Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tú ag baint úsáide as leagan brabhsálaí a bhfuil tacaíocht CSS teoranta aige.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Ina theannta sin, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánann muid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Taispeánann sé timpeallán de thrí shleamhnán ag an am céanna.Bain úsáid as na cnaipí Roimhe agus Ar Aghaidh chun bogadh trí thrí shleamhnán ag an am, nó bain úsáid as na cnaipí sleamhnáin ag an deireadh chun bogadh trí thrí shleamhnán ag an am.
Cuireann an bac fola-inchinn agus an bhacainn fola-inchinn cosc ​​ar ghníomhairí bithteiripeacha a gcuid spriocanna a bhaint amach sa lárchóras néaróg, rud a chuireann bac ar chóireáil éifeachtach ar ghalair néareolaíocha.Chun iompróirí inchinne núíosacha a fháil amach in vivo, thugamar isteach leabharlann peiptíde T7 phage agus bailíodh go sraitheach fola agus sreabhán cerebrospinal (CSF) ag baint úsáide as samhail comhfhiosach mór cannlaithe de fhrancaigh.Saibhríodh go mór clóin phage ar leith i CSF tar éis ceithre bhabhta roghnaithe.Léirigh tástáil ar pheptídí iarrthóra aonair níos mó ná saibhriú 1000-huaire i CSF.Deimhníodh bithghníomhaíocht an tseachadta peptide-idirghabhála don inchinn le laghdú 40% ar an leibhéal amyloid-β sa sreabhán cerebrospinal ag baint úsáide as inhibitor peptide BACE1 atá nasctha leis an peptide idirthurais úrscéal aitheanta.Tugann na torthaí seo le tuiscint go bhféadfadh na peiptídí a shainaithnítear trí mhodhanna roghnaithe phage in vivo a bheith ina bhfeithiclí úsáideacha chun macramóilíní a sheachadadh go córasach chuig an inchinn le héifeacht theiripeach.
Dhírigh taighde teiripe spriocdhírithe ar an néarchóras lárnach (CNS) den chuid is mó ar dhrugaí agus oibreáin optamaithe a aithint a thaispeánann airíonna spriocdhírithe CNS, le níos lú iarrachta ar aimsiú na meicníochtaí a thiomáineann seachadadh gníomhach drugaí don inchinn.Tá sé seo ag tosú ag athrú anois agus seachadadh drugaí, go háirithe móilíní móra, mar chuid lárnach d’fhorbairt drugaí néareolaíochta nua-aimseartha.Tá timpeallacht an lárchórais néaróg cosanta go maith ag an gcóras bacainn cerebrovascular, atá comhdhéanta den bhacainn fola-inchinn (BBB) ​​agus an bhacainn fola-inchinn (BCBB)1, rud a fhágann go bhfuil sé dúshlánach drugaí a sheachadadh don inchinn1,2.Meastar go ndéantar beagnach gach druga móilín mór agus níos mó ná 98% de dhrugaí móilíní beaga a dhíchur ón inchinn3.Sin é an fáth go bhfuil sé an-tábhachtach córais iompair inchinne nua a aithint a sholáthraíonn seachadadh éifeachtach agus sonrach drugaí teiripeacha don CNS 4,5.Mar sin féin, cuireann an BBB agus BCSFB deis iontach ar fáil do sheachadadh drugaí agus iad ag dul isteach i ngach struchtúr den inchinn agus ag dul isteach iontu trína soithíoch fairsing.Mar sin, tá na hiarrachtaí atá ann faoi láthair maidir le modhanna seachadta neamh-ionracha a úsáid don inchinn bunaithe go mór ar mheicníocht iompair receptor-idirghabhála (PMT) ag baint úsáide as an receptor BBB6 ingenous.In ainneoin dul chun cinn tábhachtach le déanaí ag baint úsáide as cosán gabhdóirí aistrithe7,8, tá gá le tuilleadh forbartha a dhéanamh ar chórais seachadta nua le réadmhaoine feabhsaithe.Chuige sin, ba é an sprioc a bhí againn ná peiptídí a shainaithint a bhí in ann iompar CSF a idirghabháil, toisc go bhféadfaí iad a úsáid i bprionsabal chun macramóilíní a sheachadadh chuig an CNS nó chun cosáin gabhdóirí nua a oscailt.Go háirithe, is féidir le gabhdóirí agus iompróirí sonracha an chórais cherebrovascular (BBB agus BSCFB) feidhmiú mar spriocanna féideartha do sheachadadh gníomhach agus sonrach drugaí bithteiripeacha.Is táirge rúnda den plexus choroid (CS) é an sreabhach cerebrospinal (CSF) agus bíonn sé i dteagmháil dhíreach le sreabhán interstitial na hinchinne tríd an spás subarachnoid agus an spás ventricular4.Léiríodh le déanaí go bhfuil sreabhán cerebrospinal subarachnoid idirleata ró-mhór isteach in idirstadium na hinchinne9.Tá súil againn rochtain a fháil ar an spás parenchymal ag baint úsáide as an gconair insreafa subarachnoid seo nó go díreach tríd an BBB.Chun é seo a bhaint amach, chuireamar i bhfeidhm straitéis roghnúcháin phage in vivo láidir a shainaithníonn go hidéalach na peiptídí a iompraítear ag ceachtar den dá chonair ar leith seo.
Déanaimid cur síos anois ar mhodh scagtha taispeána in vivo phage seicheamhach le sampláil CSF mar aon le seicheamhú tréchur ard (HTS) chun monatóireacht a dhéanamh ar bhabhtaí roghnúcháin tosaigh leis an éagsúlacht leabharlainne is airde.Rinneadh scagadh ar fhrancaigh chomhfhiosacha le cannula sistéala mór (CM) a ionchlannaíodh go buan chun éilliú fola a sheachaint.Rud atá tábhachtach, roghnaíonn an cur chuige seo spriocdhíriú inchinne agus peiptídí le gníomhaíocht iompair ar fud an bhacainn cherebrovascular.D’úsáideamar phages T7 mar gheall ar a mbeagmhéid (~ 60 nm)10 agus mholamar go bhfuil siad oiriúnach chun vesicles a iompar a cheadaíonn an bacainn endothelial agus/nó epithelial-medulla a thrasnú go trascheallach.Tar éis ceithre bhabhta panning, bhí daonraí phage scoite amach ag taispeáint saibhriú láidir in vivo CSF ​​​​agus comhlachas microvessel cheirbreach.Rud atá tábhachtach, bhíomar in ann ár dtorthaí a dhearbhú trína léiriú go bhfuil na peptidí iarrthacha is fearr agus a shintéisíodh go ceimiceach in ann lasta próitéine a iompar isteach sa sreabhán cerebrospinal.Ar an gcéad dul síos, bunaíodh éifeachtaí cógasdinimiciúla an CNS trí phríomh-pheiptíd idirthurais a chomhcheangal le coscaire ar an peptide BACE1.Chomh maith le léiriú gur féidir le straitéisí scagthástála feidhme in vivo peiptídí iompair inchinne núíosacha a aithint mar iompróirí éifeachtacha lasta próitéine, táimid ag súil go mbeidh tábhacht ag baint le cineálacha cur chuige roghnaithe feidhme comhchosúla maidir le bealaí núíosacha iompair inchinn a aithint.
Bunaithe ar aonaid foirmithe plaic (PFU), tar éis na céime pacáistithe phage, dearadh agus cruthaíodh leabharlann de pheptídí phage T7 líneach randamach 12-mer le héagsúlacht thart ar 109 (féach Ábhair agus Modhanna).Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara go ndearnamar anailís chúramach ar an leabharlann seo sula ndearnamar in vivo panning.Aimpliú PCR ar shamplaí leabharlainne phage ag baint úsáide as primers modhnaithe a ghintear amplicons a bhí infheidhme go díreach maidir le HTS (Fíor Forlíontach 1a).Mar gheall ar a) earráidí seicheamhaithe HTS11, b) tionchar ar cháilíocht na primers (NNK) 1-12, agus c) láithreacht phage de chineál fiáin (wt) (ionsáigh cnámharlaigh) sa leabharlann fuireachais, cuireadh nós imeachta scagtha seicheamh i bhfeidhm chun faisnéis seicheamh fíoraithe amháin a bhaint (Fíor Forlíontach 1b).Baineann na céimeanna scagaire seo le gach leabharlann seicheamhaithe HTS.Don leabharlann chaighdeánach, fuarthas 233,868 léamh san iomlán, ar shásaigh 39% díobh na critéir scagtha agus úsáideadh iad le haghaidh anailíse leabharlainne agus roghnúcháin do bhabhtaí ina dhiaidh sin (Fíor Forlíontach 1c–e).Iolraithe de 3 phéire bonn ar fad a bhí sna léamha den chuid is mó agus buaicphointe ag 36 núicléatídí (Fíor Forlíontach 1c), ag deimhniú dearadh na leabharlainne (NNK) 1-12.Go háirithe, bhí ionsá 12-tríthoiseach de chineál fiáin (wt) PAGISRELVDKL ag thart ar 11% de bhaill na leabharlainne, agus cuireadh isteach nó scriosadh i mbeagnach leath de na sraitheanna (49%).Dhearbhaigh HTS leabharlann na leabharlainne ard-éagsúlacht na peptides sa leabharlann: níor aimsíodh níos mó ná 81% de na sraitheanna peptide ach uair amháin agus níor tharla ach 1.5% i gcóip ≥4 (Fíor Forlíontach 2a).Bhain minicíochtaí aimínaigéad (aa) ag gach 12 phost sa stór go maith leis na minicíochtaí a rabhthas ag súil leo maidir le líon na gcódón a ghin an stór NKK degenerate (Fíor Forlíontach 2b).Bhí comhghaol maith idir minicíocht breathnaithe na n-iarmhar aa a bhí ionchódaithe ag na hiatáin seo agus an mhinicíocht ríofa (r = 0.893) (Fíor Forlíontach 2c).Áirítear le hullmhú leabharlanna phage le haghaidh instealladh céimeanna aimplithe agus deireadh a chur le endotoxin.Léiríodh roimhe seo go bhféadfadh sé seo éagsúlacht na leabharlann phage a laghdú12,13.Mar sin, rinneamar leabharlann phage pláta-aimplithe a sheicheamhú a ndearnadh baint endotoxin uirthi agus chuireamar i gcomparáid í leis an leabharlann bhunaidh chun minicíocht AA a mheas.Breathnaíodh comhghaol láidir (r = 0.995) idir an linn bunaidh agus an linn aimplithe agus íonaithe (Fíor Forlíontach 2d), rud a thugann le fios nach raibh an iomaíocht idir clóin méadaithe ar phlátaí ag baint úsáide as T7 phage ina chúis le claonadh mór.Tá an chomparáid seo bunaithe ar mhinicíocht móitífeanna trípeiptíde i ngach leabharlann, toisc nach féidir éagsúlacht na leabharlann (~109) a ghabháil go hiomlán fiú le HTS.Léirigh anailís mhinicíochta ar aa ag gach suíomh go raibh claonadh beag suíomh-spleách sna trí shuíomh deiridh den stór a cuireadh isteach (Fíor Fhorlíontach 2e).Mar fhocal scoir, bhaineamar de thátal as go raibh cáilíocht agus éagsúlacht na leabharlainne inghlactha agus níor breathnaíodh ach mionathruithe ar an éagsúlacht mar gheall ar aimpliú agus ullmhú na leabharlann phage idir roinnt babhtaí roghnaithe.
Is féidir sampláil sraitheach sreabhán cerebrospinal a dhéanamh trí cannula a ionchlannú go máinliachta i CM na bhfrancach comhfhiosach chun aithint phage T7 a instealladh infhéitheach (iv) tríd an BBB agus/nó BCSFB (Fíor 1a-b) a éascú.D'úsáideamar dhá lámh neamhspleách roghnúcháin (arm A agus B) sa chéad trí bhabhta den roghnú in vivo (Fíor 1c).Mhéadaigh muid déine an roghnúcháin de réir a chéile trí laghdú a dhéanamh ar an méid iomlán phage a tugadh isteach sna chéad trí bhabhta roghnaithe.Don cheathrú babhta panning, chuireamar samplaí ó bhrainsí A agus B le chéile agus rinneamar trí roghnú neamhspleácha breise.Chun staidéar a dhéanamh ar airíonna in vivo na gcáithníní phage T7 sa mhúnla seo, cuireadh phage de chineál fiáin (máistir isteach PAGISRELVDKL) isteach i bhfrancaigh tríd an vein eireaball.Léirigh aisghabháil phages ó shreabhán cerebrospinal agus fola ag pointí ama éagsúla go raibh céim imréitigh tosaigh tapa ag phages icosahedral T7 réasúnta beag ón urrann fola (Fíor Forlíontach 3).Bunaithe ar na titers a riaradh agus ar an toirt fola na francaigh, ríomh againn go bhfuil ach thart ar 1% wt.braitheadh ​​​​phage ón dáileog riartha san fhuil 10 nóiméad tar éis instealladh infhéitheach.Tar éis an meath tapa tosaigh seo, tomhaiseadh imréiteach bunscoile níos moille le leathré 27.7 nóiméad.Is é an rud is tábhachtaí ná níor aisghabhadh ach fíorbheagán phages ón urrann CSF, rud a léirigh cúlra íseal d'imirce phage de chineál fiáin isteach san urrann CSF (Fíor Forlíontach 3).Ar an meán, níor aimsíodh ach thart ar 1 x 10-3% titers de T7 phage san fhuil agus 4 x 10-8% de phages insileadh ar dtús sa sreabhach cerebrospinal thar an tréimhse samplála iomlán (0-250 min).Go háirithe, bhí an leathré (25.7 min) de phage de chineál fiáin i sreabhán cerebrospinal cosúil leis an gceann a breathnaíodh san fhuil.Léiríonn na sonraí seo go bhfuil an bacainn a scarann ​​​​an urrann CSF ón fhuil slán i bhfrancaigh CM-cannáilte, rud a fhágann gur féidir leabharlanna phage a roghnú in vivo chun clóin a iompraítear go héasca ón fhuil isteach san urrann CSF a aithint.
(a) Modh a bhunú chun sreabhán cerebrospinal (CSF) a athshampláil ó linn mór.(b) Léaráid a thaispeánann suíomh ceallach bhacainn lárchóras na néaróg (CNS) agus an straitéis roghnúcháin a úsáidtear chun peiptídí a thrasnaíonn an bhacainn fola-inchinn (BBB) ​​agus an bhacainn fola-inchinn a shainaithint.(c) Sreabhchairt scagtha taispeána in vivo phage.I ngach babhta roghnaithe, cuireadh phages (aitheantóirí ainmhithe taobh istigh de na saigheada) instealladh infhéitheach.Coimeádtar dhá bhrainse neamhspleácha eile (A, B) ar leithligh go dtí an 4ú babhta roghnaithe.Le haghaidh babhtaí roghnúcháin 3 agus 4, rinneadh seicheamh de láimh ar gach clón phage a bhaintear as CSF.(d) Cinéitic phage scoite ó fhuil (ciorcail dhearga) agus sreabhán cerebrospinal (triantáin ghlasa) le linn an chéad bhabhta roghnaithe in dhá francach cannáilte tar éis instealladh infhéitheach sa leabharlann peiptíde T7 (2 x 1012 phages/ainmhí).Léiríonn cearnóga gorm an meántiúchan tosaigh de phage san fhuil, arna ríomh ó mhéid an phage insteallta, ag cur san áireamh an méid fola iomlán.Léiríonn na cearnóga dubha pointe trasnaithe na líne y a eachtarshuíodh ó thiúchan phage fola.(e,f) Cuir i láthair minicíocht choibhneasta agus dáileadh na móitífeanna trípeiptíde forluiteacha go léir a d’fhéadfadh a bheith ann agus a fhaightear sa pheiptíd.Taispeántar líon na móitífeanna a fuarthas i 1000 léamh.Tá móitífeanna saibhrithe go suntasach (p < 0.001) marcáilte le poncanna dearga.(e) Scaipphlé comhghaoil ​​ag déanamh comparáide idir mhinicíocht choibhneasta mhóitíf thrípheiptíde na leabharlainne insteallta agus phage fola-díorthaithe ó ainmhithe #1.1 agus #1.2.(f) Scaipphlota comhghaoil ​​ag déanamh comparáide idir minicíochtaí coibhneasta móitífeanna trípeiptíde phage ainmhí #1.1 agus #1.2 atá scoite amach san fhuil agus i sreabhán cerebrospinal.(g, h) Léiriú ID seicheamhach de phage saibhrithe san fhuil (g) i gcoinne leabharlanna insteallta agus phage saibhrithe i CSF (h) i gcoinne fola tar éis babhta de roghnú in vivo sa dá ainmhí.Léiríonn méid an chóid aon-litir cé chomh minic a tharlaíonn an aimínaigéad sin ag an suíomh sin.Glas = polar, corcra = neodrach, gorm = bunúsach, dearg = aigéadach agus dubh = aimínaigéid hidreafóbach.Is é Eduard Urich a dhear agus a tháirg Fíor 1a, b.
Instealladh againn leabharlann peptide phage isteach dhá francaigh ionstraim CM (clades A agus B) agus phage scoite ó sreabhach cerebrospinal agus fola (Fíor 1d).Ní raibh imréiteach tapa tosaigh na leabharlainne chomh soiléir i gcomparáid leis an phage de chineál fiáin.Ba é meán-leathré na leabharlainne instealladh sa dá ainmhí ná 24.8 nóiméad san fhuil, cosúil le phage de chineál fiáin, agus 38.5 nóiméad i CSF.Cuireadh samplaí fola agus sreabhán cerebrospinal ó gach ainmhí faoi HTS agus rinneadh anailís ar na peiptídí sainaitheanta go léir le haghaidh móitíf ghearr trípeiptíde a bheith i láthair.Roghnaíodh móitífeanna trípeiptíde toisc go soláthraíonn siad bunús íosta le haghaidh foirmiú struchtúir agus idirghníomhaíochtaí peptide-próitéin14,15.Fuaireamar comhghaol maith i ndáileadh móitífeanna idir an leabharlann phage instealladh agus clóin a bhaintear as fuil an dá ainmhí (Fig. 1e).Tugann na sonraí le fios nach bhfuil comhdhéanamh na leabharlainne ach beagán saibhrithe san urrann fola.Rinneadh tuilleadh anailíse ar mhinicíochtaí aimínaigéad agus ar sheichimh chomhthoil ag gach suíomh agus leas á bhaint as na bogearraí Weblogo16 a oiriúnú.Suimiúil go leor, fuair muid saibhriú láidir i iarmhair glicín fola (Fíor 1g).Nuair a cuireadh fola i gcomparáid le clóin a roghnaíodh ó CSF, breathnaíodh roghnú láidir agus roinnt díroghnú móitífeanna (Fíor 1f), agus bhí aimínaigéid áirithe i láthair go fabhrach ag poist réamhshocraithe sa bhall 12 ( Fíor. 1h ).Go háirithe, bhí difríocht shuntasach idir ainmhithe aonair i sreabhán cerebrospinal, ach breathnaíodh saibhriú glicín fola sa dá ainmhí (Fíor Forlíontach 4a-j).Tar éis scagadh dian ar shonraí seicheamh i sreabhán cerebrospinal ainmhithe # 1.1 agus # 1.2, fuarthas iomlán de 964 agus 420 peptides uathúla 12-mer (Fíor Fhorlíontach 1d-e).Méadaíodh na clóin phage scoite agus cuireadh faoi réir an dara babhta de roghnú in vivo iad.Cuireadh Phage a bhaintear as an dara babhta roghnaithe faoi réir HTS i ngach ainmhí agus úsáideadh na peptidí aitheanta go léir mar ionchur i gclár aitheantais móitíf chun anailís a dhéanamh ar tharla móitífeanna trípeiptíde (Fíor 2a, b, ef).I gcomparáid leis an gcéad timthriall den phage a gnóthaíodh ó CSF, thugamar faoi deara tuilleadh roghnúcháin agus dí-roghnú go leor móitífeanna sa CSF i mbrainsí A agus B (Fíor 2).Cuireadh algartam aitheantais líonra i bhfeidhm lena fháil amach ar léirigh siad patrúin éagsúla seichimh chomhsheasmhacha.Chonacthas cosúlacht shoiléir idir na sraitheanna 12-tríthoiseach a d'aisghabh CSF i gcladach eile A (Fíor 2c, d) agus clade B (Fíor 2g, h).Nocht an anailís chomhthiomsaithe i ngach brainse próifílí roghnúcháin éagsúla do pheptídí 12-mer (Fíor Fhorlíontach Fíor 5c,d) agus méadú ar an gcóimheas CSF / titer fola le himeacht ama do Chluain Eois comhthiomsaithe tar éis an dara babhta roghnaithe i gcomparáid leis an gcéad bhabhta roghnúcháin (Fíor Fhorlíontach Fíor 5e).).
Saibhriú móitífeanna agus peiptídí i sreabhán cerebrospinal trí dhá bhabhta as a chéile de roghnú taispeáint phage feidhmiúil in vivo.
Comhthiomsaíodh, méadaíodh na hainmhithe go léir sreabhán cerebrospinal a fuarthas ón gcéad bhabhta de gach ainmhí (ainmhithe #1.1 agus #1.2), seicheamh HT agus ath-instealladh le chéile (2 x 1010 phages/ainmhí) ​​2 francach cannáilte SM (#1.1 → #).2.1 agus 2.2, 1.2 → 2.3 agus 2.4).(a,b,e,f) Scaipphléacsanna comhghaolaithe a dhéanann comparáid idir mhinicíocht choibhneasta móitífeanna trípeiptíde na n-íomhánna go léir atá díorthaithe ó CSF sa chéad bhabhta agus sa dara babhta roghnúcháin.Minicíocht choibhneasta agus dáileadh móitífeanna a léiríonn gach trípeiptíde forluiteach féideartha a fhaightear i peiptídí sa dá threoshuíomh.Taispeántar líon na móitífeanna a fuarthas i 1000 léamh.Aibhsítear móitífeanna a roghnaíodh go suntasach (p < 0.001) nó a fágadh as an áireamh i gceann de na leabharlanna comparáide le poncanna dearga.(c, d, g, h) Léiriú lógó seicheamh ar gach seicheamh fada aimínaigéad 12 saibhir i CSF bunaithe ar bhabhtaí 2 agus 1 den roghnú in vivo.Léiríonn méid an chóid aon-litir cé chomh minic a tharlaíonn an aimínaigéad sin ag an suíomh sin.Chun an lógó a léiriú, déantar comparáid idir minicíocht na seicheamh CSF a bhaintear as ainmhithe aonair idir dhá bhabhta roghnúcháin agus taispeántar na seichimh saibhrithe sa dara babhta: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 agus (h) #1.2–#2.4.Na aimínaigéid is saibhrithe ag suíomh ar leith in (c, d) ainmhithe uimh.2.1 agus uimh.2.2 nó (g, h) in ainmhithe uimh.2.3 agus uimh.Taispeántar 2.4 i ndath.Glas = polar, corcra = neodrach, gorm = bunúsach, dearg = aigéadach agus dubh = aimínaigéid hidreafóbach.
Tar éis an tríú babhta roghnaithe, d'aithníomar 124 seicheamh peiptíde uathúla (#3.1 agus #3.2) ó 332 clón phage athdhéanta CSF scoite ó dhá ainmhí (Fíor Forlíontach 6a).Bhí an comhréir choibhneasta is airde ag an seicheamh LGSVS (18.7%), agus ina dhiaidh sin cuireadh isteach de chineál fiáin PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), agus SARGSWREIVSLS (2.2%).Sa cheathrú babhta deiridh, chomhthiomsaigh muid dhá bhrainse a roghnaíodh go neamhspleách ó thrí ainmhí ar leith (Fíor 1c).As na 925 clón phage seicheamhach a gnóthaíodh ó CSF, sa cheathrú babhta fuaireamar 64 seicheamh peiptíde uathúla (Fíor Forlíontach 6b), agus thit an cion coibhneasta de phage de chineál fiáin go 0.8%.Ba iad na clóin CSF is coitianta sa cheathrú babhta ná LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) agus RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Tá raon faid na peiptídí roghnaithe mar gheall ar ionsáite/scriosadh núicléitíde nó codóin stadanna roimh am i bpriméirí na leabharlainne nuair a bhíonn códóin dhíghineacha á n-úsáid le haghaidh dearadh leabharlainne NNK.Gineann codóin stad roimh am peiptídí níos giorra agus roghnaítear iad toisc go bhfuil an móitíf aa fabhrach iontu.D'fhéadfadh peiptídí níos faide a bheith mar thoradh ar chur isteach/scriosadh i bpriméirí na leabharlann sintéiseacha.Socraíonn sé seo an stopchód deartha taobh amuigh den fhráma agus léann sé é go dtí go bhfeicfear codon stad nua le sruth.Go ginearálta, rinneamar fachtóirí saibhrithe a ríomh do na ceithre bhabhta roghnúcháin trí na sonraí ionchuir a chur i gcomparáid leis na sonraí aschuir samplacha.Don chéad bhabhta scagtha, d'úsáideamar titers phage de chineál fiáin mar thagairt chúlra neamhshonrach.Suimiúil go leor, bhí roghnú phage diúltach an-láidir sa chéad timthriall CSF, ach ní san fhuil (Fíor 3a), a d'fhéadfadh a bheith mar gheall ar an dóchúlacht íseal de idirleathadh éighníomhach an chuid is mó de na baill den leabharlann peptide isteach sa urrann CSF nó phages coibhneasta claonadh a bheith níos éifeachtaí a choinneáil nó a bhaint as an sruth fola ná bacteriophages.Mar sin féin, sa dara babhta panning, breathnaíodh rogha láidir phages i CSF sa dá chlaí, rud a thugann le tuiscint gur saibhríodh an babhta roimhe sin i phages a thaispeánann peptídí a chuireann glacadh CSF chun cinn (Fíor 3a).Arís, gan saibhriú fola suntasach.Chomh maith leis sin sa tríú agus sa cheathrú babhta, bhí na clóin phage saibhrithe go suntasach i CSF.Comparáid a dhéanamh ar mhinicíocht choibhneasta gach seicheamh peptide uathúil idir an dá bhabhta deiridh de roghnú, fuair muid amach go raibh na sraitheanna níos saibhrithe sa cheathrú babhta de roghnú (Fíor 3b).Baineadh iomlán de 931 móitíf trípeiptíde as na 64 seicheamh peiptíde uathúla ag baint úsáide as an dá threoshuíomh peptide.Rinneadh scrúdú níos dlúithe ar na móitífeanna is saibhrithe sa cheathrú babhta as a gcuid próifílí saibhrithe ar fud na mbabhtaí go léir i gcomparáid leis an leabharlann insteallta (gearrtha: saibhriú 10%) (Fíor Forlíontach 6c).Léirigh patrúin roghnóireachta ghinearálta gur saibhríodh an chuid is mó de na cúiseanna a ndearnadh staidéar orthu i ngach babhta roimhe seo den dá bhrainse roghnúcháin.Mar sin féin, tháinig roinnt móitífeanna (m.sh. SGL, VSG, LGS GSV) ó chladach malartach A den chuid is mó, agus saibhríodh cinn eile (m.sh. FGW, RTN, WGF, NTR) i gcladach eile B.
Bailíochtú iompair CSF de pheptídí phage-léirithe saibhrithe CSF agus peptides ceannaire biotinylated comhchuingeach le pálasta streptavidin.
(a) Cóimheasa saibhrithe arna ríomh i ngach ceann de na ceithre bhabhta (R1-R4) bunaithe ar na titers phage insteallta (ionchur = I) (PFU) agus titers phage CSF cinntithe (aschur = O).Ríomhadh fachtóirí saibhrithe do na trí bhabhta deiridh (R2-R4) i gcomparáid leis an mbabhta roimhe sin agus an chéad bhabhta (R1) le sonraí meáchain.Is sreabhach cerebrospinal iad barraí oscailte, is plasma iad barraí scáthaithe.(***p<0.001, bunaithe ar t-thástáil an Mhic Léinn).(b) Liosta de na peiptídí phage is flúirseach, arna rangú de réir a gcion coibhneasta leis na haiceanna uile a bailíodh sa CSF tar éis bhabhta 4 den roghnú.Aibhsítear na sé chlóin phage is coitianta i ndath, uimhriú agus a bhfachtóirí saibhrithe idir babhtaí 3 agus 4 den roghnú (insets).(c,d) Rinneadh anailís ar na sé leabharlann phage phage is saibhrithe, leabharlann phage folamh agus phage tuismitheora ó bhabhta 4 ina n-aonar i múnla samplála CSF.Bailíodh samplaí CSF agus fola ag na pointí ama sonraithe.(c) Méideanna comhionanna de 6 chlón phage iarrthóra (2 x 1010 phage/ainmhí), phages fholmha (#1779) (2 x 1010 phages/ainmhithe) agus leabharlanna stocphage peiptíde (2 x 1012 phages/ainmhithe) Déantar instealladh ar a laghad 3 CM a thabhairt don ainmhí cannulated ar leithligh tríd an bhféith channalaithe.Taispeántar cógas-chinéitic CSF gach clón phage insteallta agus leabharlann peptide phage le himeacht ama.(d) a thaispeánann an meánchóimheas CSF/fola do gach phage/mL a gnóthaíodh thar an am samplála.(e) Rinneadh ceithre pheiptíd ceannaire sintéiseacha agus rialú scrofa amháin a nascadh le biotin agus streiptaifídín trína N-terminus (taispeáint tetramer) agus ina dhiaidh sin instealladh (vein eireaball iv, 10 mg streiptavidin/kg).Ar a laghad trí francach intubated (N = 3).).Bailíodh samplaí CSF ag na pointí ama sonraithe agus tomhaiseadh tiúchain streipteitín trí CSF frith-streiptaivín ELISA (nd = níor braitheadh).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, bunaithe ar thástáil ANOVA).(f) Comparáid a dhéanamh idir an seicheamh aimínaigéad den chlón peiptíde phage #2002 (corcra) is saibhrithe le clóin pheptíde phage roghnaithe eile ón 4ú babhta roghnaithe.Tá dathchódaithe ar blúirí aimínaigéad atá comhionann agus comhchosúil.
As na phages saibhrithe go léir sa cheathrú babhta (Fíor 3b), roghnaíodh seisear clón iarrthóra le haghaidh tuilleadh anailíse aonair sa tsamhail samplála CSF.Instealladh méideanna comhionanna de shé iarrthóir phage, phage folamh (gan chur isteach) agus leabharlanna peptide prophage i dtrí ainmhí cannulated CM, agus socraíodh cógas-chinéiticí i CSF (Fíor 3c) agus fola (Fíor Forlíontach 7) measúnachtaí.Dhírigh gach clón phage a tástáladh ar an urrann CSF ag leibhéal 10-1000 uair níos airde ná leibhéal an phage rialaithe folamh (#1779).Mar shampla, bhí thart ar 1000 uair níos airde titers CSF ná an phage rialaithe ag Cluain Eois #2020 agus #2077.Tá próifíl chógaschinéiteach gach peptide roghnaithe difriúil, ach tá cumas homing ard CSF acu go léir.Thugamar faoi deara laghdú leanúnach le himeacht ama do Chluain Eois #1903 agus #2011, agus i gcás Chluain Eois #2077, #2002 agus #2009 b'fhéidir go léireodh méadú le linn na chéad 10 nóiméad iompar gníomhach ach ní mór é a fhíorú.Chobhsaigh Cluain Eois #2020, #2002, agus #2077 ag leibhéil arda, agus tháinig laghdú mall ar an tiúchan CSF de chlón #2009 tar éis an mhéadaithe tosaigh.Ansin rinneamar comparáid idir minicíocht choibhneasta gach iarrthóra CSF lena thiúchan fola (Fíor 3d).Thaispeáin comhghaol idir meán-thíter gach iarrthóra CSF lena thiter fola ag gach tráth samplála go raibh trí cinn den seisear iarrthóirí saibhrithe go suntasach i CSF fola.Rud suimiúil, léirigh Clón #2077 cobhsaíocht fola níos airde (Fíor Forlíontach 7).Chun a dhearbhú go bhfuil na peptides féin in ann lasta seachas cáithníní phage a iompar go gníomhach isteach san urrann CSF, rinneamar ceithre pheptídí ceannaire a dhíorthaítear le biotin ag an N-terminus áit a bhfuil na peptides ag gabháil leis an gcáithnín phage a shintéisiú.Rinneadh peptídí biotinylated (uimh. 2002, 2009, 2020 agus 2077) a chomhchuingeach le streptavidin (SA) chun foirmeacha iliméireacha a fháil a bhí ag déanamh aithrise ar chéimseata phage.Cheadaigh an fhormáid seo dúinn freisin nochtadh SA san fhuil agus i sreabhán cerebrospinal a thomhas mar pheptídí próitéine a iompraíonn lasta.Rud atá tábhachtach, d'fhéadfaí sonraí phage a atáirgeadh go minic nuair a riaradh peptídí sintéiseacha sa bhformáid SA-chomhchuingeach seo (Fíor 3e).Bhí níos lú nochtadh tosaigh ag na peptídí scrofa agus imréiteach CSF níos tapúla le leibhéil undetectable laistigh de 48 uair an chloig.Chun léargas a fháil ar na bealaí seachadta de na clóin phage peptide seo isteach sa spás CSF, rinneamar anailís ar logánú na n-amas peptide phage aonair ag baint úsáide as immunohistochemistry (IHC) chun cáithníní phage a bhrath go díreach 1 uair tar éis instealladh infhéitheach in vivo.Go háirithe, d’fhéadfaí clóin #2002, #2077, agus #2009 a bhrath trí smálú láidir i ribeadáin inchinne, agus níor aimsíodh phage rialaithe (#1779) agus clón #2020 (Fíor Forlíontach 8).Tugann sé seo le fios go gcuireann na peptídí seo leis an éifeacht ar an inchinn go beacht trí thrasnú an BBB.Teastaíonn anailís mhionsonraithe bhreise chun an hipitéis seo a thástáil, toisc go bhféadfadh bealach BSCFB a bheith i gceist freisin.Nuair a dhéantar comparáid idir seicheamh aimínaigéad an chlóin is saibhrithe (# 2002) le peptídí roghnaithe eile, tugadh faoi deara go bhfuil síntí aimínaigéad comhchosúla ag cuid acu, rud a d'fhéadfadh meicníocht iompair den chineál céanna a léiriú (Fíor 3f).
Mar gheall ar a phróifíl plasma uathúil agus méadú suntasach ar CSF le himeacht ama, rinneadh tuilleadh iniúchta ar chlón taispeána phage #2077 thar thréimhse 48 uair an chloig níos faide agus bhí sé in ann an méadú tapa ar CSF a breathnaíodh i gcomhar le leibhéil SA marthanacha (Fíor 4a) a atáirgeadh.Maidir le clóin phage eile a aithníodh, bhí dath láidir ar #2077 do ribeadáin inchinne agus léirigh sé comhlonnú suntasach le lectin marcála ribeach nuair a breathnaíodh air ag réiteach níos airde agus b'fhéidir roinnt staining sa spás parenchymal (Fíor 4b).Chun imscrúdú a dhéanamh an bhféadfaí éifeachtaí cógaseolaíochta peptide-idirghabhála a fháil sa CNS, rinneamar turgnamh ina ndearnadh leaganacha biotinylated de i) an peptide idirthurais # 2077 agus ii) an peptide inhibitor BACE1 a mheascadh le SA ag dhá chóimheas éagsúla.I gcás teaglaim amháin níor úsáideamar ach an t-inhibitor peptíde BACE1 agus don cheann eile d'úsáideamar cóimheas 1:3 d'inhibitor peptide BACE1 agus peptide #2077.Riaradh an dá shampla go hinfhéitheach agus rinneadh leibhéil sreabhán fola agus cerebrospinal de pheiptíd béite-amyloid 40 (Abeta40) a thomhas le himeacht ama.Tomhaiseadh Abeta40 i CSF mar go léiríonn sé cosc ​​​​BACE1 i parenchyma na hinchinne.De réir mar a bhíothas ag súil leis, laghdaigh an dá choimpléasc go mór leibhéil fola Abeta40 (Fíor 4c, d).Mar sin féin, níl ach samplaí ina bhfuil meascán de pheptíde uimh.2077 agus coscaire den pheptíd BACE1 comhchuingeach le SA ba chúis le laghdú suntasach ar Abetta40 sa sreabhán cerebrospinal (Fíor 4c).Léiríonn na sonraí go bhfuil peptide uimh.Tá 2077 in ann an próitéin SA 60 kDa a iompar isteach sa CNS agus spreagann sé éifeachtaí cógaseolaíochta freisin le coscairí comhchuingeacha SA den pheptíd BACE1.
(a) Instealladh clónail (2 × 10 phage/ainmhí) ​​de phage T7 a thaispeánann próifílí cógaschinéiteacha fadtéarmacha de pheiptíd CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) agus phage rialaithe neamh-insteallta (#1779) i dtrí francach CM-ionchorraithe ar a laghad.(b) Íomhá mhicreascópach chomhfhócasach de mhicrea-shoithí cortúla ionadaíocha i bhfrancaigh phage-insteallta (2 × 10 10 phage/ainmhí) ​​a thaispeánann frith-staining peiptíde #2077 agus soithí (lectin).Tugadh na clóin phage seo do 3 francach agus ceadaíodh iad a chur i gcúrsaíocht ar feadh 1 uair roimh perfusion.Rinneadh brains a ghearradh agus a dhaite le antasubstaintí polyclonal FITC-lipéadaithe i gcoinne capsid phage T7.Deich nóiméad roimh perfusion agus socrú ina dhiaidh sin, riaradh lectin lipéadaithe DyLight594 go infhéitheach.Íomhánna fluaraiseacha a thaispeánann staining lectin (dearg) ar an taobh lonrúil de mhicreavessels agus phages (glas) i lumen na ribeadáin agus fíocháin inchinne perivascular.Freagraíonn barra an scála do 10 µm.(c, d) Cuireadh peiptíd coisctheach BACE1 bithtinylated ina n-aonar nó i gcomhcheangal le peptide idirthurais biotinylated #2077 le streiptídín agus ina dhiaidh sin instealladh infhéitheach de thrí francach CM cannlaithe ar a laghad (10 mg streiptídín/kg).Rinneadh laghdú BACE1 peptide-mediated inhibitor in Aβ40 a thomhas ag Aβ1-40 ELISA i fola (dearg) agus sreabhach cerebrospinal (oráiste) ag na pointí ama a luaitear.Ar mhaithe le soiléireacht níos fearr, tarraingítear líne poncaithe ar an ngraf ar scála 100%.(c) Laghdú céatadánach ar Aβ40 san fhuil (triantáin dhearga) agus i sreabhán cerebrospinal (triantáin oráiste) i bhfrancaigh atá cóireáilte le streptavidin comhchuingeach chun peiptíd idirthurais #2077 agus peiptíd coisctheach BACE1 i gcóimheas 3:1.(d) Laghdú céatadánach ar fhuil Aβ40 (ciorcail dhearga) agus sreabhán cerebrospinal (ciorcail oráiste) i bhfrancaigh ar cuireadh cóireáil orthu le streptavidin i dteannta le peiptíd coisctheach BACE1 amháin.Ba é an tiúchan Aβ sa rialú ná 420 pg/ml (diall caighdeánach = 101 pg/ml).
Tá taispeáint Phage curtha i bhfeidhm go rathúil i go leor réimsí den taighde bithleighis17.Baineadh úsáid as an modh seo le haghaidh staidéir ar éagsúlacht soithíoch in vivo18,19 chomh maith le staidéir a dhíríonn ar shoithí cheirbreacha20,21,22,23,24,25,26.Sa staidéar seo, leathnaíomar cur i bhfeidhm an mhodha roghnúcháin seo ní hamháin maidir le haithint dhíreach na peptides atá dírithe ar shoithí cheirbreacha, ach freisin le hiarrthóirí a bhfuil airíonna iompair gníomhacha acu a aimsiú chun an bacainn fola-inchinn a thrasnú.Déanaimid cur síos anois ar nós imeachta roghnúcháin in vivo a fhorbairt i bhfrancaigh a bhfuil ionchorprú CM orthu agus léirímid an cumas atá aige peptides a bhfuil airíonna homing CSF acu a shainaithint.Ag baint úsáide as an phage T7 a thaispeánann leabharlann de pheptídí randamacha 12-mear, bhíomar in ann a léiriú go bhfuil an phage T7 beag go leor (thart ar 60 nm ar trastomhas)10 chun a oiriúnú don bhacainn fola-inchinn, agus ar an mbealach sin ag trasnú an bhacainn fola-inchinn nó plexus coroid go díreach.Thugamar faoi deara gur modh scagthástála feidhmiúil in vivo dea-rialaithe a bhí sa bhaint CSF ó fhrancaigh CM cannlaithe, agus go raibh an phage asbhainte ní hamháin ceangailte leis an soithíoch ach freisin go raibh sé ag feidhmiú mar iompróir trasna na bacainn fola-inchinn.Ina theannta sin, trí fhuil a bhailiú ag an am céanna agus HTS a chur i bhfeidhm ar CSF ​​agus ar phages fola-díorthaithe, dheimhnigh muid nach raibh tionchar ag saibhriú fola nó ag folláine le haghaidh leathnú idir na babhtaí roghnaithe ar ár rogha CSF.Mar sin féin, tá an urrann fola mar chuid den nós imeachta roghnúcháin, ós rud é go gcaithfidh phages atá in ann an urrann CSF a bhaint amach maireachtáil agus dul i gcúrsaíocht sa sruth fola fada go leor chun iad féin a shaibhriú san inchinn.D'fhonn faisnéis seicheamh iontaofa a bhaint as sonraí amh HTS, chuireamar scagairí i bhfeidhm a bhí oiriúnaithe d'earráidí seicheamhaithe a bhain go sonrach le hardáin sa sreabhadh oibre anailíse.Trí pharaiméadair cinéiteach a ionchorprú sa mhodh scagtha, dheimhnigh muid cógas-chinéitic tapa phages T7 fiáin (t½ ~ 28 min) i fola24, 27, 28 agus chinneamar freisin a leathré i sreabhán cerebrospinal (t½ ~ 26 min) in aghaidh an nóiméid).In ainneoin próifílí cógaschinéiteacha comhchosúla san fhuil agus CSF, níorbh fhéidir ach 0.001% den tiúchan fola de phage a bhrath i CSF, rud a léiríonn soghluaisteacht chúlra íseal de chineál fiáin T7 phage ar fud an bhacainn fola-inchinn.Leagann an obair seo béim ar a thábhachtaí atá an chéad bhabhta roghnóireachta agus straitéisí in vivo panning in úsáid, go háirithe do chórais phage a ghlantar go tapa ón gcúrsaíocht, toisc nach bhfuil mórán clón in ann an urrann CNS a bhaint amach.Mar sin, sa chéad bhabhta, bhí an laghdú ar éagsúlacht na leabharlainne an-mhór, mar níor bailíodh ach líon teoranta clón sa deireadh sa tsamhail CSF seo an-dian.Áiríodh leis an straitéis panning in vivo seo roinnt céimeanna roghnúcháin ar nós carnadh gníomhach san urrann CSF, maireachtáil chlónála san urrann fola, agus baint tapa chlóin phage T7 ón fhuil laistigh den chéad 10 nóiméad (Fíor 1d agus Fíor Forlíontach 4M).).Mar sin, tar éis an chéad bhabhta, aithníodh clóin phage éagsúla i CSF, cé gur úsáideadh an linn tosaigh céanna le haghaidh ainmhithe aonair.Tugann sé seo le tuiscint go mbíonn laghdú suntasach ar an éagsúlacht mar thoradh ar ilchéimeanna dochta roghnaithe do leabharlanna foinse ina bhfuil líon mór de bhaill leabharlainne.Mar sin, beidh imeachtaí randamacha mar chuid lárnach den phróiseas roghnúcháin tosaigh, agus beidh tionchar mór acu ar an toradh.Is dócha go raibh claonadh saibhrithe CSF an-chosúil ag go leor de na clóin sa bhunleabharlann.Mar sin féin, fiú faoi na coinníollacha turgnamhacha céanna, féadfaidh torthaí roghnúcháin a bheith difriúil mar gheall ar an líon beag de gach clón ar leith sa chomhthiomsú tosaigh.
Tá na móitífeanna saibhrithe i CSF difriúil leo siúd san fhuil.Suimiúil go leor, thugamar faoi deara an chéad athrú i dtreo peptídí ar mhórán glicín san fhuil ainmhithe aonair.(Fíor 1g, Fíoracha Forlíontacha 4e, 4f).D'fhéadfadh Phage ina bhfuil peptídí glicín a bheith níos cobhsaí agus is lú an seans go dtógfar as cúrsaíocht iad.Mar sin féin, níor aimsíodh na peptídí saibhir glicín seo sna samplaí sreabhán cerebrospinal, rud a thugann le tuiscint go ndeachaigh na leabharlanna coimeádaithe trí dhá chéim roghnúcháin éagsúla: ceann amháin san fhuil agus ceann eile a cheadaítear a charnadh sa sreabhach cerebrospinal.Rinneadh tástáil fhairsing ar chlóin saibhrithe CSF mar thoradh ar an gceathrú babhta roghnaithe.Deimhníodh nach mór gach ceann de na clóin a tástáladh ina n-aonar a bheith saibhrithe i CSF i gcomparáid le phage rialaithe bán.Scrúdaíodh buille peiptíde amháin (#2077) go mion.Léirigh sé leathré plasma níos faide i gcomparáid le amas eile (Fíor 3d agus Figiúr Forlíontach 7), agus go suimiúil, bhí iarmhar cistéin sa pheptíd seo ag an gcríochfort C.Léiríodh le déanaí gur féidir feabhas a chur ar a n-airíonna cógaschinéiteacha trí chistéin a chur le peiptídí trí cheangal a dhéanamh ar albaimin 29 .Níl sé seo ar eolas faoi láthair maidir le peptide #2077 agus tá gá le tuilleadh staidéir.Léirigh roinnt peptides spleáchas valence i saibhriú CSF (sonraí nach bhfuil léirithe), a d'fhéadfadh a bheith bainteach le céimseata dromchla taispeáint an capsid T7.Léirigh an córas T7 a d'úsáid muid 5-15 cóip de gach cáithnín peptide in aghaidh an phage.Rinneadh IHC ar chlóin phage luaidhe iarrthóra a instealladh infhéitheach isteach sa cortex cerebral na bhfrancach (Fíor Forlíontach 8).Léirigh na sonraí go ndearna ar a laghad trí chlón (Uimh. 2002, Uimh. 2009 agus Uimh. 2077) idirghníomhú leis an BBB.Tá sé fós le cinneadh cé acu an bhfuil mar thoradh ar an idirghníomhú BBB seo carnadh CSF nó gluaiseacht na gclón seo go díreach chuig an BCSFB.Rud atá tábhachtach, léirímid go gcoimeádann na peptídí roghnaithe a gcumas iompair CSF nuair a dhéantar iad a shintéisiú agus a cheangal leis an lasta próitéine.Go bunúsach is éard atá i gceangal peptides biotinylated N-críochfort le SA ná na torthaí a fhaightear lena gcuid clón phage faoi seach san fhuil agus i sreabhán cerebrospinal (Fíor 3e).Mar fhocal scoir, léirímid go bhfuil peptide luaidhe #2077 in ann gníomh inchinne coscaire peptide biotinylated de BACE1 comhchuingeach le SA a chur chun cinn, rud a fhágann go bhfuil éifeachtaí cógasdinimiciúla soiléire sa CNS trí leibhéil Abeta40 a laghdú go suntasach i CSF (Fíor 4).Níorbh fhéidir linn aon homalóg a aithint sa bhunachar sonraí trí chuardach homaleolaíochta seicheamh peptíde a dhéanamh ar gach amas.Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara go bhfuil thart ar 109 ar mhéid na leabharlainne T7, agus is é 4 x 1015 méid na leabharlainne teoiriciúil le haghaidh 12-mers. Dá bhrí sin, níor roghnaigh muid ach codán beag de spás éagsúlachta na leabharlainne peptide 12-mer, rud a d'fhéadfadh a chiallaíonn gur féidir peptides níos optamaithe a aithint trí mheastóireacht a dhéanamh ar spás seicheamh cóngarach na n-amas aitheanta seo.Go hipitéiseach, ceann de na fáthanna nach bhfuaireamar aon homalóg nádúrtha de na peiptídí seo is féidir é a dhíroghnú le linn na héabhlóide chun cosc ​​a chur ar iontráil neamhrialaithe móitífeanna peptide áirithe san inchinn.
Le chéile, cuireann ár dtorthaí bonn ar fáil d’obair amach anseo chun córais iompair an bhacainn cheirbr-shoithíoch in vivo a shainaithint agus a thréithriú níos mine.Tá bunú bunúsach an mhodha seo bunaithe ar straitéis roghnúcháin feidhme a shainaithníonn ní amháin clóin a bhfuil airíonna ceangailteacha soithíoch cheirbreacha iontu, ach folaíonn sé freisin céim ríthábhachtach ina bhfuil gníomhaíocht intreach ag clóin rathúla chun bacainní bitheolaíocha in vivo a thrasnú isteach san urrann CNS.is é sin meicníocht iompair na peptides seo a shoiléiriú agus a rogha maidir le ceangal leis an micrea-soithíoch a bhaineann go sonrach le réigiún na hinchinne.D’fhéadfadh go n-aimseofar conairí nua chun an BBB agus na gabhdóirí a iompar dá bharr.Táimid ag súil go bhféadfaidh na peiptídí aitheanta ceangal díreach a dhéanamh le gabhdóirí cerebrovascular nó le ligands i gcúrsaíocht a iompraítear tríd an BBB nó an BCSFB.Déanfar tuilleadh imscrúduithe ar na veicteoirí peiptíde le gníomhaíocht iompair CSF a aimsíodh san obair seo.Táimid ag fiosrú faoi láthair sainiúlacht inchinn na peptides seo le haghaidh a gcumas trasnú an BBB agus/nó BSFB.Beidh na peiptídí nua seo ina n-uirlisí an-luachmhar chun gabhdóirí nó cosáin nua a aimsiú agus chun ardáin nua an-éifeachtacha a fhorbairt chun macramóilíní, mar bhitheolaíoch, a sheachadadh chuig an inchinn.
Cannaigh an sistéal mór (CM) ag baint úsáide as modhnú ar an modh a thuairiscítear roimhe seo.Feistíodh francaigh Wistar ainéistéiseach (200-350 g) ar ghaireas steiréatacsach agus rinneadh incision airmheánach ar an scalp bearrtha agus ullmhaithe go aiseipteach chun an cloigeann a nochtadh.Druileáil dhá pholl i limistéar an tsáil uachtair agus ceangail na scriúnna socraithe sna poill.Druileáladh poll breise sa suaitheantas cliathánach occipital chun cannula cruach dhosmálta a threorú isteach sa CM stereotactic.Cuir stroighin fiaclóireachta timpeall an channa agus slán le scriúnna.Tar éis grianghraf-leigheas agus cruaite stroighne, dúnadh an fhoirceannadh craiceann le uaim 4/0 supramid.Deimhnítear socrúchán ceart na cannula le sceitheadh ​​spontáineach sreabhach cerebrospinal (CSF).Bain an francach as an gaireas steiréatacsach, faigh cúram iar-obráide cuí agus bainistíocht pian, agus lig dó téarnamh ar feadh seachtaine amháin ar a laghad go dtí go bhfeicfear comharthaí fola sa sreabhán cerebrospinal.Fuarthas francaigh Wistar (Crl:WI/Han) ó Charles River (An Fhrainc).Coinníodh gach francach faoi choinníollacha sonracha saor ó phataigin.D'fhaomh Oifig Tréidliachta Chathair Basel, an Eilvéis gach turgnaimh ainmhithe agus rinneadh iad de réir Cheadúnas Ainmhithe Uimh. 2474 (Measúnú ar Iompar Gníomhach Inchinn trí Leibhéil na nIarrthóirí Teiripeacha sa Sreabhán Ceirbreach agus Brain Rat a Thomhas).
Coinnigh an francach go réidh ar an eolas agus an cannula CM ina láimh.Bain Datura as an channa agus bailigh 10 µl de shreabhán cerebrospinal a shreabhann go spontáineach.Ós rud é go raibh foighne na canála i mbaol sa deireadh, níor cuireadh san áireamh sa staidéar seo ach samplaí soiléire de shreabhán cerebrospinal gan aon fhianaise ar éilliú fola ná ar mhídhath.Ag an am céanna, tógadh thart ar 10-20 μl fola ó incision beag ag barr an eireaball isteach feadáin le heparin (Sigma-Aldrich).Bailíodh CSF agus fuil ag pointí ama éagsúla tar éis instealladh infhéitheach de T7 phage.Caitheadh ​​thart ar 5-10 μl de sreabhán sular bailíodh gach sampla CSF, rud a fhreagraíonn do thoirt marbh an chaititéar.
Gineadh leabharlanna ag baint úsáide as an veicteoir T7Select 10-3b mar a thuairiscítear i lámhleabhar córais T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Go hachomair, rinneadh ionsán DNA randamach 12-méadair a shintéisiú san fhormáid seo a leanas:
Baineadh úsáid as an gcódón NNK chun codóin stad dúbailte agus ró-bhrú aimínaigéad a sheachaint sa chur isteach.Is cóimheas comhchothrom de láimh measctha é N de gach núicléitíd, agus is cóimheas cothromúil de láimh measctha é K de núicléatídí adenín agus cítoisín.Tiontaíodh réigiúin shnáithe shingil go DNA snáithe dúbailte trí gor breise le dNTP (Novagen) agus einsím Klenow (New England Biolabs) i maolán Klenow (New England Biolabs) ar feadh 3 huaire ag 37°C.Tar éis an imoibrithe, fuarthas DNA dúbailte-snáithe le deascadh EtOH.Díleádh an DNA mar thoradh air le heinsímí srianta EcoRI agus HindIII (an dá cheann ó Roche).Ansin ligeadh isteach an t-ionsán scoilte agus íonaithe (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) i bhfráma isteach i veicteoir T7 réamh-scoilte tar éis aimínaigéad 348 den ghéine capsid 10B.Goradh imoibrithe ligála ag 16° C. ar feadh 18 n-uaire roimh phacáistiú in vitro.Rinneadh pacáistiú Phage in vitro de réir na dtreoracha a soláthraíodh leis an bhfearas clónála T7Select 10-3b (Novagen) agus méadaíodh an réiteach pacáistithe uair amháin go lysis ag baint úsáide as Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Rinneadh na lysates a lártheifneoiriú, a thoirtmheascadh agus a reoite ag -80 ° C. mar thuaslagadh stoic de ghliocról.
Aimpliú díreach PCR ar réigiúin inathraithe phage méadaithe i brat nó pláta ag baint úsáide as priméirí comhleá 454/Roche-amplicon dílseánaigh.Tá seichimh sa primer comhleá ar aghaidh taobh leis an réigiún athróg (NNK) 12 (teimpléad-shonrach), GS FLX Tíotáiniam Adapter A, agus seicheamh eochair leabharlainne ceithre bhonn (TCAG) (Fíor Forlíontach 1a):
Sa primer comhleá droim ar ais tá biotin atá ceangailte le coirníní gabhála agus an GS FLX Titanium Adapter B a theastaíonn le haghaidh aimpliú clónála le linn PCR eibleachta:
Ansin cuireadh na hamplicons faoi phirealú 454/Roche de réir phrótacal Tíotáiniam 454 GS-FLX.Le haghaidh seicheamhú láimhe Sanger (Anailíseoir DNA Bithchórais Fheidhmeach Hitachi 3730 xl), méadaíodh T7 phage DNA le PCR agus seicheamhaíodh é leis na péirí primer seo a leanas:
Cuireadh ionsáigh ó phlaiceanna aonair faoi réir aimplithe PCR trí úsáid a bhaint as Kit Polymerase DNA Fast Start Roche (de réir threoracha an déantóra).Déan tús te (10 nóiméad ag 95 °C) agus 35 timthriall treisithe (50 s ag 95 °C, 1 nóiméad ag 50 °C, agus 1 nóiméad ag 72 °C).
Mhéadaigh Phage ó leabharlanna, phage de chineál fiáin, phage a tarrtháil ó CSF agus fuil, nó clóin aonair in Escherichia coli BL5615 i brat TB (Sigma Aldrich) nó i miasa 500 cm2 (Thermo Scientific) ar feadh 4 h ag 37 ° C.Baineadh Phage as na plátaí trí na plátaí a sruthlú le maolán Tris-EDTA (Fluka Analytical) nó trí na plaiceanna a bhailiú le leideanna pípéad steiriúla.Rinneadh Phage a leithlisiú ó shárchultúr cultúir nó maolán eastósctha le babhta amháin deascadh glycol poileitiléin (PEG 8000) (Promega) agus cuireadh ar fionraí arís é i maolán Tris-EDTA.
Cuireadh an phage aimplithe faoi réir 2-3 bhabhta de bhaint endotoxin ag baint úsáide as coirníní a bhaint endotoxin (Miltenyi Biotec) roimh instealladh infhéitheach (IV) (500 μl/ainmhí).Sa chéad bhabhta, tugadh isteach phages 2 × 1012;sa dara, 2 × 1010 phages;sa tríú agus sa cheathrú babhta roghnúcháin, 2 × 109 phages in aghaidh an ainmhí.Socraíodh ábhar phage i CSF agus samplaí fola a bailíodh ag na pointí ama sonraithe trí chomhaireamh plaic de réir threoracha an mhonaróra (lámhleabhar córais T7Select).Rinneadh roghnú Phage trí instealladh infhéitheach de leabharlanna íonaithe isteach sa vein eireaball nó trí ath-instealladh phage a bhaintear as CSF ón mbabhta roghnaithe roimhe seo, agus rinneadh fómhar ina dhiaidh sin ag 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, agus 240 min faoi seach CSF agus samplaí fola.Reáchtáladh ceithre bhabhta de phlandáil in vivo ina ndearnadh an dá bhrainse roghnaithe a stóráil agus a anailísiú ar leithligh le linn na chéad trí bhabhta roghnaithe.Cuireadh gach ionsáigh phage a bhaintear as CSF ón gcéad dá bhabhta roghnaithe faoi phiroseicheamhú 454/Roche, agus rinneadh seicheamhú de láimh ar gach clón a baineadh as CSF ón dá bhabhta roghnúcháin dheireanacha.Cuireadh gach céim fola ón gcéad bhabhta roghnaithe faoi phiroseicheamhú 454/Roche freisin.Le haghaidh instealladh clóin phage, aimplíodh phages roghnaithe in E. coli (BL5615) ar phlátaí 500 cm2 ag 37°C ar feadh 4 huaire.Iomadaíodh clóin a roghnaíodh ina n-aonar agus a seicheamh de láimh i meán TB.Tar éis eastóscadh phage, íonú agus baint endotoxin (mar a thuairiscítear thuas), 2 × 1010 phages / ainmhí i 300 μl instealladh infhéitheach isteach i vein eireaball amháin.
Réamhphróiseáil agus scagadh cáilíochtúil sonraí seichimh.Tiontaíodh sonraí amh 454/Roche ó fhormáid dhénártha sruthléarscáil caighdeánach (sff) go formáid inléite daonna Pearson (fasta) ag baint úsáide as bogearraí an díoltóra.Rinneadh tuilleadh próiseála ar an seicheamh núicléitíde ag baint úsáide as cláir C agus scripteanna dílseánaigh (pacáiste bogearraí neamheisithe) mar a thuairiscítear thíos.Áirítear leis an anailís ar shonraí príomhúla nósanna imeachta dochta scagtha ilchéime.Chun léamha a scagadh amach nach raibh seicheamh DNA curtha isteach bailí 12 mer iontu, rinneadh na léite a ailíniú go seicheamhach leis an lipéad tosaigh (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), lipéad stoptha (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) agus cuir isteach cúlra (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ag baint úsáide as an tástáil dhomhanda Needleman-Wunsch.ailíniú a cheadaíonn suas le 2 neamhréireachtaí in aghaidh an ailínithe31.Dá bhrí sin, léadh gan clibeanna tosaithe agus stoptha agus léite ina raibh ionsáigh chúlra, .i. ailínithe a sháraíonn an líon ceadaithe neamhréireanna, baineadh den leabharlann.Maidir leis na léamha a bhí fágtha, rinneadh an seicheamh N-mer DNA a shíneadh ón marc tosaigh agus a chríochnaigh sular baineadh amach an stopmharc ón seicheamh léite bunaidh agus rinneadh é a phróiseáil tuilleadh (dá ngairtear “cuir isteach” anseo feasta).Tar éis an t-ionchur a aistriú, baintear an chuid tar éis an chódú den chéad stad ag deireadh 5′ an phriméara den chur isteach.Ina theannta sin, baineadh freisin núicléatídí as a dtagann codóin neamhiomlána ag deireadh 3′ an phriméir.Chun iatáin nach raibh iontu ach seichimh chúlra a eisiamh, baineadh iatáin aistrithe ag tosú leis an bpatrún aimínaigéad “PAG” freisin.Baineadh peptides le fad iar-aistrithe níos lú ná 3 aimínaigéid ón leabharlann.Ar deireadh, bain an iomarcaíocht sa chomhthiomsú isteach agus cinntigh minicíocht gach cuir isteach uathúil.Áiríodh i dtorthaí na hanailíse seo liosta de sheichimh núicléitíde (cuir isteach) agus a gcuid minicíochtaí (léite) (Fíoracha Forlíontacha 1c agus 2).
Ionsátaí DNA grúpa N-mer de réir cosúlachta seichimh: Chun deireadh a chur le hearráidí seicheamhaithe a bhaineann go sonrach le 454/Roche (cosúil le fadhbanna le síntí homapolaiméire a sheicheamhú) agus iomarcaíochtaí nach bhfuil chomh tábhachtach céanna a bhaint, déantar ionsáigh sheicheamh DNA N-mer (cuir isteach) a scagadh roimhe seo a shórtáil de réir cosúlachta.cuir isteach (suas go dtí 2 bhonn neamh-mheaitseála ceadaithe) ag baint úsáide as algartam atriallach a shainmhínítear mar seo a leanas: déantar ionsá a shórtáil ar dtús de réir a minicíochta (is airde go dtí an ceann is ísle), agus más mar a chéile iad, de réir a sórtáil tánaisteach de réir faid (is faide go dtí an ceann is giorra).Mar sin, sainíonn na hionsuithe is minice agus is faide an chéad “grúpa”.Socraítear minicíocht an ghrúpa go dtí an minicíocht eochair.Ansin, rinneadh iarracht gach ionsá a bhí fágtha sa liosta sórtáilte a chur leis an ngrúpa trí ailíniú pairwise Needleman-Wunsch.Mura dtéann líon na n-athreachtuithe, na n-ionsáite nó na scriosta in ailíniú thar thairseach 2, cuirtear ionsá leis an ngrúpa, agus méadaítear minicíocht an ghrúpa iomlán de réir cé chomh minic a cuireadh an t-ionchur isteach.Marcáiltear ionchuir a chuirtear le grúpa mar úsáidte agus fágtar iad as an áireamh ó thuilleadh próiseála.Mura féidir an seicheamh ionsáite a chur le grúpa atá ann cheana féin, úsáidtear an seicheamh ionsáite chun grúpa nua a chruthú leis an minicíocht ionsáite chuí agus marcáilte mar a úsáidtear é.Críochnaíonn an t-atriall nuair a úsáidtear gach seicheamh ionsáite chun grúpa nua a dhéanamh nó nuair is féidir é a áireamh i ngrúpa atá ann cheana féin.Tar éis an tsaoil, aistrítear iatáin ghrúpáilte comhdhéanta de núicléatídí go seichimh peptide (leabharlanna peptide).Is é toradh na hanailíse seo ná sraith ionsáite agus a gcuid minicíochtaí comhfhreagracha a dhéanann suas líon na léitheanna comhleanúnacha (Fíor Forlíontach 2).
Giniúint Móitíf: Bunaithe ar liosta de pheptídí uathúla, cruthaíodh leabharlann ina raibh gach patrún aimínaigéad féideartha (aa) mar a thaispeántar thíos.Baineadh gach patrún féideartha d'fhad 3 as an peptide agus cuireadh a patrún inbhéartach leis mar aon le leabharlann móitífeanna coitianta ina raibh gach patrún (trípeiptíd).Cuireadh leabharlanna de mhóitífeanna an-athchleachtach in ord agus baineadh an iomarcaíocht.Ansin, do gach trípeiptíde sa leabharlann móitífeanna, rinneamar seiceáil le haghaidh a láithreacht sa leabharlann ag baint úsáide as uirlisí ríomhaireachtúla.Sa chás seo, cuirtear le minicíocht an peiptíde ina bhfuil an móitíf trípeiptíde aimsithe agus sanntar é don mhóitíf sa leabharlann móitíf (“líon móitífeanna”).Is é an toradh a bhíonn ar ghiniúint móitíf ná eagar déthoiseach ina bhfuil gach teagmhas de thrípeiptíde (móitífeanna) agus a luachanna faoi seach, is iad sin líon na léamha seicheamhaithe a mbíonn an móitíf chomhfhreagrach mar thoradh orthu nuair a dhéantar na léitheanna a scagadh, a ghrúpáil agus a aistriú.Méadracht mar a thuairiscítear go mion thuas.
Normalú ar líon na móitífeanna agus na scathphléacs comhfhreagrach: Rinneadh líon na móitífeanna do gach sampla a normalú trí úsáid a bhaint as
áit a bhfuil ni an líon léamha ina bhfuil topaic i.Mar sin, seasann vi don chéatadán minicíocht léite (nó peiptídí) ina bhfuil móitíf i sa sampla.Ríomhadh P-luachanna don líon neamh-normalaithe móitífeanna ag baint úsáide as tástáil bheacht Fisher.Maidir le correlograms de líon na n-motives, ríomhadh comhghaolta Spearman ag baint úsáide as an líon normalaithe motives le R.
Chun ábhar na n-aimínaigéad a shamhlú ag gach suíomh sa leabharlann peptide, cruthaíodh logogramanna gréasáin 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Ar dtús, stóráiltear ábhar na n-aimínaigéad ag gach suíomh den pheptíd 12-mer i maitrís 20×12.Ansin, gintear sraith de 1000 peptides ina bhfuil an t-ábhar aimínaigéad coibhneasta céanna ag gach suíomh i bhformáid fasta-seicheamh agus a sholáthraítear mar ionchur do lógó gréasáin 3, rud a ghineann léiriú grafach ar an ábhar aimínaigéad coibhneasta ag gach suíomh.le haghaidh leabharlann peptide ar leith.Chun tacair shonraí iltoiseacha a léirshamhlú, cruthaíodh léarscáileanna teasa ag baint úsáide as uirlis a forbraíodh go hinmheánach in R (biosHeatmap, pacáiste R atá fós le scaoileadh).Ríomhadh na dendrograms a cuireadh i láthair sna léarscáileanna teasa ag baint úsáide as modh cnuasaithe ordlathach Ward leis an méadracht faid Eoiclídeach.Le haghaidh anailís staitistiúil ar shonraí scórála móitíf, ríomhadh luachanna P le haghaidh scórála neamhnormalaithe ag baint úsáide as tástáil bheacht Fisher.Ríomhadh P-luachanna do thacair sonraí eile in R ag baint úsáide as t-thástáil an Mhic Léinn nó ANOVA.
Instealladh infhéitheach tríd an vein eireaball (2 × 1010 phages / ainmhí i 300 μl PBS) chlóin phage roghnaithe agus phages gan iatáin.Deich nóiméad roimh perfusion agus socrú ina dhiaidh sin, rinneadh instealladh infhéitheach do na hainmhithe céanna le 100 μl de lectin lipéadaithe DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 nóiméad tar éis instealladh phage, perfused francaigh tríd an croí le 50 ml PBS agus ina dhiaidh 50 ml 4% PFA/PBS.Socraíodh samplaí inchinne freisin thar oíche i 4% PFA/PBS agus socraíodh iad i 30% de shiúcrós thar oíche ag 4°C.Déantar samplaí a splanc-reoite sa mheascán OCT.Rinneadh anailís imdhíon-cheimiceach ar shamplaí reoite ag teocht an tseomra ar chrió-ghearrthóga 30 µm blocáilte le 1% BSA agus gortha iad le antasubstaintí polyclónach lipéadaithe FITC i gcoinne phage T7 (Novus NB 600-376A) ag 4 °C.Goir thar oíche.Ar deireadh, nitear na hailt 3 huaire le PBS agus scrúdaíodh iad le micreascóp léasair confocal (Leica TCS SP5).
Rinne GenScript USA na peptides go léir a bhfuil íonacht íosta 98% acu a shintéisiú, biotinylated agus lyophilized.Tá biotin faoi cheangal trí spásálaí breise trí-ghlicín ag an gcríochfort N.Seiceáil gach peptides ag baint úsáide as mais-speictriméadracht.
Measctha Streptavidin (Sigma S0677) le farasbarr 5-huaire comhionann de pheptíde biotinylated, peptide coisctheach biotinylated BACE1, nó teaglaim (cóimheas 3: 1) de peiptíd coisctheach biotinylated BACE1 agus BACE1 peiptíd coisctheach i 5-10% DMSO / gortha i PSO.1 uair an chloig ag teocht an tseomra roimh instealladh.Instealladh peiptídí comhchuingeacha streptavidin go hinfhéitheach ag dáileog de 10 mg/kg isteach i gceann de veins eireaball na bhfrancach le cuas cheirbreach.
Rinne ELISA measúnú ar thiúchan na gcoimpléisc streptavidin-peptide.Brataíodh plátaí microtiter Nunc Maxisorp (Sigma) thar oíche ag 4°C le antasubstaint frith-streiptavidin luch 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011).Tar éis blocáil (maolán blocála: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% geilitín, 1% BSA) ag teocht an tseomra ar feadh 2 uair an chloig, nigh an pláta le 0.05% Tween-20/PBS (maolán níocháin) ar feadh 3 soicind, cuireadh samplaí toplasma idirdhealaithe CSF agus 0000 (tobar idirdhealaithe toplasma 1) leis , CSF 1:115).Goradh an pláta ansin thar oíche ag 4°C le hantasubstaint braite (1 μg/ml, frith-streiptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Tar éis trí chéim níocháin, braitheadh ​​​​streptavidin trí gor i dtuaslagán tsubstráit TMB (Roche) ar feadh suas le 20 nóiméad.Tar éis stop a chur le forbairt dath le 1M H2SO4, tomhas an t-ionsúcht ag 450 nm.
Rinne Aβ(1-40) ELISA measúnú ar fheidhm an choimpléasc coscaire streptavidin-peptide-BACE1 de réir phrótacal an mhonaróra (Wako, 294-64701).Go hachomair, caolaíodh samplaí CSF i gcaolaitheoir caighdeánach (1:23) agus goraíodh iad thar oíche ag 4°C i plátaí 96-tobar a bhí brataithe le BNT77 antashubstainte gabhála.Tar éis cúig chéim níocháin, cuireadh antashubstaint BA27 comhchuingeach HRP leis agus gor é ar feadh 2 uair ag 4 ° C., agus cúig chéim níocháin ina dhiaidh sin.Braitheadh ​​Aβ(1–40) trí gor i dtuaslagán TMB ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra.Tar éis stop a chur le forbairt dath le réiteach stad, déan an t-ionsúcht a thomhas ag 450 nm.Rinneadh samplaí plasma a eastóscadh pas soladach roimh Aβ(1–40) ELISA.Cuireadh plasma le 0.2% DEA (Sigma) i plátaí 96-tobar agus gor ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad.Tar éis na plátaí SPE (Oasis, 186000679) a ní i ndiaidh a chéile le huisce agus 100% meatánól, cuireadh samplaí plasma leis na plátaí SPE agus baineadh an leacht ar fad.Níodh samplaí (ar dtús le meatánól 5% ansin 30% meatánól) agus eluted le meatánól 2% NH4OH/90%.Tar éis an eluate a thriomú ag 55°C ar feadh 99 nóiméad ag sruth tairiseach N2, laghdaíodh na samplaí i gcaolaitheoirí caighdeánacha agus tomhaiseadh Aβ(1–40) mar a thuairiscítear thuas.
Conas an t-alt seo a lua: Urich, E. et al.Seachadadh lasta chuig an inchinn ag baint úsáide as peptídí idirthurais a aithníodh in vivo.an eolaíocht.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB agus Moos T. Seachadadh drugaí macramóilíní chuig an inchinn ag baint úsáide as teiripe spriocdhírithe.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., agus Martinez-Martinez, P. Seachadadh drugaí peptide agus próitéin ar fud an bhacainn fola-inchinn.Clár Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM An bac fola-inchinn: bac ar fhorbairt drugaí inchinne.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, agus Byrd, A. Ionchais do sheachadadh feabhsaithe drugaí agus díriú ar an inchinn tríd an gconair choroid plexus-CSF.Taighde Cógaisíochta 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Nuachóiriú bithchógaisíochta le capaill mhóilíneacha Trojanacha le haghaidh seachadadh inchinne.Ceimic Bithconjug 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM iompar peptide receptor-idirghabhála ar fud an bac fola-inchinn.Endocr Ath. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Méadú ar threá inchinn agus éifeachtúlacht antasubstaintí teiripeacha ag baint úsáide as eiteáin mhóilíneacha monovalent.Néaróin 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Cinneann iompar receptor Transferrin (TfR) glacadh na hinchinne ar leagan cleamhnais d'antasubstaintí TfR.J Cait Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).