Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá leagan brabhsálaí in úsáid agat le tacaíocht theoranta CSS. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer). Ina theannta sin, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánaimid an suíomh gan stíleanna ná JavaScript.
Taispeánann sé carúsal de thrí shleamhnán ag an am céanna. Úsáid na cnaipí Roimhe Seo agus Ar Aghaidh chun bogadh trí thrí shleamhnán ag an am céanna, nó úsáid na cnaipí sleamhnáin ag an deireadh chun bogadh trí thrí shleamhnán ag an am céanna.
Cuireann an bac fola-inchinne agus an bac fola-inchinne cosc ​​ar ghníomhairí biththeiripeacha a spriocanna a bhaint amach sa lárchóras néarógach, rud a chuireann bac ar chóireáil éifeachtach galair néareolaíocha. Chun iompróirí inchinne nua a aimsiú in vivo, thugamar isteach leabharlann peiptíde faga T7 agus bhailíomar fuil agus sreabhán cheirbreasdromlaigh (CSF) go sraitheach ag baint úsáide as samhail linn snámha móir chomhfhiosach cannúlaithe de francaigh. Rinneadh clóin fhagaí sonracha a shaibhriú go mór i CSF tar éis ceithre bhabhta roghnúcháin. Léirigh tástáil ar pheiptídí iarrthóra aonair níos mó ná saibhriú 1000-huaire i CSF. Deimhníodh bithghníomhaíocht an tseachadta idirghabhála peiptíde chuig an inchinn le laghdú 40% ar leibhéal amyloid-β sa sreabhán cheirbreasdromlaigh ag baint úsáide as coscaire peiptíde BACE1 atá nasctha leis an peiptíd idirthurais nua a aithníodh. Tugann na torthaí seo le fios gur féidir leis na peiptídí a aithníodh trí mhodhanna roghnúcháin faga in vivo a bheith ina bhfeithiclí úsáideacha chun macramóilíní a sheachadadh go sistéamach chuig an inchinn le héifeacht theiripeach.
Tá taighde ar theiripe spriocdhírithe an lárchórais néarógach (CNS) dírithe den chuid is mó ar dhrugaí agus gníomhairí optamaithe a aithint a bhfuil airíonna spriocdhírithe CNS acu, agus níos lú iarrachta á déanamh ar na meicníochtaí a thiomáineann seachadadh gníomhach drugaí chuig an inchinn a fhionnadh. Tá sé seo ag tosú ag athrú anois toisc gur cuid dhílis de fhorbairt drugaí néareolaíochta nua-aimseartha é seachadadh drugaí, go háirithe móilíní móra. Tá timpeallacht an lárchórais néarógach cosanta go maith ag an gcóras bacainn cheirbreashoithíoch, arb é atá ann an bac fola-inchinne (BBB) ​​agus an bac fola-inchinne (BCBB)1, rud a fhágann go bhfuil sé dúshlánach drugaí a sheachadadh chuig an inchinn1,2. Meastar go ndéantar beagnach gach druga mór-mhóileiciúil agus níos mó ná 98% de dhrugaí beaga-mhóileiciúla a dhíchur ón inchinn3. Sin é an fáth go bhfuil sé an-tábhachtach córais nua iompair inchinne a aithint a sholáthraíonn seachadadh éifeachtach agus sonrach drugaí teiripeacha chuig an CNS4,5. Mar sin féin, cuireann an BBB agus an BCSFB deis iontach ar fáil freisin le haghaidh seachadta drugaí agus iad ag dul isteach i ngach struchtúr den inchinn trína soithíocht fairsing. Dá bhrí sin, tá na hiarrachtaí reatha chun modhanna neamh-ionracha seachadta chuig an inchinn a úsáid bunaithe den chuid is mó ar mheicníocht an iompair trí mheán gabhdóra (PMT) ag baint úsáide as an ngabhdóir BBB6 endogenous. In ainneoin dul chun cinn tábhachtach le déanaí ag baint úsáide as an gcosán gabhdóra transferrin7,8, tá gá le forbairt bhreise ar chórais seachadta nua le hairíonna feabhsaithe. Chuige seo, ba é an sprioc a bhí againn peiptídí a aithint atá in ann iompar CSF a idirghabháil, toisc go bhféadfaí iad a úsáid i bprionsabal chun macramóilíní a sheachadadh chuig an CNS nó chun conairí gabhdóra nua a oscailt. Go háirithe, is féidir le gabhdóirí agus iompróirí sonracha an chórais cheirbreashoithíoch (BBB agus BSCFB) a bheith ina spriocanna féideartha le haghaidh seachadadh gníomhach agus sonrach drugaí biththeiripeacha. Is táirge rúnda den phleicseas córóideach (CS) é sreabhán cheirbreasdromlaigh (CSF) agus bíonn sé i dteagmháil dhíreach leis an sreabhán idirmheánach san inchinn tríd an spás subarachnoid agus an spás ventricular4. Le déanaí, léiríodh go scaipeann sreabhán cheirbreasdromlaigh subarachnoid go iomarcach isteach in idirmheánach na hinchinne9. Tá súil againn rochtain a fháil ar an spás parenchymal trí úsáid a bhaint as an gconair sreafa subarachnoid seo nó go díreach tríd an BBB. Chun seo a bhaint amach, chuireamar straitéis roghnúcháin faga in vivo láidir i bhfeidhm a shainaithníonn peiptídí a iompraítear trí cheachtar den dá chonair ar leith seo.
Déanaimid cur síos anois ar mhodh scagthástála taispeána faga in vivo seicheamhach le sampláil CSF in éineacht le seicheamhú ard-tréchur (HTS) chun monatóireacht a dhéanamh ar bhabhtaí roghnúcháin tosaigh leis an éagsúlacht leabharlainne is airde. Rinneadh scagadh ar fhrancaigh chomhfhiosacha le cannula cisterna mór (CM) ionchlannaithe go buan chun éilliú fola a sheachaint. Rud tábhachtach é, roghnaíonn an cur chuige seo peiptídí spriocdhírithe inchinne agus peiptídí le gníomhaíocht iompair trasna an bhacainn cheirbreashoithíoch. D'úsáideamar faga T7 mar gheall ar a méid beag (~60 nm)10 agus mhol muid go bhfuil siad oiriúnach d'iompar veicilí a cheadaíonn trasnú trascheallach an bhacainn endothelial agus/nó epithelial-medulla. Tar éis ceithre bhabhta panála, aonraíodh daonraí faga ag taispeáint saibhriú láidir CSF in vivo agus comhlachas micrishoithíoch cheirbreach. Rud tábhachtach é, bhíomar in ann ár dtorthaí a dhearbhú trína léiriú go bhfuil na peiptídí is fearr agus is fearr a shintéisiú go ceimiceach in ann lasta próitéine a iompar isteach sa sreabhán cheirbreasdromlaigh. Ar dtús, bunaíodh éifeachtaí cógasdinimiciúla an CNS trí phríomhpheiptíd idirthurais a chomhcheangal le coscaire an pheiptíd BACE1. Chomh maith le léiriú gur féidir le straitéisí scagthástála feidhmiúla in vivo peiptídí iompair inchinne nua a aithint mar iompróirí lasta próitéine éifeachtacha, táimid ag súil go mbeidh tábhacht ag baint le cur chuige roghnúcháin feidhmiúla comhchosúla maidir le conairí iompair inchinne nua a aithint freisin.
Bunaithe ar aonaid phlaic-fhoirmithe (PFU), tar éis chéim phacáistithe an fhagaigh, dearadh agus cruthaíodh leabharlann de pheiptídí fágaigh líneacha T7 12-mhéir randamacha le héagsúlacht de thart ar 109 (féach Ábhair agus Modhanna). Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara gur anailísíomar an leabharlann seo go cúramach roimh an bpanáil in vivo. Ghin aimpliú PCR ar shamplaí leabharlainne fágaigh ag baint úsáide as tosaitheoirí modhnaithe aimplicóin a bhí infheidhme go díreach maidir le HTS (Fíor Forlíontach 1a). Mar gheall ar a) earráidí seicheamhaithe HTS11, b) tionchar ar cháilíocht na dtosaitheoirí (NNK)1-12, agus c) láithreacht fágaigh de chineál fiáin (wt) (ionchuir chnámharlaigh) sa leabharlann fuireachais, cuireadh nós imeachta scagtha seicheamhaithe i bhfeidhm chun faisnéis fhíoraithe seicheamhaithe amháin a bhaint amach (Fíor Forlíontach 1b). Baineann na céimeanna scagtha seo le gach leabharlann seicheamhaithe HTS. Maidir leis an leabharlann chaighdeánach, fuarthas 233,868 léamh san iomlán, agus d'éirigh le 39% díobh na critéir scagtha agus úsáideadh iad le haghaidh anailíse agus roghnú leabharlainne do bhabhtaí ina dhiaidh sin (Fíor Forlíontach 1c–e). Ba iolraithe de 3 phéire bonn iad na léamha den chuid is mó, le buaic ag 36 núicléatídí (Fíor Fhorlíontach 1c), rud a dheimhnigh dearadh na leabharlainne (NNK) 1-12. Is suntasach go raibh iontráil PAGISRELVDKL cnámh droma cineál fiáin 12-thoiseach (wt) i thart ar 11% de bhaill na leabharlainne, agus bhí iontrálacha nó scriostaí i mbeagnach leath de na seichimh (49%). Dheimhnigh HTS na leabharlainne an éagsúlacht ard peiptídí sa leabharlann: ní bhfuarthas níos mó ná 81% de na seichimh peiptíde ach uair amháin agus níor tharla ach 1.5% i ≥4 chóip (Fíor Fhorlíontach 2a). Bhí minicíochtaí na n-aimínaigéad (aa) ag gach ceann de na 12 shuíomh sa stór comhghaolmhar go maith leis na minicíochtaí a bhíothas ag súil leo do líon na gcódón a ghintear ag an stór NKK díghiniúna (Fíor Fhorlíontach 2b). Bhí minicíocht breathnaithe na n-iarmhar aa a ionchódaíodh leis na hiontrálacha seo comhghaolmhar go maith leis an minicíocht ríofa (r = 0.893) (Fíor Fhorlíontach 2c). Áirítear leis an ullmhúchán leabharlanna faga le haghaidh insteallta na céimeanna aimplithe agus endotoxin a bhaint. Taispeánadh roimhe seo go bhféadfadh sé seo éagsúlacht na leabharlanna faga a laghdú12,13. Dá bhrí sin, rinneamar seicheamhú ar leabharlann faga aimplithe ar phláta a raibh endotoxin bainte aisti agus rinneamar comparáid idir í agus an leabharlann bhunaidh chun minicíocht AA a mheas. Breathnaíodh comhghaol láidir (r = 0.995) idir an linn bhunaidh agus an linn aimplithe agus íonaithe (Fíor Fhorlíontach 2d), rud a léiríonn nár chruthaigh iomaíocht idir clóin a aimplithe ar phlátaí ag baint úsáide as faga T7 claonadh mór. Tá an chomparáid seo bunaithe ar mhinicíocht móitífeanna trípheiptíde i ngach leabharlann, ós rud é nach féidir éagsúlacht na leabharlann (~109) a ghabháil go hiomlán fiú le HTS. Léirigh anailís minicíochta ar aa ag gach suíomh claonadh beag atá ag brath ar shuíomh sna trí shuíomh dheireanacha den repertoire iontráilte (Fíor Fhorlíontach 2e). Mar fhocal scoir, chinn muid go raibh cáilíocht agus éagsúlacht na leabharlainne inghlactha agus nár breathnaíodh ach athruithe beaga san éagsúlacht mar gheall ar aimpliú agus ullmhú leabharlanna faga idir roinnt babhtaí roghnúcháin.
Is féidir sampláil sraitheach sreabhán cheirbreasdromlaigh a dhéanamh trí channula a ionchlannú go máinliachta i gcroílár francach atá feasach chun sainaithint faga T7 a instealladh go hinmheánach (iv) tríd an BBB agus/nó BCSFB a éascú (Fíor 1a-b). D'úsáideamar dhá lámh roghnúcháin neamhspleácha (lámha A agus B) sna chéad trí bhabhta de roghnú in vivo (Fíor 1c). Mhéadaíomar déine an roghnúcháin de réir a chéile trí mhéid iomlán an fhaga a tugadh isteach sna chéad trí bhabhta roghnúcháin a laghdú. Don cheathrú babhta panála, chomhcheangail muid samplaí ó bhrainsí A agus B agus rinneamar trí roghnú neamhspleácha breise. Chun airíonna in vivo cáithníní faga T7 sa mhúnla seo a staidéar, instealladh faga cineál fiáin (ionchur máistir PAGISRELVDKL) i bhfrancaigh tríd an bhféith eireabaill. Léirigh aisghabháil faga ó sreabhán cheirbreasdromlaigh agus fuil ag pointí ama éagsúla go raibh céim imréitigh tosaigh thapa ag faga icosahedral T7 réasúnta beag ón urrann fola (Fíor Fhorlíontach 3). Bunaithe ar na teidil a riaradh agus ar thoirt fola na bhfrancach, ríomhamar nár braitheadh ​​ach thart ar 1% de mheáchan an fhagaigh ón dáileog a riaradh san fhuil 10 nóiméad tar éis an insteallta infhéitheach. Tar éis an mheath tapa tosaigh seo, tomhaiseadh imréiteach príomhúil níos moille le leathré de 27.7 nóiméad. Rud tábhachtach nár aisghabhadh ach an-bheagán fagaigh ón urrann CSF, rud a léiríonn cúlra íseal d'imirce fagaigh de chineál fiáin isteach san urrann CSF (Fíor Fhorlíontach 3). Ar an meán, níor braitheadh ​​ach thart ar 1 x 10-3% teidil de fhagaigh T7 san fhuil agus 4 x 10-8% de na fagaigh a insileadh ar dtús sa sreabhán cheirbreasdromlaigh thar an tréimhse samplála ar fad (0-250 nóiméad). Is suntasach an rud é go raibh leathré (25.7 nóiméad) an fhagaigh de chineál fiáin i sreabhán cheirbreasdromlaigh cosúil leis an gceann a breathnaíodh san fhuil. Léiríonn na sonraí seo go bhfuil an bacainn a scarann ​​​​an urrann CSF ón fhuil slán i bhfrancaigh le cannúlú CM, rud a ligeann do roghnú in vivo leabharlanna faga chun clóin a aithint a iompraítear go héasca ón fhuil isteach san urrann CSF.
(a) Modh a chur ar bun chun sreabhán cheirbreasdromlaigh (CSF) a athshampláil ó linn mhór. (b) Léaráid a thaispeánann suíomh ceallach bhacainn an lárchórais néarógach (CNS) agus an straitéis roghnúcháin a úsáidtear chun peiptídí a shainaithint a thrasnaíonn an bac fola-inchinne (BBB) ​​agus an bac fola-inchinne. (c) Cairt sreafa scagthástála taispeántais faga in vivo. I ngach babhta roghnúcháin, instealladh faga (aitheantóirí ainmhithe taobh istigh de na saigheada) go hinmheánach. Coinnítear dhá bhrainse malartacha neamhspleácha (A, B) ar leithligh go dtí an 4ú babhta roghnúcháin. I gcás babhtaí roghnúcháin 3 agus 4, rinneadh seicheamhú de láimh ar gach clón faga a baineadh as CSF. (d) Cinéitic faga a leithlisíodh ó fhuil (ciorcail dhearg) agus sreabhán cheirbreasdromlaigh (triantáin ghlasa) le linn an chéad bhabhta roghnúcháin i ndá fhrancach cannúlaithe tar éis instealladh infhéitheach den leabharlann peiptíde T7 (2 x 1012 faga/ainmhí). Léiríonn cearnóga gorma an meántiúchan tosaigh de faga san fhuil, arna ríomh ó mhéid an faga a instealladh, agus an toirt iomlán fola á chur san áireamh. Léiríonn na cearnóga dubha pointe trasnaithe na líne y a easpórtáladh ó thiúchain fhagaí fola. (e,f) Cuir i láthair minicíocht agus dáileadh coibhneasta na móitíf trípheiptíde forluiteacha uile a fhéadfar a fháil sa pheiptíd. Taispeántar líon na móitíf a fhaightear i 1000 léamh. Go suntasach (p < 0.001) tá móitífeanna saibhrithe marcáilte le poncanna dearga. (e) Scaipphlota comhghaoil ​​​​ina ndéantar comparáid idir minicíocht choibhneasta mhóitíf trípheiptíde na leabharlainne insteallta le faga díorthaithe ó fhuil ó ainmhithe #1.1 agus #1.2. (f) Scaipphlota comhghaoil ​​​​ina ndéantar comparáid idir minicíochtaí coibhneasta móitífeanna trípheiptíde faga ainmhithe #1.1 agus #1.2 atá leithlisithe i bhfuil agus i sreabhán cheirbreasdromlaigh. (g, h) Ionadaíocht ID Seicheamh de fhag saibhrithe i bhfuil (g) i gcoinne leabharlanna insteallta agus faga saibhrithe i CSF (h) i gcoinne fola tar éis babhta roghnúcháin in vivo sa dá ainmhí. Léiríonn méid an chóid aonlitir cé chomh minic a tharlaíonn an aimínaigéad sin ag an suíomh sin. Glas = polar, corcra = neodrach, gorm = bunúsach, dearg = aigéadach agus dubh = aimínaigéid hidreafóbach. Dhear agus tháirg Eduard Urich Fíor 1a, b.
Rinneamar leabharlann peiptíde faga a instealladh i dhá fhranc ionstraime CM (clades A agus B) agus d'aonraíomar faga ó shreabhán ceirbreasdromlaigh agus fuil (Fíor 1d). Bhí imréiteach tapa tosaigh na leabharlainne níos lú suntasach i gcomparáid leis an bhfag cineál fiáin. Ba é 24.8 nóiméad meánleathré na leabharlainne insteallta sa dá ainmhí san fhuil, cosúil le fag cineál fiáin, agus 38.5 nóiméad in CSF. Rinneadh HTS ar shamplaí faga fola agus sreabhán ceirbreasdromlaigh ó gach ainmhí agus rinneadh anailís ar na peiptídí uile a aithníodh le haghaidh láithreacht móitíf ghearr trípheiptíde. Roghnaíodh móitífeanna trípheiptíde toisc go soláthraíonn siad bunús íosta le haghaidh foirmiú struchtúir agus idirghníomhaíochtaí peiptíde-próitéine14,15. Fuaireamar comhghaol maith i ndáileadh na móitífeanna idir an leabharlann faga insteallta agus clóin a baineadh as fuil an dá ainmhí (Fíor 1e). Léiríonn na sonraí nach bhfuil ach beagán saibhrithe i gcomhdhéanamh na leabharlainne san urrann fola. Rinneadh anailís bhreise ar mhinicíochtaí aimínaigéid agus ar sheichimh chomhaontaithe ag gach suíomh ag baint úsáide as oiriúnú de bhogearraí Weblogo16. Is suimiúil gur fuaireamar saibhriú láidir in iarmhair glicín fola (Fíor 1g). Nuair a rinneadh comparáid idir fuil agus clóin a roghnaíodh ó CSF, breathnaíodh roghnú láidir agus roinnt díroghnaithe móitífe (Fíor 1f), agus bhí aimínaigéid áirithe i láthair go roghnach ag suíomhanna réamhchinntithe sa 12-bhall (Fíor 1h). Is suntasach go raibh difríocht shuntasach idir ainmhithe aonair i sreabhán cheirbreasdromlaigh, ach breathnaíodh saibhriú glicín fola sa dá ainmhí (Fíor Fhorlíontach 4a–j). Tar éis scagadh dian ar shonraí seicheamh i sreabhán cheirbreasdromlaigh ainmhithe #1.1 agus #1.2, fuarthas 964 agus 420 peiptíd uathúil 12-mhéir san iomlán (Fíor Fhorlíontach 1d–e). Rinneadh na clóin fhagaí scoite a aimpliú agus cuireadh faoi réir dara babhta roghnúcháin in vivo iad. Rinneadh HTS ar fhagaí a baineadh ón dara babhta roghnúcháin i ngach ainmhí agus úsáideadh na peiptídí aitheanta go léir mar ionchur i gclár aitheantais móitífe chun anailís a dhéanamh ar tharla móitífe trípheiptíde (Fíor 2a, b, ef). I gcomparáid leis an gcéad timthriall den fhag a aisghabhadh ó CSF, thugamar faoi deara tuilleadh roghnúcháin agus díroghnaithe ar go leor móitífeanna i CSF i mbrainsí A agus B (Fíor 2). Cuireadh algartam aitheantais líonra i bhfeidhm chun a chinneadh an raibh siad ag léiriú patrúin éagsúla de sheicheamh comhsheasmhach. Breathnaíodh cosúlacht shoiléir idir na seichimh 12-thoiseacha a aisghabhadh le CSF i gclade malartach A (Fíor 2c, d) agus clade B (Fíor 2g, h). Léirigh an anailís chomhthiomsaithe i ngach brainse próifílí roghnúcháin éagsúla do pheiptídí 12-mer (Fíor Fhorlíontach 5c,d) agus méadú ar an gcóimheas CSF/titear fola le himeacht ama do chlóin chomhthiomsaithe tar éis an dara babhta roghnúcháin i gcomparáid leis an gcéad bhabhta roghnúcháin (Fíor Fhorlíontach 5e).
Saibhriú móitífeanna agus peiptídí i sreabhán cheirbreasdromlaigh trí dhá bhabhta as a chéile de roghnú taispeána fage feidhmiúil in vivo.
Rinneadh na fagaí sreabhán cheirbreasdromlaigh go léir a aisghabhadh ón gcéad bhabhta de gach ainmhí (ainmhithe #1.1 agus #1.2) a chomhthiomsú, a aimpliú, a sheicheamhú le HT agus a ath-instealladh le chéile (2 x 1010 fagaí/ainmhí) ​​2 fhrancach cannúlaithe SM (#1.1 → #). 2.1 agus 2.2, 1.2 → 2.3 agus 2.4). (a,b,e,f) Scaipphlotaí comhghaoil ​​​​a dhéanann comparáid idir minicíocht choibhneasta móitífeanna trípheiptíde na bhfagaí díorthaithe ó CSF go léir sa chéad agus sa dara babhta roghnúcháin. Minicíocht choibhneasta agus dáileadh móitífeanna a léiríonn na trípheiptídí forluiteacha féideartha go léir a fuarthas i bpeiptídí sa dá threoshuíomh. Taispeántar líon na móitífeanna a fuarthas i 1000 léamh. Tá móitífeanna a roghnaíodh nó a eisiadh go suntasach (p < 0.001) i gceann de na leabharlanna comparáide aibhsithe le poncanna dearga. (c, d, g, h) Léiriú lógó seicheamhach ar na seichimh uile atá saibhir i gcealla fola (CSF) ina bhfuil 12 aimínaigéad ar fhad bunaithe ar bhabhtaí 2 agus 1 de roghnú in vivo. Léiríonn méid an chóid aonlitir cé chomh minic is a tharlaíonn an aimínaigéad sin ag an suíomh sin. Chun an lógó a léiriú, déantar comparáid idir minicíocht na seichimh CSF a bhaintear ó ainmhithe aonair idir dhá bhabhta roghnúcháin agus taispeántar na seichimh saibhrithe sa dara babhta: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 agus (h) #1.2–#2.4. Taispeántar na aimínaigéid is saibhrithe ag suíomh ar leith in (c, d) ainmhithe uimh. 2.1 agus uimh. 2.2 nó (g, h) in ainmhithe uimh. 2.3 agus uimh. 2.4 i ndath. Glas = polar, corcra = neodrach, gorm = bunúsach, dearg = aigéadach agus dubh = aimínaigéid hidreafóbach.
Tar éis an tríú babhta roghnúcháin, d'aithin muid 124 seicheamh peiptíde uathúil (#3.1 agus #3.2) ó 332 clón faga athdhéanta le CSF a leithlisíodh ó dhá ainmhí (Fíor Fhorlíontach 6a). Bhí an cion coibhneasta is airde ag an seicheamh LGSVS (18.7%), agus ina dhiaidh sin na hiontrálacha cineál fiáin PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), agus SARGSWREIVSLS (2.2%). Sa cheathrú babhta deiridh, chuireamar dhá bhrainse roghnaithe go neamhspleách ó thrí ainmhí ar leith le chéile (Fíor 1c). As na 925 clón faga seicheamhaithe a aisghabhadh ó CSF, fuair muid 64 seicheamh peiptíde uathúil sa cheathrú babhta (Fíor Fhorlíontach 6b), agus thit an cion coibhneasta de fhaga cineál fiáin go 0.8%. Ba iad na clóin CSF is coitianta sa cheathrú babhta ná LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) agus RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). Tá raon faid na peiptídí roghnaithe mar gheall ar iontrálacha/scriosadh núicléatíde nó cóidíní stad roimh am i dtosaitheoirí na leabharlainne agus cóidíní díghiniúna á n-úsáid le haghaidh dearadh leabharlainne NNK. Gineann cóidíní stad roimh am peiptídí níos giorra agus roghnaítear iad toisc go bhfuil an móitíf fabhrach aa iontu. Féadfaidh peiptídí níos faide a bheith mar thoradh ar iontrálacha/scriosadh i dtosaitheoirí na leabharlann sintéiseach. Cuireann sé seo an códón stad deartha lasmuigh den fhráma agus léann sé é go dtí go bhfeictear códón stad nua síos an abhainn. Go ginearálta, ríomhamar fachtóirí saibhrithe do na ceithre bhabhta roghnúcháin trí na sonraí ionchuir a chur i gcomparáid leis na sonraí aschuir sampla. Don chéad bhabhta scagthástála, d'úsáideamar teidil fhagaí cineál fiáin mar thagairt chúlra neamhshonrach. Is suimiúil gur láidir an roghnú diúltach faga sa chéad timthriall CSF, ach ní san fhuil (Fíor 3a), rud a d'fhéadfadh a bheith mar gheall ar an dóchúlacht íseal go ndéanfaí formhór bhaill leabharlann na bpeiptídí a scaipeadh go héighníomhach isteach san urrann CSF nó go mbíonn claonadh ag fagaí coibhneasta a bheith coinnithe nó bainte níos éifeachtaí ón tsruth fola ná baictéarafagaí. Mar sin féin, sa dara babhta panála, breathnaíodh roghnú láidir fagaí i CSF sa dá chlad, rud a thugann le fios go raibh an babhta roimhe sin saibhrithe i bhfagaí a thaispeánann peiptídí a chuireann glacadh CSF chun cinn (Fíor 3a). Arís, gan saibhriú suntasach fola. Chomh maith leis sin sa tríú agus sa cheathrú babhta, bhí clóin na fagaí saibhrithe go suntasach i CSF. Agus minicíocht choibhneasta gach seicheamh peiptíde uathúil á comparáid idir an dá bhabhta roghnúcháin dheireanacha, fuarthas amach go raibh na seichimh níos saibhrithe fós sa cheathrú babhta roghnúcháin (Fíor 3b). Baineadh 931 móitíf trípheiptíde san iomlán as na 64 seicheamh peiptíde uathúil go léir ag baint úsáide as an dá threoshuíomh peiptíde. Rinneadh scrúdú níos géire ar na móitífeanna ba mhó saibhrithe sa cheathrú babhta maidir lena bpróifílí saibhrithe ar fud na mbabhtaí uile i gcomparáid leis an leabharlann insteallta (scoitheadh: saibhriú 10%) (Fíor Fhorlíontach 6c). Léirigh patrúin ghinearálta roghnúcháin gur saibhríodh formhór na móitífeanna a ndearnadh staidéar orthu i ngach babhta roimhe seo den dá bhrainse roghnúcháin. Mar sin féin, ba as clade malartach A den chuid is mó a tháinig roinnt móitífeanna (m.sh. SGL, VSG, LGS GSV), agus saibhríodh cinn eile (m.sh. FGW, RTN, WGF, NTR) i gclade malartach B.
Bailíochtú ar iompar CSF de pheiptídí taispeánta le fagaí saibhrithe le CSF agus peiptídí ceannaire bithitinithe atá comhchuingithe le hualaí streiptavidin.
(a) Cóimheasa saibhrithe ríofa sna ceithre bhabhta (R1-R4) bunaithe ar thítrí faga insteallta (ionchur = I) (PFU) agus títrí faga CSF cinntithe (aschur = O). Ríomhadh fachtóirí saibhrithe do na trí bhabhta dheireanacha (R2-R4) trí chomparáid a dhéanamh leis an mbabhta roimhe sin agus an chéad bhabhta (R1) le sonraí meáchain. Is sreabhán cheirbreasdromlaigh iad na barraí oscailte, is plasma iad na barraí scáthaithe. (***p<0.001, bunaithe ar thástáil-t an Mhic Léinn). (b) Liosta de na peiptídí faga is flúirseach, rangaithe de réir a gcion coibhneasta leis na faga uile a bailíodh i CSF tar éis babhta 4 den roghnú. Tá na sé chlón faga is coitianta aibhsithe i ndath, uimhrithe agus a bhfachtóirí saibhrithe idir babhtaí 3 agus 4 den roghnú (inseáin). (c,d) Rinneadh anailís ina n-aonar ar na sé chlón faga is saibhrithe, leabharlanna peiptíde faga folamh agus faga tuismitheora ó bhabhta 4 i samhail samplála CSF. Bailíodh samplaí CSF agus fola ag na pointí ama a léiríodh. (c) Méideanna comhionanna de 6 chlón fága iarrthóra (2 x 1010 fága/ainmhí), fága folamh (#1779) (2 x 1010 fága/ainmhí) ​​agus leabharlanna peiptíde fága stoic (2 x 1012 fága/ainmhí). Instealladh agus riartar 3 CM ar a laghad don ainmhí cannulaithe ar leithligh tríd an fhéith eireabaill. Taispeántar cógaschinéitic CSF gach clón fága agus leabharlann peiptíde fága insteallta thar thréimhse ama. (d) taispeánann sé an cóimheas meánach CSF/fola do na fága/mL go léir a aisghabhadh thar an am samplála. (e) Nascadh ceithre pheiptíd cheannaire sintéiseacha agus rialú scrofa amháin le biotin le streptavidin trína N-chríoch (taispeántas teitreiméir) agus ina dhiaidh sin instealladh (féith eireabaill iv, 10 mg streptavidin/kg). Trí fhrancach ar a laghad a ndearnadh intubáid orthu (N = 3). Bailíodh samplaí CSF ag na pointí ama a léiríodh agus tomhaiseadh tiúchan streptavidin trí ELISA frith-streptavidin CSF (nd = gan a bheith braite). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, bunaithe ar thástáil ANOVA). (f) Comparáid idir seicheamh aimínaigéid an chlóin peiptíde faga is saibhrithe #2002 (corcra) le clóin peiptíde faga eile a roghnaíodh ón 4ú babhta roghnúcháin. Tá blúirí aimínaigéid chomhionanna agus cosúla códaithe de réir datha.
As na fagaí saibhrithe go léir sa cheathrú babhta (Fíor 3b), roghnaíodh sé chlón iarrthóra le haghaidh tuilleadh anailíse aonair sa mhúnla samplála CSF. Instealladh méideanna comhionanna de shé leabharlann peiptíde fagaí iarrthóra, fagaí folamh (gan iontráil) agus prófag i dtrí ainmhí CM cannúlaithe, agus cinneadh cógaschinéitic i measúnuithe CSF (Fíor 3c) agus fola (Fíor Forlíontach 7). Dhírigh na clóin fagaí go léir a tástáladh ar an urrann CSF ag leibhéal 10-1000 uair níos airde ná leibhéal an fhagaí rialaithe folamh (#1779). Mar shampla, bhí teidil CSF thart ar 1000 uair níos airde ag clóin #2020 agus #2077 ná mar a bhí ag an bhfagaí rialaithe. Tá próifíl chógaschinéitic gach peiptíde roghnaithe difriúil, ach tá cumas ard-threoraithe CSF ag gach ceann acu. Thugamar faoi deara laghdú leanúnach le himeacht ama i gcás clón #1903 agus #2011, agus i gcás clón #2077, #2002 agus #2009, d'fhéadfadh méadú le linn na chéad 10 nóiméad iompar gníomhach a léiriú ach ní mór é sin a fhíorú. Chobhsaigh clón #2020, #2002, agus #2077 ag leibhéil arda, agus laghdaigh tiúchan CSF chlón #2009 go mall tar éis an mhéadaithe tosaigh. Ansin rinneamar comparáid idir minicíocht choibhneasta gach iarrthóra CSF agus a thiúchan fola (Fíor 3d). Léirigh comhghaol meántitear gach iarrthóra CSF lena thitear fola ag gach am samplála go raibh trí cinn de na sé iarrthóir saibhrithe go suntasach i CSF fola. Is suimiúil é gur léirigh clón #2077 cobhsaíocht fola níos airde (Fíor Forlíontach 7). Chun a dhearbhú go bhfuil na peiptídí féin in ann lasta seachas cáithníní faga a iompar go gníomhach isteach sa urrann CSF, shintéiseamar ceithre pheiptíd cheannaire díorthaithe le biotin ag an N-chríoch áit a gceanglaíonn na peiptídí leis an gcáithnín faga. Rinneadh peiptídí bithitinithe (uimh. 2002, 2009, 2020 agus 2077) a chomhchuingiú le streptavidin (SA) chun foirmeacha ilmhéireacha a fháil a rinne aithris ar gheoiméadracht an fhagaigh go pointe áirithe. Chuir an fhormáid seo ar ár gcumas nochtadh SA a thomhas san fhuil agus i sreabhán cheirbreasdromlaigh mar pheiptídí próitéine iompair lasta. Rud tábhachtach, is minic a d'fhéadfaí sonraí fagaigh a atáirgeadh nuair a riaradh peiptídí sintéiseacha sa fhormáid SA-chomhchuingithe seo (Fíor 3e). Bhí níos lú nochtadh tosaigh agus imréiteach CSF níos tapúla ag na peiptídí measctha le leibhéil do-bhrath laistigh de 48 uair an chloig. Chun léargas a fháil ar chonairí seachadta na gclón fagaigh peiptíde seo isteach sa spás CSF, rinneamar anailís ar logánú buillí peiptíde fagaigh aonair ag baint úsáide as imdhíoneolaíocht-cheimic (IHC) chun cáithníní fagaigh a bhrath go díreach 1 uair an chloig tar éis instealladh infhéitheach in vivo. Is suntasach gur braitheadh ​​clóin #2002, #2077, agus #2009 trí dhaiteadh láidir i ribeadáin na hinchinne, agus níor braitheadh ​​​​faga rialaithe (#1779) ná clón #2020 (Fíor Forlíontach 8). Tugann sé seo le fios go gcuireann na peiptídí seo leis an éifeacht ar an inchinn go beacht trí thrasnú an BBB. Tá gá le hanailís bhreise mhionsonraithe chun an hipitéis seo a thástáil, toisc go bhféadfadh an bealach BSCFB a bheith i gceist freisin. Agus seicheamh aimínaigéad an chlóin is saibhrithe (#2002) á chur i gcomparáid le peiptídí roghnaithe eile, tugadh faoi deara go bhfuil síntí aimínaigéad comhchosúla ag cuid acu, rud a d'fhéadfadh a léiriú go bhfuil meicníocht iompair chomhchosúil ann (Fíor 3f).
Mar gheall ar a phróifíl plasma uathúil agus an méadú suntasach ar CSF le himeacht ama, rinneadh iniúchadh breise ar chlón taispeána faga #2077 thar thréimhse níos faide 48 uair an chloig agus bhí sé in ann an méadú tapa ar CSF a breathnaíodh i gcomhar le leibhéil SA leanúnacha a atáirgeadh (Fíor 4a). Maidir le clóin faga eile a sainaithníodh, dhaitear #2077 go láidir le haghaidh ribeadáin inchinne agus léirigh sé comhlonnú suntasach le lectin marcóra ribeadáin nuair a breathnaíodh air ag réiteach níos airde agus b'fhéidir roinnt daite sa spás paireincímealach (Fíor 4b). Chun imscrúdú a dhéanamh an bhféadfaí éifeachtaí cógaseolaíocha trí mheán peiptíde a fháil sa CNS, rinneamar turgnamh inar meascadh leaganacha bithitinithe de i) an peiptíd idirthurais #2077 agus ii) an peiptíd coscaire BACE1 le SA ag dhá chóimheas éagsúla. I gcás teaglaim amháin níor úsáideadh ach an coscaire peiptíde BACE1 agus don cheann eile úsáideadh cóimheas 1:3 de choscóir peiptíde BACE1 le peiptíd #2077. Tugadh an dá shampla go hinmheánach agus tomhaiseadh leibhéil béite-aimilóideach peiptíde 40 (Abeta40) san fhuil agus sa sreabhán cheirbreasdromlaigh le himeacht ama. Tomhaiseadh Abeta40 i gciorcal sceimhle an inchinne mar léiríonn sé cosc ​​ar BACE1 i bpaireincíma na hinchinne. Mar a bhíothas ag súil leis, laghdaigh an dá choimpléasc leibhéil Abeta40 san fhuil go suntasach (Fíor 4c, d). Mar sin féin, níor tharla laghdú suntasach ar Abeta40 sa sreabhán cheirbreasdromlaigh ach amháin i samplaí ina raibh meascán de pheiptíd uimh. 2077 agus coscaire den pheiptíd BACE1 comhchuingithe le SA (Fíor 4c). Léiríonn na sonraí go bhfuil peiptíd uimh. 2077 in ann an próitéin SA 60 kDa a iompar isteach sa CNS agus go spreagann sé éifeachtaí cógaseolaíocha freisin le coscairí SA-chomhchuingithe den pheiptíd BACE1.
(a) Instealladh clónach (2 × 10 faga/ainmhí) ​​de fhaga T7 ag taispeáint próifílí cógaschinéitice fadtéarmacha peiptíde CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) agus faga rialaithe neamh-insteallta (#1779) i dtrí fhranc ar a laghad a ndearnadh CM-intubáidithe orthu. (b) Íomhá micreascópach chomhfhócasach de mhicrea-shoithigh chortéiseacha ionadaíocha i bhfrancaigh ar instealladh faga iad (2 × 10 10 faga/ainmhí) ​​ag taispeáint frith-dhaite peiptíde #2077 agus soithigh (lectin). Tugadh na clóin faga seo do 3 fhranc agus ligeadh dóibh scaipeadh ar feadh 1 uair an chloig roimh an insreabhadh. Gearradh na hinchinn agus daiteadh iad le hantashubstaintí ilchlónacha lipéadaithe le FITC i gcoinne capsid an fhaga T7. Deich nóiméad roimh an insreabhadh agus an socrú ina dhiaidh sin, tugadh lectin lipéadaithe le DyLight594 go hinmheánach. Íomhánna fluaraiseacha ag taispeáint daite lectin (dearg) ar thaobh luminal na micrea-shoithigh agus na bhfaga (glas) i lumen na ribeadán agus fíochán inchinne perivascular. Freagraíonn an barra scála do 10 µm. (c, d) Rinneadh peiptíd choscach BACE1 bith-inilte ina aonar nó i gcomhar le peiptíd idirthurais bith-inilte #2077 a nascadh le streiptavidin agus ina dhiaidh sin instealladh infhéitheach trí fhranc CM cannúlaithe ar a laghad (10 mg streiptavidin/kg). Tomhaiseadh laghdú in Aβ40 a bhí á mheánú ag coscaire peiptíde BACE1 trí Aβ1-40 ELISA san fhuil (dearg) agus sa sreabhán ceirbreasdromlaigh (oráiste) ag na pointí ama a léirítear. Chun soiléireacht níos fearr a fháil, tarraingítear líne phoncaithe ar an ngraf ag scála 100%. (c) Laghdú céatadáin in Aβ40 san fhuil (triantáin dhearga) agus sa sreabhán ceirbreasdromlaigh (triantáin oráiste) i bhfrancaigh a ndearnadh cóireáil orthu le streiptavidin comhchuingithe le peiptíd idirthurais #2077 agus peiptíd choscach BACE1 i gcóimheas 3:1. (d) Céatadán laghdaithe in Aβ40 fola (ciorcail dhearg) agus sreabhán ceirbreasdromlaigh (ciorcail oráiste) francaigh a ndearnadh cóireáil orthu le streiptavidin cúpláilte le peiptíd chosctha BACE1 amháin. Ba é 420 pg/ml tiúchan Aβ sa rialú (diall caighdeánach = 101 pg/ml).
Tá taispeántas fagaí curtha i bhfeidhm go rathúil i roinnt réimsí den taighde bithleighis17. Baineadh úsáid as an modh seo le haghaidh staidéir éagsúlachta soithíoch in vivo18,19 chomh maith le staidéir a dhíríonn ar shoithí inchinne20,21,22,23,24,25,26. Sa staidéar seo, leathnaíomar cur i bhfeidhm an mhodha roghnúcháin seo ní hamháin chun peiptídí a dhíríonn ar shoithí inchinne a aithint go díreach, ach freisin chun iarrthóirí a bhfuil airíonna iompair ghníomhacha acu chun an bac fola-inchinne a thrasnú. Déanaimid cur síos anois ar fhorbairt nós imeachta roghnúcháin in vivo i francaigh iontúbaithe CM agus léirímid a chumas chun peiptídí a bhfuil airíonna baile CSF acu a aithint. Agus leabharlann de pheiptídí randamacha 12-mer á húsáid againn, bhíomar in ann a léiriú go bhfuil an fagá T7 beag go leor (thart ar 60 nm ar trastomhas)10 le bheith oiriúnaithe don bhacainn fola-inchinne, agus ar an gcaoi sin an bac fola-inchinne nó an plexus córóideach a thrasnú go díreach. Thugamar faoi deara gur modh scagthástála feidhmiúil in vivo dea-rialaithe a bhí i mbaint CSF ó fhrancaigh CM cannulaithe, agus nár cheangail an faga eastósctha leis an soithíocht amháin ach gur fheidhmigh sé mar iompróir trasna an bhacainn fola-inchinne freisin. Ina theannta sin, trí fhuil a bhailiú ag an am céanna agus HTS a chur i bhfeidhm ar CSF agus ar fhagaí díorthaithe ó fhuil, dheimhnigh muid nach raibh tionchar ag saibhriú fola ná oiriúnacht le haghaidh leathnú idir babhtaí roghnúcháin ar ár rogha CSF. Mar sin féin, is cuid den nós imeachta roghnúcháin an urrann fola, ós rud é go gcaithfidh fagaí atá in ann teacht ar an urrann CSF maireachtáil agus scaipeadh sa tsruth fola ar feadh i bhfad go leor chun iad féin a shaibhriú san inchinn. Chun faisnéis iontaofa seicheamhach a bhaint as sonraí amha HTS, chuireamar scagairí i bhfeidhm a bhí oiriúnaithe d'earráidí seicheamhach ardáin-shonracha sa sreabhadh oibre anailíse. Trí pharaiméadair chinéiteacha a ionchorprú sa mhodh scagthástála, dheimhnigh muid cógaschinéitic thapa fagaí T7 cineál fiáin (t½ ~ 28 nóiméad) san fhuil24, 27, 28 agus chinn muid a leathré i sreabhán cheirbreasdromlaigh (t½ ~ 26 nóiméad) in aghaidh an nóiméid freisin. In ainneoin próifílí cógaschinéiteacha comhchosúla san fhuil agus i gciorcal shíceafoirt shíceafoirt (CSF), níorbh fhéidir ach 0.001% de thiúchan fola an fhagaigh a bhrath sa CSF, rud a léiríonn soghluaisteacht chúlra íseal fhagaigh T7 de chineál fiáin trasna an bhacainn fola-inchinne. Leagann an saothar seo béim ar thábhacht an chéad bhabhta roghnúcháin agus straitéisí panála in vivo á n-úsáid, go háirithe i gcás córais fhagaigh a ghlantar go tapa ón gcúrsaíocht, toisc nach bhfuil mórán clón in ann urrann an CNS a bhaint amach. Dá bhrí sin, sa chéad bhabhta, bhí an laghdú ar éagsúlacht na leabharlainne an-mhór, toisc nár bailíodh ach líon teoranta clón sa deireadh sa tsamhail CSF an-dian seo. Áiríodh sa straitéis panála in vivo seo roinnt céimeanna roghnúcháin amhail carnadh gníomhach san urrann CSF, marthanacht clón san urrann fola, agus baint thapa clón fhagaigh T7 ón fhuil laistigh den chéad 10 nóiméad (Fíor 1d agus Fíor Fhorlíontach 4M). Dá bhrí sin, tar éis an chéad bhabhta, aithníodh clóin fhagaigh éagsúla sa CSF, cé gur úsáideadh an linn snámha tosaigh céanna d'ainmhithe aonair. Tugann sé seo le fios go mbíonn laghdú suntasach ar an éagsúlacht mar thoradh ar chéimeanna roghnúcháin dian iolracha i gcás leabharlanna foinse a bhfuil líon mór ball leabharlainne iontu. Dá bhrí sin, beidh imeachtaí randamacha ina gcuid dhílis den phróiseas roghnúcháin tosaigh, agus beidh tionchar mór acu ar an toradh. Is dócha go raibh claonadh saibhrithe CSF an-chosúil ag go leor de na clóin sa leabharlann bhunaidh. Mar sin féin, fiú faoi na coinníollacha turgnamhacha céanna, d'fhéadfadh torthaí roghnúcháin a bheith difriúil mar gheall ar líon beag gach clón ar leith sa linn tosaigh.
Tá difríocht idir na móitífeanna atá saibhrithe i CSF agus iad siúd atá san fhuil. Is suimiúil gur thugamar faoi deara an chéad aistriú i dtreo peiptídí saibhir i glicín i bhfuil ainmhithe aonair. (Fíor 1g, Figiúirí Forlíontacha 4e, 4f). D’fhéadfadh sé go mbeadh peiptídí glicín ina bhfuil fagaí níos cobhsaí agus is lú an seans go mbainfear as cúrsaíocht iad. Mar sin féin, níor braitheadh ​​na peiptídí saibhir i glicín seo sna samplaí sreabhán cheirbreasdromlaigh, rud a thugann le fios gur chuaigh na leabharlanna coimeádta trí dhá chéim roghnúcháin éagsúla: ceann san fhuil agus ceann eile a ligeadh do charnadh sa sreabhán cheirbreasdromlaigh. Rinneadh tástáil fhorleathan ar chlóin saibhrithe i CSF a eascraíonn as an gceathrú babhta roghnúcháin. Deimhníodh go raibh beagnach gach ceann de na clóin a tástáladh ina n-aonar saibhrithe i CSF i gcomparáid le fagaí rialaithe bán. Rinneadh scrúdú níos mine ar bhuille peiptíde amháin (#2077). Léirigh sé leathré plasma níos faide i gcomparáid le buillí eile (Fíor 3d agus Fíor Forlíontach 7), agus is suimiúil gur raibh iarmhar cisteín sa pheiptíd seo ag an C-chríoch. Léiríodh le déanaí gur féidir le cisteín a chur le peiptídí a n-airíonna cógaschinéiteacha a fheabhsú trí cheangal le halbaimin 29. Níl sé seo ar eolas faoi láthair maidir le peiptíd #2077 agus tá gá le tuilleadh staidéir air. Léirigh roinnt peiptídí spleáchas vaileins i saibhriú CSF (níor taispeánadh sonraí), a d'fhéadfadh a bheith bainteach le geoiméadracht dhromchla taispeánta an chaipsíd T7. Léirigh an córas T7 a d'úsáideamar 5-15 chóip de gach peiptíd in aghaidh an cháithnín faga. Rinneadh IHC ar chlóin phagaí luaidhe iarrthóra a instealladh go hinmheánach isteach sa choirtéis cheirbreach francaigh (Fíor Fhorlíontach 8). Léirigh na sonraí gur idirghníomhaigh trí chlón ar a laghad (Uimh. 2002, Uimh. 2009 agus Uimh. 2077) leis an BBB. Ní fios fós an mbíonn carnadh CSF nó gluaiseacht na gclón seo go díreach chuig an BCSFB mar thoradh ar an idirghníomhaíocht BBB seo. Rud tábhachtach, taispeánaimid go gcoinníonn na peiptídí roghnaithe a gcumas iompair CSF nuair a dhéantar iad a shintéisiú agus a cheangal leis an lasta próitéine. Go bunúsach, déanann ceangal peiptídí bithitinithe N-críochfoirt le SA na torthaí a fuarthas lena gclóin fhagaigh faoi seach san fhuil agus sa sreabhán cheirbreasdromlaigh a athrá (Fíor 3e). Ar deireadh, taispeánaimid go bhfuil an phríomhpheiptíd #2077 in ann gníomh inchinne coscaire peiptíde bithitinithe de BACE1 atá comhchuingithe le SA a chur chun cinn, rud a chruthaíonn éifeachtaí cógasdinimiciúla suntasacha sa CNS trí leibhéil Abeta40 i CSF a laghdú go suntasach (Fíor 4). Ní ​​raibh muid in ann aon homalóga a aithint sa bhunachar sonraí trí chuardach homalóige seicheamh peiptíde a dhéanamh ar na buillí go léir. Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara go bhfuil méid na leabharlainne T7 thart ar 109, agus gurb é 4 x 1015 méid teoiriciúil na leabharlainne do 12-mers. Dá bhrí sin, níor roghnaigh muid ach codán beag de spás éagsúlachta na leabharlainne peiptíde 12-mer, rud a d'fhéadfadh a chiallaíonn gur féidir níos mó peiptídí optamaithe a aithint trí spás seicheamh cóngarach na mbuailtí aitheanta seo a mheas. Go hipitéiseach, d'fhéadfadh ceann de na cúiseanna nár aimsíomar aon homalóga nádúrtha de na peiptídí seo a bheith díroghnaithe le linn na héabhlóide chun cosc ​​a chur ar iontráil neamhrialaithe móitífeanna peiptíde áirithe isteach san inchinn.
Le chéile, soláthraíonn ár dtorthaí bunús d'obair amach anseo chun córais iompair an bhacainn cheirbreashoithíoch in vivo a aithint agus a thréithriú níos mine. Tá bunbhunús an mhodha seo bunaithe ar straitéis roghnúcháin fheidhmiúil a shainaithníonn ní hamháin clóin a bhfuil airíonna ceangailteach soithíoch cheirbreach acu, ach a chuimsíonn céim ríthábhachtach freisin ina mbíonn gníomhaíocht intreach ag clóin rathúla chun bacainní bitheolaíocha a thrasnú in vivo isteach sa urrann CNS. is é an aidhm atá leis ná meicníocht iompair na bpeiptídí seo agus a rogha maidir le ceangal leis an micrea-soithíocht atá sainiúil don réigiún inchinne a shoiléiriú. D'fhéadfadh sé seo go bhfaighfí conairí nua le haghaidh iompar an BBB agus na ngabhdóirí. Táimid ag súil gur féidir leis na peiptídí aitheanta ceangal go díreach le gabhdóirí cheirbreashoithíocha nó le ligands scaipthe a iompraítear tríd an BBB nó BCSFB. Déanfar imscrúdú breise ar na veicteoirí peiptíde le gníomhaíocht iompair CSF a aimsítear san obair seo. Táimid ag fiosrú faoi láthair sainiúlacht inchinne na bpeiptídí seo maidir lena gcumas an BBB agus/nó BCSFB a thrasnú. Beidh na peiptídí nua seo thar a bheith luachmhar mar uirlisí chun gabhdóirí nó conairí nua a fhionnadh agus chun ardáin nua an-éifeachtúla a fhorbairt chun macramóilíní, amhail bithleighis, a sheachadadh chuig an inchinn.
Cannulaigh an cisterna mór (CM) ag baint úsáide as modhnú ar an modh a thuairiscíodh roimhe seo. Cuireadh francaigh Wistar ainéistéisithe (200-350 g) ar fhearas steiréatacsach agus rinneadh gearradh meánach thar an scalp bearrtha agus ullmhaithe go haiseipteach chun an cloigeann a nochtadh. Druileáil dhá pholl i limistéar an tsaise uachtair agus daingnigh na scriúnna daingnithe sna poill. Druileáladh poll breise sa chrios occipital cliathánach le haghaidh treorach steiréatacsach cannula cruach dhosmálta isteach sa CM. Cuir stroighin fiaclóireachta timpeall an channula agus daingnigh le scriúnna é. Tar éis fóta-leigheas agus cruaithe stroighne, dúnadh an chréacht craicinn le fuáil supramaid 4/0. Deimhnítear socrúchán ceart an channula trí sceitheadh ​​​​spontáineach sreabhán ceirbreasdromlaigh (CSF). Bain an francach as an bhfearas steiréatacsach, faigh cúram iar-obráide agus bainistíocht pian cuí, agus lig dó téarnamh ar feadh seachtaine ar a laghad go dtí go bhfeictear comharthaí fola sa sreabhán ceirbreasdromlaigh. Fuarthas francaigh Wistar (Crl:WI/Han) ó Charles River (an Fhrainc). Coinníodh na francaigh uile faoi choinníollacha sonracha saor ó phataiginí. D'fhormheas Oifig Tréidliachta Chathair Basel, an Eilvéis, na turgnaimh ainmhithe uile agus rinneadh iad i gcomhréir le Ceadúnas Ainmhithe Uimh. 2474 (Measúnú ar Iompar Gníomhach Inchinne trí Leibhéil Iarrthóirí Teiripeacha a Thomhas sa Sreabhán Cheirbreach-dhromlaigh agus san Inchinn Francach).
Coinnigh an francach feasach go réidh leis an cannula CM ina láimh. Bain an Datura as an cannula agus bailigh 10 µl de sreabhán cheirbreosdromlaigh a bhí ag sileadh go spontáineach. Ós rud é gur cuireadh bac ar phaitinn an channula sa deireadh, níor cuireadh san áireamh sa staidéar seo ach samplaí soiléire de sreabhán cheirbreosdromlaigh gan aon fhianaise ar éilliú ná ar dhídhathú fola. Ag an am céanna, tógadh thart ar 10–20 μl fola ó ghearradh beag ag barr an eireabaill isteach i bhfeadáin le heparin (Sigma-Aldrich). Bailíodh CSF agus fuil ag pointí ama éagsúla tar éis instealladh infhéitheach de fhag T7. Caitheadh ​​thart ar 5–10 μl de sreabhán sula mbailíodh gach sampla CSF, rud a fhreagraíonn do thoirt marbh an chatheitéir.
Gineadh leabharlanna ag baint úsáide as an veicteoir T7Select 10-3b mar a thuairiscítear i lámhleabhar chórais T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Go hachomair, sintéisíodh iontráil randamach DNA 12-mer sa fhormáid seo a leanas:
Baineadh úsáid as an gcódón NNK chun códóin stad dúbailte agus ró-léiriú aimínaigéid san iontráil a sheachaint. Is cóimheas coibhéiseach mólar measctha de láimh de gach núicléatíde é N, agus is cóimheas coibhéiseach mólar measctha de láimh de núicléatídí adenine agus cítosín é K. Tiontaíodh réigiúin aon-shnáithe go DNA dúbailte shnáithe trí ghoir bhreise le dNTP (Novagen) agus einsím Klenow (New England Biolabs) i maolán Klenow (New England Biolabs) ar feadh 3 uair an chloig ag 37°C. Tar éis an imoibrithe, aisghabhadh DNA dúbailte shnáithe trí dheascadh EtOH. Díleádh an DNA mar thoradh air sin le heinsímí srianta EcoRI agus HindIII (an dá cheann ó Roche). Ansin ligáladh an t-ionchur scoilte agus íonaithe (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) in-frame isteach i veicteoir T7 réamh-scoilte tar éis aimínaigéad 348 den ghéin capsid 10B. Goradh imoibrithe ligála ag 16°C ar feadh 18 uair an chloig roimh phacáistiú in vitro. Rinneadh pacáistiú fagaí in vitro de réir na dtreoracha a cuireadh ar fáil leis an trealamh clónála T7Select 10-3b (Novagen) agus rinneadh an tuaslagán pacáistithe a aimpliú uair amháin le haghaidh lysis ag baint úsáide as Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Rinneadh na lysáití a lártheifneoiriú, a thíotrátú agus a reo ag -80°C mar thuaslagán stoic de ghliocról.
Aimpliú PCR díreach ar réigiúin athraitheacha faga a aimplíodh i brat nó i bpláta ag baint úsáide as tosaitheoirí comhleá dílseánaigh 454/Roche-aimplicon. Tá seichimh sa tosaitheoir comhleá tosaigh a chlaonann leis an réigiún athraitheach (NNK) 12 (shonrach don teimpléad), Adaptóir Tíotáiniam GS FLX A, agus seicheamh eochrach leabharlainne ceithre bhonn (TCAG) (Fíor Forlíontach 1a):
Tá biotin sa phríméir comhleá droim ar ais atá ceangailte le coirníní gabhála agus an tOiriúntóir Tíotáiniam GS FLX B atá riachtanach le haghaidh aimpliú clónúil le linn PCR eibleachta:
Ansin rinneadh pirisheicheamhú 454/Roche ar na haimplicóin de réir phrótacal Titanium 454 GS-FLX. Chun seicheamhú láimhe Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Anailíseoir), rinneadh aimpliú ar DNA an fhagaigh T7 trí PCR agus rinneadh seicheamhú air leis na péirí tosaitheoirí seo a leanas:
Rinneadh aimpliú PCR ar iontrálacha ó phlaiceanna aonair ag baint úsáide as an Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (de réir threoracha an mhonaróra). Déan tús te (10 nóiméad ag 95 °C) agus 35 timthriall borrtha (50 soicind ag 95 °C, 1 nóiméad ag 50 °C, agus 1 nóiméad ag 72 °C).
Rinneadh fagaí ó leabharlanna, fagaí cineál fiáin, fagaí a tarrtháladh ó CSF agus fuil, nó clóin aonair a aimpliú in Escherichia coli BL5615 i mbrú TB (Sigma Aldrich) nó i miasa 500 cm2 (Thermo Scientific) ar feadh 4 uair ag 37°C. Baineadh fagaí as na plátaí trí na plátaí a shruthlú le maolán Tris-EDTA (Fluka Analytical) nó trí na plaiceanna a bhailiú le bairr phípéad steiriúla. Aonraíodh fagaí ó fhorshnáithín cultúir nó maolán eastósctha le babhta amháin de dheascadh poileitiléin glycol (PEG 8000) (Promega) agus athfhionraíodar iad i maolán Tris-EDTA.
Rinneadh 2-3 bhabhta bainte endotoxin den fhag aimplithe ag baint úsáide as coirníní bainte endotoxin (Miltenyi Biotec) roimh instealladh infhéitheach (IV) (500 μl/ainmhí). Sa chéad bhabhta, tugadh isteach 2×1012 fhag; sa dara ceann, 2×1010 fhag; sa tríú agus sa cheathrú babhta roghnúcháin, 2×109 fhag in aghaidh an ainmhí. Cinneadh cion na bhfag i samplaí CSF agus fola a bailíodh ag na pointí ama léirithe trí chomhaireamh plaic de réir threoracha an mhonaróra (lámhleabhar córais T7Select). Rinneadh roghnú na bhfag trí instealladh infhéitheach leabharlanna íonaithe isteach sa fhéith eireabaill nó trí ath-instealladh fag a baineadh as CSF ón mbabhta roghnúcháin roimhe sin, agus rinneadh fómhair ina dhiaidh sin ag 10 nóiméad, 30 nóiméad, 60 nóiméad, 90 nóiméad, 120 nóiméad, 180 nóiméad, agus 240 nóiméad faoi seach i samplaí CSF agus fola. Rinneadh ceithre bhabhta san iomlán de phannáil in vivo inar stóráladh agus anailísíodh an dá bhrainse roghnaithe ar leithligh le linn na chéad trí bhabhta roghnúcháin. Rinneadh pirisheicheamhú 454/Roche ar na hiontrálacha faga uile a baineadh as CSF ó na chéad dá bhabhta roghnúcháin, agus rinneadh pirisheicheamhú de láimh ar na clóin uile a baineadh as CSF ó na dhá bhabhta roghnúcháin dheireanacha. Rinneadh pirisheicheamhú 454/Roche ar na faga fola uile ón gcéad bhabhta roghnúcháin freisin. Chun clóin faga a instealladh, rinneadh faga roghnaithe a aimpliú in E. coli (BL5615) ar phlátaí 500 cm2 ag 37°C ar feadh 4 huaire an chloig. Rinneadh clóin a roghnaíodh ina n-aonar agus a seicheamhaíodh de láimh a iomadú i meán TB. Tar éis eastóscadh faga, íonú agus baint endotoxin (mar a thuairiscítear thuas), instealladh 2 × 1010 faga/ainmhí i 300 μl go hinmheánach i bhféith eireabaill amháin.
Réamhphróiseáil agus scagadh cáilíochtúil sonraí seicheamh. Rinneadh sonraí amha 454/Roche a thiontú ó fhormáid léarscáile srutha caighdeánach dénártha (sff) go formáid inléite ag Pearson (fasta) ag baint úsáide as bogearraí díoltóra. Rinneadh tuilleadh próiseála ar an seicheamh núicléatíde ag baint úsáide as cláir agus scripteanna C dílseánaigh (pacáiste bogearraí neamheisithe) mar a thuairiscítear thíos. Áirítear leis an anailís ar shonraí príomhúla nósanna imeachta scagtha ilchéime dochta. Chun léamha nach raibh seicheamh DNA iontrála 12mer bailí iontu a scagadh amach, ailíníodh na léamha go seicheamhach le lipéad tosaigh (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), lipéad stad (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) agus lipéad iontrála cúlra (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ag baint úsáide as an tástáil dhomhanda Needleman-Wunsch. Ailíniú a cheadaíonn suas le 2 neamhréireacht in aghaidh an ailínithe31. Dá bhrí sin, baineadh léamha gan clibeanna tosaigh agus stad agus léamha ina raibh iontrálacha cúlra, i.e., ailínithe a sháraíonn an líon ceadaithe mí-oiriúnuithe, as an leabharlann. Maidir leis na léamha atá fágtha, baineadh an seicheamh DNA N-mer a shíneann ón marc tosaigh agus a chríochnaíonn roimh an marc stad as an seicheamh léitheoireachta bunaidh agus rinneadh tuilleadh próiseála air (dá ngairtear “ionchur” anseo feasta). Tar éis aistriúchán an iontrála, baintear an chuid tar éis an chéad chódóin stad ag deireadh 5′ an phrímeora ón iontráil. Ina theannta sin, baineadh núicléatídí a mbíonn códóin neamhiomlána ag deireadh 3′ an phrímeora mar thoradh orthu freisin. Chun iontrálacha ina bhfuil seichimh chúlra amháin a eisiamh, baineadh iontrálacha aistrithe a thosaíonn leis an bpatrún aimínaigéad “PAG” freisin. Baineadh peiptídí a bhfuil fad iar-aistriúcháin níos lú ná 3 aimínaigéad acu as an leabharlann. Ar deireadh, baineadh an iomarcaíocht sa linn iontrála agus cinneadh minicíocht gach iontrála uathúil. Áiríodh ar thorthaí na hanailíse seo liosta de sheichimh núicléatíde (ionchuir) agus a minicíochtaí (léithe) (Fíoracha Forlíontacha 1c agus 2).
Ionsáigh DNA N-mer grúpa de réir cosúlachta seicheamhach: Chun earráidí seicheamhach 454/Roche-shonracha (amhail fadhbanna le síntí homopolymer seicheamhach) a dhíchur agus iomarcaíochtaí nach bhfuil chomh tábhachtach a bhaint, déantar ionchuir seicheamh DNA N-mer (ionchuir) atá scagtha roimhe seo a shórtáil de réir cosúlachta. Ionchuir (suas le 2 bhonn neamh-mheaitseála ceadaithe) ag baint úsáide as algartam athchleachtach atá sainmhínithe mar seo a leanas: déantar ionchuir a shórtáil ar dtús de réir a minicíochta (ón gceann is airde go dtí an ceann is ísle), agus má tá siad mar an gcéanna, de réir a sórtála tánaistigh de réir faid (an ceann is faide go dtí an ceann is giorra)). Dá bhrí sin, sainmhíníonn na hionchuir is minice agus is faide an chéad "ghrúpa". Socraítear minicíocht an ghrúpa go dtí an mhinicíocht eochair. Ansin, rinneadh iarracht gach ionchur atá fágtha sa liosta sórtáilte a chur leis an ngrúpa trí ailíniú péire Needleman-Wunsch. Mura sáraíonn líon na mí-oiriúnuithe, na n-ionchuir, nó na scriosadh in ailíniú tairseach 2, cuirtear ionchur leis an ngrúpa, agus méadaítear minicíocht iomlán an ghrúpa de réir cé chomh minic a cuireadh an t-ionchur leis. Déantar ionchuir a chuirtear le grúpa a mharcáil mar úsáidte agus a eisiamh ó phróiseáil bhreise. Mura féidir an seicheamh iontrála a chur le grúpa atá ann cheana féin, úsáidtear an seicheamh iontrála chun grúpa nua a chruthú leis an minicíocht iontrála chuí agus marcáiltear é mar úsáidte. Críochnaíonn an t-athrá nuair a úsáidtear gach seicheamh iontrála chun grúpa nua a fhoirmiú nó nuair is féidir é a áireamh i ngrúpa atá ann cheana féin. Tar éis an tsaoil, aistrítear iontrálacha grúpáilte ina bhfuil núicléatídí ina seichimh peptide (leabharlanna peptide). Is é toradh na hanailíse seo sraith iontrálacha agus a minicíochtaí comhfhreagracha a chuimsíonn líon na léamha as a chéile (Fíor Fhorlíontach 2).
Giniúint Móitífe: Bunaithe ar liosta de pheiptídí uathúla, cruthaíodh leabharlann ina bhfuil na patrúin aimínaigéid (aa) uile a d'fhéadfadh a bheith ann mar a thaispeántar thíos. Baineadh gach patrún féideartha de fhad 3 as an bpeiptíd agus cuireadh a phatrún inbhéartach leis mar aon le leabharlann móitífe coiteann ina bhfuil na patrúin uile (trípheiptídí). Rinneadh seicheamhú ar leabharlanna de mhóitífeanna an-athchleachtacha agus baineadh an iomarcaíocht. Ansin, i gcás gach trípheiptíde sa leabharlann móitífe, rinneamar seiceáil ar a láithreacht sa leabharlann ag baint úsáide as uirlisí ríomhaireachtúla. Sa chás seo, cuirtear minicíocht an pheiptíde ina bhfuil an trípheiptíd móitífe a fuarthas leis agus sanntar don mhóitíf sa leabharlann móitífe ("líon na móitífeanna"). Is é toradh giniúint móitífe eagar dháthoiseach ina bhfuil na trípheiptídí (móitífeanna) uile agus a luachanna faoi seach, arb ionann iad agus líon na léamhanna seicheamhaithe a eascraíonn sa mhóitíf chomhfhreagrach nuair a dhéantar na léamha a scagadh, a ghrúpáil agus a aistriú. Méadracht mar a thuairiscítear go mion thuas.
Normalú líon na móitífeanna agus na scaipphlotaí comhfhreagracha: Rinneadh normalú ar líon na móitífeanna do gach sampla ag baint úsáide as
áit a seasann ni do líon na léamhanna ina bhfuil topaic i. Dá bhrí sin, seasann vi do mhinicíocht chéatadáin na léamhanna (nó na peiptídí) ina bhfuil móitíf i sa sampla. Ríomhadh luachanna P don líon neamh-gnáthmhóitíf ag baint úsáide as tástáil chruinn Fisher. Maidir le comhghaolta líon na móitífeanna, ríomhadh comhghaolta Spearman ag baint úsáide as líon normalaithe na móitífeanna le R.
Chun ábhar na n-aimínaigéad ag gach suíomh sa leabharlann peiptíde a shamhlú, cruthaíodh lógógram gréasáin 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Ar dtús, stóráiltear ábhar na n-aimínaigéad ag gach suíomh den pheiptíd 12-mhéir i maitrís 20 × 12. Ansin, gintear sraith de 1000 peiptíd ina bhfuil an t-ábhar aimínaigéad coibhneasta céanna ag gach suíomh i bhformáid fasta-seicheamh agus soláthraítear iad mar ionchur do lógó gréasáin 3, a ghineann léiriú grafach ar an ábhar aimínaigéad coibhneasta ag gach suíomh do leabharlann peiptíde ar leith. Chun tacair sonraí iltoiseacha a shamhlú, cruthaíodh léarscáileanna teasa ag baint úsáide as uirlis a forbraíodh go hinmheánach in R (biosHeatmap, pacáiste R nach bhfuil eisithe fós). Ríomhadh na deindreagraim a cuireadh i láthair sna léarscáileanna teasa ag baint úsáide as modh braislithe ordlathach Ward leis an méadracht achair Eoiclídeach. Chun anailís staitistiúil a dhéanamh ar shonraí scórála móitífe, ríomhadh luachanna P le haghaidh scórála neamhghnáthaithe ag baint úsáide as tástáil chruinn Fisher. Rinneadh luachanna P do shraitheanna sonraí eile a ríomh in R ag baint úsáide as tástáil-t an Mhic Léinn nó ANOVA.
Rinneadh clóin agus fagaí roghnaithe gan iontrálacha a instealladh go hinmheánach tríd an bhféith eireabaill (2 × 1010 fagaí/ainmhí i 300 μl PBS). Deich nóiméad roimh an insreabhadh agus an socrú ina dhiaidh sin, rinneadh 100 μl de lectin lipéadaithe le DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177) a instealladh go hinmheánach sna hainmhithe céanna. 60 nóiméad tar éis instealladh an fhagaí, rinneadh 50 ml PBS a insreabhadh tríd an gcroí do na francaigh agus ina dhiaidh sin 50 ml 4% PFA/PBS. Socraíodh samplaí inchinne thar oíche i 4% PFA/PBS agus sáithíodh iad i 30% siúcrós thar oíche ag 4°C. Reoitear na samplaí go tapa sa mheascán OCT. Rinneadh anailís imdhíoneolaíoch ar shamplaí reoite ag teocht an tseomra ar chrioghearrthacha 30 µm a bhí blocáilte le 1% BSA agus a goradh le hantashubstaintí ilchlónacha lipéadaithe le FITC i gcoinne fagaí T7 (Novus NB 600-376A) ag 4°C. Goradh thar oíche. Ar deireadh, nite na codanna 3 huaire le PBS agus scrúdaíodh iad le micreascóp léasair comhfhócasach (Leica TCS SP5).
Sintéisíodh na peiptídí uile a raibh íonacht íosta 98% acu le GenScript USA, rinneadh iad a bhiotináil agus a liofiliú. Ceanglaítear biotin trí spásaire triarach glicín breise ag an N-chríoch. Seiceáil na peiptídí uile ag baint úsáide as mais-speictriméadracht.
Meascánaíodh streipteavidín (Sigma S0677) le farasbarr coibhéiseach 5 oiread de pheiptíd bhithitinithe, peiptíd choscach BACE1 bhithitinithe, nó meascán (cóimheas 3:1) de pheiptíd choscach BACE1 bhithitinithe agus peiptíd choscach BACE1 i 5–10% DMSO/goraithe i PBS. 1 uair an chloig ag teocht an tseomra roimh an instealladh. Instealladh peiptídí streipteavidín-chomhchuingithe go hinmheánach ag dáileog de 10 mg/kg i gceann de na féitheacha eireabaill i bhfrancaigh a raibh cuas inchinne acu.
Rinneadh measúnú ar thiúchan na gcoimpléasc streptavidin-peiptíde trí ELISA. Brataíodh plátaí micritítre Nunc Maxisorp (Sigma) thar oíche ag 4°C le 1.5 μg/ml antashubstaint frith-streptavidin lucha (Thermo, MA1-20011). Tar éis blocála (maolán blocála: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% geilitín, 1% BSA) ag teocht an tseomra ar feadh 2 uair an chloig, nigh an pláta le 0.05% Tween-20/PBS (maolán níocháin) ar feadh 3 soicind, cuireadh samplaí CSF agus plasma le toibreacha caolaithe le maolán blocála (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Ansin goradh an pláta thar oíche ag 4°C le hantashubstaint bhrath (1 μg/ml, frith-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Tar éis trí chéim níocháin, braitheadh ​​streiptavidin trí ghoir i dtuaslagán foshraithe TMB (Roche) ar feadh suas le 20 nóiméad. Tar éis stop a chur le forbairt datha le 1M H2SO4, tomhais an ionsú ag 450 nm.
Rinneadh measúnú ar fheidhm an choimpléasc coscaire streptavidin-peptide-BACE1 trí Aβ(1-40) ELISA de réir phrótacal an mhonaróra (Wako, 294-64701). Go hachomair, caolaíodh samplaí CSF i gcaolaitheoir caighdeánach (1:23) agus goradh iad thar oíche ag 4°C i plátaí 96-tobair atá brataithe le hantashubstaint gabhála BNT77. Tar éis cúig chéim níocháin, cuireadh antashubstaint HRP-chomhchuingithe BA27 leis agus goradh é ar feadh 2 uair an chloig ag 4°C., agus ina dhiaidh sin cúig chéim níocháin. Braitheadh ​​Aβ(1–40) trí ghoradh i dtuaslagán TMB ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra. Tar éis stop a chur le forbairt datha le tuaslagán stad, tomhais an ionsú ag 450 nm. Rinneadh eastóscadh céime soladaí ar shamplaí plasma roimh Aβ(1–40) ELISA. Cuireadh plasma le 0.2% DEA (Sigma) i plátaí 96-tobair agus goradh é ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad. Tar éis na plátaí SPE (Oasis, 186000679) a ní go leanúnach le huisce agus 100% meatánól, cuireadh samplaí plasma leis na plátaí SPE agus baineadh an leacht go léir. Níodh na samplaí (ar dtús le 5% meatánól agus ansin le 30% meatánól) agus rinneadh iad a eluáil le 2% NH4OH/90% meatánól. Tar éis an eluáil a thriomú ag 55°C ar feadh 99 nóiméad ag sruth tairiseach N2, laghdaíodh na samplaí i gcaolaitheoirí caighdeánacha agus tomhaiseadh Aβ(1–40) mar a thuairiscítear thuas.
Conas an t-alt seo a lua: Urich, E. et al. Seachadadh lasta chuig an inchinn ag baint úsáide as peiptídí idirthurais a aithníodh in vivo. an eolaíocht. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB agus Moos T. Seachadadh drugaí macramóilíní chuig an inchinn ag baint úsáide as teiripe spriocdhírithe. Iris na Néarcheimice 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., agus Martinez-Martinez, P. Seachadadh drugaí peiptíde agus próitéine trasna an bhacainn fola-inchinne. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM An bacainn fola-inchinne: bac i bhforbairt drugaí inchinne. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, agus Byrd, A. Ionchais maidir le seachadadh agus spriocdhíriú feabhsaithe drugaí chuig an inchinn tríd an gcosán plexus choroid-CSF. Taighde Cógaisíochta 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Nuachóiriú bithchógaisíochta le capaill Thróiaigh mhóilíneacha le haghaidh seachadadh inchinne. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, iompar peiptíde idirghabhálaithe ag gabhdóirí WM trasna an bhacainn fola-inchinne. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Méadú ar threá inchinne agus ar éifeachtúlacht antashubstaintí teiripeacha ag baint úsáide as tointeálaithe móilíneacha aonfhiúsacha. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Cinneann iompar gabhdóra transferrin (TfR) glacadh inchinne le hathróga gaolmhara antashubstaintí TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).