Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá leagan brabhsálaí in úsáid agat le tacaíocht theoranta CSS. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer). Ina theannta sin, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánaimid an suíomh gan stíleanna ná JavaScript.
Taispeánann sé carúsal de thrí shleamhnán ag an am céanna. Úsáid na cnaipí Roimhe Seo agus Ar Aghaidh chun bogadh trí thrí shleamhnán ag an am céanna, nó úsáid na cnaipí sleamhnáin ag an deireadh chun bogadh trí thrí shleamhnán ag an am céanna.
Ullmhaíodh cáithníní shilice scagach tríd an modh sol-glóthach le roinnt modhnuithe chun cáithníní leathan-phóir a fháil. Rinneadh na cáithníní seo a dhíorthú le N-feinilmailíd-meitilvinile isocianáit (PMI) agus stíréin trí pholaiméiriú aistrithe slabhra droim ar ais (RAFT) chun polaimídí idirmheánacha N-feinilmailíd a tháirgeadh. Céim sheasta stíréine (PMP). Pacáladh colúin cruach dhosmálta caol-tholl (trastomhas istigh 100 × 1.8 mm) le pacáil sloda. Rinneadh feidhmíocht chrómatagrafaíochta an cholúin PMP a mheas chun meascán de pheiptídí sintéiseacha a dheighilt ina raibh cúig pheiptíd (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, aimínaigéad Leu enkephalin) agus hidrealáis tripteach d'albaimin séiream daonna (HAS). Faoi choinníollacha elution optamacha, shroich líon teoiriciúil na plátaí le meascán de pheiptídí 280,000 pláta/méadar cearnach. Agus feidhmíocht deighilte an cholúin fhorbartha á comparáid leis an gcolún tráchtála Ascentis Express RP-Amide, breathnaíodh go raibh éifeachtúlacht deighilte an cholúin PMP níos fearr ná an colún tráchtála i dtéarmaí éifeachtúlachta deighilte agus taifigh.
Tá an tionscal bithchógaisíochta ina mhargadh domhanda atá ag leathnú agus méadú suntasach tagtha ar a sciar den mhargadh le blianta beaga anuas. Le fás pléascach an tionscail bithchógaisíochta1,2,3 tá géarghá le hanailís peiptíde agus próitéine. Chomh maith leis an bpeiptíd sprice, cruthaítear eisíontais éagsúla le linn sintéis peiptíde, mar sin tá gá le híonú crómatagrafaíochta chun an íonacht atá ag teastáil ón bpeiptíd a fháil. Is tasc thar a bheith dúshlánach é anailís agus tréithriú próitéiní i sreabháin choirp, i bhfíocháin agus i gcealla mar gheall ar an líon mór speiceas inbhraite atá i láthair i sampla amháin. Cé gur uirlis éifeachtach í mais-speictriméadracht chun peiptídí agus próitéiní a sheicheamhú, má chuirtear samplaí den sórt sin isteach go díreach sa mais-speictriméadar, ní bheidh an scaradh sásúil. Is féidir an fhadhb seo a réiteach trí chrómatagrafaíocht leachtach (LC) a dhéanamh roimh anailís MS, rud a laghdóidh méid na n-anailítí a théann isteach sa mais-speictriméadar ag am ar leith4,5,6. Ina theannta sin, is féidir le hanailítí díriú i réigiún cúng le linn scaradh céime leachtach, rud a chomhchruinníonn na hanailítí seo agus a mhéadaíonn íogaireacht bhrath MS. Tá dul chun cinn suntasach déanta ar chrómatagrafaíocht leachtach (LC) le deich mbliana anuas agus tá sé ina mhodh a úsáidtear go forleathan le haghaidh anailíse próitéóime7,8,9,10.
Úsáidtear crómatagrafaíocht leachtach céim droim ar ais (RP-LC) go forleathan chun meascáin peiptídí a íonú agus a dheighilt ag baint úsáide as shilice ochtadeicil-mhodhnaithe (ODS) mar an chéim sheasta11,12,13. Mar sin féin, mar gheall ar a struchtúr casta agus a nádúr amfaiteireach,14,15 ní féidir le céimeanna seasta RP deighilt shásúil a sholáthar idir peiptídí agus próitéiní. Dá bhrí sin, éilíonn anailís peiptídí agus próitéiní le blúirí polacha agus neamhpholacha céimeanna seasta atá deartha go speisialta chun idirghníomhú agus na hanailítí seo a choinneáil16. Is féidir le crómatagrafaíocht mheasctha, a thairgeann idirghníomhaíochtaí ilmhódacha, a bheith ina rogha eile seachas RP-LC chun peiptídí, próitéiní agus meascáin chasta eile a dheighilt. Ullmhaíodh roinnt céimeanna seasta de chineál measctha agus úsáideadh colúin líonta leis na céimeanna seasta seo chun peiptídí agus próitéiní a dheighilt17,18,19,20,21. Mar gheall ar láithreacht grúpaí polacha agus neamhpholacha, tá céimeanna seasta mód measctha (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, idirshuíomh polach/RPLC) oiriúnach chun peiptídí agus próitéiní a dheighilt22,23,24,25,26,27,28. , léiríonn céimeanna seasta idirshuíomh polacha le grúpaí polacha atá nasctha go comhfhiúsach cumais dheighilte mhaithe agus roghnaíocht uathúil d'anailítí polacha agus neamhpholacha toisc go mbraitheann an deighilt ar an idirghníomhaíocht idir an anailít agus an chéim sheasta. Idirghníomhaíochtaí ilmhódacha29,30,31,32. Le déanaí, fuair Zhang et al.30 céimeanna seasta polaimíní críochnaithe le behenyl agus dheighil siad hidreacarbóin, frithdhúlagráin, flavonoidí, núicléasídí, estrogens, agus roinnt anailítí eile go rathúil. Tá grúpaí polacha agus neamhpholacha araon san ábhar seasta leabaithe polach, mar sin is féidir é a úsáid chun peiptídí agus próitéiní a dheighilt ina gcodanna hidreafóbach agus hidreafileacha. Tá colúin inlíne pholacha (m.sh., colúin C18 le haimíd inlíne) ar fáil faoin ainm trádála colúin Ascentis Express RP-Amide, ach níor úsáideadh na colúin seo ach le haghaidh anailís aimín 33.
Sa staidéar reatha, ullmhaíodh céim sheasta leabaithe polach (N-feinilmailíd, polaistiréin leabaithe) agus rinneadh meastóireacht uirthi le haghaidh scaradh peiptíde agus scoilteadh HSA tryptach. Baineadh úsáid as an straitéis seo a leanas chun an chéim sheasta a ullmhú. Ullmhaíodh cáithníní shilice scagach de réir na nósanna imeachta a thuairiscítear inár bhfoilseacháin roimhe seo, le roinnt athruithe i scéimeanna ullmhúcháin 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Coigeartaíodh na cóimheasa úiré, poileitiléin glycol (PEG), TMOS agus aigéad aicéiteach uiscí chun cáithníní shilice le méideanna móra póir a fháil. Ar an dara dul síos, sintéisíodh ligand nua feinilmailíd-meitilvinile isocianáite agus úsáideadh a cháithníní shilice díorthaithe chun céimeanna seasta leabaithe polach a ullmhú. Pacáladh an chéim sheasta a fuarthas i gcolún cruach dhosmálta (trastomhas istigh 100 × 1.8 mm) de réir scéime pacála optamaithe. Cuidítear le pacáil an cholúin trí chreathadh meicniúil chun ciseal aonfhoirmeach laistigh den cholún a chinntiú. Rinneadh meastóireacht ar an gcolún pacáilte le haghaidh scaradh meascán peiptídí comhdhéanta de chúig pheiptíd (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peiptíd leucine-einceifilín), agus hidrealáisí tripiteacha albaimin séiream daonna (HSA). Breathnaíodh gur scar an meascán peiptídí agus an díleá tripiteach HSA le réiteach agus éifeachtúlacht mhaith. Rinneadh comparáid idir éifeachtúlacht scaradh an cholúin PMP agus éifeachtúlacht scaradh an cholúin Ascentis Express RP-Amide. Breathnaíodh go raibh réiteach maith agus éifeachtúlacht scaradh ard ag peiptídí agus próitéiní ar an gcolún PMP, agus go bhfuil éifeachtúlacht scaradh an cholúin PMP níos airde ná éifeachtúlacht scaradh an cholúin Ascentis Express RP-Amide.
PEG (gliocól poileitiléine), úiré, aigéad aicéiteach, trímheitocsaortosilicáit (TMOS), trímheitilclórasilán (TMCS), trypsin, albaimin séiream daonna (HSA), clóiríd amóiniam, úiré, heicseaméitilmeataicriloildisilazán (HMDS), clóiríd meataicriloile (MC), stíréin, 4-hiodrocsa-TEMPO, sárocsaíd beinsóile (BPO), aicéatonitrile (ACN) le haghaidh HPLC, meatánól, 2-própanól agus aicéatón. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, SAM).
Corraíodh meascán d'úiré (8 g), poileitiléin glycol (8 g) agus 8 ml d'aigéad aicéiteach 0.01 N ar feadh 10 nóiméad, agus cuireadh 24 ml de TMOS leis faoi fhuarú oighir. Téite an meascán imoibrithe ag 40°C ar feadh 6 uair an chloig agus ansin ag 120°C ar feadh 8 n-uaire an chloig in uathchlabh cruach dhosmálta. Scaith an t-uisce agus triomaíodh an t-iarmhar ag 70°C ar feadh 12 uair an chloig. Meilt na bloic bhoga triomaithe go réidh agus cailcíníodh iad in oigheann ag 550°C ar feadh 12 uair an chloig. Ullmhaíodh trí bhaisc agus tréithríodh iad chun atáirgtheacht mhéideanna na gcáithníní, mhéid na bpoll agus achar dromchla a thástáil.
Grúpa polach agus céim sheasta do shlabhraí polaistiréin. Déantar cur síos ar an nós imeachta ullmhúcháin thíos.
Tuaslagadh N-feinilmailímíd (200 mg) agus meitile vinile isocianáit (100 mg) i dtolúéin neamhhidriúil, agus ansin cuireadh 0.1 ml de 2,2′-asóisobútairínitríle (AIBN) leis an bhfleascán imoibrithe chun cóipliméir de feinilmailímíd agus meitile vinile isocianáit (PMCP) a fháil. ) Téite an meascán ag 60°C ar feadh 3 uair an chloig, scagadh é agus triomaíodh é in oigheann ag 40°C ar feadh 3 uair an chloig.
Scaipeadh cáithníní shilice triomaithe (2 g) i dtolúéin thirim (100 ml), corraíodh agus rinneadh sonicíocht orthu ar feadh 10 nóiméad i bhfleascán bun cruinn 500 ml. Tuaslagadh PMCP (10 mg) i dtolúéin agus cuireadh braon de réir a chéile leis an bhfleascán imoibrithe trí fhunail bhreise. Rinneadh an meascán a athshruthú ag 100°C ar feadh 8 n-uaire an chloig, scagadh é, nite le haicéatón agus triomaíodh é ag 60°C ar feadh 3 uair an chloig. Ansin, tuaslagadh na cáithníní shilice a bhaineann le PMCP (100 g) i dtolúéin (200 ml), agus cuireadh 4-hiodrocsa-TEMPO (2 ml) leis i láthair 100 μl de dhé-úiráit débhúitílstáin mar chatalaíoch. Corraíodh an meascán ag 50°C ar feadh 8 n-uaire an chloig, scagadh agus triomaíodh é ag 50°C ar feadh 3 uair an chloig.
Scaipeadh stíréin (1 ml), sárocsaíd beinsóile BPO (0.5 ml) agus cáithníní shilice ceangailte le TEMPO-PMCP (1.5 g) i dtolúéin agus glanadh iad le nítrigin. Rinneadh polaiméiriú stíréine ag 100°C ar feadh 12 uair an chloig. Níodh an táirge mar thoradh air sin le meatánól agus triomaíodh thar oíche é ag 60°C. Taispeántar scéim ghinearálta an imoibrithe i bhfíor a haon.
Díghásáladh na samplaí ag 393 K ar feadh 1 uair an chloig go dtí gur thángthas ar bhrú iarmharach níos lú ná 10–3 Torr. Baineadh úsáid as an méid N2 a ionsúíodh ag brú coibhneasta P/P0 = 0.99 chun an toirt iomlán póire a chinneadh. Rinneadh scrúdú ar mhórfhoirmiú na gcáithníní shilice íon agus na gcáithníní shilice atá ceangailte le ligand ag baint úsáide as micreascóp scanála leictreon (Hitachi High Technologies, Tóiceo, an tSeapáin). Cuireadh samplaí tirime (shilice íon agus cáithníní shilice atá ceangailte le ligand) ar shlata alúmanaim ag baint úsáide as téip charbóin. Taisceadh ór ar an sampla ag baint úsáide as gléas spútarála Q150T, agus taisceadh ciseal Au 5 nm tiubh ar an sampla. Feabhsaíonn sé seo éifeachtúlacht an phróisis ísealvoltais agus soláthraíonn sé spraeáil fhuar mín. Rinneadh anailís eiliminteach ag baint úsáide as anailíseoir comhdhéanamh eiliminteach Thermo Electron (Waltham, MA, SAM) Flash EA1112. Baineadh úsáid as anailíseoir méid cáithníní Malvern (Worcestershire, an Ríocht Aontaithe) Mastersizer 2000 chun an dáileadh méid cáithníní a fháil. Scaipeadh cáithníní shilice neamhbhrataithe agus cáithníní shilice ceangailte le ligand (5 mg an ceann) i 5 ml d'iseaprópánól, rinneadh iad a shoniciú ar feadh 10 nóiméad, a chorraíl ar feadh 5 nóiméad, agus a chur ar bhinse optúil Mastersizer. Déantar anailís teirmeaghráiméadrach ag ráta 5 °C in aghaidh an nóiméid sa raon teochta ó 30 go 800 °C.
Pacáladh colúin cruach dhosmálta caol-tholláin líneáilte le snáithín gloine agus a raibh toisí (ID 100 × 1.8 mm) acu tríd an modh líonta sloda a lean an nós imeachta céanna agus atá i dtagairt 31. Ceanglaíodh colún cruach dhosmálta (líneáilte le gloine, ID 100 × 1.8 mm) agus asraon ina raibh friot 1 µm le meaisín pacáistithe sloda (Alltech Deerfield, IL, SAM). Ullmhaigh fionraí den chéim sheasta trí 150 mg den chéim sheasta a chur ar fionraí i 1.2 ml de meatánól agus é a bheathú isteach i gcolún taiscumair. Baineadh úsáid as meatánól mar thuaslagóir sloda agus mar thuaslagóir rialaithe. Pacáil an colún trí sheicheamh brú de 100 MP a chur i bhfeidhm ar feadh 10 nóiméad, 80 MP ar feadh 15 nóiméad, agus 60 MP ar feadh 30 nóiméad. Baineadh úsáid as dhá chreathadóir colún crómatagrafaíochta gáis (Alltech, Deerfield, IL, SAM) sa phróiseas pacála le haghaidh creathadh meicniúil chun pacáil aonfhoirmeach an cholúin a chinntiú. Dún an pacálaí sloda agus scaoil an brú go mall chun damáiste don tsreang a chosc. Dícheangaltaíodh an colún ón soic sloda agus ceanglaíodh feistis eile leis an ionraon agus ceanglaíodh é leis an gcóras LC chun a oibriú a thástáil.
Tógadh MLC saincheaptha ag baint úsáide as caidéal LC (10AD Shimadzu, an tSeapáin), samplóir le lúb insteallta 50 nL (Valco (SAM) C14 W.05), díghásálaí membrane (Shimadzu DGU-14A), agus fuinneog ribeach UV-VIS. Gléas braiteora (UV-2075) agus micreacholún cruanta. Bain úsáid as feadáin nasctha an-chúng agus gearr chun éifeacht leathnú breise an cholúin a íoslaghdú. Tar éis an colún a líonadh, suiteáil ribeach (50 µm id 365) ag asraon an acomhail laghdaithe 1/16″ agus suiteáil ribeach (50 µm) den acomhal laghdaithe. Déantar bailiú sonraí agus próiseáil crómatagram ag baint úsáide as bogearraí Multichro 2000. Ag 254 nm, rinneadh monatóireacht ar ionsú UV na n-anailítí ábhair ag 0. Rinneadh anailís ar shonraí crómatagrafaíochta ag baint úsáide as OriginPro8 (Northampton, MA).
Albaimin séiream daonna, púdar lioifile, ≥ 96% (leictreafóiréis glóthach agaróise) 3 mg measctha le trypsin (1.5 mg), 4.0 M úiré (1 ml) agus 0.2 M décharbónáit amóiniam (1 ml). Corraíodh an tuaslagán ar feadh 10 nóiméad agus coinníodh i ndabhach uisce é ag 37°C ar feadh 6 uair an chloig, ansin múchadh é le 1 ml de 0.1% TFA. Scag an tuaslagán agus stóráil faoi bhun 4°C.
Rinneadh meastóireacht ar leithligh ar dheighilt mheascáin peiptídí agus HSA díleáite tryptaí ar cholún PMP. Seiceáil hidrealú tryptaí mheascáin peiptídí agus HSA scartha le colún PMP agus déan comparáid idir na torthaí agus colún Ascentis Express RP-Amide. Ríomhtar líon na plátaí teoiriciúla ag baint úsáide as an gcothromóid seo a leanas:
Taispeántar íomhánna SEM de cháithníní shilice íon agus cáithníní shilice atá ceangailte le ligand i bhFíor 2. Taispeánann íomhánna SEM de cháithníní shilice íon (A, B) cruth sféarúil ina bhfuil na cáithníní sínte nó ina bhfuil siméadracht neamhrialta i gcomparáid lenár staidéir roimhe seo. Tá dromchla na gcáithníní shilice atá ceangailte leis an ligand (C, D) níos míne ná dromchla na gcáithníní shilice íon, rud a d'fhéadfadh a bheith mar gheall ar na slabhraí polaistiréin a chlúdaíonn dromchla na gcáithníní shilice.
Micreagraif leictreon scanála de cháithníní shilice íon (A, B) agus cáithníní shilice atá ceangailte le ligand (C, D).
Taispeántar dáileadh méid na gcáithníní i gcás cáithníní shilice íon agus cáithníní shilice atá ceangailte le ligand i bhFíor 2.3(A). Léirigh cuar dáileadh méid na gcáithníní toirtmhéadracha gur mhéadaigh méid na gcáithníní shilice tar éis modhnú ceimiceach (Fíor 3A). Déantar comparáid idir sonraí dáileadh méid na gcáithníní shilice ón staidéar reatha agus ón staidéar roimhe seo i dTábla 1(A). Ba é 3.36 µm méid na gcáithníní toirtmhéadrach d(0.5) de PMP, i gcomparáid le luach ad(0.5) de 3.05 µm inár staidéar roimhe seo (cáithníní shilice atá ceangailte le polaistiréin)34. Mar gheall ar an athrú i gcóimheas PEG, úiré, TMOS agus aigéad aicéiteach sa mheascán imoibrithe, bhí dáileadh méid na gcáithníní sa bhaisc seo níos cúinge i gcomparáid lenár staidéar roimhe seo. Tá méid na gcáithníní i gcéim PMP beagán níos mó ná méid na gcáithníní shilice atá ceangailte le polaistiréin a ndearnamar staidéar orthu níos luaithe. Ciallaíonn sé seo nár thaisc feidhmiúlacht dromchla cáithníní shilice le stíréin ach sraith polaistiréine (0.97 µm) ar dhromchla an shilice, agus sa chéim PMP ba é 1.38 µm tiús an tsraithe.
Dáileadh méid na gcáithníní (A) agus dáileadh méid na bpoll (B) i gcás cáithníní shilice íon agus cáithníní shilice atá ceangailte le ligand.
Taispeántar méid na bpoll, toirt na bpoll, agus achar dromchla na gcáithníní shilice a úsáideadh sa staidéar seo i dTábla 1 (B). Taispeántar próifílí PSD na gcáithníní shilice íon agus na gcáithníní shilice ceangailte le ligand i bhFíor 3(B). Bhí na torthaí inchomparáide lenár staidéar roimhe seo34. Ba iad 310 Å agus 241 Å méideanna na bpoll de na cáithníní shilice íon agus ceangailte le ligand, faoi seach, rud a léiríonn gur laghdaigh méid na bpoll faoi 69 Å tar éis modhnú ceimiceach, mar a thaispeántar i dTábla 1 (B), agus taispeántar an cuar aistrithe i bhFíor 3. Is é 116 m2/g achar dromchla sonrach na gcáithníní shilice sa staidéar reatha, atá inchomparáide lenár staidéar roimhe seo (124 m2/g). Mar a thaispeántar i dTábla 1(B), laghdaigh achar dromchla (m2/g) na gcáithníní shilice tar éis modhnú ceimiceach ó 116 m2/g go 105 m2/g freisin.
Cuirtear torthaí na hanailíse eilimintí ar an gcéim sheasta i láthair i dTábla 2. Is é 6.35% cion carbóin na céime seasta reatha, atá níos ísle ná mar a bhí inár staidéar roimhe seo (cáithníní shilice a bhaineann le polaistiréin, 7.93%35 agus 10.21%, faoi seach)42. Tá cion carbóin na céime seasta reatha thíos, ós rud é gur úsáideadh roinnt ligand polacha amhail feinilmailíd meitile vinile isocianáit (PCMP) agus 4-hiodrocsa-TEMPO sa bhreis ar stíréin in ullmhú SP. Is é 2.21% céatadán meáchain nítrigine sa chéim sheasta reatha i gcomparáid le 0.1735 agus 0.85% i staidéir roimhe seo42. Ciallaíonn sé seo go bhfuil céatadán meáchain ard nítrigine sa chéim sheasta reatha mar gheall ar an feinilmailíd. Ar an gcaoi chéanna, tá cion carbóin de 2.7% agus 2.9% faoi seach i dtáirgí (4) agus (5), agus tá cion carbóin de 6.35% sa táirge deiridh (6), mar a thaispeántar i dTábla 2. Baineadh úsáid as anailís teirmeagraibhiméadrach (TGA) ar chéim sheasta PMP chun tástáil a dhéanamh ar chailliúint meáchain, agus taispeántar cuar an TGA i bhFíor 4. Taispeánann cuar an TGA caillteanas meáchain de 8.6%, rud atá i gcomhréir mhaith leis an gcion carbóin (6.35%), ós rud é nach bhfuil C amháin sna ligand, ach N, O agus H freisin.
Roghnaíodh an ligand feinilmailímíd-meitilvinile isocianáit chun dromchla na gcáithníní shilice a mhodhnú mar gheall ar a ghrúpaí polacha feinilmailímíd agus vinilisocianáit. Is féidir le grúpaí vinile isocianáit imoibriú tuilleadh le stíréin trí pholaiméiriú radacach beo. Is é an dara cúis ná grúpa a chur isteach a bhfuil idirghníomhaíochtaí measartha aige leis an anailít agus gan aon idirghníomhaíochtaí leictreastatacha láidre idir an anailít agus an chéim sheasta, ós rud é nach bhfuil aon lucht fíorúil ag an gcuid feinilmailímíd ag pH gnáth. Is féidir polaraíocht na céime seasta a rialú tríd an méid is fearr stíréine agus am imoibrithe an pholaiméirithe radacaigh shaor. Tá an chéim dheireanach den imoibriú (polaiméiriú radacach saor) ríthábhachtach toisc go n-athraíonn sé polaraíocht na céime seasta. Rinneadh anailís eiliminteach chun an cion carbóin sna céimeanna seasta seo a sheiceáil. Breathnaíodh go méadaíonn méadú ar an méid stíréine agus an t-am imoibrithe cion carbóin na céime seasta agus a mhalairt. Bíonn ualaí carbóin éagsúla ag SPanna a ullmhaítear le tiúchain éagsúla stíréine. Ar an gcaoi chéanna, cuireadh na céimeanna seasta seo ar cholúin cruach dhosmálta agus rinneadh seiceáil ar a dtréithe crómatagrafaíochta (roghnaíocht, taifeach, luach N, srl.). Bunaithe ar na turgnaimh seo, roghnaíodh comhdhéanamh optamaithe chun céim sheasta PMP a ullmhú chun polaraíocht rialaithe agus coinneáil mhaith an anailíte a sholáthar.
Rinneadh meastóireacht ar an gcolún PMP freisin chun anailís a dhéanamh ar chúig mheascán peiptídí (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-einceifilín) ag baint úsáide as cumas na céime soghluaiste. 60/40 (v/v) ACN/uisce (0.1% TFA) ag ráta sreafa 80 µl/nóim. Faoi choinníollacha eluála optamacha (200,000 pláta/m²), is é 20,000 ± 100 líon na plátaí teoiriciúla (N) in aghaidh an cholúin (100 × 1.8 mm). Taispeántar na luachanna N do na trí cholún PMP i dTábla 3 agus taispeántar na crómatagram i bhFíor 5A. Anailís thapa ag ráta sreafa ard (700 µl/nóim) ar cholún PMP, cúig pheiptíd eisilte laistigh de nóiméad amháin, luach N den scoth de 13,500 ± 330 in aghaidh an cholúin (trastomhas 100 x 1.8 mm), arb ionann é agus 135,000 pláta/m (Fíor 5B). Líonadh trí cholún den mhéid chéanna (trastomhas istigh 100 x 1.8 mm) le trí bhaisc éagsúla de chéim sheasta PMP chun atáirgtheacht a thástáil. Taifeadadh anailísí do gach colún tríd an meascán tástála céanna a dheighilt ar gach colún ag baint úsáide as coinníollacha eisilte is fearr, líon na plátaí teoiriciúla N, agus am coinneála. Taispeántar na sonraí atáirgtheachta do na colúin PMP i dTábla 4. Bhí comhghaol maith idir atáirgtheacht cholún PMP agus luachanna %RSD an-íseal mar a thaispeántar i dTábla 3.
Deighilt meascán peiptíde ar cholún PMP (B) agus colún Ascentis Express RP-Amide (A), céim shoghluaiste 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), toisí cholún PMP (100 x 1.8 mm id), anailís Ord eluála na gcomhdhúl: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) agus 5 (aigéad leúcach einceifilín).
Rinneadh meastóireacht ar cholún PMP (trastomhas istigh 100 x 1.8 mm) chun hidrealáisít thripteach albaimin séiream daonna a dheighilt trí HPLC. Léiríonn an crómatagram i bhFíor 6 go bhfuil na samplaí deighilte go maith le réiteach an-mhaith. Rinneadh anailís ar thuaslagáin HSA ag baint úsáide as ráta sreafa 100 μl/nóim, céim shoghluaiste 70/30 aicéatóinítríl/uisce agus 0.1% TFA. Roinneadh scoilteadh HSA ina 17 buaic, mar a thaispeántar sa chrómatagram (Fíor 6), a fhreagraíonn do 17 peiptíd. Ríomhadh éifeachtúlachtaí deighilte buaiceanna aonair ón hidrealáisít HSA agus taispeántar na luachanna i dTábla 5.
Scaradh hidrealúáití tripteacha HSA ar cholún PMP (trastomhas istigh 100 x 1.8 mm), ráta sreafa (100 μl/nóim), céim shoghluaiste 60/40 aicéatonitrile/uisce, agus 0.1% TFA.
áit a seasann L do fhad an cholúin, η do shlaodacht na céime soghluaiste, ΔP do bhrú cúil an cholúin, agus u do luas líneach na céime soghluaiste. Ba é 2.5 × 10–14 m2 tréscaoilteacht cholún PMP, ba é 25 µl/nóim an ráta sreafa, úsáideadh 60/40 v/v. ACN/uisce. Bhí tréscaoilteacht cholún PMP (ID 100 × 1.8 mm) cosúil le tréscaoilteacht ár staidéir Ref.34 roimhe seo. Is é 1.7 × 10 .6 µm tréscaoilteacht cholúin atá líonta le cáithníní atá scagach go dromchlach, 2.5 × 10-14 m2 do cháithníní 5 µm43. Dá bhrí sin, tá tréscaoilteacht na céime PMP cosúil le tréscaoilteacht cáithníní croí-bhlaosc a bhfuil méid 5 μm acu.
áit a seasann Wx do mhais an cholúin atá líonta le clóraform, seasann Wy do mhais an cholúin atá líonta le meatánól, agus seasann ρ do dhlús an tuaslagóra. Dlús meatánóil (ρ = 0.7866) agus clóraform (ρ = 1.484). Ba é 0.63 agus 0.55, faoi seach, tréscaoilteacht iomlán cholún na gcáithníní shilice-C18 (100 × 1.8 mm ID)34 agus ár gcolún C18-úiré31 a ndearnadh staidéar air roimhe seo. Ciallaíonn sé seo go laghdaíonn láithreacht ligand úiré tréscaoilteacht na céime seasta. Ar an láimh eile, is é 0.60 tréscaoilteacht iomlán cholún PMP (trastomhas istigh 100 × 1.8 mm). Tá colúin PMP níos lú tréscaoilteachta ná colúin atá pacáilte le cáithníní shilice ceangailte le C18 toisc go bhfuil na ligand C18 ceangailte leis na cáithníní shilice i slabhraí líneacha i gcéimeanna seasta de chineál C18, agus i gcéimeanna seasta de chineál polaistiréin cruthaítear polaiméir réasúnta tiubh timpeall na gcáithníní. ciseal A. I dturgnamh tipiciúil, ríomhtar tréscaoilteacht colún mar seo a leanas:
Ar fhigiúr 7A, taispeánann B plotaí Van Deemter do cholún PMP (id 100 x 1.8 mm) agus colún Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 mm) faoi na coinníollacha eluála céanna, 60/40 ACN/H2O agus 0 .1% TFA 20 µl/nóim go 800 µl/nóim ar an dá cholún. Ba iad na luachanna íosta HETP ag an ráta sreafa is fearr (80 µl/nóim) ná 2.6 µm agus 3.9 µm don cholún PMP agus don cholún Ascentis Express RP-Amide, faoi seach. Léiríonn na luachanna HETP go bhfuil éifeachtúlacht scaradh an cholúin PMP (100 x 1.8 mm id) i bhfad níos airde ná éifeachtúlacht scaradh an cholúin Ascentis Express RP-Amide atá ar fáil go tráchtála (100 x 1.8 mm id). Léiríonn graf van Deemter i bhFíor 7(A) nach bhfuil an laghdú ar luach N níos airde go suntasach de réir mar a mhéadaíonn an sreabhadh i gcomparáid lenár staidéar roimhe seo. Tá an éifeachtúlacht scaradh níos airde atá ag an gcolún PMP (id 100 × 1.8 mm) i gcomparáid leis an gcolún Ascentis Express RP-Amide bunaithe ar chruth agus ar mhéid feabhsaithe na gcáithníní agus ar an nós imeachta pacála colúin sofaisticiúil a úsáidtear san obair reatha34.
(A) Plota Van Deemter (HETP vs. luas líneach céime soghluaiste) a fuarthas ar cholún PMP (id 100 x 1.8 mm) i 60/40 ACN/H2O le 0.1% TFA. (B) Plota Van Deemter (HETP vs. luas líneach céime soghluaiste) a fuarthas ar cholún Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 mm) i 60/40 ACN/H2O le 0.1% TFA.
Ullmhaíodh agus rinneadh meastóireacht ar chéim sheasta pholair de pholaistiréin idirshuite le haghaidh scaradh meascán de pheiptídí sintéiseacha agus hidrealáisít thripteach d'albaimin séiream daonna (HSA) i gcrómatagrafaíocht leachtach ardfheidhmíochta. Tá feidhmíocht chrómatagrafaíochta colún PMP do mheascáin pheiptíde den scoth i dtéarmaí éifeachtúlachta agus taifeach scaradh. Tá feabhas ar éifeachtúlacht scaradh colún PMP mar gheall ar roinnt cúiseanna amhail méid na gcáithníní shilice agus méid na bpoll, sintéis rialaithe céimeanna seasta, agus ábhair phacála casta colún. Chomh maith leis an éifeachtúlacht ard scaradh, buntáiste eile a bhaineann leis an gcéim sheasta seo ná an brú íseal ar ais colún ag rátaí sreafa arda. Tá colúin PMP an-in-atáirgthe agus is féidir iad a úsáid chun meascáin de pheiptídí agus díleá thripteach próitéiní éagsúla a anailísiú. Tá sé beartaithe againn an colún seo a úsáid chun comhdhúile bithghníomhacha a scaradh ó tháirgí nádúrtha, sleachta plandaí míochaine agus beacáin i gcrómatagrafaíocht leachtach. Amach anseo, déanfar meastóireacht ar cholúin PMP freisin chun próitéiní agus antashubstaintí monachlónacha a scaradh.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imscrúdú ar chórais scaradh peiptíde crómatagrafaíochta céime droim ar ais cuid I: Forbairt prótacail le haghaidh tréithriú colún. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imscrúdú ar chórais scaradh peiptíde crómatagrafaíochta céime droim ar ais cuid I: Forbairt prótacail le haghaidh tréithriú colún.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., agus Petersson, P. Imscrúdú ar Chórais Deighilte Peiptíde trí Chrómatagrafaíocht Céim Aisiompaithe, Cuid I: Prótacal a Fhorbairt le haghaidh Saintréithe Colún. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imscrúdú ar chórais scaradh peiptíde crómatagrafaíochta céime droim ar ais cuid I: Forbairt prótacail do shaintréithe colún. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imscrúdú ar chórais scaradh peiptíde crómatagrafaíochta céime droim ar ais cuid I: Forbairt prótacail do shaintréithe colún.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., agus Petersson, P. Imscrúdú ar Chórais Deighilte Peiptíde trí Chrómatagrafaíocht Céim Aisiompaithe, Cuid I: Prótacal a Fhorbairt le haghaidh Saintréithe Colún.J.色谱法。 1603, 113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. et al. Modhanna chun peiptídí gníomhacha feabhsaithe a chruthú le haghaidh cóireáil galair thógálacha. Biteicneolaíocht. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peiptídí teiripeacha sintéiseacha: Eolaíocht agus margadh. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peiptídí teiripeacha sintéiseacha: Eolaíocht agus margadh.Vliege P, Lisowski V, Martinez J agus Chreschatyski M. Peiptídí teiripeacha sintéiseacha: eolaíocht agus margadh.Vliege P, Lisowski V, Martinez J agus Khreschatsky M. Peiptídí teiripeacha sintéiseacha: eolaíocht agus margadh. fionnachtain drugaí. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Crómatagrafaíocht leachtach próitéómach ardleibhéil. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Crómatagrafaíocht leachtach próitéómach ardleibhéil.Féach F., Smith RD agus Shen Yu. Crómatagrafaíocht leachtach próitéómach ardleibhéil. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Comhdhéanamh próitéin casta 液相色谱。Féach F., Smith RD agus Shen Yu. Crómatagrafaíocht leachtach próitéómach ardleibhéil.J. Crómatagrafaíocht. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Tá crómatagrafaíocht leachtach ardleibhéil-speictriméadracht maise in ann meitibileamaíocht agus próitéamaíocht leathanbhunaithe a chomhcheangal. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ról UHPLC i bhforbairt chógaisíochta. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ról UHPLC i bhforbairt chógaisíochta.Chesnut, SM agus Salisbury, JJ Ról UHPLC i bhforbairt chógaisíochta.Chesnut, SM agus Salisbury, JJ Ról UHPLC i bhforbairt drugaí. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Gnéithe bunúsacha agus praiticiúla de chrómatagrafaíocht leachtach ardbhrú le haghaidh deighiltí gasta. Wu, N. & Clausen, AM Gnéithe bunúsacha agus praiticiúla de chrómatagrafaíocht leachtach ardbhrú le haghaidh deighiltí gasta.Wu, N. agus Clausen, AM Gnéithe bunúsacha agus praiticiúla de chrómatagrafaíocht leachtach ardbhrú le haghaidh deighilt thapa. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Wu, N. & Clausen, AM Gnéithe bunúsacha agus praiticiúla de chrómatagrafaíocht leachtach ardbhrú le haghaidh deighilt thapa.Wu, N. agus Clausen, AM Gnéithe bunúsacha agus praiticiúla de chrómatagrafaíocht leachtach ardbhrú le haghaidh deighilt thapa.Irisleabhar Eolaíochta Meán Fómhair. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Úsáid crómatagrafaíochta leachta ultra-fheidhmíochta i bhforbairt chógaisíochta. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Úsáid crómatagrafaíochta leachta ultra-fheidhmíochta i bhforbairt chógaisíochta.Ren, SA agus Chelischeff, P. Úsáid crómatagrafaíochta leachta ardfheidhmíochta i bhforbairt chógaisíochta. Dreoilín, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA agus Chelischeff, P. Feidhmiú crómatagrafaíochta leachta ultra-fheidhmíochta i bhforbairt drugaí.J. Crómatagrafaíocht. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrigl macrapóireach monailiteach díorthaithe ó eibleacht ola-in-uisce le céim inmheánach ard chun íonú éifeachtach a dhéanamh ar enterovirus 71. Ceimiceach. tionscadal. Iris 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ról na crómatagrafaíochta leachta i bpróitéómaíocht. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ról na crómatagrafaíochta leachta i bpróitéómaíocht.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. agus Wilkins, JA Ról na crómatagrafaíochta leachta i bpróitéamaíocht. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. agus Wilkins, JA Ról na crómatagrafaíochta leachta i bpróitéamaíocht.J. Crómatagrafaíocht. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Treochtaí nua i ndeighiltí crómatagrafaíochta leachtacha céim-aisiompaithe de pheiptídí agus próitéiní teiripeacha: Teoiric agus feidhmeanna. & Guillarme, D. Treochtaí nua i ndeighiltí crómatagrafaíochta leachtacha céim-aisiompaithe de pheiptídí agus próitéiní teiripeacha: Teoiric agus feidhmeanna. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов agus белков с помощью жидкостной хгомих обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Treochtaí nua i ndeighilt peiptídí teiripeacha agus próitéiní trí chrómatagrafaíocht leachtach céim droim ar ais: teoiric agus feidhmeanna. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势:理论和应用。 & Guillarme, D.agus Guillarmé, D. Treochtaí nua i ndeighilt peiptídí teiripeacha agus próitéiní trí chrómatagrafaíocht leachtach céim droim ar ais: teoiric agus feidhmeanna.J. Pharm. Eolaíocht Bhithleighis. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Deighilt dhéthoiseach peiptídí ag baint úsáide as córas RP-RP-HPLC le pH difriúil sa chéad agus sa dara toise deighilte. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Deighilt dhéthoiseach peiptídí ag baint úsáide as córas RP-RP-HPLC le pH difriúil sa chéad agus sa dara toise deighilte.Gilar M., Olivova P., Dali AE agus Gebler JK Deighilt dhéthoiseach peiptídí ag baint úsáide as an gcóras RP-RP-HPLC le pH difriúil sa chéad agus sa dara toise deighilte.Gilar M., Olivova P., Dali AE agus Gebler JK Deighilt dhéthoiseach peiptídí ag baint úsáide as luachanna pH éagsúla sa chéad agus sa dara toise deighilte ag baint úsáide as an gcóras RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Imscrúdú ar shaintréithe aistrithe maise agus cinéiteacha colún crómatagrafaíochta ardfheidhmíochta atá pacáilte le cáithníní C18 lán-scagach agus dromchlach-scagach atá níos lú ná 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Treochtaí agus dúshláin anailíseacha le déanaí i leithlisiú, sainaithint agus bailíochtú peiptídí bithghníomhacha plandaí. anus. Analóg créatúir. Ceimiceach. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Tírdhreach próitéómach ríocht na beatha. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Iarchóireáil peiptídí teiripeacha trí chrómatagrafaíocht leachtach ullmhúcháin. Molecules (Basel, an Eilvéis) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Crómatagrafaíocht mheasctha agus a feidhmeanna maidir le bithpholaiméirí. Yang, Y. & Geng, X. Crómatagrafaíocht mheasctha agus a feidhmeanna maidir le bithpholaiméirí.Yang, Yu. agus Geng, X. Crómatagrafaíocht mhodh measctha agus a cur i bhfeidhm ar bhithpholaiméirí. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Crómatagrafaíocht mhodh measctha agus a cur i bhfeidhm i mbíopholaiméirí.Yang, Yu. agus Gene, X. Crómatagrafaíocht mhodh measctha agus a cur i bhfeidhm ar bhithpholaiméirí.J. Crómatagrafaíocht. A 1218(49), 8813–8825 (2011).