Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tacaíocht teoranta CSS ag an leagan brabhsálaí atá in úsáid agat.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, cuirfimid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Is coincheap é bithóipse leachtach (LB) a bhfuil tóir air go tapa sa réimse bithleighis.Tá an coincheap bunaithe go príomha ar bhrath blúirí de DNA extracellular a scaiptear (ccfDNA), a scaoiltear go príomha mar blúirí beaga tar éis bás cille i bhfíocháin éagsúla.Eascraíonn cuid bheag de na blúirí seo as fíocháin nó orgánaigh eachtracha (eachtrannach).San obair atá ar siúl againn faoi láthair, chuireamar an coincheap seo i bhfeidhm ar dhiúilicíní, speiceas faireach a bhfuil aithne air as a n-ardchumas scagacháin uisce farraige.Bainimid úsáid as cumas na ndiúilicíní chun gníomhú mar scagairí nádúrtha chun blúirí DNA comhshaoil ​​​​a ghabháil ó fhoinsí éagsúla chun faisnéis a sholáthar faoi bhithéagsúlacht éiceachórais chósta na mara.Léiríonn ár dtorthaí go bhfuil blúirí DNA ann a bhfuil éagsúlacht mhór i méid, ó 1 go 5 kb i haemailimp na diúilicíní.Léirigh seicheamh gunna gráin go bhfuil líon mór blúirí DNA de bhunús miocróbach eachtrach.Ina measc, fuaireamar blúirí DNA ó bhaictéir, archaea, agus víris, lena n-áirítear víris arbh eol go n-ionfhabhtaíonn siad éagsúlacht óstaigh a fhaightear go coitianta in éiceachórais mhuirí cósta.Mar fhocal scoir, léiríonn ár staidéar go léiríonn an coincheap LB a chuirtear i bhfeidhm ar dhiúilicíní foinse shaibhir eolais ar éagsúlacht mhiocróbach in éiceachórais chósta na mara ach nach bhfuil aon iniúchadh déanta uirthi go fóill.
Is réimse taighde atá ag fás go tapa é tionchar an athraithe aeráide (CC) ar bhithéagsúlacht éiceachórais mhuirí.Ní hamháin go n-eascraíonn téamh domhanda strusanna fiseolaíocha tábhachtacha, ach cuireann sé brú ar theorainneacha éabhlóideacha chobhsaíocht theirmeach na n-orgánach muirí, a dhéanann difear do ghnáthóg roinnt speiceas, rud a spreagann iad chun coinníollacha níos fabhraí a chuardach [1, 2].Chomh maith le cur isteach ar bhithéagsúlacht meiteasón, cuireann CC isteach ar chothromaíocht íogair idirghníomhaíochtaí óstaigh-mhiocróbacha.Tá an dysbacteriosis miocróbach seo ina bhagairt thromchúiseach d'éiceachórais mhuirí mar go ndéanann sé orgánaigh mhara níos so-ghabhálaí i leith pataiginí ionfhabhtacha [3, 4].Creidtear go bhfuil ról tábhachtach ag SS i mbásanna mais, rud atá ina fhadhb thromchúiseach do bhainistiú éiceachórais mhuirí domhanda [5, 6].Is ceist thábhachtach í seo i bhfianaise na hiarmhairtí eacnamaíocha, éiceolaíocha agus cothaitheacha atá ag go leor speiceas muirí.Tá sé seo fíor go háirithe maidir le débhlaoscaigh a chónaíonn sna réigiúin pholacha, áit a bhfuil éifeachtaí CK níos láithreach agus níos déine [6, 7].Go deimhin, tá débhlaoscaigh mar Mytilus spp.a úsáidtear go forleathan chun monatóireacht a dhéanamh ar éifeachtaí CC ar éiceachórais mhuirí.Ní nach ionadh, forbraíodh líon réasúnta mór bithmharcóirí chun monatóireacht a dhéanamh ar a sláinte, go minic ag baint úsáide as cur chuige dhá shraith a bhaineann le bithmharcóirí feidhmiúla bunaithe ar ghníomhaíocht einsímeach nó feidhmeanna ceallacha amhail inmharthanacht cille agus gníomhaíocht phagocytic [8].Áirítear ar na modhanna seo freisin tomhas an tiúchan de tháscairí brú sonracha a charnadh i bhfíocháin bhoga tar éis méideanna móra uisce farraige a ionsú.Mar sin féin, cuireann an cumas scagacháin ard agus córas imshruthaithe leath-oscailte na débhlaoscaí deis ar fáil chun bithmharcóirí hemolymph nua a fhorbairt ag baint úsáide as an gcoincheap bithóipse leacht (LB), cur chuige simplí agus íosta ionrach maidir le bainistiú othar.samplaí fola [9, 10].Cé gur féidir roinnt cineálacha móilíní a scaiptear a fháil i LB daonna, tá an coincheap seo bunaithe go príomha ar anailís seicheamhaithe DNA ar blúirí DNA eischeallacha (ccfDNA) a scaiptear sa phlasma.Go deimhin, tá láithreacht DNA a scaiptear i bplasma daonna ar eolas ó lár an 20ú haois [11], ach níl ann ach le blianta beaga anuas go bhfuil diagnóis chliniciúil bunaithe ar ccfDNA mar thoradh ar mhodhanna seicheamhaithe ard-thréchuir.Tá láithreacht na blúirí DNA seo i gcúrsaíocht i bpáirt mar gheall ar scaoileadh éighníomhach DNA genomic (núicléach agus miteachondrial) tar éis bás cille. I ndaoine aonair sláintiúla, is gnách go mbíonn an tiúchan ccfDNA íseal (<10 ng/mL) ach is féidir é a mhéadú 5-10 huaire in othair a bhfuil paiteolaíochtaí éagsúla orthu nó atá faoi strus, rud a fhágann damáiste fíocháin. I ndaoine aonair sláintiúla, is gnách go mbíonn an tiúchan ccfDNA íseal (<10 ng/mL) ach is féidir é a mhéadú 5-10 huaire in othair a bhfuil paiteolaíochtaí éagsúla orthu nó atá faoi strus, rud a fhágann damáiste fíocháin. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в раЅьшаться в раЅьшаться в раЅьшаться в раЅьшаться в раЅьни чной патологией agus подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. I ndaoine sláintiúla, is gnách go mbíonn an tiúchan cccDNA íseal (<10 ng/mL), ach is féidir é a mhéadú 5-10 uair in othair a bhfuil paiteolaíochtaí éagsúla acu nó faoi strus a fhágann damáiste fíocháin.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）, 但在患有各种病理或承劏理或常较低10 倍,从而导致组织损伤.在 健康个体中, ccfdna 的 浓度较低 （（<10 ng/ml）但在各种病理或承寏增加 5-10倍，从而组织。。。 损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-1па ичными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Is gnách go mbíonn tiúchan ccfDNA íseal (<10 ng/ml) i ndaoine sláintiúla, ach is féidir iad a mhéadú 5-10 huaire in othair a bhfuil paiteolaíochtaí nó strus éagsúla orthu, rud a fhágann damáiste fíocháin.Athraíonn méid na blúirí ccfDNA go forleathan, ach de ghnáth raonta ó 150 go 200 bp.[12].Is féidir anailís ar ccfDNA féin-díorthaithe, ie, ccfDNA ó chealla ósta gnáth nó claochlaithe, a úsáid chun athruithe géiniteacha agus epigenetic atá i láthair sa genome núicléach agus / nó mitochondrial a bhrath, rud a chabhraíonn le cliniceoirí teiripí saindírithe móilíneacha a roghnú [13] .Mar sin féin, is féidir ccfDNA a fháil ó fhoinsí eachtracha cosúil le ccfDNA ó chealla féatais le linn toirchis nó ó orgáin trasphlandaithe [14,15,16,17].Is foinse thábhachtach faisnéise é ccfDNA freisin chun láithreacht aigéid núicléacha de ghníomhaire ionfhabhtaíoch (eachtrach) a bhrath, rud a ligeann do bhrath neamh-ionrach ionfhabhtuithe forleathan nach n-aithnítear ag cultúir fola, ag seachaint bithóipse ionrach fíocháin ionfhabhtaithe [18].Léirigh staidéir le déanaí go deimhin go bhfuil foinse shaibhir faisnéise san fhuil dhaonna ar féidir a úsáid chun pataiginí víreasacha agus baictéaracha a aithint, agus go bhfuil thart ar 1% den ccfDNA a fhaightear i bplasma daonna de thionscnamh eachtrach [19].Léiríonn na staidéir seo gur féidir measúnú a dhéanamh ar bhithéagsúlacht mhicribhithóim imshruthaithe orgánaigh trí úsáid a bhaint as anailís ccfDNA.Mar sin féin, go dtí le déanaí, baineadh úsáid as an gcoincheap seo go heisiach i ndaoine agus, go pointe níos lú, i veirteabraigh eile [20, 21].
Sa pháipéar seo, bainimid úsáid as an acmhainneacht LB chun anailís a dhéanamh ar ccfDNA Aulacomya atra, speiceas theas a fhaightear go coitianta sna hOileáin Kerguelen subantarctic, grúpa oileán ar bharr ardchlár mór a foirmíodh 35 milliún bliain ó shin.pleascán bolcánach.Ag baint úsáide as córas turgnamhach in vitro, fuaireamar amach go dtógann diúilicíní blúirí DNA in uisce farraige go tapa agus go dtéann siad isteach sa urrann haemolymph.Tá sé léirithe ag seicheamhú gunna gráin go bhfuil blúirí DNA dá mbunús féin agus neamhfhéintionscanta san haemailimpeach diúilicíní ccfDNA, lena n-áirítear baictéir siombóiseacha agus blúirí DNA ó bhithóim atá tipiciúil d’éiceachórais chósta mhuirí fuara bholcánacha.Hemolymph ccfDNA freisin tá seichimh víreasach a dhíorthaítear ó víris le raonta óstaigh éagsúla.Fuaireamar blúirí DNA freisin ó ainmhithe ilcheallacha mar iasc cnámhach, anemóin mhara, algaí agus feithidí.Mar fhocal scoir, léiríonn ár staidéar gur féidir an coincheap LB a chur i bhfeidhm go rathúil ar inveirteabraigh mhara chun stór saibhir genomic a ghiniúint in éiceachórais mhuirí.
Daoine Fásta (55-70 mm ar fad) Bailíodh Mytilus platensis (M. platensis) agus Aulacomya atra (A. atra) ó chladaí creagach idirthaoideach Port-au-Frainc (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Oileáin Kerguelen i mí na Nollag 2018. Fuarthas diúilicíní gorma fásta eile (Mytilus spp.) ó sholáthraí tráchtála (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Ceanada) agus cuireadh iad in umar aeraithe faoi rialú teochta (4°C) ina raibh 10–20 L de 32‰ sáile saorga.(salann mara saorga Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, SAM).I gcás gach turgnaimh, tomhaiseadh fad agus meáchan sliogáin aonair.
Tá prótacal rochtana oscailte saor in aisce don chlár seo ar fáil ar líne (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Go hachomair, bailíodh hemolymph LB ó na matáin abductor mar a thuairiscítear [22].Soiléiríodh an hemolymph trí lártheifneoiriú ag 1200 × g ar feadh 3 nóiméad, reoitear an súthach (-20 ° C) go dtí go n-úsáidfí é.Le haghaidh aonrú agus íonú cfDNA, rinneadh samplaí (1.5-2.0 ml) a leá agus a phróiseáil ag baint úsáide as an trealamh NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) de réir threoracha an mhonaróra.Stóráladh ccfDNA ag -80°C go dtí go ndéanfar anailís bhreise.I roinnt turgnaimh, rinneadh ccfDNA a leithlisiú agus a íonú ag baint úsáide as Kit Imscrúdaitheora DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Ceanada).Rinneadh DNA íonaithe a chainníochtú trí úsáid a bhaint as measúnacht chaighdeánach PicoGreen.Rinneadh anailís ar dháileadh blúirí an ccfDNA scoite trí leictreafóiréis ribeach ag baint úsáide as bithanailíseoir Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ag baint úsáide as Kit DNA Ard-Íogaireachta.Rinneadh an mheasúnacht ag baint úsáide as 1 µl den sampla ccfDNA de réir threoracha an déantóra.
Chun blúirí haemolymph ccfDNA a sheicheamhú, d'ullmhaigh Génome Québec (Montreal, Québec, Ceanada) leabharlanna gunna gráin ag baint úsáide as trealamh Illumina DNA Mix de threalamh Illumina MiSeq PE75.Baineadh úsáid as adapter caighdeánach (BioO).Tá comhaid sonraí amha ar fáil ó Chartlann Léamh Seicheamh NCBI (SRR8924808 agus SRR8924809).Rinneadh measúnú ar cháilíocht bhunúsach léitheoireachta ag baint úsáide as FastQC [23].Baineadh úsáid as Trimmomatic [24] le haghaidh oiriúntóirí bearrtha agus léann droch-chaighdeán.Rinneadh léamha gunna gráin le foircinn péireáilte a chumasc FLASH isteach i léann singil níos faide le forluí íosta de 20 bpp chun neamhréireanna a sheachaint [25]. Rinneadh nótaí ar léith chumaisc le BLASTN ag baint úsáide as bunachar sonraí tacsanomaíochta débhlaoscach NCBI (e luach < 1e-3 agus 90% hoimeolaíocht), agus rinneadh seichimh íseal-castachta a chumhdach ag baint úsáide as DUST [26]. Rinneadh nótaí ar léith chumaisc le BLASTN ag baint úsáide as bunachar sonraí tacsanomaíochta débhlaoscach NCBI (e luach < 1e-3 agus 90% hoimeolaíocht), agus rinneadh seichimh íseal-castachta a chumhdach ag baint úsáide as DUST [26]. Blastn agus an ceann is fearr ar an saol gan staonadh NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности былогии 26]. Rinneadh nótaí ar léamha comhthiomsaithe le BLASTN ag baint úsáide as bunachar sonraí tacsanomaíochta débhlaoscach NCBI (e luach < 1e-3 agus 90% hoimeolaíocht), agus rinneadh chumhdach seichimh ísealchasta ag baint úsáide as DUST [26].NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释䐈并的读数 [Dublin]复杂度序列的掩蔽.使用双壳类 ncbi分类（（<1e-3和 90%同源）用用用注释合并读数 6, deannaigh复杂度序列的。。。。掩蔽掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽掩蔽 蔽掩蔽掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN сиспользованием таксономической базовы базуы люсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложной сложноличнолого сложноли сложноли сложнольский ием DUST [26]. Rinneadh nótaí ar léamha comhthiomsaithe le BLASTN ag baint úsáide as bunachar sonraí tacsanomaíoch débhlaoscach NCBI (e luach <1e-3 agus 90% hoimeolaíocht), agus rinneadh cumhdach seichimh ísealchasta ag baint úsáide as DUST [26].Roinneadh léamha ina dhá ghrúpa: seichimh dhébhlaoscacha (ar a dtugtar féinléamh anseo) agus neamhghaolmhar (neamhléamhanna féin).Cuireadh dhá ghrúpa le chéile ar leithligh ag baint úsáide as MEGAHIT chun contigs a ghiniúint [27].Idir an dá linn, rinneadh dáileadh tacsanomaíoch na léite micribhithóim choimhthíocha a rangú ag baint úsáide as Kraken2 [28] agus léirithe go grafach ag píchairt Krona ar an Réaltra [29, 30].Socraíodh gurb iad na kmers optamacha ná kmers-59 ónár réamh-thurgnaimh. Aithníodh na contigí féin ansin trí ailíniú le BLASTN (bunachar sonraí débhlaoscach NCBI, e-luach < 1e−10 agus homaleolaíocht 60%) le haghaidh nóta deiridh. Aithníodh na contigí féin ansin trí ailíniú le BLASTN (bunachar sonraí débhlaoscach NCBI, e-luach < 1e−10 agus homaleolaíocht 60%) le haghaidh nóta deiridh. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворыюх двустворюкания е e<1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Aithníodh féin-chontigí ansin trí mheaitseáil le BLASTN (bunachar sonraí débhlaoscach NCBI, e-luach <1e-10 agus 60% homology) le haghaidh nóta deiridh.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库， agus 值< 1e-10和60% uair an chloig终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库， agus 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги le haghaidh an окончательной аннотации путем сопоставления я двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 agus гомология 60%). Aithníodh féin-chontigí ansin le haghaidh nóta deiridh trí mheaitseáil le BLASTN (bunachar sonraí débhlaoscach NCBI, e-luach <1e-10 agus hoimeolaíocht 60%). Ag an am céanna, bhí contigs grúpa nonself nótaí le BLASTN (nt bunachar sonraí NCBI, luach e < 1e - 10 agus 60% homology). Ag an am céanna, bhí contigs grúpa nonself nótaí le BLASTN (nt bunachar sonraí NCBI, luach e < 1e - 10 agus 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI < 1 гия 60%). Ag an am céanna, cuireadh contigs grúpa eachtrach anótáilte le BLASTN (bunachar sonraí NT NCBI, luach e <1e-10 agus homaleolaíocht 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库， agus 值< 1e-10和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库， agus 值< 1e-10和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (банзе на помощью BLASTN <1e-10 agus гомология 60%). Ag an am céanna, rinneadh nótaí neamh-fhéinghrúpaí le BLASTN (bhunachar sonraí NCBI nt, luach e <1e-10 agus hoimeolaíocht 60%). Rinneadh BLASTX freisin ar contigs nonself ag baint úsáide as an próitéin nr agus RefSeq bunachair shonraí NCBI (e luach < 1e - 10 agus 60% homology). Rinneadh BLASTX freisin ar contigs nonself ag baint úsáide as an próitéin nr agus RefSeq bunachair shonraí NCBI (e luach < 1e - 10 agus 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr nr 1 e-1 омология 60%). Rinneadh BLASTX freisin ar contigs neamh-féin ag baint úsáide as bunachair shonraí próitéin nr agus RefSeq NCBI (e luach < 1e-10 agus 60% homology).还使用nr 和RefSeq蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e值< 1e-10和怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怉还使用nr 和RefSeq蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e值< 1e-10和怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怉 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr NC agus RefSeq (1) ология 60%). Rinneadh BLASTX freisin ar contigs neamh-féin ag baint úsáide as bunachair shonraí próitéin nr agus RefSeq NCBI (e luach <1e-10 agus 60% homology).Is ionann na comhthiomsuithe BLASTN agus BLASTX de neamh-fhéin-chontigí agus na contigí deiridh (féach an Comhad Forlíontach).
Tá na primers a úsáidtear le haghaidh PCR liostaithe i dTábla S1.Baineadh úsáid as Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) chun spriocghéinte ccfDNA a mhéadú.Baineadh úsáid as na coinníollacha imoibrithe seo a leanas: dínádúrú ag 95 ° C ar feadh 3 nóiméad, 95 ° C ar feadh 1 nóiméad, socraigh teocht anáil ar feadh 1 nóiméad, fadú ag 72 ° C ar feadh 1 nóiméad, 35 timthriall, agus ar deireadh 72 ° C laistigh de 10 nóiméad..Scaradh táirgí PCR trí leictreafóiréis i glóthacha agarose (1.5%) ina raibh SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Ceanada) ag 95 V.
Aeráideadh na diúilicíní (Mytilus spp.) in uisce farraige ocsaiginithe 500 ml (32 PSU) ar feadh 24 uair ag 4°C.Cuireadh DNA plasma ina bhfuil ionsán a ionchódaíonn an seicheamh cDNA galectin-7 daonna (uimhir aontachais NCBI L07769) leis an vial ag tiúchan deiridh de 190 μg/μl.Ba iad na diúilicíní a goradh faoi na coinníollacha céanna gan DNA a chur leo a bhí i gceannas.Bhí DNA gan diúilicíní sa tríú umar rialaithe.Chun monatóireacht a dhéanamh ar cháilíocht DNA in uisce farraige, tógadh samplaí uisce farraige (20 μl; trí athrá) ó gach umar ag an am sonraithe.Maidir le hinrianaitheacht DNA plasmideach, baineadh diúilicíní LB ag na hamanna sonraithe agus rinneadh anailís orthu ag qPCR agus ddPCR.Mar gheall ar an méid salainn ard atá in uisce farraige, caolaíodh slánchodanna in uisce cáilíochta PCR (1:10) roimh gach measúnacht PCR.
Rinneadh droplet digiteach PCR (ddPCR) ag baint úsáide as prótacal BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Ceanada).Bain úsáid as an bpróifíl teochta chun an teocht is fearr a chinneadh (Tábla S1).Gineadh titeann ag baint úsáide as gineadóir titim QX200 (BioRad).Rinneadh ddPCR mar seo a leanas: 95°C ar feadh 5 nóiméad, 50 timthriall de 95°C ar feadh 30 s agus teocht annealaithe tugtha ar feadh 1 nóiméad agus 72°C ar feadh 30 s, 4°C ar feadh 5 nóiméad agus 90°C laistigh de 5 nóiméad.Rinneadh líon na dtiteann agus na bhfrithghníomhartha dearfacha (líon cóipeanna/µl) a thomhas ag baint úsáide as léitheoir titim QX200 (BioRad).Diúltaíodh do shamplaí le níos lú ná 10,000 braoinín.Ní dhearnadh rialú patrún gach uair a ritheadh ​​ddPCR.
Rinneadh qPCR ag baint úsáide as primers sonracha Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, an Astráil) agus LGALS7.Rinneadh gach PCR cainníochtúil i 20 µl ag baint úsáide as Kit PCR Glas QuantiFast SYBR Green (QIAGEN).Cuireadh tús le qPCR le gor 15 nóiméad ag 95°C agus ina dhiaidh sin 40 timthriall ag 95°C ar feadh 10 soicind agus ag 60°C ar feadh 60 soicind le bailiú sonraí amháin.Gineadh cuair leá trí úsáid a bhaint as tomhais leantacha ag 95°C ar feadh 5 s, 65°C ar feadh 60 s, agus 97°C ag deireadh an qPCR.Rinneadh trí chóip de gach qPCR, ach amháin i gcás samplaí rialaithe.
Ós rud é go bhfuil cáil ar dhiúilicíní mar gheall ar a n-ardráta scagacháin, rinneamar imscrúdú ar dtús an bhféadfaidís na blúirí DNA atá san uisce farraige a scagadh agus a choinneáil.Bhí suim againn freisin i dtaobh an gcruinníonn na blúirí seo ina gcóras limfeach leath-oscailte.Réitíomar an cheist seo go turgnamhach trí chinniúint na blúirí DNA intuaslagtha a cuireadh le umair diúilicíní gorma a rianú.Chun rianú blúirí DNA a éascú, d'úsáideamar DNA plasmideach eachtrach (ní féin) ina raibh an ghéin galectin-7 daonna.Rianaíonn ddPCR blúirí DNA plasmid in uisce farraige agus diúilicíní.Léiríonn ár dtorthaí má fhan an méid blúirí DNA in uisce farraige sách seasta le himeacht ama (suas go dtí 7 lá) in éagmais diúilicíní, ansin i láthair na ndiúilicíní imithe an leibhéal seo beagnach go hiomlán taobh istigh de 8 n-uaire (Fíor 1a,b).Braitheadh ​​blúirí de DNA exogenous go héasca laistigh de 15 nóiméad i sreabhán infhéitheach agus hemolymph (Fíor 1c).D'fhéadfaí na blúirí seo a bhrath go fóill suas le 4 huaire an chloig tar éis nochta.Tá an ghníomhaíocht scagtha seo maidir le blúirí DNA inchomparáide le gníomhaíocht scagtha baictéir agus algaí [31].Tugann na torthaí seo le tuiscint gur féidir le diúilicíní DNA eachtracha a scagadh agus a charnadh ina n-urrann sreabhán.
Tiúcháin choibhneasta DNA plasmid in uisce farraige i láthair (A) nó as láthair (B) diúilicíní, tomhaiste ag DPCR.In A, cuirtear na torthaí in iúl mar chéatadáin, agus is ionann teorainneacha na mboscaí agus an 75ú agus an 25ú peircintíl.Taispeántar an cuar logartamach feistithe i dearg, agus is ionann an limistéar atá scáthaithe i liath agus an t-eatramh muiníne 95%.I B, seasann an líne dhearg don mheán agus seasann an líne ghorm don eatramh muiníne 95% don tiúchan.C Carnadh DNA plasmid sa hemolymph agus sreabhán valvular na ndiúilicíní ag amanna éagsúla tar éis DNA plasmid a chur leis.Cuirtear na torthaí i láthair mar chóipeanna dearbha braite/mL (±SE).
Ansin, rinneamar imscrúdú ar bhunús ccfDNA i ndiúilicíní a bailíodh ó leapacha diúilicíní ar na hOileáin Kerguelen, grúpa iargúlta oileán le tionchar antrapaigineach teoranta.Chun na críche seo, rinneadh cccDNA ó hemolymphs diúilicíní a leithlisiú agus a íonú trí mhodhanna a úsáidtear go coitianta chun cccDNA daonna a íonú [32, 33].Fuaireamar amach go bhfuil meántiúchan ccfDNA haemalimfeach i ndiúilicíní sa raon haemalimfeach íseal micreagram in aghaidh an ml (féach Tábla S2, Faisnéis Fhorlíontach).Tá an raon comhchruinnithe seo i bhfad níos mó ná i ndaoine sláintiúla (nanagram íseal in aghaidh an mhillilítear), ach i gcásanna neamhchoitianta, in othair ailse, is féidir le leibhéal ccfDNA roinnt microgram in aghaidh an millilítear a bhaint amach [34, 35].Léirigh anailís ar dháileadh méid hemolymph ccfDNA go bhfuil éagsúlacht mhór i méid na blúirí seo, ó 1000 bp go 1000 bp.suas le 5000 bp (Fig. 2).Fuarthas torthaí comhchosúla ag baint úsáide as an Kit Imscrúdaitheora QIAamp atá bunaithe ar shilice, modh a úsáidtear go coitianta san eolaíocht fhóiréinseach chun DNA genómach a leithlisiú go tapa agus a íonú ó shamplaí DNA tiúchan íseal, lena n-áirítear ccfDNA [36].
Ionadaí ccfDNA electrophoregram de haemolymph diúilicíní.Bainte le Trealamh Plasma NucleoSnap (barr) agus Kit Imscrúdaitheora DNA QIAamp.B Plota veidhlín a thaispeánann dáileadh na dtiúchan haemalimfeach ccfDNA (±SE) i ndiúilicíní.Léiríonn na línte dubha agus dearga an t-airmheán agus an chéad cheathairíl agus an tríú ceathrú, faoi seach.
Tá foinse eachtrach ag thart ar 1% de ccfDNA i ndaoine agus i bpríomhaigh [21, 37].I bhfianaise an chórais imshruthaithe leath-oscailte de dhébhlaoscacha, uisce farraige saibhir miocróbach, agus dáileadh méid na ndiúilicíní ccfDNA, rinneamar hipitéisiú go bhféadfadh go mbeadh linn saibhir agus éagsúil de DNA miocróbach i haemailimpeach diúilicíní ccfDNA.Chun an hipitéis seo a thástáil, rinneamar seicheamhú ccfDNA haemolymph ó Aulacomya atra samplaí a bailíodh ó na hOileáin Kerguelen, torthaí a fuarthas os cionn 10 milliún léamh, 97.6% acu a rith rialú cáilíochta.Rinneadh na léamha a rangú ansin de réir féinfhoinsí agus foinsí neamhfhéinúsáide ag baint úsáide as bunachair shonraí débhlaoscacha BLASTN agus NCBI (Fíor S1, Faisnéis Fhorlíontach).
I ndaoine, is féidir DNA núicléach agus mitochondrial araon a scaoileadh isteach sa sruth fola [38].Mar sin féin, sa staidéar seo, níorbh fhéidir cur síos mion a dhéanamh ar DNA géanóm núicléach na ndiúilicíní, toisc nach bhfuil seicheamh nó cur síos déanta ar ghéanóm A. atra.Mar sin féin, bhíomar in ann roinnt blúirí ccfDNA dár mbunús féin a aithint ag baint úsáide as an leabharlann dhébhlaoscach (Fíor S2, Faisnéis Fhorlíontach).Dhearbhaigh muid freisin láithreacht blúirí DNA dár mbunús féin trí aimpliú PCR dírithe ar na géinte A. atra sin a cuireadh in ord (Fig. 3).Mar an gcéanna, ós rud é go bhfuil an genome mitochondrial de A. atra ar fáil i mbunachair shonraí poiblí, is féidir fianaise a fháil maidir le láithreacht blúirí ccfDNA mitochondrial i haemolymph A. atra.Deimhníodh láithreacht blúirí DNA mitochondrial trí aimpliú PCR (Fíor 3).
Bhí géinte miteachondrialacha éagsúla i láthair i haemalimfeach A. atra (poncanna dearga – stocuimhir: SRX5705969) agus M. platensis (poncanna gorma – stocuimhir: SRX5705968) méadaithe ag PCR.Figiúr oiriúnaithe ó Bhriotáinis et al., 2011 B Amplification of hemolymph supernatant from A. atra Stóráilte ar pháipéar FTA.Bain úsáid as punch 3 mm chun cur go díreach leis an bhfeadán PCR ina bhfuil an meascán PCR.
Ag cur san áireamh an t-ábhar miocróbach atá in uisce farraige, dhíríomar ar dtús ar thréithriú seichimh DNA miocróbacha i haemolymph.Chun seo a dhéanamh, úsáidimid dhá straitéis éagsúla.Bhain an chéad straitéis úsáid as Kraken2, clár aicmithe seicheamh bunaithe ar algartam ar féidir seichimh mhiocróbacha a aithint le cruinneas atá inchomparáide le BLAST agus uirlisí eile [28].Cinneadh gur de bhunús baictéarach iad níos mó ná 6719 léamh, agus tháinig 124 agus 64 ó archaea agus víris, faoi seach (Fíor 4).Ba iad na blúirí DNA baictéarach is flúirseach ná Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), agus Bacteroidetes (17%) (Fíor 4a).Tá an dáileadh seo comhsheasmhach le staidéir roimhe seo ar mhicribhithóim na ndiúilicíní gorma mara [39, 40].Ba é gammaproteobacteria an príomh-aicme Proteobacteria (44%), lena n-áirítear go leor Vibrionales (Fíor 4b).Dhearbhaigh an modh ddPCR láithreacht blúirí Vibrio DNA sa ccfDNA de A. atra hemolymph (Fíor 4c) [41].Chun tuilleadh faisnéise a fháil faoi bhunús baictéarach ccfDNA, glacadh cur chuige breise (Fíor S2, Faisnéis Fhorlíontach). Sa chás seo, cuireadh léann a bhí forluiteach le chéile mar léitheanna péireáilte agus rangaíodh iad mar bhunadh féin (débhlaoscaí) nó neamhfhéin ag baint úsáide as BLASTN agus luach e 1e−3 agus scoithphointe le >90% homology. Sa chás seo, cuireadh léann a bhí forluiteach le chéile mar léitheanna péireáilte agus rangaíodh iad mar bhunadh féin (débhlaoscaí) nó neamhfhéin ag baint úsáide as BLASTN agus luach e 1e−3 agus scoithphointe le >90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения случае парными концами и были собраны как чтения спарными концами и бысили кания ые (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 значения e 1e-3е 90%. Sa chás seo, bailíodh léamha forluiteacha mar léamha péireáilte agus rangaíodh iad mar léann dúchasach (débhlaoscach) nó neamhbhunaidh ag baint úsáide as BLASTN agus luach e 1e-3 agus scoite le >90% homology.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN和1e-3的e值和>9组术数和和>9分类为自身（双壳类）或非自身来源。在这种情况下, 重叠读数组装为配末端读数，使用使用使璔 的倌 组 用 使用 使璔 数用 使璔 数用 使璔 的倌 猄 和 用 数 用 使用 使璔 blast 1 倌 倌 和 猄 儖0% 同源性的分类自身（双壳类）非自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения случае парными концами и классрифицица устворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN agus 1e-3 % и происхождению с Sa chás seo, bailíodh léamha forluiteacha mar léamha péireáilte agus aicmíodh iad mar léitheanna dílse (débhlaoscacha) nó neamhbhunaidh ag baint úsáide as luachanna e BLASTN agus 1e-3 agus tairseach homaleolaíochta >90%.Ós rud é nach bhfuil an genome A. atra curtha in ord fós, d'úsáideamar an straitéis tionóil de novo de chuid cóimeálaí Seicheamhaithe don Chéad Ghlúin Eile (NGS) MEGAHIT.Sainaithníodh 147,188 contig san iomlán mar chleithiúnaí (débhlaoscaí) de bhunadh.Phléasc na contigs sin ansin le r-luachanna 1e-10 ag baint úsáide as BLASTN agus BLASTX.Cheadaigh an straitéis seo dúinn 482 blúirí neamhdhébhlaoscacha atá in A. atra ccfDNA a shainaithint.Fuarthas níos mó ná leath (57%) de na blúirí DNA seo ó bhaictéir, go príomha ó shiombailí geolbhaigh, lena n-áirítear siombailí sulfatrófacha, agus ó shiombailí geolbhaigh Solemya velum (Fig. 5).
Flúirse coibhneasta ag leibhéal an chineáil.B Éagsúlacht mhiocróbach dhá phríomhfhíleáil (Firmicutes agus Proteobacteria).Aimpliú ionadaíoch ar ddPCR C Vibrio spp.A. Blúirí den ghéin rRNA 16S (gorm) i dtrí haemolymphs atra.
Rinneadh anailís ar 482 contig bailithe san iomlán.Próifíl ghinearálta ar dháileadh tacsanomaíoch na nótaí contige meitigenómacha (prokaryotes agus eukaryotes).B Dáileadh mionsonraithe blúirí DNA baictéaracha aitheanta ag BLASTN agus BLASTX.
Léirigh anailís Kraken2 freisin go raibh blúirí DNA seandálaíochta ag ccfDNA diúilicíní, lena n-áirítear blúirí DNA de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), agus Thaurmarcheota (11%) (Fíor 6a).Níor cheart go dtiocfadh iontas ar láithreacht blúirí DNA a dhíorthaítear ó Euryarchaeota agus Crenarchaeota, a fuarthas roimhe seo i bpobal miocróbach na ndiúilicíní California [42].Cé go bhfuil Euryarchaeota bainteach go minic le coinníollacha foircneacha, aithnítear anois go bhfuil Euryarchaeota agus Crenarcheota araon i measc na prokaryotes is coitianta sa timpeallacht chrióigineach mara [43, 44].Ní haon ionadh é láithreacht miocrorgánaigh mheatánaigineacha i ndiúilicíní, i bhfianaise tuairiscí le déanaí ar sceitheanna fairsinge meatáin ó sceitheanna grinnill ar Ardchlár Kerguelen [45] agus táirgeadh meatáin mhiocróbach a d’fhéadfadh a bheith ann faoi deara amach ó chósta Oileáin Kerguelen [46].
D'athraigh ár n-aird ansin chuig léamha ó víris DNA.Chomh fada agus is eol dúinn, is é seo an chéad staidéar seach-sprioc ar chion víreas na ndiúilicíní.De réir mar a bheifí ag súil leis, fuaireamar blúirí DNA de bacteriophages (Caudovirales) (Fíor 6b).Mar sin féin, tagann an DNA víreasach is coitianta ó fhíleam de nucleocytoviruses, ar a dtugtar freisin an víreas DNA mór cíteaplasma núicléach (NCLDV), a bhfuil an genome is mó d'aon víreas.Laistigh den fhíleam seo, baineann formhór na seichimh DNA leis na teaghlaigh Mimimidoviridae (58%) agus Poxviridae (21%), a bhfuil veirteabraigh agus artrapóid ina n-óstach nádúrtha, agus baineann cuid bheag de na seichimh DNA seo le algaí víreolaíocha aitheanta.Ionfhabhtaíonn algaí eucaryotic muirí.Fuarthas na seichimh freisin ón víreas Pandora, an víreas ollmhór leis an méid géanóm is mó d'aon ghéine víreasach atá ar eolas.Suimiúil go leor, bhí raon na n-óstach ar a dtugtar a bheith ionfhabhtaithe leis an víreas, mar a chinntear ag seicheamh hemolymph ccfDNA, sách mór (Fíor S3, Faisnéis Fhorlíontach).Áirítear leis víris a ionfhabhtaíonn feithidí mar Baculoviridae agus Iridoviridae, chomh maith le víris a ionfhabhtaíonn amoeba, algaí agus veirteabraigh.Fuaireamar seichimh freisin a bhí ag teacht leis an ngéanóm Pithovirus sibericum.Rinneadh pitoviruses (ar a dtugtar “víris zombie freisin”) a leithlisiú den chéad uair ó permafrost 30,000 bliain d’aois sa tSibéir [47].Mar sin, tá ár dtorthaí comhsheasmhach le tuarascálacha roimhe seo a léiríonn nach bhfuil gach speiceas nua-aimseartha de na víris seo imithe i léig [48] agus go bhféadfadh na víris seo a bheith i láthair in éiceachórais mhuirí iargúlta subarctic.
Ar deireadh, rinneamar tástáil féachaint an bhféadfaimis blúirí DNA ó ainmhithe ilcheallacha eile a aimsiú.D’aithin BLASTN agus BLASTX 482 contig coigríche san iomlán le leabharlanna nt, nr agus RefSeq (genomic agus próitéin).Léiríonn ár dtorthaí gur i measc na blúirí eachtracha de ccfDNA na n-ainmhithe ilcheallacha DNA na cnámha bony is mó (Fig. 5).Fuarthas blúirí DNA ó fheithidí agus ó speicis eile freisin.Níor sainaithníodh cuid sách mór de na blúirí DNA, b’fhéidir mar gheall ar ghannionadaíocht líon mór speiceas muirí i mbunachair shonraí géanómaíochta i gcomparáid le speicis talún [49].
Sa pháipéar seo, cuirimid an coincheap LB i bhfeidhm ar dhiúilicíní, ag áitiú gur féidir le seicheamhú lámhaigh haemolymph ccfDNA léargas a thabhairt ar chomhdhéanamh éiceachórais chósta na mara.Go háirithe, fuaireamar amach go bhfuil 1) hemolymph diúilicíní tiúchain sách ard (leibhéil micreagraim) de réasúnta mór (~ 1-5 kb) blúirí DNA a scaiptear;2) tá na blúirí DNA seo neamhspleách agus neamhspleách araon 3) I measc foinsí eachtracha na blúirí DNA seo, fuair muid DNA baictéarach, seandálaíochta agus víreasach, chomh maith le DNA ainmhithe ilcheallacha eile;4) Tarlaíonn carnadh na blúirí ccfDNA eachtracha seo sa hemolymph go tapa agus cuireann sé le gníomhaíocht scagtha inmheánach na ndiúilicíní.Mar fhocal scoir, taispeánann ár staidéar go n-ionchódaíonn coincheap LB, a cuireadh i bhfeidhm go príomha go dtí seo i réimse na bithleighis, foinse saibhir eolais ach nach bhfuil taiscéalaithe ar féidir a úsáid chun tuiscint níos fearr a fháil ar an idirghníomhú idir speicis fheighlithe agus a dtimpeallacht.
Chomh maith le príomhaigh, tá aonrú ccfDNA tuairiscithe i mamaigh, lena n-áirítear lucha, madraí, cait, agus capaill [50, 51, 52].Mar sin féin, go bhfios dúinn, is é ár staidéar an chéad cheann a dtuairiscigh braite agus seicheamhú ccfDNA i speicis mhara le córas oscailte cúrsaíochta.D’fhéadfadh an ghné anatamaíoch seo agus cumas scagtha na ndiúilicíní, go pointe ar a laghad, míniú a thabhairt ar shaintréithe méideanna éagsúla na blúirí DNA a scaiptear i gcomparáid le speicis eile.I ndaoine, is blúirí beaga iad an chuid is mó de na blúirí DNA a scaiptear san fhuil ó 150 go 200 bp.le buaic uasta de 167 bp [34, 53].Tá cuid bheag ach suntasach de blúirí DNA idir 300 agus 500 bp i méid, agus tá thart ar 5% níos faide ná 900 bp.[54].Is é an chúis atá leis an dáileadh méide seo ná go dtarlaíonn príomhfhoinse ccfDNA i plasma mar thoradh ar bhás cille, mar gheall ar bhás cille nó mar gheall ar necróis na gcealla hematopoietic a scaiptear i ndaoine aonair sláintiúla nó mar gheall ar apoptosis cealla meall in othair ailse (ar a dtugtar DNA meall a scaiptear)., ctDNA).Bhí dáileadh méide an ccfDNA haemolymph a fuaireamar i ndiúilicíní sa raon ó 1000 go 5000 bp, rud a thugann le tuiscint go bhfuil bunús difriúil ag ccfDNA diúilicíní.Is hipitéis loighciúil é seo, ós rud é go bhfuil córas soithíoch leath-oscailte ag na diúilicíní agus go gcónaíonn siad i dtimpeallachtaí uisceacha muirí ina bhfuil tiúchan ard DNA géanómaíochta miocróbach.Go deimhin, léirigh ár dturgnaimh saotharlainne a úsáideann DNA eisghineach go gcruinníonn diúilicíní blúirí DNA in uisce na farraige, tar éis cúpla uair an chloig ar a laghad go ndéantar iad a dhíghrádú tar éis glacadh le cealla agus/nó a scaoiltear agus/nó a stóráiltear iad in eagraíochtaí éagsúla.Mar gheall ar a ganntanas cealla (procaryotic agus eucaryotic araon), laghdóidh úsáid urranna infhéitheacha an méid ccfDNA ó fhéinfhoinsí agus ó fhoinsí eachtracha freisin.Ag cur san áireamh a thábhachtaí atá díolúine dhúchasach dhébhlaoscach agus an líon mór fagaicítí a scaiptear, rinneamar hipitéis a thuilleadh go bhfuil fiú ccfDNA eachtrach saibhrithe i gcúrsaíocht fagaicítí a charnann DNA eachtrach ar ionghabháil mhiocrorgánaigh agus/nó smionagar ceallacha.Nuair a chuirtear le chéile, léiríonn ár dtorthaí gur stór uathúil d’fhaisnéis mhóilíneach é hemolymph débhlaoscach ccfDNA agus go neartaíonn sé a stádas mar speiceas feighlithe.
Tugann ár sonraí le fios gur féidir le seicheamhú agus anailís ar blúirí haemolymph de bharr baictéarach ccfDNA faisnéis ríthábhachtach a sholáthar faoi fhlóra baictéarach an óstaigh agus faoi na baictéir atá san éiceachóras muirí mórthimpeall.Tá teicníochtaí seicheamhaithe urchar tar éis seichimh de na baictéir comónta A. atra geolbhaigh a nochtadh a bheadh ​​caillte dá mbainfí úsáid as gnáthmhodhanna aitheantais rRNA 16S, mar gheall go páirteach ar laofacht leabharlainne tagartha.Go deimhin, léirigh ár n-úsáid sonraí LB a bailíodh ó M. platensis sa chiseal diúilicíní céanna ag Kerguelen go raibh comhdhéanamh na siombailí baictéaracha geolbhaigh mar an gcéanna don dá speiceas diúilicíní (Fíor S4, Faisnéis Fhorlíontach).D’fhéadfadh an chosúlacht seo idir dhá dhiúilicíní géiniteacha comhdhéanamh na bpobal baictéarach i dtaiscí fuar, sulfarach agus bolcánacha Kerguelen a léiriú [55, 56, 57, 58].Tá cur síos maith déanta ar leibhéil níos airde de mhiocrorgánaigh a laghdaíonn sulfair nuair a bhíonn diúilicíní á mbaint ó limistéir cois cósta bioturbated [59], amhail cósta Port-au-Frainc.Féidearthacht eile is ea go bhféadfadh tarchur cothrománach difear a dhéanamh ar fhlóra na ndiúilicíní cóimeálta [60, 61].Tá gá le tuilleadh taighde chun an comhghaol idir an timpeallacht mhuirí, dromchla ghrinneall na farraige, agus comhdhéanamh na mbaictéar siombóiseach i ndiúilicíní a chinneadh.Tá na staidéir seo ar siúl faoi láthair.
Tá fad agus tiúchan an ccfDNA haemolymph, a éasca íonú, agus ardchaighdeán chun seicheamhú gunna gráin tapa a cheadú ar chuid de na buntáistí iomadúla a bhaineann le ccfDNA diúilicíní a úsáid chun measúnú a dhéanamh ar bhithéagsúlacht in éiceachórais chósta na mara.Tá an cur chuige seo éifeachtach go háirithe chun tréithriú a dhéanamh ar phobail víreasacha (míróim) in éiceachóras ar leith [62, 63].Murab ionann agus baictéir, archaea, agus eukaryotes, ní bhíonn géinte atá caomhnaithe go fíoligineach ar nós seichimh 16S i géanóim víreasacha.Tugann ár dtorthaí le fios gur féidir bithóipsí leachtacha ó tháscairspeicis cosúil le diúilicíní a úsáid chun líon sách mór de na blúirí víreas ccfDNA a aithint a n-ionfhabhtaíonn óstaigh a mbíonn gnáthchónaí orthu in éiceachórais mhuirí cósta.Áirítear leis seo víris a bhfuil aithne orthu go n-ionfhabhtaíonn siad prótozoa, artrapóid, feithidí, plandaí, agus víris baictéaracha (m.sh., baictéarophages).Fuarthas dáileadh comhchosúil nuair a rinneamar scrúdú ar virome hemolymph ccfDNA na ndiúilicíní gorma (M. platensis) a bailíodh sa chiseal diúilicíní céanna ag Kerguelen (Tábla S2, Faisnéis Fhorlíontach).Go deimhin, is cur chuige nua é seicheamh gunna gráin ccfDNA a ghnóthaíonn móiminteam i staidéar a dhéanamh ar virome daoine nó speiceas eile [21, 37, 64].Tá an cur chuige seo úsáideach go háirithe chun staidéar a dhéanamh ar víris DNA dhá shnáithe, ós rud é nach gcaomhnaítear aon ghéine amháin i measc na víris DNA dúbailte-snáithe go léir, a ionadaíonn don rang is éagsúla agus is leithne de víris i Baltimore [65].Cé go bhfuil an chuid is mó de na víris seo fós neamhrangaithe agus go bhféadfadh víris ó chuid go hiomlán anaithnid den domhan víreasach a bheith san áireamh [66], fuair muid amach go dtagann viróim agus raonta óstach na ndiúilicíní A. atra agus M. platensis idir an dá speiceas.mar an gcéanna (féach figiúr S3, faisnéis bhreise).Ní haon ionadh é seo, mar b’fhéidir go léiríonn sé easpa roghnaíochta maidir le glacadh DNA atá sa chomhshaol.Tá gá le staidéir sa todhchaí a úsáideann RNA íonaithe faoi láthair chun an virome RNA a thréithriú.
Inár staidéar, d’úsáideamar píblíne an-dian oiriúnaithe ó shaothar Kowarski agus comhghleacaithe [37], a d’úsáid scriosadh dhá chéim de léith comhthiomsaithe agus contigs roimh agus tar éis ccfDNA dúchais a thionól, rud a d’eascair cion ard de léitheanna gan léarscáiliú.Mar sin, ní féidir linn a chur as an áireamh go bhféadfadh a mbunús féin a bheith ag cuid de na léitheanna neamhphleanáilte seo go fóill, go príomha toisc nach bhfuil géanóm tagartha againn don speiceas diúilicíní seo.Bhaineamar úsáid as an bpíblíne seo freisin toisc go raibh imní orainn faoi na chimeras idir féinléamh agus neamhléamh féin agus na faid léite a ghineann an Illumina MiSeq PE75.Fáth eile atá le formhór na léamha neamhchomartha ná nach bhfuil anótáil déanta ar chuid mhór de na miocróib mhara, go háirithe i gceantair iargúlta ar nós Kerguelen.D'úsáideamar Illumina MiSeq PE75, ag glacadh leis go raibh faid blúirí ccfDNA cosúil le ccfDNA daonna.Maidir le staidéir sa todhchaí, i bhfianaise ár dtorthaí a léiríonn go bhfuil léamh níos faide ag hemolymph ccfDNA ná daoine agus / nó mamaigh, molaimid úsáid a bhaint as ardán seicheamhaithe atá níos oiriúnaí do blúirí ccfDNA níos faide.Déanfaidh an cleachtas seo é i bhfad níos éasca níos mó tásca a aithint le haghaidh anailíse níos doimhne.Dá bhfaighfí seicheamh iomlán A. atra genome núicléach faoi láthair d'éascófaí go mór idirdhealú ccfDNA ó fhoinsí féin agus neamhfhéinfhoinsí.Ós rud é gur dhírigh ár dtaighde ar an bhféidearthacht coincheap bithóipse leachta a chur i bhfeidhm ar dhiúilicíní, tá súil againn, de réir mar a úsáidtear an coincheap seo i dtaighde amach anseo, go bhforbrófar uirlisí agus píblínte nua chun cumas an mhodha seo a mhéadú chun staidéar a dhéanamh ar éagsúlacht mhiocróbach na ndiúilicíní.éiceachóras muirí.
Mar bhithmharcóir cliniciúil neamh-ionrach, tá leibhéil plasma daonna ardaithe ccfDNA bainteach le galair éagsúla, damáiste fíocháin, agus coinníollacha struis [67,68,69].Baineann an méadú seo le scaoileadh blúirí DNA dá thionscnamh féin tar éis damáiste fíocháin.Thugamar aghaidh ar an tsaincheist seo agus úsáid á baint as géarstrus teasa, inar nochtaíodh diúilicíní go hachomair do theocht 30 °C.Rinneamar an anailís seo ar thrí chineál éagsúla diúilicíní i dtrí thurgnamh neamhspleách.Mar sin féin, níor aimsigh muid aon athrú ar leibhéil ccfDNA tar éis strus teasa géarmhíochaine (féach Fíor S5, faisnéis bhreise).D’fhéadfadh an fhionnachtain seo a mhíniú, go páirteach ar a laghad, ar an bhfíric go bhfuil córas imshruthaithe leath-oscailte ag na diúilicíní agus go carnann siad méideanna móra DNA eachtrach mar gheall ar a ngníomhaíocht ard scagtha.Ar an láimh eile, féadfaidh diúilicíní, cosúil le go leor inveirteabraigh, a bheith níos resistant do dhamáiste fíocháin de bharr strus, rud a chuirfeadh teorainn le scaoileadh ccfDNA ina hemolymph [70, 71].
Go dtí seo, dhírigh anailís DNA ar bhithéagsúlacht in éiceachórais uisceacha go príomha ar mheiteashonraí comhshaoil ​​DNA (eDNA).Mar sin féin, tá an modh seo teoranta de ghnáth in anailís bithéagsúlachta nuair a úsáidtear primers.Téann úsáid seicheamh gunna gráin ar theorainneacha PCR agus ar roghnú claonta tacair primer.Mar sin, ar bhealach, tá ár modh níos gaire don mhodh seicheamhaithe ard-thréchur eDNA Shotgun a úsáideadh le déanaí, atá in ann DNA ilroinnte a sheicheamhú go díreach agus anailís a dhéanamh ar bheagnach gach orgánach [72, 73].Mar sin féin, tá roinnt saincheisteanna bunúsacha ann a dhéanann idirdhealú idir LB agus modhanna caighdeánacha eDNA.Ar ndóigh, is é an príomh-difríocht idir eDNA agus LB ná úsáid óstach scagaire nádúrtha.Tuairiscíodh úsáid speiceas muirí mar spúinsí agus débhlaoscaí (Dresseina spp.) mar scagaire nádúrtha chun staidéar a dhéanamh ar eDNA [74, 75].Mar sin féin, bhain staidéar Dreissena úsáid as bithóipí fíocháin as a baineadh DNA.Ní éilíonn anailís ar ccfDNA ó LB bithóipse fíocháin, trealamh speisialaithe agus uaireanta costasach agus lóistíocht a bhaineann le eDNA nó bithóipse fíocháin.Go deimhin, thuairiscigh muid le déanaí gur féidir ccfDNA ó LB a stóráil agus a anailísiú le tacaíocht FTA gan slabhra fuar a chothabháil, rud atá ina dhúshlán mór do thaighde i gceantair iargúlta [76].Tá eastóscadh ccfDNA ó bhithóipsí leachtacha simplí freisin agus soláthraíonn sé DNA ardchaighdeáin le haghaidh seicheamhú gunna gráin agus anailís PCR.Is buntáiste mór é seo i bhfianaise roinnt de na teorainneacha teicniúla a bhaineann le hanailís eDNA [77].Tá simplíocht agus costas íseal an mhodha samplála oiriúnach go háirithe do chláir monatóireachta fadtéarmacha freisin.Chomh maith lena gcumas scagtha ard, is gné aitheanta eile de dhébhlaoscaí comhdhéanamh ceimiceach mucopolysaccharide a mucus, rud a chuireann ionsú víris chun cinn [78, 79].Fágann sin gur scagaire nádúrtha idéalach iad na débhlaoscaí chun an bhithéagsúlacht a shaintréithe agus chun tionchar an athraithe aeráide in éiceachóras uisceach ar leith.Cé gur féidir breathnú ar blúirí DNA óstach-díorthaithe mar theorainn ar an modh i gcomparáid le eDNA, tá an costas a bhaineann le ccfDNA dúchais den sórt sin i gcomparáid le eDNA intuigthe ag an am céanna don mhéid ollmhór faisnéise atá ar fáil le haghaidh staidéir sláinte.fhritháireamh ósta.Áirítear leis seo láithreacht sraitheanna víreasacha atá comhtháite i genome an óstaigh óstach.Tá sé seo thar a bheith tábhachtach do dhiúilicíní, i bhfianaise láithreacht retroviruses leoicéime a tharchuirtear go cothrománach i ndébhlaí [80, 81].Buntáiste eile a bhaineann le LB thar eDNA ná go mbaineann sé leas as an ngníomhaíocht phagocytic a bhaineann le cealla fola a scaiptear sa hemolymph, a imíonn miocrorgánaigh (agus a gcuid géanóim).Is é phagocytosis príomhfheidhm na gcealla fola i débhlaoscaigh [82].Ar deireadh, baineann an modh leas as cumas ard scagtha na ndiúilicíní (meán 1.5 l/h d’uisce farraige) agus cúrsaíocht dhá lá, rud a mhéadaíonn meascadh sraitheanna éagsúla uisce farraige, rud a fhágann gur féidir eDNA heitreolaíoch a ghabháil.[83, 84].Mar sin, is bealach suimiúil í anailís ccfDNA diúilicíní i bhfianaise na hiarmhairtí cothaitheacha, eacnamaíocha agus comhshaoil ​​a bhíonn ag diúilicíní.Cosúil leis an anailís ar LB a bailíodh ó dhaoine, osclaíonn an modh seo freisin an fhéidearthacht athruithe géiniteacha agus epigenetic i DNA óstaigh a thomhas mar fhreagra ar shubstaintí exogenous.Mar shampla, is féidir le teicneolaíochtaí seicheamhaithe tríú glúin a shamhlú chun anailís mheititheachta ar fud an ghéanóim a dhéanamh i ccfDNA dúchais ag baint úsáide as seicheamhú nana-póir.Ba cheart go n-éascófaí an próiseas seo toisc go bhfuil fad na blúirí ccfDNA diúilicíní ag luí go hidéalach le hardáin seicheamhaithe fad-léite a cheadaíonn anailís mheitibiliúcháin DNA ar fud an ghéanóim ó rith seicheamhaithe amháin gan gá le claochluithe ceimiceacha.85,86] Is féidearthacht suimiúil é seo, toisc go bhfuil sé léirithe go léiríonn patrúin meitile DNA freagra ar strus timpeallachta agus go maireann siad thar go leor giniúna.Dá bhrí sin, is féidir leis léargas luachmhar a thabhairt ar na sásraí bunúsacha a rialaíonn freagairt tar éis nochtadh d’athrú aeráide nó do thruailleáin [87].Mar sin féin, níl úsáid LB gan teorainneacha.Ní gá a rá, éilíonn sé seo go bhfuil táscairí speicis san éiceachóras.Mar a luadh thuas, teastaíonn dianphíblíne bhithfhaisnéisíochta chun LB a úsáid chun bithéagsúlacht éiceachóras ar leith a mheas a chuireann san áireamh láithreacht blúirí DNA ón bhfoinse.Fadhb mhór eile is ea infhaighteacht géanóim tagartha do speicis mhuirí.Táthar ag súil go n-éascóidh tionscnaimh amhail an Tionscadal Géanóim Mamach Mara agus an tionscadal Fish10k a bunaíodh le déanaí [88] anailís den sórt sin sa todhchaí.Tá cur i bhfeidhm an choincheapa LB ar orgánaigh chothaithe mhara ag luí freisin leis an dul chun cinn is déanaí i dteicneolaíocht seicheamhaithe, rud a fhágann go bhfuil sé oiriúnach go maith chun bithmharcóirí il-ohm a fhorbairt chun faisnéis thábhachtach a sholáthar faoi shláinte na ngnáthóg mara mar fhreagra ar strus comhshaoil.
Tá sonraí seicheamhaithe genome i dtaisce i gCartlann Léamh Seicheamh NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 faoi Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Tionchar an athraithe aeráide ar shaol na mara agus ar éiceachórais.Bitheolaíocht Cole.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Déan machnamh ar chomhthionchair an athraithe aeráide agus na nithe a chuireann strus áitiúil eile ar an gcomhshaol muirí.timpeallacht eolaíoch ghinearálta.2021; 755: 142564.
Carela F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Eolaíocht an chéad cheann de Mhárta.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Míníonn lamháltas teasa laghdaithe faoi choinníollacha strus teasa athchleachtach básmhaireacht ard diúilicíní gorma sa samhradh.Tuarascáil eolaíoch 2019;9: 17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Athruithe le déanaí ar mhinicíocht, cúiseanna agus méid básanna ainmhithe.Proc Natl Acad Sci USA.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.D’fhéadfadh go mbeadh mais-mhortlaíocht Pinna nobilis mar thoradh ar phataiginí iomadúla neamhspeicis-shonracha.Saol.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Tionchar féideartha an athraithe aeráide ar ghalair zónóiseacha Artach.Int J Sláinte circumpolar.2005;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Diúilicíní gorma (Mytilus edulis spp.) mar orgánaigh chomharthacha i monatóireacht ar thruailliú cósta: athbhreithniú.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Comhtháthú bithóipse leachtach i gcóireáil ailse.Nat Rev Glan Oncol.2017;14:531-48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Aibiú bithóipse leachta: Ligeann sé seo do DNA meall a chur i gcúrsaíocht.Ailse Nat Rev.2017; 17:223–38.
Mandel P., Metais P. Aigéid núicléasacha i bplasma daonna.Miontuairiscí cruinnithe na bhfochuideachtaí Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Ról nua do DNA saor ó chealla mar mharcóir móilíneach le haghaidh cóireála ailse.Cainníochtú anailíse bithmhóilín.2019; 17: 100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Téann bithóipse leachtach isteach sa chlinic - saincheisteanna cur chun feidhme agus dúshláin amach anseo.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW agus daoine eile.Tá DNA féatais i láthair i bplasma agus serum na máthar.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Staidéar ar chúrsa an toirchis agus a chuid deacrachtaí ag baint úsáide as RNA extracellular a scaiptear san fhuil mná le linn toirchis.Dhópéidiatraice.2020; 8: 605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Bithóipse leachtach: baintear úsáid as DNA deontóra saor ó chealla chun loit allogeneic a bhrath i ngreangán duánach.Nat Rev Nephrol.2021;17:591-603.
Juan FC, Lo YM Nuálaíochtaí i ndiagnóisic réamhbhreithe: seicheamhú géanóim plasma na máthar.Anna MD.2016; 67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Brath tapa pataigin le seicheamh meitegenomic den chéad ghlúin eile de shreabháin choirp ionfhabhtaithe.Leigheas Nat.2021; 27: 115-24.