Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá leagan brabhsálaí in úsáid agat le tacaíocht theoranta CSS. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer). Ina theannta sin, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánaimid an suíomh gan stíleanna ná JavaScript.
Taispeánann sé carúsal de thrí shleamhnán ag an am céanna. Úsáid na cnaipí Roimhe Seo agus Ar Aghaidh chun bogadh trí thrí shleamhnán ag an am céanna, nó úsáid na cnaipí sleamhnáin ag an deireadh chun bogadh trí thrí shleamhnán ag an am céanna.
Is ardán gealladh fúthu in vitro iad orgánaidí néaracha féin-chomhthionóil chun forbairt agus galair an duine a shamhaltú. Mar sin féin, níl an nascacht atá ann in vivo ag orgánaidí, rud a chuireann teorainn leis an aibiú agus a chuireann cosc ​​ar chomhtháthú le ciorcaid eile a rialaíonn iompar. Anseo, taispeánaimid go bhforbraíonn orgánaidí cortex díorthaithe ó chealla gas daonna a thrasphlandaítear isteach sa cortex somatosensory de francaigh nochta néonatal cineálacha cealla aibí a chomhtháthaíonn i gciorcaid céadfacha agus spreagtha. Léirigh MRI fás orgánaidí iar-thrasphlandúcháin i roinnt línte gaschealla agus ainmhithe, agus léirigh anailís aon-chroí dul chun cinn corticogenesis agus teacht chun cinn clár trascríobh atá ag brath ar ghníomhaíocht. Go deimhin, taispeánann néaróin cortexacha trasphlandaithe airíonna moirfeolaíocha, sineipseacha agus membrane inmheánacha níos casta ná a gcomhghleacaithe in vitro, rud a ligeann do lochtanna néarónacha a bhrath in othair a bhfuil siondróm Timothy orthu. Léirigh rianú anatamaíoch agus feidhmiúil go bhfaigheann orgánaidí trasphlandaithe ionchuir thalamocortical agus corticocortical, agus tugann taifeadtaí in vivo de ghníomhaíocht néaróg le fios gur féidir leis na hionchuir seo freagairtí céadfacha a ghiniúint i gcealla daonna. Ar deireadh, leathnaíonn orgánaidí cortexacha aicsóin ar fud inchinn an fhrancaigh, agus bíonn iompar atá ag lorg luach saothair mar thoradh ar a ngníomhachtú optogenetic. Dá bhrí sin, aibíonn néaróin cortex daonna trasphlandaithe agus glacann siad páirt i gciorcaid an óstaigh a rialaíonn iompar. Táimid ag súil go n-éascóidh an cur chuige seo braiteadh feinitíopaí ar leibhéal snáithe i gcealla díorthaithe ó othair nach féidir a bhrath ar bhealaí eile.
Is próiseas féin-eagraithe suntasach é inchinn an duine atá ag forbairt ina iomadaíonn, a dhifreálann, a imíonn agus a nascann cealla chun ciorcaid néarónacha feidhmiúla a fhoirmiú a ndéantar scagadh breise orthu trí thaithí chéadfach. Fadhb lárnach i dtuiscint ar fhorbairt inchinne an duine, go háirithe i gcomhthéacs galair, is ea an easpa rochtana ar fhíochán inchinne. Is féidir le horgánaidí féin-eagraithe, lena n-áirítear orgánóidigh cortex an duine (hCO; ar a dtugtar sféar an cortex dhaonna freisin), 2,3,4,5,6 a ghiniúint. Mar sin féin, cuireann roinnt teorainneacha teorainn lena bhfeidhm níos leithne chun tuiscint a fháil ar fhorbairt agus ar fheidhmiú ciorcad néarónach. Go háirithe, níl sé soiléir an bhfuil aibiú hCO teoranta ag easpa ionchur micri-chomhshaoil ​​​​agus céadfach áirithe atá i láthair in vivo. Ina theannta sin, toisc nach bhfuil hCOanna comhtháite i gciorcaid ar féidir leo torthaí iompraíochta a ghiniúint, tá a n-úsáideacht i samhaltú neamhoird néar-shíciatracha géiniteacha casta agus iompraíochta teoranta faoi láthair.
Is féidir le trasphlandú hCO isteach in inchinn bheo shlán na teorainneacha seo a shárú. Léirigh staidéir roimhe seo go bhfuil néaróin dhaonna a thrasphlandaítear isteach sa cortex creimire in ann maireachtáil, teilgean, agus cumarsáid a dhéanamh le cealla creimire7,8,9,10,11,12. Mar sin féin, déantar na turgnaimh seo de ghnáth ar ainmhithe fásta, rud a d'fhéadfadh comhtháthú sineaptach agus axónach a theorannú. Anseo, déanaimid cur síos ar pharaidím trasphlandaithe ina n-trasphlandaíomar hCO 3D díorthaithe ó chealla hiPS isteach sa phríomh-cortex somatosensory (S1) de francaigh imdhíon-easpa ag céim luath den fhorbairt phlaisteach. Téann néaróin hCO (t-hCO) trasphlandaithe faoi aibiú suntasach, faigheann siad ionchuir thalamocortical agus cortical-cortical a spreagann freagairtí céadfacha, agus síneann siad teilgin axónacha isteach san inchinn francach chun iompar atá ag lorg luaíochta a thiomáint. Léirigh aibiú fada t-hCO lochtanna néarónacha in othair a bhfuil siondróm Timothy (TS) orthu, neamhord géiniteach tromchúiseach de bharr sócháin sa chainéal cailciam CaV1.2 de chineál L atá íogair ó thaobh voltais de (atá ionchódaithe ag CACNA1C).
Chun néaróin chortéiseacha daonna i gciorcaid in vivo a staidéar, rinneamar trasphlandú steiréatactach ar hCO3 slán i S1 francaigh aitiméiseacha luatha iarbhreithe (laethanta 3-7 iarbhreithe) (Fíor 1a agus sonraí leathnaithe de Fíor 1a-c). Ag an bpointe seo, níl a n-innéarú S1 críochnaithe fós ag teilgean axónach na talamocortical agus na corticocortical (tag. 13). Dá bhrí sin, tá an cur chuige seo deartha chun comhtháthú t-hCO3 a uasmhéadú agus an tionchar ar chiorcaid intíre a íoslaghdú ag an am céanna. Chun suíomh t-hCO3 in ainmhithe beo a shamhlú, rinneamar atógálacha inchinne MRI T2-ualaithe ar fhrancaigh 2-3 mhí tar éis trasphlandúcháin (Fíor 1b agus sonraí leathnaithe, Fíor 1d). Breathnaíodh t-hCO3 go héasca agus bhí tomhais toirte t-hCO3 cosúil leo siúd a ríomhadh ó shlisní seasta (Fíor Sonraí Leathnaithe 1d,e; P > 0.05). Breathnaíodh t-hCO3 go héasca agus bhí tomhais toirte t-hCO3 cosúil leo siúd a ríomhadh ó shlisní seasta (Fíor Sonraí Leathnaithe 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированныеѷ данные, рис. Breathnaíodh t-hCO3 go héasca, agus bhí tomhais toirtmhéadracha t-hCO3 cosúil leo siúd a ríomhadh le haghaidh rannóga seasta (sonraí leathnaithe, Fíor 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO cliceáil grianghraif níos mó a fheiceáil很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированнреыыыы данные, рис. Breathnaíodh t-hCO go héasca, agus bhí tomhais toirtmhéadracha t-hCO cosúil leo siúd a ríomhadh le haghaidh rannóga seasta (sonraí leathnaithe, Fíor 1d, e; P > 0.05).Chinntigh muid t-hCO3 i 81% de na hainmhithe trasphlandaithe thart ar 2 mhí tar éis trasphlandaithe (n = 72 ainmhí; hCO3 ó 10 líne cille hiPS; línte cille hiPS i dTábla Forlíontach 1). Díobh seo, bhí 87% suite sa cortex cheirbreach (Fíor 1c). Trí scananna MRI sraitheacha a dhéanamh ag pointí ama iolracha sa francach trasphlandaithe céanna, fuarthas méadú naoi n-uaire ar thoirt t-hCO3 laistigh de 3 mhí (Fíor 1d agus sonraí leathnaithe, Fíor 1f). Bhí ráta ard marthanais (74%) ag ainmhithe trasphlandaithe 12 mhí tar éis trasphlandaithe (sonraí leathnaithe, Fíor 1g agus Tábla Forlíontach 2), agus ní bhfuarthas aon lagú follasach mótair ná cuimhne, glióis, ná leictreinceifileagram (EEG). Sonraí Fíor 1g agus tábla forlíontach 2). 1h–m agus 3e).
a, Sceitse den dearadh turgnamhach. Rinneadh hCO díorthaithe ó chealla hiPS a thrasphlandú isteach i S1 francaigh nochta nuabheirthe ar laethanta 30-60 den difreáil. b, Íomhánna MRI corónacha agus cothrománacha T2-ualaithe a thaispeánann t-hCO i S1 2 mhí tar éis trasphlandúcháin. Barra scála, 2 mm. c, Cainníochtú rátaí rathúlachta greamaithe a thaispeántar do gach líne cille hiPS (n = 108, léiríonn na huimhreacha laistigh de na barraí méid t-hCO in aghaidh gach líne cille hIPS) agus suíomh cortical nó fo-chortical (n = 88). d, Íomhá MRI d'artaire corónach (ar chlé; barra scála, 3 mm) agus atógáil toirtmhéadrach 3D comhfhreagrach (barra scála, 3 mm) a thaispeánann méadú ar t-hCO thar 3 mhí. e, Athbhreithniú ar phatrúin t-hCO i gcortex cheirbreach francach. Barra scála, 1 mm. f, Íomhánna ionadaíocha imdhíon-chíteocheimiceacha de t-hCO a thaispeántar ó bharr ar chlé go deas (le linn difreála): PPP1R17 (4 mhí d'aois), NeuN (8 mí d'aois), SOX9 agus GFAP (8 mí d'aois), PDGFRα; (8 mí), MAP2 (8 mí) agus IBA1 (8 mí). Barra scála, 20 µm. Léiríonn comhléiriú HNA cealla de bhunadh daonna. g, snRNA-seq: Íomháú laghdaithe toise ilchodach agus teilgean aontaithe (UMAP) de gach núicléas t-hCO ardchaighdeáin tar éis comhtháthú Seurat (n=3 shampla t-hCO, n=2 líne cille hiPS). Astraicítí, cealla na líne astraicítí; cyc prog, sinsir imshruthaithe; GluN DL, néaróin glutamatergic dhomhain; GluN DL/SP, néaróin glutamatergic dhomhain agus fo-lamellar; GluN UL, néaróin glutamatergic uachtarach; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, cealla sinsir oligodendrocyte; RELN, néaróin reelin. h, Anailís saibhrithe téarmaí Gene Ontology (GO) ar ghéinte a raibh ardú suntasach tagtha orthu (P coigeartaithe < 0.05, athrú fillte > 2, léirithe i 10% ar a laghad de na núicléis) i néaróin glutamatergic t-hCO i gcomparáid le néaróin glutamatergic hCO. h, Anailís saibhrithe téarmaí Gene Ontology (GO) ar ghéinte a raibh ardú suntasach tagtha orthu (P coigeartaithe < 0.05, athrú fillte > 2, léirithe i 10% ar a laghad de na núicléis) i néaróin glutamatergic t-hCO i gcomparáid le néaróin glutamatergic hCO. h, Анализ обогащения терминов Gin Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05иритичельный P < 0,05 страницельной 2. hCO. h, Anailís saibhrithe téarmaí ar Ghéineolaíocht Géine (GO) le haghaidh géinte le gníomhachtú suntasach (P coigeartaithe <0.05, athrú fillte >2, léiriú i 10% de na núicléis ar a laghad) i néaróin glutamatergic t-hCO i gcomparáid le néaróin glutamatergic hCO. h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比, t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着调（调整.后嘰 嘍2, 在至少 10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h，与 hco 谷氨酸能元相比, t-hco 谷氨酸能 神经元基因显着 上调（后 嘌 嘌嘎嘎 变化> 2, 至少 10% 的 表达 表达）） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессрео níos mó i 10% ядер) sa глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Оионию analiz termina obbogachheniya. h, bhí géinte suasrialaithe go suntasach (P coigeartaithe < 0.05, athrú fillte > 2, léirithe i 10% ar a laghad de na núicléis) i néaróin glutamatergic t-hCO i gcomparáid le néaróin glutamatergic hCO Anailís ontolaíoch (GO) ar an téarma saibhrithe.Léiríonn an líne poncaithe luach aq de 0.05. i, íomháú UMAP de chineálacha cealla GluN i t-hCO ag baint úsáide as aistriú lipéid ó shraith sonraí tagartha 22 snRNA-seq cortex mótair fásta. CT — cealla corticothalamic, ET — cealla eachtar-cheirbreach, IT — cealla teileincefalacha inmheánacha, NP — gar-teilgean.
Ansin rinneamar measúnú ar chítearailtireacht agus ar chomhdhéanamh ceallach foriomlán t-hCO. Léirigh ruaimniú antashubstaintí cealla endothelial francach soithíochtú le t-hCO, agus léirigh ruaimniú IBA1 láithreacht micriglia francach ar fud an ghrafta (Fíor 1f agus sonraí leathnaithe, Fíor 3c,d). Léirigh imdhíon-ruaimniú cealla dearfacha d'antaigin núicléach dhaonna (HNA) a chomh-léiríonn PPP1R17 (sinúsaigh chortéiseacha), NeuN (néaróin), SOX9 agus GFAP (cealla díorthaithe ó glial) nó PDGFRα (sinúsaigh oligodendrocyte) (Fíor 1f). Chun comhdhéanamh ceallach t-hCO a staidéar ag réiteach cille aonair, rinneamar seicheamhú RNA aon-chroí (snRNA-seq) tar éis thart ar 8 mí de dhifreáil. Thug scagadh mórchóir agus baint núicléis francach 21,500 léarscáil monanúicléach daonna ardchaighdeáin (Fíor 1g agus sonraí leathnaithe, Fíor 4a,b). D'aithin patrúin léirithe marcóirí tipiciúla cille braislí de phríomh-aicmí cealla cortex, lena n-áirítear néaróin glutamatergic dhomhain agus dromchlacha, sinsir imshruthaithe, oligodendrocytes, agus líneáil astrocyte (Fíor 1g, sonraí leathnaithe, Fíor 4c, agus Tábla Forlíontach 3). Léirigh imdhíon-dhaite le haghaidh SATB2 agus CTIP2, in ainneoin láithreacht fochineálacha cortex, nach raibh srathú anatamaíoch soiléir ag t-hCO (sonraí leathnaithe, Fíor 3a). Tháirg snRNA-seq céim-mheaitseáilte hCO aicmí cealla den chineál céanna go forleathan, le cúpla eisceacht, lena n-áirítear easpa oligodendrocytes agus láithreacht néaróin GABAergic, rud a d'fhéadfadh a bheith ina léiriú ar na coinníollacha fabhracha in vitro a tuairiscíodh roimhe seo do chealla sinsir cliathánacha15 (sonraí leathnaithe, Fíor 4f – i agus Tábla Forlíontach 4). Léirigh anailís difreálach ar léiriú géine difríochtaí suntasacha i néaróin glutamatergic idir t-hCO agus hCO (Tábla Forlíontach 5), lena n-áirítear gníomhachtú tacair géinte a bhaineann le haibiú néarónach amhail comharthaíocht sineaptach, logánú deindríteach, agus gníomhaíocht cainéil voltais-gheataithe (Fíor 1h agus Tábla Forlíontach 5). Dá réir sin, léirigh néaróin t-hCO glutamatergic cortex aibiú trascríobh luathaithe.
Chun a shoiléiriú an raibh baint ag na hathruithe trascríobhacha seo i t-hCO3 le difríochtaí moirfeolaíocha idir hCO3 in vitro agus t-hCO3 in vivo, rinneamar atógáil ar hCO3 agus hCO3 líonta le biocytin a bhí meaitseáilte de réir céime i rannóga géara tar éis 7–8 mí de dhifreáil. Néaróin hCO3 (Fíor 2a). Bhí néaróin t-hCO3 i bhfad níos mó, bhí trastomhas 1.5 oiread an tsoma acu, dhá oiread deindrídí, agus méadú foriomlán sé huaire ar fhad iomlán na ndeindríteach i gcomparáid le hCO3 in vitro (Fíor 2b). Ina theannta sin, thugamar faoi deara dlús i bhfad níos airde de dhroim deindríteach i néaróin t-hCO3 ná i néaróin hCO3 (Fíor 2c). Tugann sé seo le fios go mbíonn fadú agus craobhú fairsing deindríteach ar néaróin t-hCO3, rud a d'fhéadfadh, i gcomhar le iomadú leanúnach cille, cur le fás dian t-hCO3 tar éis trasphlandúcháin (Fíor 1d agus Sonraí Leathnaithe Fíor 1f). Spreag sé seo sinn chun na hairíonna leictrifhiseolaíocha a imscrúdú. Bhí toilleas an scannáin ocht n-uaire níos airde (sonraí leathnaithe, Fíor 8d), bhí an poitéinseal scannáin i staid scíthe níos hipearpolaraithe (thart ar 20 mV), agus spreag instealladh reatha ráta spreagtha uasta níos airde i néaróin t-hCO3 ná i néaróin hCO3. in vitro (Fíor 2d), e), rud atá comhsheasmhach leis na gnéithe moirfeolaíocha níos mó agus níos casta de t-hCO3. Ina theannta sin, bhí minicíocht na n-imeachtaí reatha iar-shionapsacha spreagúla spontáineacha (EPSC) i bhfad níos airde i néaróin t-hCO3 (Fíor 2f), rud a thugann le fios go raibh baint ag an dlús méadaithe de dhroim deindreacha a breathnaíodh i néaróin t-hCO3 le spreagthacht fheidhmiúil. sionapsa gnéasach. Dheimhnigh muid carachtar neamhaibí néaróin hCO3 in vitro trí néaróin glutamatergic lipéadaithe a thaifeadadh (sonraí leathnaithe, Fíor 6a-c).
a, Atógáil 3T de néaróin hCO agus t-hCO líonta le biocytin tar éis 8 mí de dhifreáil. b, Cainníochtú gnéithe moirfeolaíocha (n = 8 néarón hCO, n = 6 néarón t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 agus ***P < 0.0001). b, Cainníochtú gnéithe moirfeolaíocha (n = 8 néarón hCO, n = 6 néarón t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 agus ***P < 0.0001). б, количественная ценка морялеских пенка морstraческих признаков (n = 8 нейронов HCO, n = 6 нейроно láthair t-hco; b, cainníochtú gnéithe moirfeolaíocha (n=8 néarón hCO, n=6 néarón t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, agus ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元， n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.01**0＀

b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元， n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.01**0＀

б, количественная ценка морялеских пенка морstraческих признаков (n = 8 нейронов HCO, n = 6 нейроно láthair t-hco; b, cainníochtú gnéithe moirfeolaíocha (n=8 néarón hCO, n=6 néarón t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, agus ***P<0.0001).c, Atógáil 3T ar chraobhacha deindreacha hCO agus t-hCO tar éis 8 mí de dhifreáil. Léiríonn réaltaí dearga dealga deindreacha ionchasacha. Cainníochtú dlús dromlaigh deindreacha (n = 8 néarón hCO, n = 6 néarón t-hCO; **P = 0.0092). d, Cainníochtú ar phoitéinseal an scannáin scíthe (n = 25 néarón hCO, n = 16 néarón t-hCO; ***P < 0.0001). d, Cainníochtú ar phoitéinseal an scannáin scíthe (n = 25 néarón hCO, n = 16 néarón t-hCO; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; ***P <0,0001). d, cainníochtú acmhainneachta membrane scíthe (n = 25 néarón hCO3, n = 16 néarón t-hCO3; ***P < 0.0001). d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；**P < 0.0001）。 d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；**P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; ***P <0,0001). d, cainníochtú acmhainneachta membrane scíthe (n = 25 néarón hCO3, n = 16 néarón t-hCO3; ***P < 0.0001). e, Lámhaigh acmhainneacht ghníomhaíochta athchleachtach i hCO agus t-hCO spreagtha ag instealltaí reatha a mhéadú, agus cainníochtú an ráta lámhaigh uasta (n = 25 néarón hCO, n = 16 néarón t-hCO; ***P < 0.0001). e, Lámhaigh acmhainneacht ghníomhaíochta athchleachtach i hCO agus t-hCO spreagtha ag instealltaí reatha a mhéadú, agus cainníochtú an ráta lámhaigh uasta (n = 25 néarón hCO, n = 16 néarón t-hCO; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO agus t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественкенаи оличественкио скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ath-lámhacht acmhainneachta gníomhaíochta i hCO agus t-hCO spreagtha ag méadú reatha agus cainníochtú an ráta lámhaigh uasta (n = 25 néarón hCO, n = 16 néarón t-hCO; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电,以及最大放电率的5 =CO神经元，n = 16 个t-hCO 神经元； ***P < 0.0001）。 E，通过增加电流注入的的 hco和 t-hco 重复电位放电, 以及最大的里   神经, n = 16 个 t-hco 神经； *** p <0.0001）。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO agus t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, ицо компании максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, lámhaigh athchleachtach ar phoitéinsil ghníomhaíochta hCO agus t-hCO arna spreagadh ag soláthar reatha méadaithe agus cainníochtú an ráta lámhaigh uasta (n = 25 néarón hCO, n = 16 néarón t-hCO; *** P < 0.0001). f, EPSCanna spontáineacha (sEPSCanna) i néaróin hCO agus t-hCO ag 8 mí de dhifreáil, agus cainníochtú minicíocht imeachtaí sineipseacha (n = 25 néarón hCO, n = 17 néarón t-hCO; ***P < 0.0001). f, EPSCanna spontáineacha (sEPSCanna) i néaróin hCO agus t-hCO ag 8 mí de dhifreáil, agus cainníochtú minicíocht imeachtaí sineipseacha (n = 25 néarón hCO, n = 17 néarón t-hCO; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценкаты чаты чаты чаты чественная оценкаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCanna spontáineacha (sEPSCanna) i néaróin hCO agus t-hCO ag 8 mí de dhifreáil agus cainníochtú rátaí imeachtaí sineipseacha (n=25 néarón hCO, n=17 néarón t-hCO; ***P<0.0001). f，分化8个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的里匌 = 2神经元，n = 17 t-hCO 神经元； ***P < 0.0001） . f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的釼匼匼匼匼匼率的釼 5神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценкаты чаты чаты чаты чественная оценкаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCanna spontáineacha (sEPSCanna) i néaróin hCO agus t-hCO ag 8 mí de dhifreáil agus cainníochtú rátaí imeachtaí sineipseacha (n = 25 néarón hCO, n = 17 néarón t-hCO; *** P<0.0001).I gcás bf, tógadh hCO3 agus t-hCO3 i líne 1208-2 ón bhaisc difreála chéanna a coinníodh go comhthreomhar. g, Anailís saibhrithe tacair géine (tástáil chruinn aontaobhach Fisher) ar ghéinte atá suasrialaithe go suntasach (P coigeartaithe < 0.05, athrú fillte > 2, léirithe i 10% ar a laghad de na núicléis) i néaróin glutamatergic t-hCO i gcomparáid le néaróin glutamatergic hCO le tacair géine de ghéinte atá ag brath ar ghníomhaíocht freagartha luath (ERG) agus freagartha déanach (LRG) a sainaithníodh ó staidéar lucha in vivo16 agus LRGanna sainiúla don duine ó néaróin in vitro17. g, Anailís saibhrithe tacair géine (tástáil chruinn aontaobhach Fisher) ar ghéinte atá suasrialaithe go suntasach (P coigeartaithe < 0.05, athrú fillte > 2, léirithe i 10% ar a laghad de na núicléis) i néaróin glutamatergic t-hCO i gcomparáid le néaróin glutamatergic hCO le tacair géine de ghéinte atá ag brath ar ghníomhaíocht freagartha luath (ERG) agus freagartha déanach (LRG) a sainaithníodh ó staidéar lucha in vivo16 agus LRGanna sainiúla don duine ó néaróin in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной акительной акительной акительной (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутамаронкина t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG, генон) активности, идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, agus специфических для человека in vivo17 LRGе из. g, anailís ar shaibhriú tacair géine (tástáil chruinn aon-eireaballach Fisher) géinte le gníomhachtú suntasach (P coigeartaithe <0.05, athrú fillte >2, léiriú i 10% ar a laghad de na núicléis) i néaróin glutamatergic t-hCO i gcomparáid le tacair néaróin glutamatergic hCO de ghéinte luatha (ERG) agus déanacha (LRG) atá ag brath ar ghníomhaíocht a sainaithníodh i lucha in vivo16 agus LRGanna sainiúla don duine ó néaróin in vitro17. g, t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05,倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher 精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类槀倂 g，t-hco 谷氨酸 神经元与 hco 谷氨酸 神经元相比, t-hco 谷氨酸 神经元上  尼惰惰惰尔尔尔尔尔尔 元尔小， 倍数> 2 ， 至少至少 10%的细胞 核中表达）的集富集分析伈单侧 iascaire 精＆小鼠 研究 中的早期反应反应反应和晚期反应反应 (cd) 活性基因的基因组 16神经元 17中中 17中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергемичи (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (одностора генов Фишера) раннего ответа (ERG) agus позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированили мышах in vivo16 agus нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, bhí néaróin glutamatergic t-hCO suasrialaithe go suntasach i gcomparáid le néaróin glutamatergic hCO (P coigeartaithe <0.05, athrú fillte >2, 10% ar a laghad. Anailís saibhrithe géine ar fhreagairt luath (ERG) agus freagairt dhéanach (tástáil chruinn aon-eireaballach Fisher) géinte spleácha ar ghníomhaíocht freagartha (LRGanna) a aithníodh i lucha in vivo16 agus néaróin in vitro.17 LRGanna sonracha do dhaoine.Léiríonn an líne poncaithe luach P de 0.05, ceartaithe ag Bonferroni. h, bhí méadú suntasach tagtha ar léiriú géine GluN (pacáiste bréagach agus scálú gach géine) i macasamhla snRNA-seq de ghéinte LRG i néaróin glutamatergic t-hCO. i, imdhíon-dhaite a thaispeánann léiriú SCG2 i néaróin t-hCO (uachtarach) agus hCO (íochtarach). Léiríonn saigheada bána cealla SCG2+. Barra scála, 25 µm. Léirítear sonraí mar mheán ± diall caighdeánach.
Bunaithe ar an méadú ar ghníomhaíocht t-hCO a breathnaíodh i slisní ex vivo, léirigh snRNA-seq suasrialáil spleách ar ghníomhaíocht trascríbhinní géine i t-hCO i gcomparáid le hCO in vitro. Léirigh néaróin glútamatergic t-hCO leibhéil níos airde de ghéinte a rialaíonn gníomhaíocht fhreagartha déanach (Fíor 2g,h), a fuarthas i staidéir roimhe seo i néaróin lucha agus daonna16,17. Mar shampla, léirigh BDNF18, SCG2, agus OSTN, géin rialála gníomhaíochta atá sainiúil do phríomhaidí, méadú ar léiriú i néaróin t-hCO i gcomparáid le néaróin hCO (Fíor 2g-i). Dá bhrí sin, léirigh néaróin t-hCO tréithe aibithe feabhsaithe i gcomparáid le néaróin hCO trí anailísí trascríobhacha, moirfeolaíocha agus feidhmiúla.
Chun an bhaint idir aibiú t-hCO agus forbairt inchinne an duine a mheas tuilleadh, rinneamar comparáidí trascríbhinneamacha ar chineálacha cealla cortex féatais agus fásta19,20 agus fásta21,22 chomh maith le sonraí fairsinge ar léiriú géine cortex23 le linn forbartha (sonraí leathnaithe, Fíor 5). le hobair roimhe seo24, tá stádas aibithe trascríbhinneam domhanda hCO agus t-hCO ag 7-8 mí de dhifreáil comhsheasmhach go ginearálta le ham forbartha in vivo agus is coibhéiseach é le saol féatais déanach (Sonraí Leathnaithe Fíor 5a). Is suntasach gur thugamar faoi deara aibíocht trascríbhinneam méadaithe i t-hCO i gcomparáid le hCO meaitseáilte de réir aoise, chomh maith le gníomhachtú trascríbhinneam a bhaineann le sineiptogenesis, astrogenesis, agus myelination (sonraí leathnaithe, Fíor 5b-d). Ag an leibhéal ceallach, fuaireamar fianaise ar fhochineál cortex níos tanaí i t-hCO, le braislí de néaróin glutamatergic ag forluí le fochineálacha néaróin fásta L2/3, L5, agus L6 (Fíor 1i). I gcodarsnacht leis sin, bhí forluí braisle idir néaróin t-hCO glutamatergic agus néaróin cortex féatais níos teoranta i lár an toirchis (sonraí leathnaithe, Fíor 5e-j). Chun a fháil amach an bhfuil néaróin t-hCO cosúil ó thaobh feidhme de le néaróin néochortex iarbhreithe daonna, rinneamar taifeadtaí leictrifhiseolaíocha agus athchruthuithe anatamaíocha de néaróin pirimideacha L2/3 daonna i rannóga géara den cortex iarbhreithe daonna (sonraí leathnaithe, Fíor 7a). Bhí airíonna leictrifhiseolaíocha néaróin pirimideacha L2/3 cosúil le hairíonna néaróin pirimideacha t-hCO (sonraí leathnaithe, Fíor 7e). Ó thaobh moirfeolaíochta de, bhí néaróin L2/3 ó shamplaí daonna iarbhreithe níos cosúla le t-hCO ná le hCO, cé go raibh cealla L2/3 níos faide, go raibh níos mó brainsí iontu san iomlán, agus go raibh dlús droma níos airde acu (Fíor 3g agus sonraí leathnaithe, Fíor 7b-). G).
a, trasphlandú hCO arna tháirgeadh ag línte cille rialaithe agus TS hiPS isteach i bhfrancaigh néonatal. b, atógáil 3T de néaróin t-hCO líonta le biocytin tar éis 8 mí de dhifreáil. c, cainníochtú ar mheánfhad deindríteach (n = 19 néarón rialaithe, n = 21 néarón TS; **P = 0.0041). d, craobhacha deindríteacha atógtha tríthoiseach ó rialú agus TS t-hCO ag 8 mí de dhifreáil, agus cainníochtú dlús an dromlaigh deindrítigh (n = 16 néarón rialaithe, n = 21 néarón TS, ***P < 0.0001). d, craobhacha deindríteacha atógtha tríthoiseach ó rialú agus TS t-hCO ag 8 mí de dhifreáil, agus cainníochtú dlús an dromlaigh deindrítigh (n = 16 néarón rialaithe, n = 21 néarón TS, ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля agus TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колия плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, Atógáil 3T ar bhrainsí deindríteacha ó rialú agus t-hCO TS ag 8 mí de dhifreáil agus cainníochtú dlús dromlach deindríteach (n=16 néarón rialaithe, n=21 néarón TS, ***P<0.0001). d，分化8个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 uair an chloig, ***P < 0.0001）。 d，分化 8个时对照和 ts t-hco 的 3d 重建分支 分支 以及树突棘密度量和 的 终 1元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля agus TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и коленкиче страница дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, Atógáil 3T ar bhrainsí deindreacha rialaithe agus TS t-hCO ag 8 mí de dhifreáil agus cainníochtú dlús dromlach deindreacha (n=16 néarón rialaithe, n=21 néarón TS, ***P<0.0001).Léiríonn réaltaí dearga dealga deindreacha ionchasacha. e, EPSCanna spontáineacha i néaróin rialaithe agus TS t-hCO tar éis 8 mí de dhifreáil. f, plota minicíochta carnach agus cainníochtú minicíochta agus aimplitiúid imeachtaí sineaptacha (n=32 néarón rialaithe, n=26 néarón TS; **P=0.0076 agus P=0.8102). g, anailís Scholl ar néaróin TS agus rialaithe i hCO agus t-hCO. Taispeánann línte briste néaróin phirimideacha iarbhreithe L2/3 daonna le haghaidh comparáide (n = 24 néarón rialaithe t-hCO, n = 21 néarón TS t-hCO, n = 8 néarón rialaithe hCO, agus n = 7 néarón TS hCO). Léirítear sonraí mar an meán ± diall caighdeánach.
Spreag cumas t-hCO gnéithe moirfeolaíocha agus feidhmiúla néaróin cortex an duine a mhacasamhlú ar leibhéal ard sinn chun iniúchadh a dhéanamh ar an bhféadfaí t-hCO a úsáid chun feinitíopaí galair a bhrath. Dhírigh muid ar TS, neamhord néarfhorbartha tromchúiseach de bharr sócháin gnóthachan feidhme sa ghéin a ionchódaíonn CaV1.2, a chuireann tús le trascríobh géine atá ag brath ar ghníomhaíocht i néaróin. Fuaireamar hCO ó thrí othar TS a raibh an t-ionadú is coitianta (p.G406R) acu agus trí rialú (Fíor 3a). Tar éis trasphlandúcháin, fuarthas amach go raibh moirfeolaíocht deindríteach athraithe i néaróin TS i gcomparáid le rialuithe (Fíor 3b agus sonraí leathnaithe, Fíor 8a,b), le méadú faoi dhó ar líon na ndeindrídí príomhúla agus méadú foriomlán ar an meánfhad agus laghdú foriomlán ar fhad deindríteach (Fíor 3c agus sonraí leathnaithe, Fíor 8c). Bhí baint aige seo le dlús méadaithe de spíneacha agus minicíocht mhéadaithe EPSCanna spontáineacha i TS i gcomparáid le néaróin rialaithe (Fíor 3d–f agus sonraí leathnaithe, Fíor 8g). Léirigh anailís bhreise patrúin brainseála deindrítigh neamhghnácha i TS t-hCO i gcomparáid le rialuithe, ach ní i TS hCO in vitro ag céim chomhchosúil idirdhealaithe (Fíor 3g). Tá sé seo comhsheasmhach lenár dtuarascálacha roimhe seo ar chrapadh deindrítigh atá ag brath ar ghníomhaíocht i TS agus leagann sé béim ar chumas an ardáin trasphlandaithe seo feinitíopaí galair a bhrath in vivo.
Ansin d'fhiafraíomar cé chomh feidhmiúil is atá cealla t-hCO2 comhtháite i francach S1. Faigheann S1 i gcreimirí ionchuir láidre sineipseacha ó na núicléis talamacha bonn ventral agus cúil ipsilateral, chomh maith leis na cortex somatosensory mótair agus tánaisteacha ipsilateral, agus S1 contralateral (Fíor 4a). Chun an patrún innervation a athbhunú, ionfhabhtaíomar hCO2 le víreas confaidh-dG-GFP/AAV-G agus thrasphlandaíomar hCO2 isteach i francach S1 3 lá ina dhiaidh sin. Breathnaíomar léiriú dlúth GFP i néaróin an S1 ipsilateral agus na ganglia bonn ventral 7–14 lá tar éis trasphlandúcháin (Fíor 4b, c). Ina theannta sin, nocht ruaimniú antashubstainte an marcóra talamaigh netrin G1 láithreacht foircinn talamacha i t-hCO2 (Fíor 4d, e). Chun a mheas an bhféadfadh na teilgean afferent seo freagairtí sineipseacha a spreagadh i gcealla t-hCO2, rinneamar taifeadtaí cille iomlána ó chealla daonna i rannóga géara den chiseal talamocortical. Spreagadh leictreach ar S1 francach, capsúl inmheánach, ábhar bán, snáithíní in aice le t-hCO nó gníomhachtú optghéiniteach de chríoch talamacha a léiríonn opsin i EPSCanna gearr-latency spreagtha ag t-hCO i néaróin t-hCO atá nochtaithe don antagonist gabhdóra AMPA NBQX. (Fíor 4f, g agus sonraí leathnaithe, Fíor 9a–g). Léiríonn na sonraí seo go bhfuil t-hCO comhtháite go hanatamaíoch in inchinn an fhrancaigh agus gur féidir le fíochán óstach francach é a ghníomhachtú.
a, Léaráid sceitseach de thurgnamh rianaithe confadh. b, GFP agus léiriú STEM121 atá sainiúil don duine idir t-hCO agus cortex cheirbreach francach (painéal uachtarach). Taispeántar freisin léiriú GFP i núicléas bonn ventral (VB) ipsilateral francach (íochtarach ar chlé) agus ipsilateral S1 (íochtarach ar dheis). Barra scála, 50 µm. Léiríonn na cearnóga dearga na réimsí den inchinn inar tógadh na híomhánna. c, cainníochtú cealla a léiríonn GFP (n = 4 francach). d, e — Teirminéil talamacha Netrin G1+ i t-hCO. Taispeánann d alt corónach ina bhfuil núicléis t-hCO agus VB. Barra scála, 2 mm. Taispeánann e léiriú Netrin G1 agus STEM121 i néaróin t-hCO (ar chlé) agus VB (ar dheis). Barra scála, 50 µm. Léiríonn an líne poncaithe oráiste an teorainn t-hCO. f, g, Rianta reatha néaróin t-hCO tar éis spreagadh leictreach i francach S1 (f) nó i gcapsúl inmheánach (g), le NBQX (corcra) nó gan (dubh) (ar chlé). Aimplitiúidí EPSC le agus gan NBQX (n = 6 néarón S1, *P = 0.0119; agus n = 6 néarón i gcapsúl inmheánach, **P = 0.0022) (lár). Céatadán de néaróin t-hCO a thaispeánann EPSC mar fhreagairt ar spreagadh leictreach francach S1 (f) nó i gcapsúl inmheánach (g) (ar dheis). aCSF, sreabhán ceirbreasdromlaigh saorga. h, léaráid sceitseach den turgnamh íomháithe 2P (ar chlé). Léiriú GCaMP6s i t-hCO (lár). Barra scála, 100 µm. Am-imeacht fluaraiseachta GCaMP6s (ar dheis). i, Scór Z de fhluaraiseacht ghníomhaíochta spontáineach. j, léiriú sceitseach de spreagadh mustáis. k, conairí fluaraiseachta 2P scóráilte le z i dtriail amháin, ailínithe le diall na bhfuadar ag am nialas (líne phraiseach) i gcealla samplacha. l, freagraí scór-z meándaonra na gcealla uile ailínithe le diall na bhfuadar ag am nialas (líne phraiseach) (dearg) nó stampaí ama a ghintear go randamach (liath). m. Léaráid scéimeach den turgnamh ar mharcáil optúil. n, Cuar voltais amha ó chill shamplach t-hCO le linn spreagadh léasair ghoirm nó diall na bhfuadar. Léiríonn saigheada dearga na chéad spící de bharr solais (barr) nó de bharr diall na bhfuadar (bun). Léiríonn scáthú liath tréimhsí diall na bhfuadar. o, Tonnfhoirmeacha buaicsholais agus freagairtí diall na bhfuadar. p, spící iarrachta aonair, ailínithe le diall na bhfuadar i gcealla an tsampla. Léiríonn 0 diall na bhfuadar (líne phraiseach). q, ráta lámhaigh scór-z meándaonra do gach cill íogaire don solas, ailínithe le diall na bhfuadar ag am nialas (líne phraiseach) (dearg) nó stampaí ama a ghintear go randamach (liath). r, Cion na n-aonad íogaire don solas atá modhnaithe go suntasach ag diall na sreabhán (n = 3 francach) (ar chlé). Lántracht buaic-z (n = 3 francach; n = 5 (glas éadrom), n = 4 (glas dorcha), agus n = 4 (cian) aonad modhnaithe diall na sreabhán in aghaidh an fhrancaigh) (ar dheis). Léirítear sonraí mar mheán ± diall caighdeánach
Ansin d'fhiafraíomar an bhféadfaí t-hCO a ghníomhachtú le spreagthaigh chéadfacha in vivo. Rinneamar trasphlandú ar hCO ina bhfuil na táscairí cailciam GCaMP6 atá ionchódaithe go géiniteach á léiriú i bhfrancaigh S1. Tar éis 150 lá, rinneamar fótaiméadracht snáithíneach nó íomháú cailciam dhá-fótón (Fíor 4h agus sonraí leathnaithe, Fíor 10a). Fuaireamar amach go raibh gníomhaíocht rithimeach sioncrónaithe ag cealla t-hCO (Fíor 4i, Sonraí Leathnaithe, Fíor 10b agus Físeán Forlíontach 1). Chun buaicghníomhaíocht t-hCO a shainiú, rinneamar taifeadtaí leictrifiseolaíocha eachtarcheallacha i bhfrancaigh trasphlandaithe ainéistéisithe (sonraí leathnaithe, Fíor 10c-f). Tá comhordanáidí steiréatacsacha ginte againn ó íomhánna MRI; dá bhrí sin, is ionann na haonaid taifeadta seo agus néaróin dhaonna ionchasacha, cé nach gceadaíonn leictrifiseolaíocht ina haonar speiceas tionscnaimh a chinneadh. Breathnaíomar ar phléascanna sioncrónaithe gníomhaíochta (sonraí leathnaithe, Fíor 10d). Mhair na pléascanna thart ar 460 ms agus bhí tréimhsí tost de thart ar 2 soicind eatarthu (sonraí leathnaithe, Fíor 10d, e). Lámhaigh aonaid aonair meán de thart ar thrí bhabhta in aghaidh an phléasctha, arb ionann é agus thart ar 73% de na haonaid chláraithe in aghaidh an phléasctha. Bhí baint mhór ag gníomhaíochtaí na n-aonad aonair, agus bhí na comhghaolta seo níos airde ná iad siúd a bhí ag aonaid a aithníodh in ainmhithe neamhvacsaínithe a taifeadadh faoi na coinníollacha céanna (sonraí leathnaithe, Fíor 10f). Chun freagairtí spící néaróin díorthaithe ó dhaoine a aithníodh a thréithriú tuilleadh, rinneamar turgnaimh clibeála solais ar francaigh ainéistéisithe a ndearnadh hCO a thrasphlandú orthu a léiríonn an cainéal catóin íogair don solas rhodopsin 2 (hChR2), trína n-aithnítear néaróin t-hCO le latency ghearr (níos lú ná 10 ms) mar fhreagairt ar spreagthaigh solais ghoirm (Fíor 4m–o). Léirigh néaróin t-hCO pléascanna gníomhaíochta spontáineacha ag minicíochtaí cosúil leo siúd a breathnaíodh in íomháú cailciam, chomh maith le taifeadtaí leictrifhiseolaíocha a rinneadh i t-hCO gan mharcáil solais (sonraí leathnaithe, Fig. 10c-g). Níor breathnaíodh aon ghníomhaíocht spontáineach sna céimeanna comhfhreagracha de hCO a taifeadadh in vitro. Chun a mheas an bhféadfaí t-hCO a ghníomhachtú le spreagthaigh céadfacha, dhíríomar na guairí francach go hachomair ar shiúl ó t-hCO (Fig. 4j,m agus sonraí leathnaithe, Fig. 10h,k). De réir staidéir roimhe seo8,10, léirigh fo-thacar de chealla t-hCO méadú ar ghníomhaíocht mar fhreagairt ar dhíriú guairí, rud nár breathnaíodh nuair a rinneadh comparáid idir na sonraí agus stampaí ama randamacha (Fig. 4k–q agus sonraí leathnaithe, Fig. 10h–q). Go deimhin, léirigh thart ar 54% de na haonaid aonair opto-lipéadaithe ráta múscailte méadaithe go suntasach tar éis spreagadh guairí, ag buaicphointe ag thart ar 650 ms (Fig. 4r). Le chéile, tugann na sonraí seo le fios go bhfaigheann t-hCO ionchuir fheidhmiúla cuí agus gur féidir é a ghníomhachtú le spreagthaigh chomhshaoil.
Ansin rinneamar imscrúdú an bhféadfadh t-hCO ciorcaid a ghníomhachtú i bhfrancaigh chun iompar a rialú. Ar dtús rinneamar imscrúdú an raibh acsóin néaróin t-hCO ag teilgean isteach sna fíocháin máguaird den bhfrancach. Rinneamar hCO a ionfhabhtú le lentivíreas a ionchódaíonn hChR2 comhleáite le EYFP (hChR2-EYFP). Tar éis 110 lá, bhreathnaíomar léiriú EYFP i réigiúin chortéiseacha ipsilateral, lena n-áirítear na cortex éisteachta, mótair, agus somatosensory, chomh maith le réigiúin fho-chortéiseacha, lena n-áirítear an striatum, an hipeocampus, agus an talamas (Fíor 5a). Chun a mheas an bhféadfadh na teilgin efferent seo freagairtí sineipseacha a spreagadh i gcealla francach, ghníomhaíomar go optúil cealla t-hCO a bhí ag léiriú hChR2-EYFP trí chealla cortex cheirbreach francach a thaifeadadh i rannóga géara inchinne. Gníomhachtú acsóin t-hCO le EPSCanna gearr-latency spreagtha ag solas gorm i néaróin cortex pirimideacha francach, a raibh bac orthu ag NBQX (Fíoranna 5b–g). Ina theannta sin, d’fhéadfadh teitreatocsain (TTX) bac a chur ar na freagairtí seo agus iad a athbhunú le 4-aimínipirídín (4-AP), rud a thugann le fios gur naisc mhonasynaptacha ba chúis leo (Fíor 5e).
a, Léaráid sceitseach de rianú acsóin (ar chlé). léiriú t-hCO3 EYFP (ar dheis). Barra scála, 100 µm. A1, cortex éisteachta, ACC, cortex cingulate anterior, d. striatum, striatum dorsal, HPC, hipeocampus; Diafragma, septum cliathánach, mPFC, cortex réamh-éadanach medial, piri, cortex piriform, v. striatum, striatum ventral, VPM, núicléas ventropostomedial an talamus, VTA, réigiún tegmental ventral. Léiríonn na cearnóga dearga na ceantair den inchinn inar tógadh na híomhánna. b, Léaráid sceitseach den turgnamh spreagtha. c, d, Samplaí de fhreagairt fótachruth (barr) agus voltais (bun) spreagtha ag solas gorm i gcealla EYFP+ t-hCO3 daonna nó francach (d) EYFP-. e, f, Rianta reatha néaróin francach tar éis spreagadh solais ghoirm ar aicsóin t-hCO le TTX agus 4-AR (glas), TTX (liath) nó aCSF (dubh) (e), le (corcra-violet) nó gan (dubh)) NBQX (e). g, moill na bhfreagairtí a spreag solas gorm i gcealla francach (n = 16 chill); léiríonn barraí cothrománacha an mhoill mheánach (7.13 ms) (ar chlé). Aimplitiúid EPSCanna a spreagtar le solas a taifeadadh le nó gan NBQX (n = 7 gceall; ***P < 0.0001) (lár). Aimplitiúid EPSCanna a spreagtar le solas a taifeadadh le nó gan NBQX (n = 7 gceall; ***P < 0.0001) (lár). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ев цент). Aimplitiúid EPSCanna spreagtha ag solas a taifeadadh le nó gan NBQX (n = 7 gceall; ***P < 0.0001) (lár).使用或不使用NBQX记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7个细胞；**P <0.0001）（〭）使用或不使用NBQX记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7个细胞；**P <0.0001）（〭） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ев цент). Aimplitiúid EPSCanna spreagtha ag solas a taifeadadh le nó gan NBQX (n = 7 gceall; ***P < 0.0001) (lár).Céatadán de chealla francach a thaispeánann EPSCanna a fhreagraíonn do sholas gorm (ar dheis). h, Léaráid sceitseach de thasc iompraíochta. d0, lá 0. i. Feidhmíocht ainmhithe eiseamláireacha ar lá 1 (ar chlé) nó lá 15 (ar dheis) den oiliúint. Meánlíon na lí a rinneadh ar lá 1 (ar chlé) nó lá 15 (ar dheis sa lár) (n = 150 triail solais ghoirm, n = 150 triail solais dhearg; ***P < 0.0001). Meánlíon na lí a rinneadh ar lá 1 (ar chlé) nó lá 15 (ar dheis sa lár) (n = 150 triail solais ghoirm, n = 150 triail solais dhearg; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) agus день 15 (вцентре справа) (n = 15 спанис светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Meánlíon na lí a rinneadh ar lá 1 (ar chlé) nó lá 15 (lár ar dheis) (n = 150 triail solais ghoirm, n = 150 triail solais dhearg; ***P < 0.0001).1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；**P <0.0001）。1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；**P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) agus день 15 (вцентре справа) (n = 15 спанис светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Meánlíon na lí a rinneadh ar lá 1 (ar chlé) nó lá 15 (lár ar dheis) (n = 150 triail solais ghoirm, n = 150 triail solais dhearg; ***P < 0.0001).Ligeanna carnacha le haghaidh trialacha solais dhearg agus ghoirm ar lá 1 (lár ar chlé) nó lá 15 (ar dheis). NS, gan suntas. j,k, Saintréithe iompraíochta na n-ainmhithe uile a ndearnadh trasphlandú orthu le t-hCO a léiríonn hChR2-EYFP (j) nó fluairifóir rialaithe (k) ar lá 1 nó 15 (hChR2-EYFP: n = 9 francach, **P = 0.0049; rialú: n = 9, P = 0.1497). l, Éabhlóid scór rogha (n = 9 hChR2, n = 9 rialú; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Éabhlóid scór rogha (n = 9 hChR2, n = 9 rialú; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Éabhlóid scór rogha (n = 9 hChR2, n = 9 rialú; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2， n = 9 对照；**P < 0.001, ***P < 0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2， n = 9 对照；**P < 0.001, ***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Éabhlóid scóir rogha (n = 9 hChR2, n = 9 rialú; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, léiriú FOS mar fhreagairt ar ghníomhachtú optogenetic t-hCO i S1. Taispeántar íomhánna de léiriú FOS (ar chlé), agus cainníochtú (n = 3 in aghaidh an ghrúpa; *P < 0.05, **P < 0.01 agus ***P < 0.001) (ar dheis). Taispeántar íomhánna de léiriú FOS (ar chlé), agus cainníochtú (n = 3 in aghaidh an ghrúpa; *P < 0.05, **P < 0.01 agus ***P < 0.001) (ar dheis). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) agus количественного определения (n = 3 ag группу; *P <0,0,0) <0,0,0,00,00,00,00,00,00,00,00,00 <0,00,00,00,00,00,00 <0,05,00,00,00,00 <0,00,00,00,00,00 <0,05,00,00,00,00 <0,05,00,00,00 <0,05,00,00 <0,05,00,00,00,00 <0,05,00,00,200 <0. (справа). Taispeántar íomhánna de léiriú FOS (ar chlé) agus cainníochtú (n = 3 in aghaidh an ghrúpa; *P<0.05, **P<0.01, agus ***P<0.001) (ar dheis).显示了FOS 表达（左）和量化 (每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和**P < 0.001）（右倁）显示了FOS 表达（左）和量化 (每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和**P < 0.001）（右倁） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) agus количественного определения (n = 3 ag группу; *P <0,0,0) <0,0,0,00,00,00,00,00,00,00,00,00 <0,00,00,00,00,00,00 <0,05,00,00,00,00 <0,00,00,00,00,00 <0,05,00,00,00,00 <0,05,00,00,00 <0,05,00,00 <0,05,00,00,00,00 <0,05,00,00,200 <0. (справа). Taispeántar íomhánna de léiriú FOS (ar chlé) agus cainníochtú (n = 3 in aghaidh an ghrúpa; *P<0.05, **P<0.01, agus ***P<0.001) (ar dheis).Barra scála, 100 µm. Léirítear sonraí mar mheán ± earráid chaighdeánach BLA, tonsil basolateral, MDT, núicléas talamach dorsomedial, PAG, liath periaqueductal.
Ar deireadh, d'fhiafraíomar an bhféadfadh t-hCO iompar francach a mhodhnú. Chun seo a thástáil, thrasphlandáil muid hCO a léiríonn hChR2-EYFP isteach i S1, agus 90 lá ina dhiaidh sin, chuireamar snáithíní optúla isteach i t-hCO le haghaidh seachadta solais. Ansin, rinneamar na francaigh a thraenáil le paraidím oiriúnaithe oibriúcháin modhnaithe (Fíor 5h). Chuireamar na hainmhithe i seomra tástála iompraíochta agus chuireamar spreagthaigh léasair gorma (473 nm) agus dearga (635 nm) 5 soicind i bhfeidhm go randamach. Fuair ​​​​ainmhithe luach saothair uisce má lig siad le linn spreagadh solais ghoirm ach nár lig siad le linn spreagadh solais dhearg. Ar an gcéad lá den oiliúint, níor léirigh na hainmhithe aon difríocht i ligiú nuair a spreagadh iad le solas gorm nó dearg. Mar sin féin, ar lá 15, léirigh ainmhithe a trasphlandaíodh le hCO a léiríonn hChR2-EYFP ligiú níos gníomhaí nuair a spreagadh iad le solas gorm i gcomparáid le spreagadh solais dhearg. Níor breathnaíodh na hathruithe seo in iompar lice in ainmhithe rialaithe ar trasphlandaíodh hCO iontu a raibh an fluairifóir rialaithe á léiriú acu (ráta ratha foghlama: hChR2 89%, EYFP 0%, Fíor 5i-1 agus Físeán Forlíontach 2). Tugann na sonraí seo le fios gur féidir le cealla t-hCO néaróin francach a ghníomhachtú chun iompar atá ag lorg luaíochta a spreagadh. Chun a fháil amach cé na ciorcaid néaracha t-hCO francach a d'fhéadfadh a bheith páirteach sna hathruithe iompraíochta seo, ghníomhachtaíomar t-hCO go optogenetach in ainmhithe oilte agus bhailíomar fíocháin 90 nóiméad ina dhiaidh sin. Léirigh imdhíoneolaíocht léiriú an phróitéine FOS atá ag brath ar ghníomhaíocht i roinnt réigiún inchinne a bhfuil baint acu le hiompar spreagtha, lena n-áirítear an cortex réamhfrontal medial, an talamas medial, agus an t-ábhar liath periaqueductal, a léiríodh in ainmhithe rialaithe neamhspreagtha nó in ainmhithe. rís. 5m). Le chéile, tugann na sonraí seo le fios gur féidir le t-hCO gníomhaíocht néarónach francach a mhodhnú chun iompar a thiomáint.
Is córas gealladh fúthu iad orgánóidigh néaracha chun forbairt agus galair an duine a staidéar in vitro, ach tá siad teoranta mar gheall ar an easpa naisc idir ciorcaid atá ann in vivo. D'fhorbraíomar ardán úrnua inar thrasphlandaíomar hCO3 isteach i S1 francaigh iar-bhreithe luatha imdhíonlagaithe chun forbairt agus feidhm cealla daonna a staidéar in vivo. Léirigh muid go bhforbraíonn t-hCO3 cineálacha cealla aibí nach bhfeictear in vitro28 agus go bhfuil t-hCO3 comhtháite go hanatamaíoch agus go feidhmiúil in inchinn an chreimire. Thug comhtháthú t-hCO3 i gciorcaid néaracha creimire deis dúinn nasc a bhunú idir gníomhaíocht cheallacha an duine agus iompar ainmhithe a ndearnadh staidéar orthu, rud a léiríonn gur féidir le néaróin t-hCO3 gníomhaíocht néarónach francach a mhodhnú chun freagairtí iompraíochta a thiomáint.
Tá roinnt buntáistí ag an ardán a thuairiscímid thar thaighde roimhe seo ar thrasphlandú cealla daonna isteach in inchinn creimirí. Ar dtús, thrasphlandaíomar hCO3 isteach sa cortex atá ag forbairt i bhfrancaigh luath-iarbhreithe, rud a d'fhéadfadh comhtháthú anatamaíoch agus feidhmiúil a éascú. Ar an dara dul síos, lig monatóireacht MRI t-hCO3 dúinn suíomh agus fás an ghreamaithe in ainmhithe beo a staidéar, rud a lig dúinn staidéir il-ainmhithe fadtéarmacha a dhéanamh agus iontaofacht roinnt línte cille hiPS a bhunú. Ar deireadh, thrasphlandaíomar orgánóidigh slána, seachas fionraí cealla aonair scoite, atá níos lú millteach do chealla daonna agus a fhéadann comhtháthú agus giniúint néarón cortex daonna in inchinn francach a chur chun cinn.
Aithnímid, in ainneoin dul chun cinn san ardán seo, go gcuireann srianta ama, spásúla agus tras-speicis cosc ​​ar fhoirmiú ciorcad néarógach daonna le hard-dhílseacht, fiú tar éis trasphlandú ag céim luath den fhorbairt. Mar shampla, níl sé soiléir an léiríonn an ghníomhaíocht spontáineach a breathnaíodh i t-hCO feinóip forbartha cosúil leis an ngníomhaíocht rithimeach a breathnaíodh le linn forbairt chortéiseach, nó an bhfuil sé mar gheall ar easpa cineálacha cealla coisctheacha i láthair i t-hCO. Ar an gcaoi chéanna, níl sé soiléir a mhéid a théann easpa lannaithe i t-hCO i bhfeidhm ar nascacht slabhra30. Díreofar obair amach anseo ar chineálacha eile cealla a chomhtháthú amhail micriglia daonna, cealla endothelial daonna, agus comhréireanna éagsúla d'internéaróin GABAergic mar a thaispeántar ag baint úsáide as tionól 6 in vitro, chomh maith le tuiscint a fháil ar an gcaoi a bhféadfadh comhtháthú agus próiseáil néarógach tarlú i t-hCO athraithe. leibhéil thrascríobhacha, sineaptacha agus iompraíochta i gcealla a fhaightear ó othair.
Tríd is tríd, is acmhainn chumhachtach an t-ardán in vivo seo a fhéadann forbairt inchinne an duine agus taighde galair in vitro a chomhlánú. Táimid ag súil go gceadóidh an t-ardán seo dúinn feinitíopaí nua ar leibhéal snáithe a fhionnadh i gcealla díorthaithe ó othair a bheadh ​​​​leochaileach murach sin agus straitéisí teiripeacha nua a thástáil.
Ghineamar hCO2.5 ó chealla HiPS mar a thuairiscíodh roimhe seo. Chun táirgeadh hCO a thionscnamh ó chealla hiPS a saothraíodh ar shraitheanna beathaithe, baineadh coilíneachtaí slána de chealla hiPS as miasa saothraithe ag baint úsáide as dispase (0.35 mg/mL) agus aistríodh iad chuig cultúir phlaisteacha le ceangaltán thar a bheith íseal ina raibh miasa le meán saothraithe cealla hiPS. (Corning) curtha leis le dhá choscóir SMAD dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) agus SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) agus coscóir ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Le linn na chéad 5 lá, athraíodh meán na gcealla hiPS go laethúil agus cuireadh dorsomorphine agus SB-431542 leis. Ar an séú lá i bhfionraí, aistríodh sféaróidigh néaracha go meán néarach ina raibh neurobasal-A (10888, Life Technologies), forlíonadh B-27 gan vitimín A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), peinicillin agus streiptimícin (1:100, Life Technologies) agus cuireadh fachtóir fáis eipideirmeach (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) agus fachtóir fáis fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) leis go dtí lá 24. Ó lá 25 go lá 42, cuireadh fachtóir néaratrófach díorthaithe ón inchinn (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) agus néaratrófin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) leis an meán agus athruithe meán gach dara lá. Ar an séú lá i bhfionraí, aistríodh sféaróidigh néaracha go meán néarach ina raibh neurobasal-A (10888, Life Technologies), forlíonadh B-27 gan vitimín A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), peinicillin agus streiptimícin (1:100, Life Technologies) agus cuireadh fachtóir fáis eipideirmeach (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) agus fachtóir fáis fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) leis go dtí lá 24. Ó lá 25 go lá 42, cuireadh fachtóir néaratrófach díorthaithe ón inchinn (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) agus néaratrófin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) leis an meán agus athruithe meán gach dara lá.Ar an séú lá i bhfionraí, aistríodh na sféaróidigh néaracha go meán néarach ina raibh Neurobasal-A (10888, Life Technologies), forlíonadh B-27 gan vitimín A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), peinicillin.и стрептомицин (1:100, Teicneolaíochtaí Beatha) agus дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; T&D Systems) agus факторомифроF2 (EGF; 20 нг/мл; T&D Systems) agus факторомифроF2 20 нг/мл; Córais T&F) до 24-го дня. agus streiptimícin (1:100, Life Technologies) agus fachtóir fáis eipideirmeach (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) agus fachtóir fáis fibroblast 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) curtha leis go dtí lá 24.Ó laethanta 25 go 42, cuireadh fachtóir neurotrófach díorthaithe ón inchinn (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) agus neurotrófin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) leis an meán, ag athrú an mheáin gach dara lá.在悬浮的第6天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888, Life Technologies）、不含维生素A 的B-2补充剂 (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100), Teicneolaíochtaí Saoil) Teicneolaíochtaí）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1 Córais）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；T&D Systems）直至第24 天。在悬浮的第第 6天将神经球体转移含有含有 neurobasal-a（10888，Teicneolaíochtaí Saoil） 不绠生移含有 含有, 10888 ， Life Technologies ） 不 素 素 有 有移 秠 有 有有有有有, 10888 ， Life Technologies ） 不 素 素 有移移 含有吟补充剂 (12587), Teicneolaíochtaí Saoil) Glutamax (1: 100), Life TechNOGIS青霉素的神经培养 基中 链霉素 ， 1:00 Teicneolaíochtaí Saol生长 因子 (（（20 ng ml-1 ； r&d Systems） 成 纤维细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）盬嬀】 Le 6-й день суспензии нейросферы были переведены ag добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life-Technology), без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) слендома эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; Córais T&F) agus фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; Ar lá 6, aistríodh fionraí néarosféir go forlíonadh ina raibh néarobásal-A (10888, Life Technologies), forlíonadh B-27 gan vitimín A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streiptimícin neodraithe le peinicillin (1:100, Life Technologies) arna fhorlíonadh le fachtóir fáis eipideirmeach (EGF; 20 ng ml-1; Córais T&F) agus fachtóir fáis fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Córais T&F) le haghaidh 24 uair an chloig. Córais T&F) go dtí an 24ú lá.Ó laethanta 25 go 42, cuireadh fachtóir néaratrófach díorthaithe ón inchinn (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) agus fachtóir néaratrófach 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) leis an meán cultúir gach dara lá. Athraigh an meán uair amháin.Ag tosú ó lá 43, coinníodh hCO i meán neurobasal-A neamhfhorlíonadh (NM; 1088022, Thermo Fisher) agus an meán á athrú gach 4–6 lá. Chun hCO a fháil ó chealla hiPS a saothraíodh faoi choinníollacha gan bheatha, goradh cealla hiPS le Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ag 37°C ar feadh 7 nóiméad, rinneadh iad a dhícheangal ina gcealla aonair, agus a phlátáil ar phlátaí AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) ag dlús 3 × 106 cealla aonair in aghaidh an tobair i meán Essential 8 a raibh an coscaire ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) curtha leis. Tar éis 24 uair an chloig, rinneadh na meáin sna toibreacha a phípéadú suas agus síos i meáin ina raibh meáin Essential 6 (A1516401, Life Technologies) a raibh dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) agus SB-431542 (10 μM; 1614) curtha leo. , Tocrida). Ó laethanta 2 go 6, cuireadh dorsomorphine agus an forlíonadh SB-431542 in ionad meán Essential 6 go laethúil. Ón séú lá, aistríodh na fionraí néarosféir chuig an meán néar-bhonnach agus cothabháladh iad mar a thuairiscítear thuas.
Rinneadh na nósanna imeachta ainmhithe go léir de réir na dtreoirlínte cúraim ainmhithe a d'fhormheas Coiste Riaracháin Cúraim Ainmhithe Saotharlainne Ollscoil Stanford (APLAC). Ceannaíodh francaigh eotaimiceacha RNU (rnu/+) torracha (Charles River Laboratories) nó cuireadh iad i dtithe iad. Coinníodh na hainmhithe ar thimthriall solais-dorchadas 12 uair an chloig le bia agus uisce ad libitum. Aithníodh coileáin francach nocht (FOXN1–/–) idir trí agus seacht lá d'aois trí fhás feadóga neamhaibí roimh an marú. Rinneadh coileáiníní (fireann agus baineann) a ainéistéisiú le 2-3% isoflurane agus cuireadh ar fhráma steiréatacsach iad. Rinneadh trepanation den chloigeann le trastomhas de thart ar 2-3 mm os cionn S1 agus sláine an dura mater á coinneáil. Ansin bain úsáid as snáthaid 30-G (thart ar 0.3 mm) díreach lasmuigh den chraniotomy chun an dura a tholladh. Ansin cuir HCO3 i bhfeidhm ar pharafilm tanaí 3 × 3 cm agus bain an meán breise. Ag baint úsáide as steallaire Hamilton atá ceangailte le snáthaid 23 G, 45°, tarraing hCO go réidh isteach sa cheann is faide den tsnáthaid. Ansin, suiteáil an steallaire ar an gcaidéal steallaire atá ceangailte leis an bhfeiste steiréatacsach. Ansin, cuir barr na snáthaide thar pholl pollta 0.3 mm ar leithead a rinneadh roimhe seo sa dura (z = 0 mm) agus caolaigh an steallaire 1–2 mm (z = thart ar –1.5 mm) go dtí go mbeidh an tsnáthaid idir an dura mater A. Cruthaítear séala dlúth. Ansin, ardaigh an steallaire go lár dhromchla an chortéis ag z = -0.5 mm agus instealladh hCO ag ráta 1-2 µl in aghaidh an nóiméid. Tar éis an instealladh hCO a chríochnú, tarraingítear siar an tsnáthaid ag ráta 0.2-0.5 mm in aghaidh an nóiméid, fuaitear an craiceann, agus cuirtear an coileán láithreach ar ceap téimh te go dtí go mbeidh sé/sí téarnamh go hiomlán. Rinneadh trasphlandú déthaobhach ar roinnt ainmhithe.
Rinneadh na nósanna imeachta ainmhithe go léir de réir threoirlínte cúraim ainmhithe atá ceadaithe ag APLAC Ollscoil Stanford. Spreagadh francaigh (níos mó ná 60 lá tar éis trasphlandúcháin) le 5% ainéistéise isoflurane agus rinneadh iad a ainéistéisiú le 1-3% isoflurane le linn íomháithe. Chun amharcléiriú a dhéanamh, baineadh úsáid as scanóir tollphoill chothrománach 7 Tesla ó Bruker (Bruker Corp.) le tiomáint grádáin ó International Electric Company (IECO), iontráil grádáin sciatháilte le trastomhas inmheánach 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) ag baint úsáide as AVANCE. III, cumais ilchorna RF ocht gcainéal agus ilchroí, agus an t-ardán Paravision 6.0.1 a ghabhann leis. Rinneadh an taifeadadh ag baint úsáide as corna RF toirtmhéadrach díchúpláilte go gníomhach le trastomhas inmheánach 86 mm agus corna RF crió-fhuaraithe ceithre chainéal le haghaidh glactha amháin. Aiseach 2D Turbo-RARE (am athrá = 2500 ms, am macalla = 33 ms, 2 mheán) le 16 gabháil slisne, tiús slisne 0.6–0.8 mm, ina bhfuil 256 × 256 sampla. Fuarthas na comharthaí ag baint úsáide as corna RF toirtmhéadrach tarchuradóra cearnach le trastomhas inmheánach 2 cm (Rapid MR International, LLC). Ar deireadh, bain úsáid as na feidhmeanna meastacháin dromchla Imaris (BitPlane) ionsuite le haghaidh rindreáil 3D agus anailís toirte. Sainmhíníodh trasphlandú rathúil mar cheann inar cruthaíodh limistéir de chomhartha MRI leanúnach T2-ualaithe sa leathsféar trasphlandaithe. Sainmhíníodh diúltú grafta mar ghrafta nár tháirg limistéir de chomhartha MRI leanúnach T2-ualaithe sa leathsféar trasphlandaithe. Eisiadh t-hCO fo-chortical ón anailís ina dhiaidh sin.
Chun GCaMP6s a chur in iúl go cobhsaí i hCO3 le haghaidh íomháú cailciam dhá fhótón, rinneadh cealla hiPS a ionfhabhtú le pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro agus ina dhiaidh sin roghnaíodh antaibheathaigh. Go hachomair, dícheangal na cealla le EDTA agus cuireadh ar fionraí iad i 1 ml de mheán Essential 8 ag dlús de thart ar 300,000 cealla i láthair polaibréine (5 μg/ml) agus 15 μl de víreas. Ansin goradh na cealla i bhfionraí ar feadh 60 nóiméad agus cuireadh síolta iontu ag dlús de 50,000 cealla in aghaidh an tobair. Tar éis cumar, rinneadh na cealla a chóireáil le 5-10 μg ml-1 puromycin ar feadh 5-10 lá nó go dtí go raibh coilíneachtaí cobhsaí le feiceáil. Rinneadh ionfhabhtú géarmhíochaine hCO3 mar a thuairiscíodh roimhe seo5 le roinnt modhnuithe. Go hachomair, aistrigh lá 30-45 hCO3 isteach i bhfeadáin micrea-lártheifneoir Eppendorf 1.5 ml ina raibh 100 µl de mheán néaróg. Ansin baintear thart ar 90 µl den mheán, cuirtear 3-6 µl de lentivíreas ard-títear (ó 0.5 x 108 go 1.2 x 109) leis an bhfeadán, agus aistrítear an hCO3 chuig an gorlann ar feadh 30 nóiméad. Ansin cuir 90–100 µl den mheán le gach feadán agus cuir na feadáin ar ais chuig an gorlann thar oíche. An lá dár gcionn, aistrigh hCO3 chuig meán néaróg úr i plátaí ceangail ísle. Tar éis 7 lá, aistríodh hCO3 chuig plátaí bun gloine 24-tobar chun cáilíocht an ionfhabhtaithe a léirshamhlú agus a mheas. Gineadh pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE agus pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE le VectorBuilder. Úsáidtear lentivíreas i bhformhór na dturgnaimh toisc go bhfuil sé comhtháite i ngéanóm an óstaigh, rud a ligeann don léiriú géine tuairisceora i línte cille ionfhabhtaithe. Chun leanúint suas le confadh, rinneadh comhionfhabhtú ar hCO le confadh-ΔG-eGFP agus AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene) ar lá 30-45, nite go maith é ar feadh 3 lá, agus trasphlandú isteach i bhfrancaigh i S1 agus cothabháil in vivo ar feadh 7-14 lá.
Chun críocha imdhíon-chíteocheimice, rinneadh ainmhithe a ainéistéisiú agus rinneadh iad a philliú go traschairdiach le PBS agus ina dhiaidh sin 4% paraformaldehyde (PFA i PBS; Electron Microscopy Sciences). Socraíodh na hinchinn i 4% PFA ar feadh 2 uair an chloig nó thar oíche ag 4°C, crió-chaomhnaíodh iad i 30% siúcrós i PBS ar feadh 48-72 uair an chloig, agus leabaíodh iad i gcóimheas 1:1, 30% siúcrós: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) agus rinneadh rannóga corónacha ag 30 µm ag baint úsáide as criostat (Leica). Chun críocha imdhíon-histeocheimice ar rannóga tiubha, rinneadh ainmhithe a philliú le PBS, agus díchóimeáladh an inchinn agus gearradh go corónach iad ag 300–400 µm ag baint úsáide as creathadóir (Leica) agus socraíodh na rannóga le 4% PFA ar feadh 30 nóiméad. Ansin nitear crió-ghearrthacha nó codanna tiubha le PBS, blocáiltear iad ar feadh 1 uair an chloig ag teocht an tseomra (10% serum asal gnáth (NDS) agus 0.3% Triton X-100 caolaithe i PBS) agus blocáiltear iad le tuaslagán blocála ag 4°C. – Goradh Goradh crió-ghearrthacha thar oíche agus goradh na codanna tiubha ar feadh 5 lá. Seo a leanas na príomh-antasubstaintí a úsáideadh: frith-NeuN (luch, 1:500; ab104224, abcam) frith-CTIP2 (francach, 1:300; ab18465, abcam), frith-GFAP (coinín, 1:1,000; Z0334, Dako), frith-GFP (sicín, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), frith-HNA (luch, 1:200; ab191181, abcam), frith-NeuN (coinín, 1:500; ABN78, Millipore), frith-PDGFRA (coinín, 1:200; sc-338, Santa Cruz), frith-PPP1R17 (coinín, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), frith-RECA-1 (luch, 1:50; ab9774, abcam), frith-SCG2 (coinín, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), frith-SOX9 (gabhar, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (gabhar, 1:100; AF1166, R&D Systems), frith-STEM121 (luch, 1:200; Y40410, Takara Bio), frith-SATB2 (luch, 1:50; ab51502, abcam), frith-GAD65/67 (coinín, 1:400; ABN904, Millipore) agus frith-IBA1 (gabhar, 1:100; ab5076, abcam). Seo a leanas na príomh-antasubstaintí a úsáideadh: frith-NeuN (luch, 1:500; ab104224, abcam) frith-CTIP2 (francach, 1:300; ab18465, abcam), frith-GFAP (coinín, 1:1,000; Z0334, Dako), frith-GFP (sicín, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), frith-HNA (luch, 1:200; ab191181, abcam), frith-NeuN (coinín, 1:500; ABN78, Millipore), frith-PDGFRA (coinín, 1:200; sc-338, Santa Cruz), frith-PPP1R17 (coinín, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), frith-RECA-1 (luch, 1:50; ab9774, abcam), frith-SCG2 (coinín, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), frith-SOX9 (gabhar, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (gabhar, 1:100; AF1166, R&D Systems), frith-STEM121 (luch, 1:200; Y40410, Takara Bio), frith-SATB2 (luch, 1:50; ab51502, abcam), frith-GAD65/67 (coinín, 1:400; ABN904, Millipore) agus frith-IBA1 (gabhar, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (анти-CTIP2: 3; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мы1: 2: анти-HNA (мы1: 2: abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; SC-338, санта-крзз), анти-PPP1R17 (кролик, 1: 200; HPA047819, antasubstaintí Atlas), анти-reca-1 (мышыш, 1:50; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, T&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, T&D Systems), анти-Mыы 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) agus анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Seo a leanas na príomhantasubstaintí a úsáideadh: frith-NeuN (luch, 1:500; ab104224, abcam), frith-CTIP2 (francach, 1:300; ab18465, abcam), frith-GFAP (coinín, 1:1000; Z0334, Dako), frith-GFP (sicín, 1:1000; GTX13970, GeneTex), frith-HNA (luch, 1:200; ab191181, abcam), frith-NeuN (coinín, 1:500; ABN78, Millipore), frith-PDGFRA (coinín, 1:200; sc-338, Santa Cruz), frith-PPP1R17 (coinín, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), frith-RECA-1 (luch, 1:50; ab9774, abcam), frith-SCG2 (coinín, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), frith-SOX9 (gabhar, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (gabhar, 1:100; AF1166, R&D Systems), frith-STEM121 (luch, 1:200; Y40410, Takara Bio), frith-SATB2 (luch, 1:50; ab51502, abcam), frith-GAD65/67 (coinín, 1:400; ABN904, Millipore) agus frith-IBA1 (gabhar, 1:100; ab5076, abkam).MARA: 抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠,1:3 00；ab18465, abcam）, 抗GFAP（兔, 1:1,000；Z0334, Dako）, 抗-GF P（鸡,1:1,000；GTX13970, GeneTex）, HNA（小鼠, 1:200；ab191181, abcam）,抗NeuN（兔, 1:500（兔,1:500（小鼠,1:200;ab191181, abcam）,抗NeuN; 1:200；sc-338, Santa Cruz）, 抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819,Atlas抗体）, RECA-1（小鼠, 1:50；ab9774, abcam）, SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP, Proteintech）, SOX9（山羊, 1:500；AF3075, Córais T&F）, Netrin G1a（山羊, 1:100；AF1166, R&D Córais）, STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是:抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠, 1 : 300; ab18465, abcam）, 抗 GFAP (兔, 1:1,000) Z0334, Dako）,抗-GFP (鸡, 1:1,000) GTX13970, GeneTex）, HNA (小鼠, 1:200) ab191181, abcam）,抗NeuN（兔,1:500,1:500,1:500,1:500,1:500; 200;sc-338, Santa Cruz; PPP1R17; 100 ； 20357-1-AP, Proteintech）, SOX9（山 羊, 1:500； AF3075, Córais T&F）, Netrin G1a（山 羊, 1:100； AF1166, 200, Córais T&F;Y40410, Takara Bio), frith-SATB2 (luch, 1:50; ab51502, abcam), frith-GAD65/67 (coinín, 1:400; ABN904, Millipore) agus frith-IBA1 (gabhar, 1:100; ab5076, abcam).Ba iad na príomh-antasubstaintí a úsáideadh: frith-NeuN (luch, 1:500; ab104224, abcam), frith-CTIP2 (francach, 1:300; ab18465, abcam), frith-GFAP (coinín, 1:1000; Z0334, Dako). , frith-GFP (sicín, 1:1000; GTX13970, GeneTex), frith-HNA (luch, 1:200; ab191181, abcam), frith-NeuN (coinín, 1:500; ABN78, Millipore), frith-PDGFRA (coinín, 1:200; sc-338, Santa Cruz), frith-PPP1R17 (coinín, 1:200; HPA047819, antashubstaint Atlas), frith-RECA-1 (luch, 1:50; ab9774, abcam), frith-SCG2 (coinín), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, T&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, T&D Systems), анти -мSTEM1: 21; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) agus анти-IBA1 (к1оза0; абкам). 20357-1-AP, Proteintech), frith-SOX9 (gabhar, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (gabhar, 1:100; AF1166, R&D Systems), frith-STEM121 (luch, 1:200; Y40410, Takara Bio), frith-SATB2 (luch, 1:50; ab51502, abcam), frith-GAD65/67 (coinín, 1:400; ABN904, Millipore), agus frith-IBA1 (gabhar, 1:100; ab5076, abkam).Ansin nite na codanna le PBS agus goradh iad le hantashubstaint thánaisteach ar feadh 1 uair an chloig ag teocht an tseomra (codanna reoite) nó thar oíche ag 4°C (codanna tiubha). Baineadh úsáid as antashubstaint thánaisteach Alexa Fluor (Life Technologies) caolaithe 1:1000 i dtuaslagán blocála. Tar éis níocháin le PBS, rinneadh na núicléis a shamhlú le Hoechst 33258 (Life Technologies). Ar deireadh, cuireadh na sleamhnáin ar mhicreascóp le clúdachghloiníní (Fisher Scientific) ag baint úsáide as Aquamount (Polysciences) agus rinneadh anailís orthu ar mhicreascóp fluaraiseach Keyence (anailíseoir BZ-X) nó micreascóp comhfhócasach Leica TCS SP8 (Las-X) ar an íomhá. Próiseáladh na híomhánna ag baint úsáide as an gclár ImageJ (Fiji). Chun cion na néarón daonna i t-hCO agus sa cortex francach a chainníochtú, tógadh íomhánna dronuilleogacha 387.5 μm ar leithead i lár an t-hCO, ag imeall an cortex francach nó gar dó. Cinneadh imill na ngrafta trí athruithe i dtrédhearcacht fíocháin, núicléis HNA+, agus/nó láithreacht uathfhluaraiseachta fíocháin a mheas. I ngach íomhá, roinneadh líon iomlán na gcealla NeuN+ agus HNA+ ar líon iomlán na gcealla NeuN+ sa limistéar céanna. Chun a chinntiú nach gcomhaireamh ach cealla a bhfuil núicléis acu sa phlána íomhá, ní chuirtear san áireamh sa ríomh ach cealla atá Hoechst+ freisin. Rinneadh meánú ar dhá íomhá scartha le 1 mm ar a laghad chun an earráid staitistiúil a laghdú.
Seachtain roimh bhailiú an tsampla, cuir ainmhithe trasphlandaithe hCO3 (thart ar 8 mí de dhifreáil) i seomra dorcha agus a gcuid guairí bearrtha chun spreagadh céadfach a íoslaghdú. Rinneadh aonrú ar na núicléis mar a thuairiscíodh roimhe seo, le roinnt modhnuithe. Go hachomair, scriosadh t-hCO3 agus hCO3 ag baint úsáide as lysis cealla glantach-mheicniúil agus meilteoir fíocháin gloine 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Scagadh na núicléis amha ansin ag baint úsáide as scagaire 40 µm agus lártheifneoiríodh iad ag 320 g ar feadh 10 nóiméad ag 4 °C sula ndearnadh grádán dlúis siúcróis. Tar éis an chéim lártheifneoirithe (320 g ar feadh 20 nóiméad ag 4 °C), athfhionraíodh na samplaí i 0.04% BSA/PBS le 0.2 aonad de choscóir µl-1 RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) a chur leis agus cuireadh trí scagaire sreafa 40 µm iad. Ansin, athfhionraíodh na núicléis dheighilte i PBS ina raibh 0.02% BSA agus luchtáladh iad ar sliseanna Chromium Single Cell 3′ (measta go mbeadh 8,000 cealla in aghaidh an lána mar thoradh air sin). Ullmhaíodh leabharlanna snRNA-seq leis an Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ullmhaíodh leabharlanna snRNA-seq leis an Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Cróimiam Aonchill 3′ GEM, Leabharlann & Glóthach Bead Kit v3 (10x Géanóm). Ullmhaíodh na leabharlanna snRNA-seq ag baint úsáide as Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Cróimiam Aonchill 3′ GEM, Leabharlann & Glóthach Bead Kit v3 (10x Géanóm) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Cróimiam Aonchill 3′ GEM, Leabharlann & Glóthach Bead Kit v3 (10x Géanóm) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Cróimiam Cill Aonair 3′ GEM, Leabharlann & Glóthach Bead Kit v3 (10x Géanóm). Ullmhaíodh an leabharlann snRNA-seq ag baint úsáide as Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Rinne Admera Health leabharlanna ó shamplaí éagsúla a chomhthiomsú agus a sheicheamhú ar NovaSeq S4 (Illumina).
Rinneadh leibhéil léirithe géine do gach cód barra núicléach ionchasach a chainníochtú ag baint úsáide as an bpacáiste bogearraí anailíse 10x Genomics CellRanger (leagan 6.1.2). Go sonrach, rinneadh na léamha a mheaitseáil i gcoinne meascán de ghéanóim tagartha daonna (GRCh38, Ensemble, leagan 98) agus francach (Rnor_6.0, Ensemble, leagan 100) a cruthaíodh leis an ordú mkref agus ag baint úsáide as comhaireamh leis an ordú –include-introns=TRUE chun léamha mapáilte chuig réigiúin intron a chainníochtú. I gcás samplaí t-hCO3, sainaithníodh núicléis dhaonna bunaithe ar an riachtanas coimeádach go mbeadh 95% ar a laghad de na léamha mapáilte go léir ag teacht leis an ngéanóm daonna. Rinneadh na hanailísí ina dhiaidh sin ar eagar cód barra scagtha a aschuir ón CellRanger ag baint úsáide as an bpacáiste R (leagan 4.1.2) Seurat (leagan 4.1.1)32.
Chun a chinntiú nach n-áireofar ach núicléis ardchaighdeáin san anailís ina dhiaidh sin, cuireadh próiseas scagtha athchleachtach i bhfeidhm do gach sampla. Ar dtús, aithnítear agus baintear núicléis ísealchaighdeáin a bhfuil níos lú ná 1000 géin uathúil aimsithe iontu agus níos mó ná 20% den iomlán mitochondria iontu. Ina dhiaidh sin, rinneadh an maitrís amh-uimhir géine a normalú trí aischéimniú déthéarmach diúltach rialtaithe ag baint úsáide as an bhfeidhm sctransform(vst.flavor=”v2″), a shainaithin na 3000 géin is athraitheacha freisin ag baint úsáide as paraiméadair réamhshocraithe. Rinneadh laghdú toise ar na géinte athraitheacha uachtaracha ag baint úsáide as Anailís Phríomh-Chomhpháirte (PCA) le paraiméadair réamhshocraithe ag baint úsáide as toise tacair sonraí de 30 (roghnaíodh dims = 30 bunaithe ar iniúchadh amhairc ar shuíomhanna glúine agus úsáideadh é do na samplaí agus na hanailísí ensemble go léir). Ansin rinneamar roinnt babhtaí de chnuasach athchleachtach (taifeach = 1) chun géinte a aicmiú bunaithe ar chomhaireamh géine thar a bheith íseal (meán faoi bhun an 10ú peircintíl), comhaireamh géine mitochondrial thar a bheith ard (meán os cionn an 95ú peircintíl) chun cealla ionchasacha de cháilíocht íseal a aithint agus a bhaint. braislí agus/nó cion ard de chúplaí amhrasta a sainaithníodh ag baint úsáide as an bpacáiste DoubletFinder33 (meánscór DoubletFinder os cionn an 95ú peircintíl). Comhtháthaíodh samplaí t-hCO (n=3) agus samplaí hCO (n=3) ar leithligh ag baint úsáide as an bhfeidhm IntegrateData leis na paraiméadair thuas. Ansin Rinneadh babhta eile de scagadh cáilíochtúil ar an tacar sonraí comhtháite mar a thuairiscítear thuas.
Tar éis na croíleacáin ísealcháilíochta a bhaint, grúpáladh an tacar sonraí comhtháite (taifeach = 0.5) agus leabaíodh é chun críocha léirshamhlaithe UMAP34. Cinneadh géinte marcóirí do gach braisle ag baint úsáide as an bhfeidhm FindMarkers le paraiméadair réamhshocraithe ríofa ó shonraí léirithe géine normalaithe. Aithnímid agus aicmímid príomh-aicmí cealla trí shraitheanna sonraí tagartha cortex féatais agus fásta a chomhcheangal le léiriú géine marcóra 19,20,21,35 agus anótáil. Go háirithe, sainaithníodh réamhtheachtaithe imshruthaithe trí léiriú MKI67 agus TOP2A. Sainmhíníodh braislí sinsear trí easpa trascríbhinní miotóiseacha, forluí ard le braislí sinsear glial ilchumhachtacha a thuairiscítear i gcoirtex féatais meiteafáis déanach, agus léiriú EGFR agus OLIG1. Úsáidimid an téarma astrocyte chun roinnt staideanna difreála astrocyte a chuimsiú, ó glia gathach déanach go dtí aibiú astrocytes. Léiríonn braislí astrocyte leibhéil arda SLC1A3 agus AQP4 agus tá sé léirithe go mapálann siad le fochineálacha de glia gathach féatais agus/nó astrocytes fásta. Léiríonn OPCanna PDGFRA agus SOX10 agus léiríonn oligodendrocytes marcóirí miéilinithe (MOG agus MYRF). Aithníodh néaróin glutamatergic trí láithreacht trascríbhinní néarónach (SYT1 agus SNAP25), easpa marcóirí GABAergic (GAD2), agus léiriú NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, nó SATB2. Roinneadh néaróin GluN ina bhfo-aicmí uachtaracha (léiriú SATB2 agus cailliúint BCL11B) agus doimhne (léiriú BCL11B). Léiríonn néaróin fho-phláta ionchasacha (SP) marcóirí SP18 aitheanta amhail ST18 agus SORCS1 chomh maith le marcóirí doimhne GluN. Aithníodh cealla cosúil le plexus córóideach trí léiriú TTR, agus léirigh cealla cosúil le meiningeach géinte a bhaineann le fibroblast agus mapáladh cealla pial/soithíoch den tacar sonraí tagartha.
Rinneadh anailís dhifreálach ar léiriú géine idir fo-aicmí t-hCO agus hCO ag baint úsáide as modh bréige-bhaisc nua-fhorbartha atáirgthe i samplaí a cuireadh i bhfeidhm ag baint úsáide as an bpacáiste Libra R (leagan 1.0.0). Go sonrach, rinneadh tástálacha log-dóchúlachta edgeR (leagan 3.36.0, pacáiste R) do ghrúpaí trí líon na ngéinte i gcealla a shuimiú do rang cealla ar leith do gach macasamhlú samplach. Chun léirshamhlú léarscáile teasa, ríomhtar luachanna normalaithe in aghaidh an mhilliúin (CPM) ag baint úsáide as edgeR (feidhm cpm()) agus déantar iad a scála (chun meán = 0, diall caighdeánach = 1 a bhaint amach). Rinneadh anailís saibhrithe Ontolaíochta Géine (GO) ar ghéinte GluN t-hCO atá suasrialaithe go suntasach (luach P ceartaithe Benjamini-Hochberg níos lú ná 0.05 arna léiriú in 10% ar a laghad de chealla GluN t-hCO agus méadú fillte ar athrú de 2 oiread ar a laghad). Rinneadh é seo ag baint úsáide as ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Úsáidimid an aip ToppFun le paraiméadair réamhshocraithe agus tuairiscímid luachanna P atá ceartaithe ag Benjamini-Hochberg arna ríomh ó thástálacha hipeargheoiméadracha anótáilte le GO.
Chun ár mbraislí snRNA-seq a mheaitseáil le braislí cealla anótáilte ó staidéir thagartha ar RNA-seq príomhúil aoncheallach nó snRNA-seq fásta19,20,21,22, chuireamar cur chuige comhtháthaithe tacar sonraí péireáilte i bhfeidhm. D'úsáideamar sreabhadh oibre normalúcháin SCTransform (v2) i Seurat chun forluí braislí idir tacair sonraí a chomhtháthú agus a chur i gcomparáid (ag baint úsáide as na paraiméadair chéanna atá thuas). Rinneadh fo-roinnt randamach ar thacair sonraí aonair suas le 500 cealla nó croíleacán in aghaidh an bhraisle bhunaidh chun éifeachtúlacht ríomhaireachtúil a chinntiú. Ag baint úsáide as cur chuige cosúil leis an méid a thuairiscíodh roimhe seo, sainmhíníodh forluí braislí mar an cion de chealla nó núicléis i ngach braisle comhthiomsaithe a raibh forluí acu le lipéad an bhraisle tagartha. Chun GluNanna a aicmiú tuilleadh, d'úsáideamar sreabhadh oibre TransferData Seurat do shonraí fo-thacar GluN chun lipéid tacair sonraí tagartha a shannadh dár gcealla GluN.
Chun stádas aibithe an trascríbhinn dhomhanda de shamplaí t-hCO agus hCO a mheas, rinneamar comparáid idir ár samplaí bréige-mhórchóire agus BrainSpan/psychENCODE23, arb é atá ann seicheamh mór RNA a shíneann thar fhorbairt inchinne an duine. Rinneamar PCA ar mhaitrís léirithe géine comhcheangailte patrún-normalaithe ó shamplaí cortex 10 seachtaine tar éis an choincheapa agus ina dhiaidh sin, i 5567 géin (mar aon lenár sonraí) a aithníodh roimhe seo mar ghníomhacha i samplaí cortex BrainSpan (sainmhínithe mar níos mó ná 50% in athraitheas forbartha a mhínítear de réir aoise ag baint úsáide as samhail chiúbach)38. Ina theannta sin, dhíorthaigh muid géinte a bhaineann le sínithe móra trascríbhinne de néarfhorbairt ag baint úsáide as fachtóiriú maitrís neamh-dhiúltach mar a thuairiscíodh roimhe seo. Tá na meáchain sampla a ríomhadh ag baint úsáide as an nós imeachta fachtóirithe maitrís neamh-dhiúltach plotaithe i bhFíor 5b le sonraí leathnaithe do gach ceann de na cúig shíniú a thuairiscigh Zhu et al.38. Arís, díorthaíodh marcóirí trascríbhinne atá ag brath ar ghníomhaíocht ó staidéir a foilsíodh roimhe seo. Go háirithe, bhí ERG agus LRG suasrialaithe go suntasach i néaróin glutamatergic a sainaithníodh le bailiúchán snRNA-seq cortex amhairc na luiche tar éis spreagadh amhairc ó Thábla Forlíontach 3 Hrvatin et al.16. Fuarthas LRGanna saibhrithe le daoine ó chultúir inchinne féatais dhaonna gníomhachtaithe le KCl agus bailíodh iad 6 uair an chloig tar éis an spreagtha, agus bhí na géinte scagtha suasrialaithe go suntasach i ndaoine ach ní i gcreimirí (Tábla Forlíontach 4). Rinneadh anailís ar shaibhriú tacair géine ag baint úsáide as na tacair géine seo ag baint úsáide as tástáil chruinn aontreo Fisher.
Cuir isoflurán ar na francaigh, bain na hinchinn agus cuir i dtuaslagán siúcróis fuar (thart ar 4°C) ocsaiginithe (95% O2 agus 5% CO2) iad le haghaidh codanna ina bhfuil: 234 mM siúcrós, 11 mM glúcós, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 agus 0.5 mM CaCl2 (thart ar 310 mOsm). Rinneadh codanna corónacha inchinne francaigh (300–400 µm) ina raibh t-hCO3 ag baint úsáide as creathóid Leica VT1200 mar a thuairiscíodh roimhe seo39. Ansin aistríodh na codanna chuig seomra gearrtha le hocsaiginiú leanúnach ag teocht an tseomra ina raibh aCSF ullmhaithe ó: glúcós 10 mM, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 agus 126 mM NaCl (298 mOsm), 45 nóiméad ar a laghad roimh an taifeadadh. Taifeadadh na codanna i seomra tumtha áit a raibh aCSF (fial 95% O2 agus 5% CO2) á n-ionphlandú go leanúnach. Taifeadadh na sonraí go léir ag teocht an tseomra. Cuireadh deireadh le néaróin t-hCO le pipéad gloine borosilicate líonta le tuaslagán ina raibh 127 mM glúcónáit photaisiam, 8 mM NaCl, 4 mM maignéisiam ATP, 0.3 mM sóidiam GTP, 10 mM HEPES, agus 0.6 mM EGTA, pH 7.2, tuaslagán inmheánach coigeartaithe le KOH (290 mOsm). Chun aisghabháil a dhéanamh, cuireadh biocytin (0.2%) leis an tuaslagán taifeadta.
Fuarthas sonraí ag baint úsáide as aimplitheoir MultiClamp 700B (Molecular Devices) agus digiteoir Digidata 1550B (Molecular Devices), scagtha íseal-phas ag 2 kHz, digitithe ag 20 kHz, agus anailísithe ag baint úsáide as Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). agus feidhmeanna saincheaptha MATLAB (Mathworks). Ríomhadh an poitéinseal acomhail ag baint úsáide as JPCalc agus coigeartaíodh na hiontrálacha go dtí an luach ríofa de -14 mV. Is éard atá in Oibríocht IV sraith céimeanna reatha i gcéimeanna 10-25 pA, ó -250 go 750 pA.
Spreagadh an talamas, an t-ábhar bán, agus na haifríní S1 go leictreach i slisní talamascótacha le linn taifeadadh paiste-clampála néaróin hCO3, mar a thuairiscíodh roimhe seo. Go hachomair, cuireadh an inchinn ar bhord priontála 3D a bhí claonta ag uillinn 10°, agus gearradh tosaigh na hinchinne ag uillinn 35°. Ansin, greamaíodh an inchinn leis an dromchla gearrtha agus roinneadh í, ag caomhnú na n-acsón talamascótacha a bhí ag gobadh amach. Suiteáladh leictreoidí tungstain dépholacha (0.5 MΩ) ar dhara micrea-ionramháileoir agus cuireadh i suíomh straitéiseach iad chun ceithre réigiún in aghaidh an chill a spreagadh (capsúl istigh, ábhar bán, S1 agus hCO3). Taifead freagairtí sineipseacha tar éis spreagadh céimneach 300 µA ag 0.03–0.1 Hz.
Gníomhachtaíodh néaróin hCO a léirigh hChR2 ag 480 nm agus cuireadh bíoga solais a ghintear ag LED (Prizmatix) i bhfeidhm trí chuspóir ×40 (0.9 NA; Olympus) chun léiriú hChR2 a thaifeadadh in aice leis na cealla. Tá trastomhas an réimse soilsithe thart ar 0.5 mm agus is é 10-20 mW an chumhacht iomlán. Socraíodh leithead na bíge go 10 ms, rud a fhreagraíonn don bhuilg a tugadh le linn an turgnaimh foghlama iompraíochta. Baineadh úsáid as minicíochtaí spreagtha éagsúla, ó 1 go 20 Hz, ach níor úsáideadh ach an chéad bhuilg den tsraith le haghaidh cainníochtaithe. De ghnáth bíonn na eatraimh idir traenacha níos faide ná 30 s chun an éifeacht ar chonairí coisctheacha nó éascaitheacha sineipseacha a íoslaghdú. Chun tástáil a dhéanamh an raibh an freagairt hChR2 monashineipseach, chuireamar TTX (1 μM) i bhfeidhm ar an dabhach go dtí gur imigh an t-imoibriú EPSC, agus ansin chuireamar 4-aimínipirídín (4-AP; 100 μM) i bhfeidhm. De ghnáth, cuirtear freagairt ar ais laistigh de chúpla nóiméad, le moill beagán níos faide idir lasadh LED agus giniúint EPSC. Baineadh úsáid as NBQX (10 μM) chun tástáil a dhéanamh an bhfuil an freagairt á tiomáint ag gabhdóirí AMPA.
Cruthaíodh rannóga géara hCO mar a thuairiscíodh roimhe seo. Go hachomair, leabaíodh rannóga hCO in agarós 4% agus aistríodh iad chuig cealla ina raibh 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 agus 10 mM d-(+)-glúcós. Gearradh na rannóga ag 200–300 µm ag teocht an tseomra ag baint úsáide as creathadh Leica VT1200 agus stóráladh iad in ASF ag teocht an tseomra. Ansin, rinneadh taifeadadh paiste-campa de chealla iomlána ar rannóga hCO faoi mhicreascóp díreach SliceScope (Scientifica). Rinneadh aCSF (95% O2 agus 5% CO2) a phumpáil ar na rannóga agus taifeadadh comharthaí na gcealla ag teocht an tseomra. Cuireadh néaróin hCO i bhfeidhm ag baint úsáide as pipéad gloine borosilicate líonta le tuaslagán ina raibh 127 mM glúcónáit photaisiam, 8 mM NaCl, 4 mM maignéisiam ATP, 0.3 mM GTP sóidiam, 10 mM HEPES, agus 0.6 mM EGTA, pH inmheánach 7, 2, coigeartaithe le KOH (osmolarity 290). Chun críocha aisghabhála, cuir 0.2% Biocytin leis an tuaslagán inmheánach.
Fuarthas sonraí le Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) ag baint úsáide as aimplitheoir MultiClamp 700B (Molecular Devices) agus digiteoir Digidata 1550B (Molecular Devices), scagadh íseal-phas ag 2 kHz, digitiú ag 20 kHz, agus anailísíodh iad ag baint úsáide as Clampfit (leagan 10.6) le haghaidh anailíse, feistí móilíneacha) agus feidhmeanna saincheaptha MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). Ríomhadh an poitéinseal acomhail ag baint úsáide as JPCalc agus coigeartaíodh na hiontrálacha go dtí an poitéinseal acomhail ríofa de -14 mV. Is éard atá in Oibríocht IV sraith céimeanna reatha i gcéimeanna 5-10 pA ó -50 go 250 pA.
Chun athchruthú moirfeolaíoch néaróin phionáilte a dhéanamh, cuireadh 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) leis an tuaslagán inmheánach. Déantar na cealla a ullmhú ar feadh 15 nóiméad ar a laghad tar éis an hacála. Tarraingítear an pipéad isteach go mall ansin ar feadh 1-2 nóiméad go dtí go mbeidh an scannán cláraithe séalaithe go hiomlán. Tar éis nós imeachta fiseolaíochta na rannóige, socraíodh na rannóga thar oíche ag 4°C i 4% PFA, nite le PBS X3, agus caolaíodh iad 1:1000 le DyLight 549 nó DyLight 405 (Vector Labs) atá comhchuingithe le streptavidin. Lipéadaíodh cealla líonta le biocytin (2%; Sigma-Aldrich) le linn taifeadadh clamp paiste ag teocht an tseomra ar feadh 2 uair an chloig. Ansin cuireadh na rannóga ar shleamhnáin micreascópachta ag baint úsáide as Aquamount (Thermo Scientific) agus léiríodh iad an lá dár gcionn ar mhicreascóp comhfhócasach Leica TCS SP8 ag baint úsáide as cuspóir tumoideachais ola le hoscailt uimhriúil ×40 1.3, formhéadú ×0.9–1.0, xy. Is é an ráta samplála ná thart ar 7 picteilín in aghaidh an mhicrón. Fuarthas cruacha Z ag eatraimh 1 µm go sraitheach, agus rinneadh mósáicí cruacha Z agus uath-fhuáil bunaithe ar Leica chun crann deindríteach iomlán gach néaróin a chlúdach. Ansin rianaíodh néaróin go leathláimhe ag baint úsáide as comhéadan neuTube 40 agus gineadh comhaid SWC. Ansin uaslódáileadh na comhaid chuig an mbreiseán SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, leagan 2.1.0; NIH).
Fuarthas fíochán cortex daonna le toiliú feasach de réir prótacail arna cheadú ag Bord Athbhreithnithe Institiúideach Ollscoil Stanford. Fuarthas dhá shampla d'fhíochán iar-bhreithe daonna (3 agus 18 mbliana d'aois) trí resection an cortex tosaigh (gyrus tosaigh lár) mar chuid de mháinliacht le haghaidh titimeas teasfhulangach. Tar éis resection, bailíodh an fíochán i NMDG-aCSF oighir-fhuar ina bhfuil: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glúcós, 2 mM thioúiré, 5 mM ascorbáit sóidiam, 3 mM pirúváit sóidiam, 0.5 mM CaCl2 4H2O agus 10 mM MgSO4 7H2O. Tíotráigh go pH 7.3-7.4 le haigéad hidreaclórach tiubhaithe. Seachadadh na fíocháin chuig an tsaotharlann laistigh de 30 nóiméad agus tógadh codanna corónacha de réir an nós imeachta a thuairiscítear thuas.
Rinneadh na nósanna imeachta ainmhithe go léir de réir threoirlínte cúraim ainmhithe atá ceadaithe ag APLAC Ollscoil Stanford. Spreagadh francaigh (níos mó ná 140 lá tar éis trasphlandúcháin) le 5% ainéistéise isoflurane agus ainéistéisíodh iad le 1-3% isoflurane le linn na hoibríochta. Cuireadh na hainmhithe i bhfráma steiréatacsach (Kopf) agus instealladh búprenorfín scaoilte leanúnach (SR) go fo-chraicneach. Nochtadh an cloigeann, glanadh é agus cuireadh 3-5 scriú cnámh isteach. Chun t-hCO3 a spriocdhíriú, ghineamar comhordanáidí steiréatacsacha ó íomhánna MRI. Druileáladh poll burr ag an suíomh spéise agus íslíodh snáithíní (trastomhas 400 µm, NA 0.48, Doric) 100 µm faoi dhromchla hCO3 agus daingníodh iad leis an gcloigeann le stroighin fiaclóireachta inleigheasta le UV (Relyx).
Rinneadh taifeadtaí fótaiméadracha snáithíní mar a thuairiscíodh roimhe seo42. Chun gníomhaíocht spontáineach a thaifeadadh, cuireadh francaigh i gcliabhán glan agus ceanglaíodh cábla paiste snáithíní optúla (Doric) 400 µm ar trastomhas, ceangailte le córas fála sonraí fótaiméadracha snáithíní optúla, leis an gcábla snáithíní optúla ionchlannaithe. Le linn an taifeadta 10 nóiméad ar ghníomhaíocht mhótair, bhí na hainmhithe saor chun an cliabhán a iniúchadh. Chun an ghníomhaíocht spreagtha a thaifeadadh, rinneadh francaigh (níos mó ná 140 lá tar éis trasphlandúcháin) a ainéistéisiú le 5% isoflurane le haghaidh ionduchtaithe agus 1-3% isoflurane le haghaidh cothabhála. Cuir an t-ainmhí i bhfráma steiréatachtach (Kopf) agus bearrtar na feada ar an taobh eile den t-hCO go dtí thart ar 2 cm agus cuirtear trí mhogalra iad atá ceangailte le gníomhaitheoir piezoelectric (PI). Ceanglaíodh cábla paiste snáithíní optúla 400 µm (Doric) leis an snáithín ionchlannaithe agus ceanglaíodh é leis an gcóras fála sonraí. Ansin, rinneadh na fuaidreacha ar an taobh eile de t-hCO a atreorú 50 uair (2 mm ag 20 Hz, 2 soicind in aghaidh an chur i láthair) ag amanna randamacha le tiomántán piezoelectric thar thréimhse taifeadta 20 nóiméad. Bain úsáid as Pacáiste Tacaíochta Arduino MATLAB chun am atreoraithe a rialú le cód MATLAB saincheaptha. Déantar imeachtaí a shioncrónú leis an mbogearra fála sonraí ag baint úsáide as bíoga loighce trasraitheora-trasraitheora (TTL).
Rinneadh francaigh (níos mó ná 140 lá tar éis trasphlandúcháin) a spreagadh le 5% ainéistéise isoflurane agus rinneadh iad a ainéistéisiú le 1-3% isoflurane le linn na hoibríochta. Cuireadh na hainmhithe i bhfráma steiréatacsach (Kopf) agus instealladh buprenorphine SR agus dexamethasone go fo-chraicneach. Nochtadh an cloigeann, glanadh é agus cuireadh 3-5 scriú cnámh isteach. Chun t-hCO3 a spriocdhíriú, ghineamar comhordanáidí steiréatacsacha ó íomhánna MRI. Rinneadh craniotomy ciorclach (thart ar 1 cm ar trastomhas) le druil ardluais go díreach os cionn an hCO3 trasphlandaithe. Nuair a bhíonn an cnámh chomh tanaí agus is féidir, ach sula ndéantar druileáil tríd an gcnámh ar fad, bain úsáid as forceps chun an diosca pelvic slán atá fágtha a bhaint chun an t-hCO3 faoi bhun a nochtadh. Líonadh an craniotomy le saline steiriúil, agus ceanglaíodh clúdach-shleamhnán agus biorán ceann speisialta leis an cloigeann le stroighin fiaclóireachta leigheasta le UV (Relyx).
Rinneadh íomháú dhá fhótóin ag baint úsáide as micreascóp ilfhótóin Bruker le cuspóir Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Rinneadh íomháú GCaMP6 ag 920 nm le formhéadú z-phlána aonair 1.4x agus meán 8x de 7.5 fps. Spreagadh francaigh le 5% ainéistéise isofluráin agus coinníodh iad le 1-3% isofluráin. Cuireadh na francaigh i ndaingneán ceann saincheaptha agus suite faoin lionsa. Fuarthas taifeadadh cúlra 3 nóiméad de ghníomhaíocht mhótair. Thar chúrsa 20 nóiméad de thaifeadadh, seachadadh 50 puff (gach cur i láthair 100 ms ar fhad) go randamach chuig an eochaircheap fuip os comhair t-hCO ag baint úsáide as picospricer. Bain úsáid as Pacáiste Tacaíochta Arduino MATLAB chun am pléasctha a rialú le cód MATLAB saincheaptha. Sioncrónaigh imeachtaí le bogearraí fála sonraí (PrairieView 5.5) ag baint úsáide as bíoga TTL. Chun críocha anailíse, ceartaíodh na híomhánna le haghaidh gluaiseachta xy ag baint úsáide as ceartú afíneach sa chlár MoCo a seoladh i bhFidsí. Eastóscadh rianta fluaraiseacha ó chealla aonair ag baint úsáide as CNMF-E43. Eastóscadh fluaraiseacht do gach réigiún spéise, tiontaíodh go cuar dF/F í, agus ansin tiontaíodh go scóir-z í.
Spreagadh francaigh (níos mó ná 140 lá tar éis trasphlandúcháin) le 5% ainéistéise isoflurane agus rinneadh iad ainéistéise le 1-3% isoflurane le linn na hoibríochta. Cuireadh na hainmhithe i bhfráma steiréatacsach (Kopf) agus instealladh buprenorphine SR agus dexamethasone go fo-chraicneach. Gearradh na feadáin ar an taobh eile den t-hCO go dtí thart ar 2 cm agus snáithíodh iad trí mhogalra a bhí ceangailte le gníomhaitheoir piezoelectric. Nochtadh agus glanadh an cloigeann. Ceanglaítear scriú talún cruach dhosmálta leis an gcloigeann. Chun t-hCO a spriocdhíriú, ghineamar comhordanáidí steiréatacsacha ó íomhánna MRI. Déan craniotomy ciorclach (thart ar 1 cm ar trastomhas) le druil ardluais díreach os cionn an t-hCO. Nuair a bhíonn an cnámh chomh tanaí agus is féidir, ach sula ndéantar druileáil tríd an gcnámh ar fad, bain úsáid as forceps chun an diosca pelvic slán atá fágtha a bhaint chun an t-hCO atá faoi bhun a nochtadh. Taifeadadh cealla aonair ag baint úsáide as tóireadóirí sileacain ard-dlúis 32-chainéal nó 64-chainéal (Cambridge Neurotech) atá talmhaithe le scriúnna talmhaithe agus réamh-aimplithe le haimplitheoirí RHD (Intan). Bain úsáid as an ionramhálaí chun na leictreoidí a ísliú go dtí an suíomh sprice tríd an gcraniotomy, atá líonta le saline steiriúil. Rinneadh bailiú sonraí ag minicíocht 30 kHz ag baint úsáide as an gcóras fála sonraí Open Ephys. Níor lean an taifeadadh ar aghaidh ach amháin nuair a bhraith muid gníomhaíocht spontáineach rithimeach an-chomhghaolmhar i níos mó ná 10 chainéal, rud a thugann le fios go raibh na leictreoidí suite sa ghreamacht (bunaithe ar shonraí íomháithe cailciam dhá fhótón). Fuarthas taifeadadh cúlra 10 nóiméad de ghníomhaíocht mhótair. Ansin, díríodh na guairí ar an taobh eile de t-hCO 50 uair (2 mm ag 20 Hz, 2 s in aghaidh an chur i láthair) ag amanna randamacha le tiomáint piezoelectric thar thréimhse taifeadta 20 nóiméad. Ag baint úsáide as an Pacáiste Tacaíochta MATLAB do Arduino (MATLAB 2019b), rialaigh am díraonta le cód MATLAB saincheaptha. Bain úsáid as bíoga TTL chun imeachtaí a shioncrónú le bogearraí fála sonraí.
I gcás turgnaimh marcála optúla, ceanglaíodh corda paiste optúil 200 µm (Doric) atá ceangailte le léasar 473 nm (Omicron) le snáithín optúil 200 µm a cuireadh os cionn an chraniotóime. Díreach roimhe seo, coigeartaigh cumhacht an léimneoir go 20 mW. Bain úsáid as an ionramhálaí chun na leictreoidí a ísliú go dtí an suíomh sprice tríd an gcraniotóime, atá líonta le saline steiriúil. Ag tús an taifeadta, astaíodh deich bíog solais 473 nm (minicíocht 2 Hz, fad bíge 10 ms). Sainmhíníodh cealla fótaisíogaire mar chealla a léirigh freagairt spíceach laistigh de 10 ms solais i 70% nó níos mó de na trialacha.