálacha éagsúla cosúil le Norovirus 8, Siondróm Riospráide Géar Géar Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 nó Vibrio cholerae.Tá an lucht féachana ar phaiteolaíocht an ghalair agus pataiginéis úsáideach freisin.D’fhéadfadh úsáid chóras micrfiseolaíochta gut ar-sliseanna comhchultúr fadaimseartha 10 a cheadú agus measúnú ina dhiaidh sin ar chosaint óstaigh, freagairtí imdhíonachta agus deisiú díobhála pataigineach sa chonair gastrointestinal (GI) 11 . ullmhaítear sraitheanna epithelial trí úsáid a bhaint as sraitheanna epithelial intestinal 3D an othair, áirítear ar na galair seo atrophy villous, giorrú cripte, damáiste mucosal, nó bacainn epithelial lagaithe. Bithóipse nó orgánoidí stéigeach díorthaithe gascheall12,13. microarchitectures villus-crypt.cealla imdhíonachta a bhaineann go sonrach le fíocháin, 5.
Ós rud é gur féidir micreastruchtúr epithelial 3D a shocrú agus a léirshamhlú gan an próiseas rannta, d'fhéadfadh go mbeadh suim ag lucht féachana atá ag obair ar thras-scríbhinní spásúla agus íomháú ardtaifigh nó sár-réiteach inár léarscáiliú ar dhinimic spásúlachta na ngéinte agus na bpróitéiní ar nideoga epithelial.Spéis agat in technology.Response to miocróbach nó imdhíonachta stimuli.Furthermore, fadaimseartha óstach-miocróib crosstalk 10, 14 a chomhordaíonn homeostasis gut a bhunú sa chiseal mucosal intestinal 3D trí chomh-cultúr speiceas miocróbach éagsúla, pobail mhiocróbacha nó miocróib fecal, go háirithe sa gut-on-a-chip.Tá an cur chuige seo tarraingteach go háirithe do lucht féachana atá ag déanamh staidéir ar imdhíoneolaíocht mhúcóis, gaistreintreolaíocht, micribhithóim dhaonna, cultúir agus micribhitheolaíocht chliniciúil atá ag iarraidh miocróib gut neamhshaothraithe roimhe seo a chothú sa saotharlann. dóibh siúd atá ag forbairt ardáin scagtha nó bailíochtaithe cógaisíochta, bithleighis nó ard-thréchuir don tionscal bia. Mar chruthúnas ar phrionsabal, léirigh muid le déanaí indéantacht córas ilphléacs ard-tréchur morphogenach inscálaithe chuig formáid pláta 24-tobar. saotharlanna, tionscal nó gníomhaireachtaí rialtais agus rialála chun athchlárú ceallach de morphogens gut in vitro a thuiscint ag an leibhéal tras-traipeolaíoch chun drugaí nó bith-theiripeach a thástáil Rinneadh measúnú ar ionsú agus iompar iarrthóirí drugaí ag baint úsáide as ionaid gut 3D nó ag baint úsáide as samhlacha orgán-ar-a-sliseanna saincheaptha nó tráchtála chun in-atáirgtheacht phróiseas morphogenesis gut a mheasúnú.
Baineadh úsáid as líon teoranta samhlacha turgnamhacha a bhaineann leis an duine chun staidéar a dhéanamh ar mhorphogenesis epithelial intestinal, go príomha mar gheall ar an easpa prótacail infheidhmithe chun morphogenesis 3D in vitro a spreagadh. al process.These samhlacha freisin an-teoranta ina gcumas a thástáil ar bhealach il-bhealach Inscálaithe.Therefore, ár prótacal le haghaidh athghiniúint struchtúir fíocháin 3D in vitro níos fearr ná samhlacha in vivo ainmhithe chomh maith le samhlacha traidisiúnta eile statach 2D cultúr cille. Is féidir le sraitheanna epithelial D spás a sholáthar chun staidéar a dhéanamh ar an gcaoi a dtéann cealla miocróbach in iomaíocht le nideoga spásúla agus éabhlóid éiceolaíoch a fhoirmiú mar fhreagra ar fhachtóirí ósta (m.sh., sraitheanna mucus istigh in aghaidh seachtracha, secretion IgA agus peiptídí frithmhiocróbacha). Ina theannta sin, is féidir le moirfeolaíocht epithelial 3D ligean dúinn tuiscint a fháil ar conas a tháirgeann an gut micribhitheog go struchtúrach a bpobail mheitibileacha agus syibíteacha saille (micribhithite a struchtúrú go meitibíteach) a tháirgeann meitibilít saill-aigéid go gearr. eagraíocht cheallacha agus nideoga gascheall sna criptí basal.Ní féidir na gnéithe seo a léiriú ach amháin nuair a bhunaítear sraitheanna epithelial 3D in vitro.
Chomh maith lenár modh a chruthú struchtúir epithelial intestinal 3D, tá roinnt in vitro methods.Intestinal cultúr organoid stát-de-aimseartha teicníc innealtóireachta fíocháin atá bunaithe ar an saothrú na cealla gas intestinal faoi choinníollacha morphogen sonracha23,24,25. cealla dé nó antaiginí exogenous teoranta.Is féidir rochtain ar lumens orgánaigh a fheabhsú trí úsáid a bhaint as microinjector,26,27 ach tá an modh seo ionrach agus dian ar shaothar agus éilíonn sé eolas speisialaithe chun feidhmiú.
Úsáideann cineálacha cur chuige eile atá in úsáid ag grúpaí taighde éagsúla scafaill hidrigil 3D réamhstruchtúrtha chun aithris a dhéanamh ar an struchtúr epithelial gut trí shaothrú cealla aonair intestinal daonna ar an dromchla glóthach. Déan scafallanna hidrogel le húsáid múnlaí 3D-chlóite, micrea-mheilte, nó monaraithe liteagrafaíochta. struchtúr elial agus stroma-epithelial crosstalk trí cealla stromal san áireamh sa scafall.Mar sin féin, d'fhéadfadh nádúr na scafaill réamhstruchtúrtha cosc ​​a chur ar taispeáint an phróisis morphogenetic spontáineach itself.These samhlacha nach bhfuil chomh maith ar fáil luminal dinimiciúil nó sreabhadh interstitial, in easnamh ar an strus lomadh sreabhach gur gá cealla intestinal dul faoi morphogenesis in úsáid le déanaí agus ardán hidreafluarach scafall staidéar eile fiseolaíocha. Struchtúir elial ag baint úsáide as teicnící léasair-eitseáil.Liche orgánóidí intestinal a leanúint patrúin eitseáilte chun foirm struchtúir feadánacha intestinal, agus is féidir sreabhadh sreabhán intraluminal a athchaipitliú ag baint úsáide as modúl microfluidics. feadán, an múnla seo freisin in easnamh ar shreabhadh sreabhach luminal agus dífhoirmiúchán meicniúil.Additionally, d'fhéadfadh inoibritheacht múnla a bheith teoranta, go háirithe tar éis an próiseas bithphriontáil a bheith críochnaithe, perturbing coinníollacha turgnamhacha nó cille-go-cill idirghníomhaíochtaí.In ionad sin, soláthraíonn ár prótacal molta morphogenesis gut spontáineach, strus lomadh fiseolaíoch ábhartha, bithmheicnice a mimic gutility gutility, inrochtaineacht ar mhodhanna neamhspleácha micrea-críochnaíocht compord. ity.Mar sin, féadfaidh ár bprótacal morphogenesis in vitro 3D cur chuige comhlántach a sholáthar chun dúshláin na modhanna atá ann cheana a shárú.
Tá ár bprótacal dírithe go hiomlán ar mhorphogenesis epithelial 3D, gan ach cealla epithelial sa chultúr agus gan aon chineál cealla eile máguaird cosúil le cealla mesenchymal, cealla endothelial, agus cealla imdhíonachta. chun an ciseal epithelial droimneach 3D a athchruthú, ní mór breithniú breise a dhéanamh ar chastacht bhitheolaíoch bhreise cosúil le hidirghníomhaíochtaí epithelial-mesenchymal33,34, sil-leagan Maitrís extracellular (ECM) 35 agus, inár múnla, gnéithe crypt-villus a chuireann nideoga gascheall in iúl i gcriptí basal. vivo35,37,38.Cuireadh cealla mesenchymal lenár múnla feabhas ar an bpróiseas morphogenetic agus éifeachtúlacht astaithe cille.Tá ról tábhachtach ag an gciseal endothelial (ie, ribeadáin nó limfeach) maidir le hiompar móilíneach39 agus earcaíocht chealla imdhíonachta40 a rialáil sa microenvironment gut. Ina theannta sin, taispeánann comhpháirteanna soithíoch ar féidir iad a nascadh le fíocháin endothelial. d'fhéadfadh go mbeadh gá le cealla otelial chun gnéithe fiseolaíocha níos cruinne a shamhaltú le réiteach leibhéal orgán. Tá cealla imdhíonachta díorthaithe ag othair riachtanach freisin chun freagairtí imdhíonachta dúchasacha a thaispeáint, cur i láthair antaigin, crostalk imdhíonachta oiriúnaitheach dúchasach, agus díolúine fíocháin-shonrach i gcomhthéacs aithris a dhéanamh ar ghalar stéigeach.
Tá úsáid sceallóga hibrideacha níos simplí ná gut-ar-a-sliseanna toisc go bhfuil an gléas socraithe níos simplí agus ceadaíonn an úsáid a bhaint as Ionsáigh Transwell do chultúr Inscálaithe an epithelium gut.Mar sin féin, ar fáil ar bhonn tráchtála Transwell iatáin le seicní poileistear hibrideach agus ní féidir insamhail gluaiseachtaí peristaltic-mhaith. Is annamh a chumasaíonn airíonna san urrann apical comhchultúr baictéarach fadtéarmach i sceallóga hibrideacha. Cé gur féidir linn morphogenesis 3D a chothú go láidir i ionsáiteáin Transwell agus sliseanna hibrideacha á n-úsáid, d’fhéadfadh ganntanas bithmheicnice atá ábhartha go fiseolaíoch agus sreabhadh sreabhán apical teorainn a chur le féidearthacht ardáin sliseanna hibrideach le haghaidh feidhmeanna féideartha.
Níor bunaíodh go hiomlán athchóirithe ar scála iomlán an ais crypt-villus daonna i gcultúir gut-ar-a-sliseanna agus hibrideach-ar-a-sliseanna. Ós rud é go dtosaíonn morphogenesis ó monolayer epithelial, ní gá go soláthraíonn microarchitectures 3D cosúlacht moirfeolaíoch le crypts in vivo.Cé gur thréithe muid an daonra cille proliferating in vivo cripte agus an daonra cille proliferating in aice leis an gcill criptín v3. Cé go bhfuil bealaí uachtair níos airde ar an sliseanna mar thoradh ar airde méadaithe an epithelium microengineered, tá an airde uasta fós teoranta do ~ 300-400 µm. Is é doimhneacht iarbhír crypts intestinal daonna sna intestines bheaga agus mhóra ~ 135 µm agus ~ 400 µm, tá an airde intestinal ~ 6 ~ 4 faoi seach, agus vi.
Ó thaobh íomháithe, d'fhéadfadh íomháú sár-réiteach in situ de mhicreiltirí 3D a bheith teoranta don gut ar sliseanna, toisc go bhfuil an t-achar oibre riachtanach ón lionsa oibiachtúil go dtí an ciseal epithelial ar ord cúpla milliméadar.Chun an fhadhb seo a shárú, d'fhéadfadh go mbeadh gá le cuspóir i bhfad i gcéin. den gut ar sliseanna i gceist greamaitheacht buan idir gach ciseal, tá sé thar a bheith dúshlánach a oscailt nó a bhaint as an ciseal uachtair chun scrúdú a dhéanamh ar struchtúr dromchla an ciseal epithelial.Mar shampla, trí úsáid a bhaint as scanadh micreascóp leictreon (SEM).
Bhí hidreafóbacht PDMS ina fhachtóir teorannach i staidéir mhicrea-shreabhach-bhunaithe a dhéileálann le móilíní beaga hidreafóbach, toisc gur féidir le PDMS móilíní hidreafóbach den sórt sin a adsorb go neamhshonrach. Féadfar roghanna eile do PDMS a mheas le hábhair pholaiméireacha eile. Mar mhalairt air sin, is féidir modhnú dromchla PDMS (m.sh., sciath le hábhair lipophilic 432d) nó hidreaciléin a íoslaghdú. móilíní phobic.
Mar fhocal scoir, níl ár modh tréithrithe go maith maidir le scagadh ard-tréchur nó ardán turgnamhach atá éasca le húsáid a sholáthar. Éilíonn an prótacal reatha caidéal steallaire in aghaidh an mhicrifheiste, a ghlacann spás i gorlann CO2 agus a chuireann cosc ​​ar thurgnaimh ar scála mór. nishment agus baint na meán basolateral).
Chun morphogenesis 3D an epithelium intestinal daonna in vitro a aslú, d'úsáideamar gléas intestinal sliseanna microfluidic ina raibh dhá mhicrichainéil chomhthreomhara agus scannán scagach leaisteacha eatarthu chun comhéadan lumen-ribealach a chruthú. Is féidir an nós imeachta turgnamhach iomlán (Fíor 1) a léiriú trí ionramháil treorach a chur i bhfeidhm chun antagonists morphogen a bhaint as an urrann basolateral.Is éard atá sa nós imeachta turgnamhach iomlán (Fíor 1) de chúig chuid: (i) microfabrication an sliseanna gut nó sliseanna hibrideach inchurtha Transwell (céimeanna 1-5; Bosca 1), (ii) ullmhú cealla epithelial intestinal (Caco-2oids);boscaí 2-5), (iii) cultúr na gcealla epithelial intestinal ar sceallóga intestinal nó sceallóga hibrideacha (céimeanna 6-9), (iv) ionduchtú morphogenesis 3D in vitro (céim 10) agus (v) ) chun an microstructure epithelial 3D (céimeanna 11-24) a thréithriú. Ar deireadh, ceapadh grúpa rialaithe cuí faoi bhun an eipideirm mhoirfóil (pléadh níos mó faoi bhun an éifeachtúlacht morphoelial) chun comparáid a dhéanamh idir morphogenesis. le rialuithe spásúla, ama, coinníollach nó nós imeachta.
D’úsáideamar dhá ardán cultúir éagsúla: gut-on-a-sliseanna le cainéil dhíreacha nó cainéil convoluted neamhlíneacha, nó sceallóga hibrideacha ina bhfuil ionsáigh Transwell (TW) i bhfeiste micreashreabhach, déanta mar a thuairiscítear i mBosca 1, agus céim 1 -5.” Léiríonn Déantús an Ghléis” na príomhchéimeanna chun sliseanna aonair nó sliseanna hibrideach a dhéanamh. Léiríonn an nós imeachta a úsáidtear sa phrótacal seo.” Morphogenesis In vitro” na céimeanna foriomlána ina saothraítear cealla epithelial Caco-2 nó orgánaigh-díorthaithe ar shlis intestinal nó ar ionsáí sliseanna hibrideach Transwell, agus ina dhiaidh sin ionduchtú morphogenesis 3D agus foirmiú struchtúr epithelial tréithrithe. Taispeántar uimhir chéim an chláir nó uimhir bhosca faoi bhun gach saigheada. t staidéir fiseolaíochta, bunú éiceachórais ósta-mhiocróbóin, agus samhaltú galair.Íomhánna imdhíonfhluaraiseachta i “Difreálú Cille” a thaispeánann núicléis, F-actin agus MUC2 in iúl sa chiseal epithelial 3D Caco-2 ginte ar an sliseanna gut. Iarmhair N-acetylglucosamine ag baint úsáide as fluaraiseacha miocrób cruithneacht agglutinin.The dhá íomhá forluiteacha i "Ósta-Microbe Comh-Chultúr" léiríonn óstach-microbiome comhchultúr ionadaíoch sa gut ar sliseanna. Léiríonn an painéal ar chlé an comh-chultúr E. coli in iúl próitéin fluaraiseacha glas (GFP) le microengineization cealla áitiúla GFP.2 3th. -cultúrtha le cealla epithelial 3D Caco-2, agus ina dhiaidh staining inmunofluorescence le F-actin (dearg) agus núicléis (gorm). Léiríonn samhaltú galar sláintiúil versus leaky gut i sceallóga athlasadh gut faoi dhúshlán fiseolaíoch le antaiginí baictéarach (m.sh., lipopolysaccharide, LPS) agus cealla imdhíonachta (m.sh., PBMC;glas).Saothraíodh cealla Caco-2 chun barra Scála epithelial 3D.Oxford University Press;Atáirgeadh le cead ó Thag.5.NAS;“Óst-Miocrób Comh-Chultúr” arna oiriúnú le cead ó thag.3.NAS;“Samhaltú Galar” arna oiriúnú le cead ón tagairt.5.NAS.
Rinneadh an dá sliseanna gut-ar-sliseanna agus hibrideach ag baint úsáide as macasamhla PDMS a bhí scartáilte ó mhúnlaí sileacain ag lithography bog1,44 agus patterned le SU-8.Tá dearadh na microchannels i ngach sliseanna a chinneadh trí smaoineamh ar hidridinimiciúil cosúil le strus lomadh agus brú hidridinimiciúil1,4,12. tar éis teacht chun cinn ina gut-ar-a-sliseanna casta (Sonraí Breisithe Fíor. 1b) a chuimsíonn péire micreachainéil chuartha chun méadú ar am cónaithe sreabhán méadaithe, patrúin sreafa neamhlíneacha, agus dífhoirmiúchán il-aiseach na gceall saothraithe (Fíor 2a-f) 12.Nuair is gá bithmheicníocht gut níos casta a athchruthú, is féidir an gut-Chóta a athchruthú go láidir freisin. aslú morphogenesis 3D i bhfráma ama den chineál céanna le leibhéal comhchosúil d'fhás epithelial i gcomparáid leis an Gut-Chip bunaidh, beag beann ar an cineál cille saothraithe.Therefore, chun aslú 3D morphogenesis, líneach agus casta dearaí gut ar-sliseanna idirmhalartaithe. PDMS macasamhla cured ar mhúnlaí sileacain le patrúin SU-8 ar fáil gnéithe diúltacha tar éis demoldig.2a).Chun an gut a dhéanamh ar shlis, ceanglaíodh an ciseal PDMS uachtarach ullmhaithe go seicheamhach le scannán póiriúil PDMS agus ansin ailínithe leis an gciseal PDMS íochtair trí nascáil do-aisiompaithe ag baint úsáide as cóireálacha corónach (Fíor 2b–f). ed Sonraí Fíor. 2).Tá an próiseas nascáil a dhéantar trí chóireáil na dromchlaí an macasamhail PDMS agus gloine le plasma ocsaigine nó cóireáil corónach. Tar éis steiriliú an gléas microfabricated ceangailte leis an fheadáin silicone, bhí an gléas thus réidh a dhéanamh morphogenesis 3D an epithelium intestinal (Fíor 2g).
a, Léaráid scéimreach d'ullmhú páirteanna PDMS ó mhúnlaí sileacain phatrúin SU-8.Doirteadh an tuaslagán PDMS uncured ar mhúnla sileacain (ar chlé), leigheasta ag 60 ° C (lár) agus scartáilte (ar dheis). Gearradh an PDMS scartáilte i bpíosaí agus glanadh é le haghaidh tuilleadh úsáide.b, Grianghraf den mhúnla sileacain a úsáideadh chun an membrane PDMS a mhúnlú chun an ciseal uachtarach a mhúnlú, PDMS.c. sraith de ghrianghraif de na comhpháirteanna PDMS uachtaracha agus íochtaracha agus an gléas stéigeach ar-sliseanna cóimeáilte.e, Scéimreach ailíniú na gcomhpháirteanna PDMS uachtaracha, scannáin, agus íochtaracha.Tá gach ciseal nasctha go dochúlaithe ag plasma nó cóireáil corónach. ic cell culture.The gut déanta ar sliseanna le chéile le feadán silicone agus steallaire cuireadh ar coverlip. Cuireadh an gléas sliseanna ar an clúdach de mias hibrideach 150 mm Petri le haghaidh próiseála.Tá an ceanglóra a úsáidtear a dhúnadh an tube.h silicone, snapshots Amharc de mhonarú sliseanna hibrideach agus 3D morphogenesis ag baint úsáide as sliseanna hibrideach. duce intestinal 3D morphogenesis.The mheán perfused trí microchainnels faoi bhun an ciseal cille a bunaíodh ar an Transwell insert.Scale barra, 1 cm.h Athchló le cead ó tagartha.4.Elsevier.
Sa phrótacal seo, baineadh úsáid as an líne ceall Caco-2 agus orgánaigh stéigeach mar fhoinsí epithelial (Fíor 3a).Saothraíodh an dá chineál cealla go neamhspleách (Bosca 2 agus Bosca 5) agus úsáideadh iad chun micreachainéil brataithe ECM de gut ar-sliseanna nó cuir isteach Transwell a shíolú. a bhaintear chun fionraí cealla dissociated a ullmhú le sreabhach trypsinization (bosca 2).Saothraíodh orgánaigh intestinal daonna ó bithóipsí intestinal nó resections máinliachta i cruinneacháin scafall Matrigel i plátaí 24-tobar chun tacú leis an microenvironment.Medium struchtúrach ina bhfuil moirfíníní riachtanacha (cosúil le Wnt, R-spondin, agus Forlíonadh ar fhás Noggin gach lá) go dtí go d'fhás na fachtóirí 30 forlíonadh gach lá. µm ar trastomhas.Déantar orgánaigh a fhástar go hiomlán a bhaint agus a dhícheangal i gcealla aonair le haghaidh síolú isteach sa phutóg nó cuireann Transwell isteach ar shlis (Bosca 5). Mar a thuairiscigh muid roimhe seo, is féidir é a dhifreáil de réir cineáil galair12,13 (m.sh. colitis ulcerative, galar Crohn, ailse cholaireicteach, nó gnáth-dheontóir), suíomh loit (m.sh., suíomh loit agus loit (m.sh., suíomh loit). jejunum, ileum, cecum, colon, nó rectum). Cuirimid prótacal optamaithe ar fáil i mBosca 5 chun orgánaigh choilíneacha (colóidigh) a shaothrú a dteastaíonn tiúchan níos airde de morphogens orthu de ghnáth ná mar a bhíonn orgánaigh stéigeacha beaga.
a, Sreabhadh oibre le haghaidh ionduchtú morphogenesis gut sa gut chip.Caco-2 epithelium intestinal daonna agus orgánaigh intestinal a úsáid sa phrótacal seo a léiriú morphogenesis 3D. Cuireadh síol na cealla epithelial scoite sa gléas gut-ar-a-sliseanna ullmhaithe (ullmhú sliseanna). Chomh luath agus a síolaítear cealla (síolaithe) agus ceangailte (sreabhadh) i membrane porous (PDMS0) ceangailte leis an lá (PDMS0) porous. agus a chothabháil don chéad 2 lá (sreabhadh, AP, D0-D2).Tionscnaítear sreabhadh basolateral (BL) chomh maith le tairiscintí síneadh timthriallach (stráice, sreabhadh, AP agus BL) nuair a dhéantar monolayer 2D iomlán a fhoirmiú.Intestinal 3D morphogenesis tharla go spontáineach tar éis 5 lá de chultúr microfluidic (moirfeolaíocht-íomhánna codarsnachta pointe Ca5). graf, 100 µm).Ceithre léaráid scéimeacha a léiríonn na cascáidí comhfhreagracha de mhorphogenesis gut (barr ar dheis). Léiríonn na saigheada briste sa scéimre treo an tsreabháin sreabháin.b, íomhá SEM a thaispeánann topology dromchla an epithelium bunaithe 3D Caco-2 (ar chlé). Taispeánann an inset a aibhsíonn an t-achar daise-3D micreathonnaithe (ar chlé). c, Radharc tosaigh cothrománach ar Caco-2 bunaithe 3D, claudin (ZO-1, dearg) agus seicní teorann scuab leanúnach lipéadaithe F-actin (glas) agus núicléis (gorm) Immunofluorescence Amharcléiriú comhfocal de chealla epithelial ar sceallóga intestinal.Saigheada atá dírithe ar an scéimre lár in iúl ar an suíomh na n-athruithe morphologach ar an gcúrsa fócasach de chips. trí mhicreascópacht chodarsnachta céime ar laethanta 3, 7, 9, 11, agus 13. Léiríonn an inset (barr ar dheis) an formhéadú ard ar an íomhá ar fáil.e, DIC photomicrograph de epithelium organoid 3D a bunaíodh sa gut ar slice a glacadh ar an lá 7.f, íomhánna immunofluorescence forleagtha ag taispeáint marcóirí do gascheall (LGR5;magenta), cealla goblet (MUC2; glas), F-actin (liath) agus núicléis (cian) tar éis fás ar sliseanna gut ar feadh 3 lá, faoi seach (Clé) agus 13-lá (lár) organoids ar an ciseal epithelial. bunaithe sa gut ar sliseanna ag staining an membrane plasma le dath CellMask (ar dheis) ar an lá 13 de chultúir.Tá barra scála 50 μm mura sonraítear a mhalairt.b Athchló le cead ó thagairt.2.Oxford University Press;c Arna chur in oiriúint le cead ón Tagairt.2.Oxford University Press;e agus f curtha in oiriúint le cead faoi threoir.12 Faoi Creative Commons License CC BY 4.0.
Sa gut ar sliseanna, tá sé riachtanach a mhodhnú ar an dromchla hidreafóbach an membrane scagach PDMS le haghaidh sciath ECM rathúil.Sa phrótacal seo, cuirimid i bhfeidhm dhá mhodh éagsúla a mhodhnú ar an hidreafóbacht na seicní PDMS.For shaothrú cealla Caco-2, gníomhachtú dromchla trí chóireáil UV / ózóin ina n-aonar ba leor chun laghdú ar an hidreafóbacht an dromchla PDMS, cóta na cealla membrane ECM-PD2. Éilíonn epithelium oid feidhmiúil dromchla atá bunaithe ar cheimiceáin chun taisceadh éifeachtach próitéiní ECM a bhaint amach trí pholaitiléinimine (PEI) agus glutaraldehyde a chur i bhfeidhm go seicheamhach ar mhicreacainéil PDMS.Tar éis modhnú dromchla, taisceadh próitéiní ECM chun an dromchla PDMS feidhmiúil a chlúdach agus ansin tugadh isteach sa epithelium orgánóideach scoite amach, ach tar éis an microchannel orgánaigh a bheith ceangailte leis na cealla uachtaracha. cruthaíonn cealla monolayer iomlán, agus coinníonn an micreachainéal níos ísle coinníollacha statacha. Leis an modh optamaithe seo le haghaidh gníomhachtú dromchla agus sciath ECM is féidir epithelium orgánaigh a cheangal chun morphogenesis 3D a chothú ar dhromchla an PDMS.
Teastaíonn sciath ECM ó chultúir Transwell freisin sula gcuirtear síolú cille;Mar sin féin, ní gá cultacha Transwell céimeanna casta pretreatment a ghníomhachtú an dromchla na inserts scagach.For fás cealla Caco-2 ar Ionsáigh Transwell, ECM sciath ar Ionsáigh scagach dlús a chur iatán cealla Caco-2 dissociated (<1 uair) agus foirmiú bacainn acomhal daingean (<1-2 lá). monolayer iomlán le sláine bhacainn. Déantar cultúir Transwell i plátaí 24-tobar gan úsáid a bhaint as sliseanna hibrideach.
Is féidir in vitro morphogenesis 3D a thionscnamh trí shreabhadh sreabhach a chur i bhfeidhm ar an ngné basolateral de chiseal epithelial bunaithe. Sa gut ar sliseanna, thosaigh morphogenesis epithelial nuair a bhí an mheán perfused isteach sa microchainels uachtair agus íochtair (Fíor 3a). chun cealla faoi cheangal ar seicní scagach agus a ghiniúint strus lomadh lonrúil, ní mór dúinn iarratas a dhéanamh de ghnáth sreabhadh dé sa gut ar sliseanna.I sliseanna hibrideach, Transwell Ionsáigh ina bhfuil monolayers epithelial cuireadh isteach sa sliseanna hibrideach. Ansin, cuireadh an mheán i bhfeidhm faoin taobh basolateral den Transwell scagach isteach tríd an microchannel.Intestinal morphogenesis initiation ardán tar éis 3-5 lá tar éis an chultúir basolateral.
Is féidir anailís a dhéanamh ar ghnéithe moirfeolaíocha na sraitheanna epithelial 3D micrea -innealtóireachta trí mhódúlachtaí íomháithe éagsúla a chur i bhfeidhm, lena n -áirítear micreascópacht chodarsnachta céimnithe, codarsnacht cur isteach difreálach (DIC), SEM, nó imdhíonfhluaraiseacht chuisniúcháin micreascópachta a dhéanamh go héasca i rith an chiorclach agus an t -imdhíonadh. Is féidir le trédhearcacht optúil PDMS agus scannáin poileistir, na hardáin ghut-on-a-sliseanna agus sliseanna hibrideacha íomháú fíor-ama in situ a sholáthar gan an gá atá le rannán a roinnt nó a dhí-chomhdhlúthú. 2% (wt/vol)) albaimin serum bólachta (BSA), in ord. O-2-phenylene) indole, DAPI) nó F-actin (m.sh., lipéad fluaraiseach lipéadaithe).1, "Difreáil Cell" agus "fiseolaíocht Gut"), coilíniú randamach de chealla mhiocróbacha (Fíor 1, "Óstach-miocrób comh-cultúr") , earcú cealla imdhíonachta (Fíor 1, 'Samhaltú Galar') nó comhrianta de mhoirfeolaíocht epithelial 3D (Fig. mar a thuairiscítear i ref.Mar a léirítear i bhFíor 2, is féidir leis an mhoirfeolaíocht epithelial 3D chomh maith leis an microvilli ar an teorainn scuab apical a shamhlú ag SEM (Fíor 3b).Is féidir léiriú marcóirí difreála a mheasúnú trí PCR5 cainníochtúil nó seicheamhú RNA aonchealla. a úsáidtear le haghaidh anailíse móilíneach nó ghéiniteach.
a, Sreabhadh oibre le haghaidh ionduchtú morphogenesis intestinal i sliseanna hibrideach.Caco-2 agus orgánaigh intestinal a úsáidtear sa phrótacal seo a léiriú morphogenesis 3D i sliseanna hibrideach platform.Dissociated cealla epithelial síolaíodh i iatáin Transwell ullmhaithe (TW prep; féach an figiúr thíos). Chomh luath agus a bhí síolú cealla (síolaithe) agus ceangailte le seicní poileistir cuireadh isteach i gcultúr Transwell 7 amháin (TW). ina raibh monolayer 2D de chealla epithelial a chomhtháthú isteach i sliseanna hibrideach a thabhairt isteach sreabhadh basolateral (Sreabhadh, BL), a ba chúis ar deireadh thiar a ghiniúint ciseal epithelial 3D (morphogenesis). Micreagraif codarsnachta Céim léiríonn gnéithe moirfeolaíocha na cealla epithelial orgán daonna a dhíorthaítear ó ghnáth-deontóir (C103 líne) colon ardaitheach ag gach pointe turgnamhacha céime nó sraitheanna uachtaracha. is féidir le sceallóga droichid (schematic ar chlé) a bheith mar thoradh ar mhorphogenesis 3D de chealla epithelial orgánaigh le radharcanna micreascópachta comhfhócasacha ón mbarr anuas a thógtar ag suíomhanna éagsúla Z (uachtair, lár, agus íochtair;féach ar dheis scéimreach agus línte poncanna comhfhreagracha).léirigh tréithe moirfeolaíocha soiléire.F-actin (cian), núicléas (liath).c, micreagraif chomhfhócasacha fhluaraiseachta (amharc 3D uillinne) de chealla epithelial díorthaithe orgánaigh atá saothraithe i Transwell statach (TW; inset laistigh den bhosca bán briste) i gcoinne sliseanna hibrideach (an lámhaigh iomlán is mó) ag déanamh comparáide de mhoirfeolaíocht péire 2D in aghaidh an chrosghearrtha ar dheis, radhairc 3D sa choirnéal uachtarach faoi seach. “XZ”) taispeáin freisin gnéithe 2T agus 3D. Barra scála, 100 µm.c Athchló le cead ó thagairt.4.Elsevier.
Is féidir rialuithe a ullmhú trí na cealla céanna (Caco-2 nó cealla epithelial orgánaí intestinal) a shaothrú ina monaiméirí déthoiseacha faoi choinníollacha cultúir statacha traidisiúnta.Go háirithe, d'fhéadfadh ídiú cothaitheach a bheith mar thoradh ar chumas toirte teoranta na micrichainéil (ie ~4 µL sa chainéal barr ar an dearadh gut-sliseanna bunaidh).
Ba chóir an próiseas liteagrafaíocht bog a dhéanamh i room.For gach ciseal ar an sliseanna (sraitheanna uachtair agus íochtair agus seicní) agus sliseanna hibrideach, baineadh úsáid as photomasks éagsúla agus déanta ar sliseog sileacain ar leith toisc go raibh airde na microchainels difriúil. µm.
Cuir wafer sileacain 3-orlach i mias le haicéatón. Cuir an pláta go réidh ar feadh 30 soicind, ansin aer tirim an wafer.Aistrigh an wafer chuig pláta le IPA, ansin casadh an pláta ar feadh 30 s le glanadh.
Is féidir tuaslagán piranha (meascán sárocsaíd hidrigine agus aigéad sulfarach tiubhaithe, 1:3 (toirt / toirt)) a úsáid go roghnach chun baint na n-iarmhar orgánach as an dromchla sliseog sileacain a uasmhéadú.
Tá réiteach Piranha thar a bheith creimneach agus gineann sé teas.Tá réamhchúraimí sábháilteachta breise riachtanach.Chun diúscairt dramhaíola, lig don réiteach fuarú agus aistriú chuig coimeádán dramhaíola tirim glan. Úsáid coimeádáin tánaisteacha agus lipéadaigh coimeádáin dramhaíola i gceart. Lean treoirlínte sábháilteachta na háise le haghaidh nósanna imeachta níos mionsonraithe.
Déan na sliseog a dhíhiodráitiú trí iad a chur ar phláta te 200 °C ar feadh 10 nóiméad. Tar éis díhiodráitithe, rinneadh an sliseog a chroitheadh ​​san aer cúig huaire chun fuarú.
Doirt ~10 g de photoresist SU-8 2100 isteach i lár an wafer sileacain glanta. Úsáid tweezers chun an photoresist a scaipeadh go cothrom ar an wafer. Uaireanta cuir an wafer ar phláta te 65 ° C chun an photoresist a dhéanamh níos lú greamaitheach agus níos éasca le scaipeadh.Ná cuir an wafer díreach ar an pláta te.
Dáileadh SU-8 go cothrom ar an wafer trí sciath casadh a rith. Déan rothlú ag teacht isteach ar an SU-8 do 5-10 s a ríomh chun iomadú ag 500 rpm ag luasghéarú 100 rpm/s. gut ar an tslis; féach “Céimeanna criticiúla” thíos) socraithe ag luasghéarú 300 rpm/s 30 soicind ag 1,200 rpm.
Is féidir an luas casadh is mó a choigeartú de réir thiús sprice an patrún SU-8 ar an wafer sileacain.
Chun patrúin SU-8 d'airde 500 µm a dhéanamh le haghaidh ciseal uachtarach an ghut ar an sliseanna, rinneadh an sciath casadh agus céimeanna bácála bog an Bhosca seo (céimeanna 7 agus 8) a athdhéanamh go seicheamhach (féach céim 9) chun dhá shraith de 250 µm a tháirgeadh Ciseal tiubh de SU-8, ar féidir iad a srathú agus a cheangal le ciseal UV a nochtadh sa chéim seo 0.0 µ
Bácáil na sliseog SU-8 brataithe go bog trí na sliseog a chur go cúramach ar phláta te ag 65 °C ar feadh 5 nóiméad, ansin aistrigh an socrú go 95 °C agus gor ar feadh 40 nóiméad breise.
Chun airde 500 μm de phhatrún SU-8 a bhaint amach sa mhicrichannel uachtarach, déan céimeanna 7 agus 8 arís chun dhá shraith SU-8 250 μm tiubh a ghiniúint.
Ag baint úsáide as an Ailíneoir Masc UV, déan tástáil lampa de réir threoracha an déantóra chun am nochta an wafer a ríomh. (am nochta, ms) = (dáileog nochta, mJ/cm2)/(cumhacht lampa, mW/cm2).
Tar éis an t-am nochta a chinneadh, cuir an photomask ar shealbhóir masc an ailínithe masc UV agus cuir an photomask ar an wafer brataithe SU-8.
Cuir dromchla clóite an photomask go díreach ar an taobh brataithe SU-8 den wafer sileacain chun scaipeadh UV a íoslaghdú.
Nocht an wafer brataithe SU-8 agus an masc fótagrafach go hingearach do 260 mJ/cm2 de sholas UV ar feadh an t-am nochta réamhchinnte (féach céim 10 den bhosca seo).
Tar éis nochtadh UV, bácáladh sliseog sileacain SU-8-brataithe ag 65 ° C ar feadh 5 nóiméad agus 95 ° C ar feadh 15 nóiméad ar gach pláta te chun patrúin le airde 200 μm a dhéanamh.
Déantar an forbróir a dhoirteadh isteach i mias gloine, agus cuirtear an wafer bácáilte sa mhias.D'fhéadfadh méid an fhorbróra SU-8 a bheith éagsúil ag brath ar mhéid an phláta gloine.Déan cinnte go leor forbróir SU-8 a úsáid chun SU-8.8.8 a bhaint go hiomlán gan nochtadh.
Sruthlaigh an múnla forbartha le ~10 ml d'fhorbróir úr agus an IPA ina dhiaidh sin tríd an tuaslagán a spraeáil le pípéad.
Cuir an wafer i nglantóir plasma agus nocht do phlasma ocsaigine (gás atmaisféarach, brú sprice 1 × 10−5 Torr, cumhacht 125 W) ar feadh 1.5 nóiméad.
Cuir an triomadán i bhfolús triomadán le sleamhnán gloine taobh istigh.Is féidir wafers agus sleamhnáin a chur taobh le taobh.Má roinntear an triomadán folúis i roinnt sraitheanna ar phláta, cuir na sleamhnáin sa seomra íochtair agus na sliseog sa seomra uachtarach.Drop 100 μL de trichloro(1H, 1H, tuaslagán folúis ar 2Hct), cuir i bhfeidhm ar shleamhnán folúis-2Hct, ar shleamhnán gloine-2, cuir i bhfeidhm ar shleamhnán folúis-2Hct .
Leáigh vial de chealla Caco-2 reoite i ndabhach uisce 37°C, ansin aistrigh na cealla leáite go dtí fleascán T75 a bhfuil 15 ml de mheán Caco-2 réamhthéite 37°C ann.
Chun cealla Caco-2 a phasáil ag comhlí ~ 90%, an chéad mheán te Caco-2, PBS, agus 0.25% trypsin/1 mM EDTA i ndabhach uisce 37°C.
Asúigh an meán trí asúite bhfolús. Nigh cealla faoi dhó le 5 ml de PBS te trí asúite bhfolús a athrá agus PBS úr a chur leis.