Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá tacaíocht theoranta do CSS sa leagan brabhsálaí atá in úsáid agat. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, déanfaimid an suíomh a rindreáil gan stíleanna ná JavaScript.
Tá gá le córas iontaofa in vitro ar féidir leis timpeallacht fhiseolaíoch an chroí a atáirgeadh go cruinn le haghaidh tástála drugaí. Mar gheall ar an easpa infhaighteachta ar chórais chultúir fíocháin chroí dhaonna, tá léirmhínithe míchruinne ar éifeachtaí drugaí cairdiacha ann. Anseo, tá samhail chultúir fíocháin chairdiach (CTCM) forbartha againn a spreagann slisní croí go leictrimheicniúil agus a théann faoi shíneadh fiseolaíoch le linn céimeanna sistólacha agus diastólacha thimthriall an chairdiach. Tar éis 12 lá de chultúr, fheabhsaigh an cur chuige seo inmharthanacht na gcodanna croí go páirteach, ach níor chaomhnaigh sé a sláine struchtúrach go hiomlán. Dá bhrí sin, tar éis scagthástáil mhóilíní beaga, fuarthas amach gur choinnigh cur 100 nM tríiodothyronine (T3) agus 1 μM dexamethasone (Dex) lenár meán micreastruchtúr na gcodanna ar feadh 12 lá. I gcomhar le cóireáil T3/Dex, choinnigh an córas CTCM próifílí trascríobhacha, inmharthanacht, gníomhaíocht meitibileach, agus sláine struchtúrach ag an leibhéal céanna le fíochán croí úr ar feadh 12 lá. Ina theannta sin, spreagann síneadh iomarcach fíocháin chairdiach i gcultúr comharthaíocht chairdiach hipirtrófach, rud a sholáthraíonn fianaise ar chumas CTCM aithris a dhéanamh ar dhálaí hipirtrófacha a spreagtar le síneadh cairdiach. Mar fhocal scoir, is féidir le CTCM fiseolaíocht agus paiteafiseolaíocht an chroí i gcultúr a shamhaltú thar thréimhsí fada ama, rud a chuireann scagadh drugaí iontaofa ar chumas.
Sula ndéantar taighde cliniciúil, tá gá le córais iontaofa in vitro ar féidir leo timpeallacht fhiseolaíoch chroí an duine a atáirgeadh go cruinn. Ba cheart do chórais den sórt sin aithris a dhéanamh ar shíneadh meicniúil athraithe, ráta croí, agus airíonna leictrifhiseolaíocha. Úsáidtear samhlacha ainmhithe go coitianta mar ardán scagthástála le haghaidh fiseolaíocht chairdiach agus tá iontaofacht theoranta acu maidir le héifeachtaí drugaí i gcroí an duine a léiriú1,2. Sa deireadh thiar, is samhail í an tSamhail Thurgnamhach Chultúir Fíocháin Chairdiach Ideal (CTCM) atá an-íogair agus sainiúil d'idirghabhálacha teiripeacha agus cógaseolaíochta éagsúla, ag atáirgeadh fiseolaíocht agus paiteafiseolaíocht chroí an duine go cruinn3. Cuireann easpa córais den sórt sin teorainn le fionnachtain cóireálacha nua le haghaidh cliseadh croí4,5 agus tá cardashoithíoch drugaí ar cheann de na príomhchúisí atá ann le himeacht ón margadh6.
Le deich mbliana anuas, tarraingíodh ocht ndruga neamh-cardashoithíoch siar ó úsáid chliniciúil toisc go mbíonn siad ina gcúis le fadú eatramh QT, rud a fhágann arrhythmias ventricular agus bás tobann7. Dá bhrí sin, tá gá méadaitheach le straitéisí scagthástála réamhchliniciúla iontaofa chun éifeachtúlacht agus tocsaineacht cardashoithíoch a mheas. Soláthraíonn úsáid le déanaí cardamiocytes díorthaithe ó chealla gas ilchumhachtacha daonna (hiPS-CM) i scagadh drugaí agus tástáil tocsaineachta réiteach páirteach ar an bhfadhb seo. Mar sin féin, is teorainneacha móra iad nádúr neamhaibí hiPS-CManna agus easpa castachta ilcheallaí fíocháin chairdiach. Léirigh staidéir le déanaí gur féidir an teorannú seo a shárú go páirteach trí hiPS-CM luath a úsáid chun hidrigéil fíocháin chairdiach a fhoirmiú go gairid tar éis thús crapadh spontáineach agus spreagadh leictreach a mhéadú de réir a chéile le himeacht ama. Mar sin féin, níl na hairíonna leictrifhiseolaíocha agus crapadh aibí atá ag miocairdiam an duine fásta ag na micrifíocháin hiPS-CM seo. Ina theannta sin, tá struchtúr níos casta ag fíochán cairdiach an duine, arb é atá ann meascán héagsúil de chineálacha éagsúla cealla, lena n-áirítear cealla inchríneacha, néaróin, agus fibroblasts strómacha, atá idirnasctha le tacair shonracha de phróitéiní maitrís eachtarcheallacha. Is bac mór é an éagsúlacht seo i ndaonraí neamh-chairdiamíicítí11,12,13 i gcroí mamaigh fásta maidir le samhaltú fíocháin chairdiach ag baint úsáide as cineálacha cealla aonair. Leagann na teorainneacha móra seo béim ar thábhacht modhanna a fhorbairt chun fíochán miócairdiach slán a shaothrú faoi choinníollacha fiseolaíocha agus paiteolaíocha.
Tá sé cruthaithe gur samhail ghealladh fúthu de mhiocardiam slán daonna iad codanna tanaí saothraithe (300 µm) den chroí dhaonna. Soláthraíonn an modh seo rochtain ar chóras ilcheallach 3T iomlán cosúil le fíochán croí an duine. Mar sin féin, go dtí 2019, bhí úsáid codanna croí saothraithe teoranta ag an marthanacht ghearr (24 uair an chloig) sa chultúr. Tá sé seo mar gheall ar roinnt fachtóirí lena n-áirítear easpa síneadh fisiceach-meicniúil, an comhéadan aeir-leachta, agus úsáid meán simplí nach dtacaíonn le riachtanais fíochán cairdiach. In 2019, léirigh roinnt grúpaí taighde gur féidir le fachtóirí meicniúla a ionchorprú i gcórais chultúir fíocháin chairdiach saol an chultúir a shíneadh, léiriú cairdiach a fheabhsú, agus paiteolaíocht chairdiach a aithris. Léiríonn dhá staidéar galánta 17 agus 18 go bhfuil éifeacht dhearfach ag luchtú meicniúil aon-aiseach ar fheinotíopa cairdiach le linn cultúir. Mar sin féin, níor úsáid na staidéir seo an luchtú fisiceach-meicniúil tríthoiseach dinimiciúil den timthriall cairdiach, ós rud é gur luchtaíodh codanna croí le fórsaí teanntachta isiméadracha 17 nó le luchtú aicseatónach líneach 18. Mar thoradh ar na modhanna síneadh fíocháin seo, cuireadh cosc ​​ar go leor géinte cairdiacha nó rinneadh ró-léiriú ar ghéinte a bhaineann le freagairtí síneadh neamhghnácha. Is suntasach gur fhorbair Pitoulis et al.19 folctha cultúir slisne croí dinimiciúil le haghaidh atógáil timthriall cairdiach ag baint úsáide as aiseolas trasduchtóir fórsa agus tiomántáin teannais. Cé go gceadaíonn an córas seo samhaltú timthriall cairdiach in vitro níos cruinne, cuireann castacht agus tréchur íseal an mhodha teorainn le cur i bhfeidhm an chórais seo. D'fhorbair ár saotharlann le déanaí córas cultúir simplithe ag baint úsáide as spreagadh leictreach agus meán optamaithe chun inmharthanacht rannóga fíocháin chroí muc agus daonna a choinneáil ar feadh suas le 6 lá20,21.
Sa lámhscríbhinn reatha, déanaimid cur síos ar mhúnla cultúir fíocháin chairdiach (CTCM) ag baint úsáide as codanna de chroí na muice a ionchorpraíonn leideanna humoral chun fiseolaíocht chairdiach tríthoiseach agus distension paiteafiseolaíoch le linn timthriall cairdiach a athrá. Is féidir leis an CTCM seo cruinneas réamh-mheastacháin drugaí réamhchliniciúla a mhéadú go leibhéal nár baineadh amach riamh cheana trí chóras cairdiach meán-tréchur cost-éifeachtach a sholáthar a dhéanann aithris ar fhiseolaíocht/paiteafiseolaíocht chroí mamaigh le haghaidh tástála drugaí réamhchliniciúla.
Tá ról ríthábhachtach ag comharthaí meicniúla hemodinimiciúla i gcothabháil feidhm cardiomyocyte in vitro 22,23,24. Sa lámhscríbhinn reatha, d'fhorbraíomar CTCM (Fíor 1a) ar féidir leis timpeallacht chairdiach an duine fásta a aithris trí spreagadh leictreach agus meicniúil araon a spreagadh ag minicíochtaí fiseolaíocha (1.2 Hz, 72 buille in aghaidh an nóiméid). Chun síneadh iomarcach fíocháin a sheachaint le linn diastól, úsáideadh gléas priontála 3D chun méid an fhíocháin a mhéadú 25% (Fíor 1b). Socraíodh luasghéarú leictreach arna spreagadh ag an gcóras C-PACE chun tús a chur le 100 ms roimh an sistól ag baint úsáide as córas fála sonraí chun an timthriall cairdiach a atáirgeadh go hiomlán. Úsáideann an córas cultúir fíocháin gníomhaitheoir aeroibrithe in-ríomhchláraithe (LB Engineering, an Ghearmáin) chun scannán silicone solúbtha a leathnú go timthriallach chun leathnú na slisní croí sa seomra uachtarach a chur faoi deara. Ceanglaíodh an córas le líne aeir sheachtrach trí thrasduchtóir brú, rud a chuir ar chumas an brú (± 1 mmHg) agus an t-am (± 1 ms) a choigeartú go cruinn (Fíor 1c).
a Ceangail an chuid fíocháin leis an bhfáinne tacaíochta 7 mm, a thaispeántar i ngorm, taobh istigh de sheomra cultúir an fheiste. Tá an seomra cultúir scartha ón seomra aeir le scannán tanaí silicone solúbtha. Cuir gaiscéad idir gach seomra chun sceitheanna a chosc. Tá leictreoidí graifíte i gclúdach an fheiste a sholáthraíonn spreagadh leictreach. b Léiriú scéimeach den fheiste fíocháin mhór, den fáinne treorach agus den fháinne tacaíochta. Cuirtear na codanna fíocháin (donn) ar an bhfeiste rómhór agus an fáinne treorach curtha sa chlais ar imeall seachtrach an fheiste. Ag baint úsáide as an treoir, cuir an fáinne tacaíochta atá brataithe le greamachán aicrileach fíocháin go cúramach thar an gcuid fíocháin chairdiach. c Graf a thaispeánann am an spreagtha leictrigh mar fheidhm de bhrú an tseomra aeir atá rialaithe ag gníomhaitheoir aeroibrithe in-ríomhchláraithe (PPD). Baineadh úsáid as gléas fála sonraí chun spreagadh leictreach a shioncrónú ag baint úsáide as braiteoirí brú. Nuair a shroicheann an brú sa seomra cultúir an tairseach socraithe, seoltar comhartha cuisle chuig an C-PACE-EM chun spreagadh leictreach a spreagadh. d Íomhá de cheithre CTCM curtha ar sheilf goradáin. Tá ceithre fheiste ceangailte le PPD amháin trí chiorcad aeroibrithe, agus cuirtear braiteoirí brú isteach sa chomhla hemostatach chun monatóireacht a dhéanamh ar an mbrú sa chiorcad aeroibrithe. Tá sé chuid fíocháin i ngach gléas.
Le húsáid aon ghníomhaitheoir aeroibrithe amháin, bhíomar in ann 4 fheiste CTCM a rialú, agus gach ceann acu in ann 6 chuid fíocháin a shealbhú (Fíor 1d). I CTCM, déantar an brú aeir sa seomra aeir a thiontú go brú sioncrónach sa seomra sreabhach agus spreagann sé leathnú fiseolaíoch ar an slisne croí (Fíor 2a agus Scannán Forlíontach 1). Léirigh meastóireacht ar shíneadh fíocháin ag 80 mm Hg. Art. síneadh 25% ar chuid fíocháin (Fíor 2b). Taispeánadh go gcomhfhreagraíonn an céatadán síneadh seo do fhad fiseolaíoch sarcomere de 2.2–2.3 µm le haghaidh conraitheacht gnáth-chuid chairdiach17,19,25. Rinneadh measúnú ar ghluaiseacht fíocháin ag baint úsáide as socruithe ceamara saincheaptha (Fíor Forlíontach 1). Chomhfhreagraigh aimplitiúid agus luas ghluaiseacht fíocháin (Fíor 2c, d) don shíneadh le linn an timthrialla chairdiach agus don am le linn siostóil agus diastól (Fíor 2b). D'fhan síneadh agus luas fíocháin chairdiach le linn crapadh agus scíthe tairiseach ar feadh 12 lá i gcultúr (Fíor 2f). Chun tionchar an spreagtha leictrigh ar chonraitheacht le linn cultúir a mheas, d'fhorbraíomar modh chun dífhoirmíocht ghníomhach a chinneadh ag baint úsáide as algartam scáthaithe (Fíor Forlíontach 2a,b) agus bhíomar in ann idirdhealú a dhéanamh idir dífhoirmíochtaí le spreagadh leictreach agus gan spreagadh leictreach. An chuid chéanna den chroí (Fíor 2f). Sa réigiún sochorraithe den ghearradh (R6-9), bhí an voltas le linn spreagtha leictrigh 20% níos airde ná mar a bhí sé in éagmais spreagtha leictrigh, rud a léiríonn ranníocaíocht an spreagtha leictrigh leis an bhfeidhm chonraitheachta.
Deimhníonn rianta ionadaíocha de bhrú an tseomra aeir, brú an tseomra sreabháin, agus tomhais ghluaiseachta fíocháin go n-athraíonn brú an tseomra brú an tseomra sreabháin, rud a fhágann gluaiseacht chomhfhreagrach sa slisne fíocháin. b Rianta ionadaíocha de shíneadh céatadáin (gorm) d'ailt fíocháin a fhreagraíonn don shíneadh céatadáin (oráiste). c Tá gluaiseacht tomhaiste an tseomra cairdiach comhsheasmhach leis an luas gluaiseachta tomhaiste. (d) Conairí ionadaíocha de ghluaiseacht chiorclach (líne ghorm) agus luas (líne poncaithe oráiste) i slisne den chroí. e Cainníochtú am timthrialla (n = 19 slisne in aghaidh an ghrúpa, ó mhuca éagsúla), am crapadh (n = 19 slisne in aghaidh an ghrúpa), am scíthe (n = 19 slisne in aghaidh an ghrúpa, ó mhuca éagsúla), gluaiseacht fíocháin (n = 25 slisne)/grúpa ó mhuca éagsúla), buaicluas sistólach (n = 24(D0), 25(D12) slisne/grúpa ó mhuca éagsúla) agus buaicráta scíthe (n=24(D0), 25(D12) slisne/grúpa ó mhuca éagsúla). Níor léirigh tástáil t dhá-eireaballach an Mhic Léinn aon difríocht shuntasach in aon pharaiméadar. Rianta anailíse brú ionadaíocha de rannóga fíocháin le spreagadh leictreach (dearg) agus gan spreagadh leictreach (gorm), deich limistéar réigiúnacha de rannóga fíocháin ón rannóg chéanna. Taispeánann na painéil bun cainníochtú an difríochta céatadáin i brú i rannóga fíocháin le spreagadh leictreach agus gan spreagadh leictreach i ndeich limistéar ó rannóga éagsúla. (n = 8 slisne/grúpa ó mhuc éagsúla, déantar tástáil-t Mac Léinn dhá-eireaballach; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 slisne/grúpa ó mhuc éagsúla, déantar tástáil-t Mac Léinn dhá-eireaballach; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,000,0,*, **p<0,00,0,0, **p). (n = 8 alt/grúpa ó mhuc éagsúla, tástáil-t dhá-eireaballach an Mhic Léinn; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). n = 8 片/组, 来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001,**p < 0.01，*p <0.05） n = 8 片/组, 来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001,**p < 0.01，*p <0.05） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,00). (n = 8 alt/grúpa, ó mhuc éagsúla, tástáil-t dhá-eireaballach an Mhic Léinn; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Léiríonn barraí earráide an meán ± diall caighdeánach.
Inár gcóras cultúir slisne croí bithmhímeach statach roimhe seo [20, 21], choinníomar inmharthanacht, feidhm agus sláine struchtúrach slisní croí ar feadh 6 lá trí spreagadh leictreach a chur i bhfeidhm agus comhdhéanamh an mheáin a bharrfheabhsú. Mar sin féin, tar éis 10 lá, thit na figiúirí seo go géar. Tagróimid do rannóga a saothraíodh inár gcóras cultúir bithmhímeach statach roimhe seo 20, 21 coinníollacha rialaithe (Ctrl) agus úsáidfimid ár meán a bhí optamaithe roimhe seo mar choinníollacha MC agus cultúr faoi spreagadh meicniúil agus leictreach comhuaineach (CTCM). ar a dtugtar . Ar dtús, chinneamar nach raibh spreagadh meicniúil gan spreagadh leictreach leordhóthanach chun inmharthanacht fíocháin a choinneáil ar feadh 6 lá (Fíor Fhorlíontach 3a,b). Is suimiúil é, le tabhairt isteach spreagadh fise-mheicniúil agus leictreach ag baint úsáide as STCM, gur fhan inmharthanacht rannóga croí 12 lá mar a chéile agus a bhí i rannóga croí úra faoi choinníollacha MS, ach ní faoi choinníollacha Ctrl, mar a thaispeántar le hanailís MTT (Fíor 1). 3a). Tugann sé seo le fios gur féidir le spreagadh meicniúil agus insamhladh an timthrialla cairdiach rannóga fíocháin a choinneáil inmharthana ar feadh dhá oiread níos faide ná mar a tuairiscíodh inár gcóras cultúir statach roimhe seo. Mar sin féin, léirigh measúnú ar shláine struchtúrach na rannóga fíocháin trí lipéadú imdhíoneolaíoch troponin T cairdiach agus connexin 43 go raibh léiriú connexin 43 i bhfad níos airde i bhfíocháin MC ar lá 12 ná i rialuithe ar an lá céanna. Mar sin féin, níor coinníodh léiriú aonfhoirmeach connexin 43 agus foirmiú diosca Z go hiomlán (Fíor 3b). Úsáidimid creat intleachta saorga (AI) chun sláine struchtúrach fíocháin26 a chainníochtú, píblíne foghlama domhain bunaithe ar íomhá bunaithe ar ruaimniú troponin-T agus connexin43 chun sláine struchtúrach agus fluaraiseacht slisní croí a chainníochtú go huathoibríoch i dtéarmaí neart logánaithe. Úsáideann an modh seo Líonra Néarónach Comhbhrúiteach (CNN) agus creat foghlama domhain chun sláine struchtúrach fíocháin chairdiach a chainníochtú go hiontaofa ar bhealach uathoibrithe agus neamhchlaonta, mar a thuairiscítear sa tagairt.26. Léirigh fíochán MC cosúlacht struchtúrach fheabhsaithe go lá 0 i gcomparáid le rannóga rialaithe statach. Ina theannta sin, léirigh ruaimniú tríchróim Masson céatadán i bhfad níos ísle de fhíobróis faoi choinníollacha MS i gcomparáid le coinníollacha rialaithe ar lá 12 den chultúr (Fíor 3c). Cé gur mhéadaigh CTCM inmharthanacht chodanna fíocháin croí ag lá 12 go leibhéal cosúil le leibhéal fíocháin chroí úr, níor fheabhsaigh sé sláine struchtúrach chodanna an chroí go suntasach.
Taispeánann graf barra cainníochtú ar inmharthanacht MTT slisní croí úra (D0) nó cultúir slisní croí ar feadh 12 lá i gcultúr statach (D12 Ctrl) nó i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) slisní/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil ANOVA aonbhealach; ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus **p < 0.01 i gcomparáid le D12 Ctrl). Taispeánann graf barra cainníochtú ar inmharthanacht MTT slisní croí úra (D0) nó cultúir slisní croí ar feadh 12 lá i gcultúr statach (D12 Ctrl) nó i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) slisní/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil ANOVA aonbhealach; ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus **p < 0.01 i gcomparáid le D12 Ctrl).taispeánann an histagram cainníochtú inmharthanachta rannóga croí úra MTT (D0) nó cultúr rannóga croí ar feadh 12 lá i gcultúr statach (rialú D12) nó CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (rialú D12). ) ), 12 (D12 MC) rannóga/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo;####p < 0,0001 по сравнению с D0 agus **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus **p < 0.01 i gcomparáid le D12 (Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n=18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组进塌测试；与D0 相比,####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比,**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n=18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片， 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, 进行单向ANOVA 测试；与D0相比,####p < 0.0001，Ct**C 1, アhistagram a thaispeánann cainníochtú inmharthanachta MTT i rannóga croí úra (D0) nó rannóga croí a saothraíodh ar feadh 12 lá i gcultúr statach (rialú D12) nó CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (rialú D12)), 12 (D12 MC) rannóga/grúpa ó mhuca éagsúla, tástáil ANOVA aontreo;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0, **p < 0.01 i gcomparáid le D12 (Ctrl).b Troponin-T (glas), connexin 43 (dearg) agus DAPI (gorm) i rannóga croí úrnua-aonraithe (D0) nó rannóga croí a saothraíodh faoi dhálaí statach (Ctrl) nó coinníollacha CTCM (MC) ar feadh 12 lá) d'íomhánna ionadaíocha imdhíonfhluaraiseachta (scála bán = 100 µm). Cainníochtú intleachta saorga ar shláine struchtúrach fíochán an chroí (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slisne/grúpa ó mhuc dhifriúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl). Cainníochtú intleachta saorga ar shláine struchtúrach fíochán an chroí (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slisne/grúpa ó mhuc éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), Crl 1 , 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; сравнению с D12 Ctrl). Cainníochtú ar shláine struchtúrach fíochán cairdiach trí intleacht shaorga (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) alt/grúpa ó mhuca éagsúla, tástáil ANOVA aontreo déanta; ####p < 0.0001 vs. le D0 agus ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl).n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slisní/grúpa gach ceann de mhuc dhifriúil, tástáil aontreo ANOVA;###p.0;相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slisne/grúpa gach ceann de mhuca éagsúla, tástáil aontreo ANOVAp <##0.0;与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D 1 ) , 7 (D 1 ) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 Для сравнения, с D12 Ctrl). Intleacht shaorga chun sláine struchtúrach fíochán cairdiach a chainníochtú (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) alt/grúpa de mhuc éagsúla, tástáil ANOVA aontreo; ####p<0.0001 vs .D0 Chun comparáide ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl). c Íomhánna ionadaíocha (ar chlé) agus cainníochtú (ar dheis) do shliseanna croí atá daite le ruaim tríchróim Masson (Scála lom = 500 µm) (n = 10 slisne/grúpa ó mhuc dhifriúil, déantar tástáil ANOVA aontreo; ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus ***p < 0.001 i gcomparáid le D12 Ctrl). c Íomhánna ionadaíocha (ar chlé) agus cainníochtú (ar dheis) do shliseanna croí atá daite le ruaim tríchróim Masson (Scála lom = 500 µm) (n = 10 slisne/grúpa an ceann ó mhuc éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; #### p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus ***p < 0.001 i gcomparáid le D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенныых срезов Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется онстон; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 agus ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Íomhánna ionadaíocha (ar chlé) agus cainníochtú (ar dheis) de chodanna croí atá daite le ruaim tríchróim Masson (scála neamhbhrataithe = 500 µm) (n = 10 gcod/grúpa ó mhuca éagsúla, tástáil ANOVA aontreo déanta; #### p < 0 .0001 i gcomparáid le D0 agus ***p < 0.001 i gcomparáid le D12 Ctrl). c 用Masson三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（覸=尺） 10 个切片/组，每组来自不同的猪, 进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 来自不同的猪, 进行单向ANOVA 测试;相比）. C用 Masson三色染料的心脏切片的代表性（左左）量化（右）裸尺度帰帰度庰裸尺度 = 500 µm）（n = 10 个切片 组每组来自不同 猪，进行 单向单向 # Anova# Anova#An 0.0001D0 相比, ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) agus количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенныыыыыы красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, провоююь однофакторного дисперсионного анализа;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Íomhánna ionadaíocha (ar chlé) agus cainníochtú (ar dheis) de chodanna croí atá daite le ruaim tríchróim Masson (bán = 500 µm) (n = 10 gcod/grúpa, gach ceann ó mhuc dhifriúil, tástáilte trí anailís athraitheas aonbhealach;### # p < 0.0001 i gcomparáid le D0, ***p < 0.001 i gcomparáid le D12 Ctrl).Léiríonn barraí earráide an meán ± diall caighdeánach.
Rinneamar hipitéis gur féidir sláine cardamiocyte a fheabhsú agus forbairt fibróise a laghdú le linn saothrú CTCM trí mhóilíní beaga a chur leis an meán cultúir. Dá bhrí sin, rinneamar scagthástáil ar mhóilíní beaga ag baint úsáide as ár gcultúir rialaithe statach20,21 mar gheall ar an líon beag fachtóirí mearbhaill. Roghnaíodh Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), agus SB431542 (SB) don scagthástáil seo. Baineadh úsáid as na móilíní beaga seo roimhe seo i gcultúir hiPSC-CM chun aibiú cardamiocyte a spreagadh trí fhad an tsaircéime, na T-tiúbaill, agus an luas seoltachta a mhéadú. Ina theannta sin, is eol go gcuireann Dex (glucocorticoid) agus SB araon cosc ​​ar athlasadh29,30. Dá bhrí sin, rinneamar tástáil ar cibé an bhfeabhsódh cuimsiú ceann amháin nó meascán de na móilíní beaga seo sláine struchtúrach na rannóga croí. Le haghaidh scagthástála tosaigh, roghnaíodh dáileog gach comhdhúile bunaithe ar na tiúchain a úsáidtear go coitianta i samhlacha cultúir cille (1 μM Dex27, 100 nM T327, agus 2.5 μM SB31). Tar éis 12 lá de chultúr, bhí sláine struchtúrach cardiomyocyte is fearr agus athmhúnlú snáithíneach íosta mar thoradh ar an meascán de T3 agus Dex (Fíoracha Forlíontacha 4 agus 5). Ina theannta sin, bhí éifeachtaí díobhálacha mar thoradh ar úsáid tiúchan dúbailte nó dúbailte na tiúchana seo de T3 agus Dex i gcomparáid le tiúchain ghnáth (Fíoracha Forlíontacha 6a,b).
Tar éis scagthástála tosaigh, rinneamar comparáid ceann ar cheann ar 4 choinníoll cultúir (Fíor 4a): Ctrl: codanna croí saothraithe inár gcultúr statach a thuairiscíodh roimhe seo ag baint úsáide as ár meán optamaithe; 20.21 TD: T3 agus Ctrl s Cuireadh Dex leis Dé Céadaoin; MC: codanna croí saothraithe i CTCM ag baint úsáide as ár meán optamaithe roimhe seo; agus MT: CTCM le T3 agus Dex curtha leis an meán. Tar éis 12 lá de shaothrú, d'fhan inmharthanacht fíochán MS agus MT mar a chéile agus a bhí i bhfíocháin úra a measúnaíodh trí anailís MTT (Fíor 4b). Is suimiúil an rud é, níor tháinig feabhas suntasach ar inmharthanacht i gcomparáid le coinníollacha Ctrl mar thoradh ar T3 agus Dex a chur le cultúir thras-tobair (TD), rud a léiríonn ról tábhachtach atá ag spreagadh meicniúil i gcothabháil inmharthanachta codanna croí.
Léaráid dearaidh turgnamhach ina léirítear na ceithre choinníoll cultúir a úsáideadh chun éifeachtaí spreagtha meicniúil agus forlíonadh T3/Dex ar mheán ar feadh 12 lá a mheas. b Taispeánann an graf barra cainníochtú inmharthanachta 12 lá tar éis an chultúir sna 4 choinníoll cultúir go léir (Ctrl, TD, MC, agus MT) i gcomparáid le slisní croí úra (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MT), 12 (D12 MC) slisní/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 i gcomparáid le D0 agus **p < 0.01 i gcomparáid le D12 Ctrl). b Taispeánann an graf barra cainníochtú inmharthanachta 12 lá tar éis saothraithe sna 4 choinníoll saothraithe go léir (Ctrl, TD, MC, agus MT) i gcomparáid le slisní croí úra (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MT), 12 (D12 MC) slisní/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 i gcomparáid le D0 agus **p < 0.01 i gcomparáid le D12 ctrl). b Gistограмма показывает количественную оценку жизнеспобности 12 после количественную оценку жизнеспобности 12 dней после куличественную 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC agus MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 118 (D0), 18 (D0), 18 (D0), 18 (D0) D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; с D0 agus **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Taispeánann an graf barra cainníochtú na hinmharthanachta 12 lá tar éis an chultúir sna 4 choinníoll cultúir go léir (rialú, TD, MC, agus MT) i gcomparáid le codanna croí úra (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, agus D12 MT), 12 (D12 MC) codanna/grúpa ó mhuca éagsúla, tástáil ANOVA aontreo; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 agus **p < 0.01 i gcomparáid le D12 Ctrl). b 条形图显示所有4种培养条件（Ctrl,TD,MC和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n= 12D,105) (n=12D,105) TD 和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，ANOVA 测试；####p < 0.0001，#.#0p <0.0001，#00 <0.0001，#00 <0.0001, #. < 0.01与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со семцию со сезадию (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонепа, одностороней,#0; ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram ina bhfuil na 4 choinníoll cultúir (rialú, TD, MC agus MT) i gcomparáid le codanna úra croí (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MT), ó 12 choda/grúpa éagsúla de mhuc (D12 MC), tástáil ANOVA aontreo; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. rialú D12). c Taispeánann graf barra cainníochtú an tsreabh glúcóis 12 lá tar éis an chultúir sna 4 choinníoll cultúir go léir (Ctrl, TD, MC, agus MT) i gcomparáid le slisní croí úra (D0) (n = 6 slisne/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; ###p < 0.001, i gcomparáid le D0 agus ***p < 0.001 i gcomparáid le D12 Ctrl). c Taispeánann graf barra cainníochtú an tsreabh glúcóis 12 lá tar éis an chultúir sna 4 choinníoll cultúir go léir (Ctrl, TD, MC, agus MT) i gcomparáid le slisní croí úra (D0) (n = 6 slisne/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; ###p < 0.001, i gcomparáid le D0 agus ***p < 0.001 i gcomparáid le D12 Ctrl). c gistограма показывает количественную оценку потока глюкозы 12 dней после культививири условиях культивирования (контроль, TD, MC agus MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срет разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; c Taispeánann an histagram cainníochtú an tsreabhadh glúcóis 12 lá tar éis an chultúir faoi na 4 choinníoll cultúir go léir (rialú, TD, MC agus MT) i gcomparáid le codanna úra croí (D0) (n = 6 chuid/grúpa ó mhuca éagsúla, tástáil ANOVA aontreo déanta; ###p < 0.001 i gcomparáid le D0 agus ***p < 0.001 i gcomparáid le D12 Ctrl). c 条形图显示所有4种培养条件（Ctrl,TD,MC和MT）与新鲜心脏切片(D0)相比和天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p <0.001，D*测术术测术术术测同猪单向执行0.001与D12 Ctrl 相比）. C条形图显示所有4种条件（（ctrl、td、mc和mt）新鲜心脏切片切片切片切片切片和培养后后 12 天的通量定量 = 6 片/组, 来自猪, ，,，，, ，, 猪自猪单 ANO.测试；###p < 0.001，与D0 相比, ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульелься 4 условий культивирования (контроль, TD, MC agus MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (nп: 6 сро, по сравнению) разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; (контроль). c Histogram a thaispeánann cainníochtú sreabhadh glúcóis 12 lá tar éis an chultúir do na 4 choinníoll cultúir go léir (rialú, TD, MC, agus MT) i gcomparáid le codanna croí úra (D0) (n = 6 chuid/grúpa, ó mhuca éagsúla, aontaobhach Inar rinneadh tástálacha ANOVA, ###p < 0.001 i gcomparáid le D0, ***p < 0.001 i gcomparáid le D12 (rialú).d Plotaí anailíse brú de fhíocháin úra (gorm), MC lá 12 (glas), agus MT lá 12 (dearg) ag deich bpointe rannóige fíocháin réigiúnacha (n = 4 slisne/grúpa, tástáil ANOVA aontreo; ní raibh aon difríocht shuntasach idir na grúpaí). e Plota bolcáin a thaispeánann géinte a léirítear go difriúil i rannóga croí úra (D0) i gcomparáid le rannóga croí a saothraíodh faoi choinníollacha statach (Ctrl) nó faoi choinníollacha MT (MT) ar feadh 10-12 lá. f Léarscáil teasa de ghéinte sarcomere do rannóga croí a saothraíodh faoi gach ceann de na coinníollacha cultúir. Léiríonn barraí earráide an meán ± diall caighdeánach.
Is sainairíonna de dhí-idirdhealú cardamiocyte an spleáchas meitibileach ar an aistriú ó ocsaídiú aigéid shailleacha go glicealú. Úsáideann cardamiocytes neamhaibí glúcós go príomha le haghaidh táirgeadh ATP agus tá mitochondria hipoplasmacha acu le cúpla cristé5,32. Léirigh anailísí úsáide glúcóis, faoi choinníollacha MC agus MT, go raibh úsáid glúcóis cosúil leis an méid a úsáideadh i bhfíocháin lá 0 (Fíor 4c). Mar sin féin, léirigh samplaí Ctrl méadú suntasach ar úsáid glúcóis i gcomparáid le fíochán úr. Léiríonn sé seo go bhfeabhsaíonn an teaglaim de CTCM agus T3/Dex inmharthanacht fíocháin agus go gcaomhnaíonn sé feinitíopa meitibileach na gcodanna croí saothraithe 12 lá. Ina theannta sin, léirigh anailís brú gur fhan leibhéil brú mar a chéile agus a bhí i bhfíochán croí úr ar feadh 12 lá faoi choinníollacha MT agus MS (Fíor 4d).
Chun tionchar foriomlán CTCM agus T3/Dex ar thírdhreach trascríobh domhanda fíocháin slisne cairdiach a anailísiú, rinneamar RNAseq ar shlisní cairdiacha ó na ceithre choinníoll cultúir éagsúla (Sonraí Forlíontacha 1). Is suimiúil gur léirigh rannóga MT cosúlacht ard trascríobh le fíochán croí úr, agus gan ach 16 géin léirithe go difriúil as 13,642 géin. Mar sin féin, mar a léirigh muid níos luaithe, léirigh slisní Ctrl 1229 géin léirithe go difriúil tar éis 10–12 lá i gcultúr (Fíor 4e). Deimhníodh na sonraí seo le qRT-PCR géinte croí agus fibroblast (Fíor Forlíontach 7a-c). Is suimiúil gur léirigh na rannóga Ctrl síosrialáil géinte cairdiacha agus timthriall cille agus gníomhachtú clár géine athlastacha. Tugann na sonraí seo le fios go laghdaítear dídhifreáil, a tharlaíonn de ghnáth tar éis cultúir fhadtéarmaigh, go hiomlán faoi choinníollacha MT (Fíor Forlíontach 8a,b). Léirigh staidéar cúramach ar ghéinte sarcoméire nach mbíonn na géinte a chódálann an sarcoméir (Fíor 4f) agus an cainéal ian (Fíor Fhorlíontach 9) caomhnaithe ach amháin faoi dhálaí MT, rud a chosnaíonn iad ó chosc faoi dhálaí Ctrl, TD, agus MC. Léiríonn na sonraí seo, le meascán de spreagadh meicniúil agus humoral (T3/Dex), gur féidir leis an trascríptóm slisne croí fanacht cosúil le slisní croí úra tar éis 12 lá i gcultúr.
Tacaítear leis na torthaí trascríobhacha seo leis an bhfíric go gcaomhnaítear sláine struchtúrach cardamiocytes i rannóga croí ar an mbealach is fearr faoi dhálaí MT ar feadh 12 lá, mar a léirítear le connexin 43 slán agus logánta (Fíor 5a). Ina theannta sin, laghdaíodh fibróis i rannóga croí faoi dhálaí MT go suntasach i gcomparáid le Ctrl agus cosúil le rannóga croí úra (Fíor 5b). Léiríonn na sonraí seo go gcaomhnaíonn an meascán de spreagadh meicniúil agus cóireáil T3/Dex struchtúr cairdiach go héifeachtach i rannóga croí i gcultúr.
Íomhánna ionadaíocha imdhíonfhluaraiseachta de troponin-T (glas), connexin 43 (dearg), agus DAPI (gorm) i rannóga croí úr-aonraithe (D0) nó saothraithe ar feadh 12 lá sna ceithre choinníoll saothraithe rannóige croí (barra scála = 100 µm). Cainníochtú intleachta saorga ar shláine struchtúrach fíochán an chroí (n = 7 (D0 agus D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC agus D12 MT) slisne/grúpa ó mhuc éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus *p < 0.05, nó ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl). Cainníochtú intleachta saorga ar shláine struchtúrach fíochán an chroí (n = 7 (D0 agus D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC agus D12 MT) slisne/grúpa ó mhuc éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; #### p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus *p < 0.05, nó ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (D1 = 1 C 1 ), 1 C 1 TD, D12 MC agus D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 0,05 nó ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Cainníochtú ar shláine struchtúrach fíochán croí ag baint úsáide as intleacht shaorga (n = 7 (D0 agus D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC agus D12 MT) alt/grúpa ó mhuca éagsúla, tástáil ANOVA aontreo déanta; #### p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus *p < 0.05 nó ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0和D12 Ctrl）,5（D12 TD,D12 MC和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化, 进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 世D0 和*p < 0.****p <0. 0.0001与D12 Ctrl 相比）.对不同猪的心脏结构完整性（n = 7（d0 和 d12 ctrl）（5（d12 td 、d12 mc 和 ）人工智能量化进行单向单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0****港 测测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0****渔戯 0.0 渔戯 测测测试Íoslódáil bileog eolais D12Ctrl 相比）.Cainníochtú ar shláine struchtúrach fíochán cairdiach ag baint úsáide as intleacht shaorga i muca éagsúla (n = 7 (D0 agus D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC agus D12 MT) alt/grúpa) le tástáil ANOVA aontreo;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 agus *p < 0,05 nó ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus *p < 0.05 nó ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 (Ctrl). b Íomhánna ionadaíocha agus cainníochtú le haghaidh slisní croí atá daite le ruaim tríchróim Masson (Barra scála = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, agus D12 MC), 9 (D12 MT) slisne/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus ***p < 0.001, nó ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl). b Íomhánna ionadaíocha agus cainníochtú le haghaidh slisní croí atá daite le ruaim tríchróim Masson (Barra scála = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, agus D12 MC), 9 (D12 MT) slisne/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil ANOVA aontreo; ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0 agus ***p < 0.001, nó ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl). b reprезентативные изображения agus количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красима (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разныпу от разныпх снеснеы срезов односторонний тест ANOVA; b Íomhánna ionadaíocha agus cainníochtú ar rannóga croí atá daite le ruaim tríchróim Masson (barra scála = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MC), 9 (D12 MT) rannóg/grúpa ó mhuca éagsúla, déanta ANOVA aontreo; ####p < 0.0001 vs. D0 agus ***p < 0.001 nó ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（1D（1（ Ctrl, D12 TD 和D12 MC）,来自不同猪的9个（D12 MT）切片/组,进行单因素方差分#0;0;相比, ***p < 0.001，或****p < 0.0001与D12 Ctrl 相比）. b用 masson三色染料的心脏切片的代表性和量化（比例尺尺尺 = 500 µm（（ 、d12 ctrl、d12 td 和 d12 mc） 来自不同 的 9个 d12 mt切片切片切片切片切片切切切切切切切切切切切切切切片切片 切片切片切片切片切片切片切片切片/组，进行单因素方差分析；#0.##0 <0.相比, *** p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b reprезентативные изображения agus количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом намаланая = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо; сравнению с D0, ***p < 0,001 nó ****p < 0,0001 сравнению с D12 Ctrl). b Íomhánna ionadaíocha agus cainníochtú ar rannóga croí atá daite le tríchróim Masson (barra scála = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD agus D12 MC), 9 rannóg (D12 MT) ó mhuca/grúpa éagsúla, modh ANOVA amháin; ####p < 0.0001 i gcomparáid le D0, ***p < 0.001 nó ****p < 0.0001 i gcomparáid le D12 Ctrl).Léiríonn barraí earráide an meán ± diall caighdeánach.
Ar deireadh, rinneadh measúnú ar chumas CTCM hipirtróf cairdiach a aithris trí shíneadh fíocháin chairdiach a mhéadú. I CTCM, mhéadaigh brú buaic an tseomra aeir ó 80 mmHg go 80 mmHg. Art. (síneadh gnáth) suas go dtí 140 mmHg Art. (Fíor 6a). Freagraíonn sé seo do mhéadú 32% ar shíneadh (Fíor 6b), a léiríodh roimhe seo mar an síneadh céatadáin chomhfhreagrach a bhí ag teastáil do rannóga croí chun fad sarcomere a bhaint amach cosúil leis an méid a fheictear i hipirtróf. D'fhan síneadh agus luas fíochán cairdiach le linn crapadh agus scíthe tairiseach le linn sé lá de chultúr (Fíor 6c). Rinneadh fíochán cairdiach ó dhálaí MT a chur faoi shíneadh gnáth (MT (Gnáth)) nó coinníollacha ró-shínte (MT (OS)) ar feadh sé lá. Cheana féin tar éis ceithre lá i gcultúr, bhí an bithmharcóir hipirtrófach NT-ProBNP ardaithe go suntasach sa mheán faoi dhálaí MT (OS) i gcomparáid le coinníollacha MT (gnáth) (Fíor 7a). Ina theannta sin, tar éis sé lá de shaothrú, mhéadaigh méid na gceall i MT (OS) (Fíor 7b) go suntasach i gcomparáid le codanna de chroí MT (gnáth). Ina theannta sin, mhéadaigh trasghluaiseacht núicléach NFATC4 go suntasach i bhfíocháin ró-shínte (Fíor 7c). Léiríonn na torthaí seo forbairt fhorásach athmhúnlaithe paiteolaíoch tar éis hipear-distension agus tacaíonn siad leis an gcoincheap gur féidir an gléas CTCM a úsáid mar ardán chun comharthaíocht hipirtróife chairdiach de bharr síneadh a staidéar.
Deimhníonn rianta ionadaíocha de bhrú an tseomra aeir, brú an tseomra sreabháin, agus tomhais ghluaiseachta fíocháin go n-athraíonn brú an tseomra brú an tseomra sreabháin, rud a fhágann go ngluaiseann an slisne fíocháin chomhfhreagrach. b Cuar céatadáin síne agus ráta síne ionadaíocha do rannóga fíocháin atá sínte de ghnáth (oráiste) agus róshínte (gorm). c Graf barra a thaispeánann am timthrialla (n = 19 slisne in aghaidh an ghrúpa, ó mhuc éagsúla), am crapadh (n = 18-19 slisne in aghaidh an ghrúpa, ó mhuc éagsúla), am scíthe (n = 19 slisne in aghaidh an ghrúpa, ó mhuc éagsúla)), aimplitiúid ghluaiseacht fíocháin (n = 14 slisne/grúpa, ó mhuc éagsúla), buaicluas sistólach (n = 14 slisne/grúpa, ó mhuc éagsúla) agus buaicráta scíthe (n = 14 (D0), 15 (D6)) rannóga/grúpaí) ó mhuc éagsúla), níor léirigh tástáil t dhá-eireaballach an Mhic Léinn aon difríocht shuntasach in aon pharaiméadar, rud a léiríonn gur fhan na paraiméadair seo tairiseach le linn 6 lá de chultúr le róvoltas. Léiríonn barraí earráide an meán ± diall caighdeánach.
Cainníochtú barraghraf ar thiúchan NT-ProBNP i meáin chultúir ó slisní croí a saothraíodh faoi choinníollacha gnáth-shínte (Norm) nó ró-shínte (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, agus D4 MTOS) slisní/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar ANOVA dhá bhealach; **p < 0.01 i gcomparáid le gnáth-shínte). Cainníochtú barraghraif ar thiúchan NT-ProBNP i meáin chultúir ó slisní croí a saothraíodh faoi choinníollacha gnáth-shínte (Norm) nó ró-shínte (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, agus D4 MTOS) slisní/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar ANOVA dhá bhealach; **p < 0.01 i gcomparáid le gnáth-shínte).Histogram cainníochtúil de thiúchan NT-ProBNP i meán cultúir ó slisní croí a saothraíodh faoi choinníollacha gnáth-shínte MT (norm) nó ró-shínte (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, agus D4).MTOS) slisní /grúpa ó mhuca éagsúla, déantar anailís dhá fhachtóir ar an athraitheas;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 i gcomparáid le síneadh gnáth). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p< 0.01）. a Cainníochtú tiúchan NT-ProBNP i slisní croí saothraithe faoi ghnáthchoinníollacha MT stráice (Norm) nó overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) ó éagsúla猪的切片/组，可以双向方方发发动; **i gcomparáid le gnáthshíneadh, p < 0.01).Histeagram Cainníochtú tiúchan NT-ProBNP i slisní croí a saothraítear faoi choinníollacha síneadh MT gnáth (norm) nó ró-shíneadh (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) agus D4 MTOS) slisní/grúpa ó mhuca éagsúla, anailís athraitheas dhá bhealach;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 i gcomparáid le síneadh gnáth). b Íomhánna ionadaíocha de shlisní croí atá daite le troponin-T agus WGA (ar chlé) agus cainníochtú méid cealla (ar dheis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cealla/grúpa ó 10 slisne éagsúla ó mhuc éagsúla, déantar tástáil t dhá-eireaballach Mac Léinn; ****p < 0.0001 i gcomparáid le síneadh gnáth). b Íomhánna ionadaíocha de shliseanna croí atá daite le troponin-T agus WGA (ar chlé) agus cainníochtú méid cealla (ar dheis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cealla/grúpa ó 10 slisne éagsúla ó mhuc éagsúla, déantar tástáil t Mac Léinn dhá-eireaballach; ****p < 0.0001 i gcomparáid le síneadh gnáth). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и колипрониче размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных спо, хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Íomhánna ionadaíocha de rannóga croí daite le troponin-T agus AZP (ar chlé) agus cainníochtú méid cealla (ar dheis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cealla/grúpa ó 10 rannóg dhifriúla ó mhuca difriúla, rinneadh tástáil t dhá-eireaballach an Mhic Léinn; ****p < 0.0001 i gcomparáid le brú gnáth). b 用肌钙蛋白-T和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表怼（ MTOS）,来自不同猪的10 个不同切片的369 (D6 MTNorm) 细胞/组,两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p< 0.0001）. b Íomhánna ionadaíocha de shliseanna croí daite le calcarein-T agus WGA (ar chlé) agus méid na gceall (ar dheis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 ó 10 slisne éagsúla (D6 MTNorm)) Cealla/Cealla, tástáil t ar bhonn comhdhlúthaithe; i gcomparáid le síneadh gnáth, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и коликема клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) agus 10 rátáil критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Íomhánna ionadaíocha de rannóga croí atá daite le troponin-T agus AZP (ar chlé) agus cainníochtú mhéid na gceall (ar dheis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ó 10 rannóg dhifriúla ó mhuc dhifriúla) Cealla/grúpa, critéar dhá-eireaballach t an Mhic Léinn; ****p < 0.0001 i gcomparáid le gnáthstrain). c Íomhánna ionadaíocha do shliseanna croí MTOS lá 0 agus lá 6 atá imdhíon-lipéadaithe le haghaidh troponin-T agus NFATC4 agus cainníochtú ar aistriú NFATC4 go núicléis CManna (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slisne/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil t dhá-eireaballach Mac Léinn; *p < 0.05). c Íomhánna ionadaíocha do shliseanna croí MTOS lá 0 agus lá 6 atá imdhíon-lipéadaithe le haghaidh troponin-T agus NFATC4 agus cainníochtú ar aistriú NFATC4 go núicléis CManna (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slisne/grúpa ó mhuca éagsúla, déantar tástáil-t Mac Léinn dhá-eireaballach; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 agus 6 le MTS, иммуномеченых для тропонина-Т 4 количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/групрах срезов/групраѷе выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Íomhánna ionadaíocha do rannóga croí ag 0 agus 6 lá MTOS, imdhíonlipéadaithe le haghaidh troponin-T agus NFATC4, agus cainníochtú trasghluaiseacht NFATC4 i núicléas cealla uaimheacha (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slisní/grúpa ó mhuca éagsúla) a rinneadh tástáil t dhá-eireaballach an Mhic Léinn; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 MT = 4 MT切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Íomhánna ionadaíocha de lipéadú imdhíon-lipéadaithe calcanin-T agus NFATC4 第0天和第6天MTOS slisní croí, agus NFATC4 ó núicléas cille CM4 易位至 éagsúla NFATC4 的的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS, 焇) 切时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Repрезентативные изображения срезов сердца MTOS ag 0 agus 6 ag имуномаркировки тропображения срезов сердца MTOS ag 0 agus 6 bliain d' имуномаркировки тропонином-Ти NFATCецения оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатыты Стьюдента; *p < 0,05). c Íomhánna ionadaíocha de shlisní croí MTOS ag lá 0 agus 6 le haghaidh lipéadú imdhíonachta troponin-T agus NFATC4 agus cainníochtú trasghluaiseacht NFATC4 i núicléas CM ó mhuca éagsúla (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slisní/grúpa, critéar t dé-eireaballach an Mhic Léinn; *p < 0.05).Léiríonn barraí earráide meán ± diall caighdeánach.
Éilíonn taighde cardashoithíoch aistriúcháin samhlacha ceallacha a atáirgeann an timpeallacht chairdiach go cruinn. Sa staidéar seo, forbraíodh agus tréithríodh gléas CTCM ar féidir leis rannóga ultrathanaí den chroí a spreagadh. Áirítear leis an gcóras CTCM spreagadh leictrimeicniúil sioncrónaithe go fiseolaíoch agus saibhriú sreabhán T3 agus Dex. Nuair a nochtadh rannóga croí muc do na tosca seo, d'fhan a n-inmharthanacht, a sláine struchtúrach, a ngníomhaíocht meitibileach, agus a léiriú trascríobh mar a chéile agus a bhí i bhfíochán croí úr tar éis 12 lá de chultúr. Ina theannta sin, is féidir le síneadh iomarcach fíocháin chairdiach hipirtróife an chroí a chur faoi deara de bharr hipearshíneadh. Tríd is tríd, tacaíonn na torthaí seo le ról ríthábhachtach na ndálaí cultúir fiseolaíocha maidir le feinitíopa cairdiach gnáth a chothabháil agus soláthraíonn siad ardán le haghaidh scagthástáil drugaí.
Cuireann go leor fachtóirí le timpeallacht is fearr a chruthú le haghaidh feidhmiú agus marthanacht cardamiocytes. Baineann na fachtóirí is soiléire de na fachtóirí seo le (1) idirghníomhaíochtaí idircheallacha, (2) spreagadh leictrimheicniúil, (3) fachtóirí humoral, agus (4) foshraitheanna meitibileacha. Éilíonn idirghníomhaíochtaí fiseolaíocha cill go cill líonraí casta tríthoiseacha de chineálacha cealla iolracha atá tacaithe ag maitrís eachtarcheallach. Tá sé deacair idirghníomhaíochtaí ceallacha casta den sórt sin a atógáil in vitro trí chomhchultúr cineálacha cealla aonair, ach is féidir iad a bhaint amach go héasca ag baint úsáide as nádúr orgánaitipiciúil na rannóga croí.
Tá síneadh meicniúil agus spreagadh leictreach cardamiocytes ríthábhachtach chun feinitíopa cairdiach a chothabháil33,34,35. Cé gur úsáideadh spreagadh meicniúil go forleathan le haghaidh riochtú agus aibiú hiPSC-CM, rinne roinnt staidéar galánta iarracht le déanaí spreagadh meicniúil a dhéanamh ar shlisní croí i gcultúr ag baint úsáide as luchtú aon-aiseach. Léiríonn na staidéir seo go bhfuil éifeacht dhearfach ag luchtú meicniúil aon-aiseach 2D ar feinitíopa an chroí le linn an chultúir. Sna staidéir seo, luchtaíodh codanna den chroí le fórsaí teanntachta isiméadracha17, luchtú aucsotonach líneach18, nó athchruthaíodh an timthriall cairdiach ag baint úsáide as aiseolas trasducer fórsa agus tiomántáin teannas. Mar sin féin, úsáideann na modhanna seo síneadh fíocháin aon-aiseach gan uasmhéadú comhshaoil, rud a fhágann go gcuirtear cosc ​​​​ar go leor géinte cairdiacha nó go ndéantar ró-léiriú ar ghéinte a bhaineann le freagairtí síneadh neamhghnácha. Soláthraíonn an CTCM a thuairiscítear anseo spreagadh leictrimheicniúil 3D a dhéanann aithris ar an timthriall cairdiach nádúrtha i dtéarmaí am timthrialla agus síneadh fiseolaíoch (síneadh 25%, siostóil 40%, diastól 60%, agus 72 buille in aghaidh an nóiméid). Cé nach leor an spreagadh meicniúil tríthoiseach seo leis féin chun sláine fíocháin a choinneáil, tá gá le meascán de spreagadh humoral agus meicniúil ag baint úsáide as T3/Dex chun inmharthanacht, feidhm agus sláine fíocháin a choinneáil go leormhaith.
Tá ról tábhachtach ag tosca humoral i modhnú feinitíopa croí daoine fásta. Leagadh béim air seo i staidéir HiPS-CM inar cuireadh T3 agus Dex le meáin chultúir chun aibiú cille a luathú. Féadfaidh T3 tionchar a imirt ar iompar aimínaigéid, siúcraí agus cailciam trasna seicní cille36. Ina theannta sin, cuireann T3 léiriú MHC-α agus síosrialáil MHC-β chun cinn, rud a chuireann foirmiú miofibrils luascacha chun cinn i gcardaimiocytes aibí i gcomparáid le miofibrils mall-phléascacha i CM féatais. Mar thoradh ar easnamh T3 in othair hypothyroid cailliúint bandaí miofibrillar agus ráta laghdaithe forbartha ton37. Gníomhaíonn Dex ar ghabhdóirí glucocorticoid agus tá sé léirithe go méadaíonn sé conradh miócairdiach i gcroíthe perfused scoite;38 meastar go bhfuil baint ag an bhfeabhsú seo leis an éifeacht ar iontráil tiomáinte ag taiscí cailciam (SOCE)39,40. Ina theannta sin, ceanglaíonn Dex lena ghabhdóirí, rud a chruthaíonn freagairt leathan intracellular a chuireann cosc ​​​​ar fheidhm imdhíonachta agus athlasadh30.
Léiríonn ár dtorthaí gur fheabhsaigh spreagadh meicniúil fisiceach (MS) feidhmíocht fhoriomlán an chultúir i gcomparáid le Ctrl, ach nár éirigh leis inmharthanacht, sláine struchtúrach, agus léiriú cairdiach a choinneáil thar 12 lá i gcultúr. I gcomparáid le Ctrl, fheabhsaigh cur T3 agus Dex le cultúir CTCM (MT) inmharthanacht agus choinnigh sé próifílí trascríobh, sláine struchtúrach, agus gníomhaíocht meitibileach comhchosúla le fíochán croí úr ar feadh 12 lá. Ina theannta sin, trí rialú a dhéanamh ar an méid síneadh fíocháin, cruthaíodh samhail hipirtróife cairdiach spreagtha ag hipear-shíneadh ag baint úsáide as STCM, rud a léiríonn solúbthacht an chórais STCM. Ba chóir a thabhairt faoi deara, cé go mbíonn orgáin shlána i gceist de ghnáth le hathmhúnlú cairdiach agus fibróis a bhfuil a gcealla imshruthaithe in ann na cítocíní cuí a sholáthar chomh maith le fagaicítóis agus fachtóirí athmhúnlaithe eile, is féidir le codanna den chroí aithris a dhéanamh ar an bpróiseas fibrotic mar fhreagairt ar strus agus tráma i miofibroblastaí. Rinneadh meastóireacht air seo roimhe seo sa tsamhail slisne cairdiach seo. Ba chóir a thabhairt faoi deara gur féidir paraiméadair CTCM a mhodhnú trí bhrú/aimplitiúid leictreach agus minicíocht a athrú chun go leor coinníollacha ar nós tachycardia, bradycardia, agus tacaíocht imshruthaithe meicniúil (croí díluchtaithe meicniúil) a insamhladh. Fágann sé seo go bhfuil an córas seo ina chóras a bhfuil tréchur meánach aige le haghaidh tástála drugaí. Réitíonn cumas CTCM hipirtróife chairdiach de bharr ró-iarmhairtí a shamhaltú an bealach chun an córas seo a thástáil le haghaidh teiripe phearsantaithe. Mar fhocal scoir, léiríonn an staidéar seo go bhfuil síneadh meicniúil agus spreagadh humoral ríthábhachtach chun cultúr na rannóga fíocháin chairdiach a chothabháil.
Cé go dtugann na sonraí a chuirtear i láthair anseo le fios gur ardán an-ghealladh é CTCM chun miocairdiam slán a shamhaltú, tá roinnt teorainneacha ag baint leis an modh cultúir seo. Is é príomhtheorainn chultúir CTCM go gcuireann sé strusanna meicniúla dinimiciúla leanúnacha ar na slisní, rud a chuireann cosc ​​ar an gcumas crapadh slisní croí a mhonatóiriú go gníomhach le linn gach timthrialla. Ina theannta sin, mar gheall ar mhéid beag na gcodanna cairdiacha (7 mm), tá an cumas chun feidhm shistólach a mheas lasmuigh de chórais chultúir ag baint úsáide as braiteoirí fórsa traidisiúnta teoranta. Sa lámhscríbhinn reatha, sháraíomar an teorannú seo go páirteach trí voltas optúil a mheas mar tháscaire ar fheidhm chrapadh. Mar sin féin, beidh gá le tuilleadh oibre don teorannú seo agus féadfar aghaidh a thabhairt air sa todhchaí trí mhodhanna a thabhairt isteach chun monatóireacht optúil a dhéanamh ar fheidhm slisní croí i gcultúr, amhail mapáil optúil ag baint úsáide as ruaimeanna íogaire ó thaobh cailciam agus voltais de. Teorainn eile ar CTCM is ea nach ndéanann an tsamhail oibre strus fiseolaíoch (réamhualach agus iarualach) a ionramháil. I CTCM, spreagadh brú i dtreonna difriúla chun síneadh fiseolaíoch 25% a atáirgeadh i ndiastóil (síneadh iomlán) agus siostóil (fad crapadh le linn spreagadh leictreach) i bhfíocháin an-mhór. Ba cheart an teorannú seo a bhaint i ndearaí CTCM amach anseo trí bhrú leordhóthanach a chur ar an bhfíochán cairdiach ó gach taobh agus trí na caidrimh chruinne brú-toirte a tharlaíonn i seomraí an chroí a chur i bhfeidhm.
Tá an t-athmhúnlú de bharr ró-shínte a tuairiscíodh sa lámhscríbhinn seo teoranta do chomharthaí hipirshínte hipirtrófacha a aithris. Dá bhrí sin, is féidir leis an tsamhail seo cabhrú le staidéar a dhéanamh ar chomharthaíocht hipirtrófach de bharr sínte gan gá le fachtóirí humoral nó néaracha (nach bhfuil ann sa chóras seo). Tá gá le tuilleadh staidéar chun iolracht CTCM a mhéadú, mar shampla, comh-chultúr le cealla imdhíonachta, fachtóirí humoral plasma atá ag scaipeadh, agus innervation nuair a fheabhsóidh comh-chultúr le cealla néarónacha na féidearthachtaí maidir le samhaltú galair le CTCM.
Baineadh úsáid as trí mhuc déag sa staidéar seo. Rinneadh na nósanna imeachta ainmhithe go léir de réir threoirlínte institiúideacha agus cheadaigh Coiste Institiúideach um Chúram agus Úsáid Ainmhithe Ollscoil Louisville iad. Cuireadh clampáil ar áirse an aortaigh agus rinneadh an croí a phulsiú le 1 L de chardiopléigia steiriúil (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH suas le 7.4); Caomhnaíodh na croíthe i dtuaslagán cairdipleigeach oighir-fhuar go dtí gur iompraíodh chuig an tsaotharlann iad ar oighear, rud a mhaireann <10 nóiméad de ghnáth. Caomhnaíodh na croíthe i dtuaslagán cairdipleigeach oighir-fhuar go dtí gur iompraíodh chuig an tsaotharlann iad ar oighear, rud a mhaireann <10 nóiméad de ghnáth. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе do транспортировки в лабораторию ag льду, что обызанию1. Stóráladh croíthe i dtuaslagán cairdipleigeach oighir-fhuar go dtí gur iomparadh chuig an tsaotharlann ar oighear iad, rud a thógann <10 nóiméad de ghnáth.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室, 通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室, 通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Coinnigh na croíthe ar oighear le haghaidh cardaplegia go dtí go n-iompraítear iad chuig an tsaotharlann ar oighear, de ghnáth <10 nóiméad.
Forbraíodh an gléas CTCM i mbogearraí deartha ríomhchuidithe (CAD) SolidWorks. Tá na seomraí cultúir, na roinnteoirí agus na seomraí aeir déanta as plaisteach aicrileach soiléir CNC. Tá an fáinne cúltaca 7mm ar trastomhas déanta as poileitiléin ard-dlúis (HDPE) sa lár agus tá clais O-fáinne ann chun freastal ar an O-fáinne silicone a úsáidtear chun na meáin a shéalú faoi. Scarann ​​scannán tanaí shilice an seomra cultúir ón pláta deighilte. Tá an scannán silicone gearrtha le léasar ó bhileog silicone 0.02″ tiubh agus tá cruas 35A aige. Tá na gaiscéid silicone bun agus barr gearrtha le léasar ó bhileog silicone 1/16″ tiubh agus tá cruas 50A acu. Úsáidtear scriúnna cruach dhosmálta 316L agus cnónna sciatháin chun an bloc a dhaingniú agus séala aerdhíonach a chruthú.
Tá bord ciorcad priontáilte (PCB) tiomnaithe deartha le bheith comhtháite leis an gcóras C-PACE-EM. Tá soicéid nascóra meaisín na hEilvéise ar an PCB ceangailte le leictreoidí graifíte le sreanga copair airgeadphlátáilte agus scriúnna cré-umha 0-60 atá scriúdaithe isteach sna leictreoidí. Cuirtear an bord ciorcad priontáilte i gclúdach an phrintéara 3D.
Tá an fheiste CTCM á rialú ag gníomhaitheoir aeroibrithe in-ríomhchláraithe (PPD) a chruthaíonn brú imshruthaithe rialaithe cosúil le timthriall cairdiach. De réir mar a mhéadaíonn an brú taobh istigh den seomra aeir, leathnaíonn an scannán silicone solúbtha suas, ag brú an mheáin faoin suíomh fíocháin. Ansin, sínfear an limistéar fíocháin tríd an sreabhán seo a dhíbirt, ag aithris leathnú fiseolaíoch an chroí le linn diastól. Ag buaic an scíthe, cuireadh spreagadh leictreach i bhfeidhm trí leictreoidí graifíte, rud a laghdaigh an brú sa seomra aeir agus a chuir crapadh ar rannóga fíocháin faoi deara. Taobh istigh den phíopa tá comhla hemostatach le braiteoir brú chun an brú sa chóras aeir a bhrath. Cuirtear an brú a bhraitear ag an braiteoir brú i bhfeidhm ar bhailitheoir sonraí atá ceangailte leis an ríomhaire glúine. Ligeann sé seo monatóireacht leanúnach ar an mbrú taobh istigh den seomra gáis. Nuair a shroicheadh ​​​​an brú uasta sa seomra (caighdeánach 80 mmHg, 140 mmHg OS), ordaíodh don fheiste fála sonraí comhartha a sheoladh chuig an gcóras C-PACE-EM chun comhartha voltais déchéimneach a ghiniúint ar feadh 2 ms, socraithe go 4 V.
Fuarthas rannóga croí agus rinneadh na coinníollacha cultúir i 6 thobar mar seo a leanas: Aistríodh na croíthe bainte ón soitheach aistrithe go tráidire ina raibh cardapléige fuar (4°C). Aonraíodh an ventricle clé le lann steiriúil agus gearradh ina phíosaí 1-2 cm3 é. Ceanglaíodh na bloic fíocháin seo le tacaí fíocháin le greamachán fíocháin agus cuireadh iad i ndabhach fíocháin micritóim chreathach ina raibh tuaslagán Tyrode agus ocsaiginithe go leanúnach (3 g/L 2,3-bútánedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glúcós (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml tuaslagán 1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml tuaslagán 1 M), suas le 1 L ddH2O). Socraíodh an micrítóm creathach chun slisní 300 µm tiubh a ghearradh ag minicíocht 80 Hz, aimplitiúid creathach cothrománach de 2 mm, agus ráta dul chun cinn de 0.03 mm/s. Bhí an folcadán fíocháin timpeallaithe ag oighear chun an tuaslagán a choinneáil fionnuar agus coinníodh an teocht ag 4°C. Aistrigh rannóga fíocháin ón folcadán micrítóm go folcadán goradáin ina raibh tuaslagán Tyrode ocsaiginithe go leanúnach ar oighear go dtí go bhfaighfí dóthain rannóga le haghaidh pláta cultúir amháin. I gcás cultúir tras-tobair, ceanglaíodh rannóga fíocháin le tacaí polaiúireatáin steiriúla 6 mm ar leithead agus cuireadh i 6 ml de mheán optamaithe iad (meán 199, forlíonadh 1x ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcaileach agus 2X antaibheathach-frithfhungach). Cuireadh spreagadh leictreach (10 V, minicíocht 1.2 Hz) i bhfeidhm ar na rannóga fíocháin tríd an C-Pace. I gcás coinníollacha TD, cuireadh T3 agus Dex úr leis ag 100 nM agus 1 μM ag gach athrú meán. Sáithítear an meán le hocsaigin sula ndéantar é a athsholáthar 3 huaire sa lá. Saothraíodh codanna fíocháin i ngoradán ag 37°C agus 5% CO2.
I gcás cultúir CTCM, cuireadh codanna fíocháin ar phrintéir 3D saincheaptha i mias Petri ina raibh tuaslagán Tyrode modhnaithe. Tá an gléas deartha chun méid slisne an chroí a mhéadú faoi 25% de limistéar an fháinne tacaíochta. Déantar é seo ionas nach síneann codanna an chroí tar éis iad a aistriú ó thuaslagán Tyrode go dtí an meán agus le linn diastól. Ag baint úsáide as gliú histoacrileach, socraíodh codanna 300 µm ar tiús ar fháinne tacaíochta 7 mm ar trastomhas. Tar éis na codanna fíocháin a cheangal leis an bhfáinne tacaíochta, gearr na codanna fíocháin bhreise agus cuir na codanna fíocháin ceangailte ar ais i ndabhach tuaslagáin Tyrode ar oighear (4°C) go dtí go mbeidh dóthain codanna ullmhaithe do ghléas amháin. Níor cheart go mbeadh an t-am próiseála iomlán do na gléasanna uile níos mó ná 2 uair an chloig. Tar éis 6 chuid fíocháin a cheangal lena bhfáinní tacaíochta, cuireadh an gléas CTCM le chéile. Tá seomra cultúir an CTCM réamh-líonta le 21 ml de mheán réamh-ocsaiginithe. Aistrigh na codanna fíocháin chuig an seomra cultúir agus bain aon bhoilgeoga aeir go cúramach le pipéad. Ansin, treoraítear an chuid fíocháin isteach sa pholl agus brúitear go réidh ina háit í. Ar deireadh, cuir caipín an leictreoid ar an bhfeiste agus aistrigh an fheiste chuig an gorlann. Ansin, ceangail an CTCM leis an bhfeadán aeir agus leis an gcóras C-PACE-EM. Osclaítear an t-achtúthóir aeir agus osclaítear an comhla aeir an CTCM. Cumraíodh an córas C-PACE-EM chun 4 V a sheachadadh ag 1.2 Hz le linn luasghéarú déchéimeach ar feadh 2 ms. Athraíodh an meán faoi dhó sa lá agus athraíodh na leictreoidí uair amháin sa lá chun carnadh graifíte ar na leictreoidí a sheachaint. Más gá, is féidir codanna fíocháin a bhaint as a dtoibreacha cultúir chun aon bhoilgeoga aeir a d'fhéadfadh a bheith tite fúthu a dhíbirt. I gcás coinníollacha cóireála MT, cuireadh T3/Dex úr leis le gach athrú meán le 100 nM T3 agus 1 μM Dex. Saothraíodh na feistí CTCM i ngorlann ag 37°C agus 5% CO2.
Chun conairí sínte de shlisní croí a fháil, forbraíodh córas ceamara speisialta. Baineadh úsáid as ceamara SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tóiceo, an tSeapáin) le lionsa macra Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Rinneadh an léirshamhlú ag teocht an tseomra tar éis an meán a athsholáthar le meán úr. Tá an ceamara suite ag uillinn 51° agus taifeadtar físeán ag 30 fráma in aghaidh an tsoicind. Ar dtús, baineadh úsáid as bogearraí foinse oscailte (MUSCLEMOTION43) le Image-J chun gluaiseacht na slisní croí a chainníochtú. Cruthaíodh an masc ag baint úsáide as MATLAB (MathWorks, Natick, MA, SAM) chun réigiúin spéise a shainiú do shlisní croí ag bualadh chun torann a sheachaint. Cuirtear maisc de láimh-roinnte i bhfeidhm ar gach íomhá i seicheamh fráma agus ansin cuirtear chuig an mbreiseán MUSCLEMOTION iad. Úsáideann Muscle Motion meán-déine na bpicteilíní i ngach fráma chun a ghluaiseacht a chainníochtú i gcoibhneas leis an bhfráma tagartha. Taifeadadh, scagadh agus úsáideadh sonraí chun am timthrialla a chainníochtú agus síneadh fíocháin a mheas le linn an timthrialla cairdiach. Rinneadh iarphróiseáil ar an bhfíseán taifeadta ag baint úsáide as scagaire digiteach céim nialasach den chéad ord. Chun síneadh fíocháin (buaic go buaic) a chainníochtú, rinneadh anailís buaic go buaic chun idirdhealú a dhéanamh idir buaicphointí agus íosphointí sa chomhartha taifeadta. Ina theannta sin, déantar dí-threochtáil ag baint úsáide as polainéim den 6ú ord chun drift comhartha a dhíchur. Forbraíodh cód cláir i MATLAB chun gluaiseacht dhomhanda fíocháin, am timthrialla, am scíthe, agus am crapadh a chinneadh (Cód Cláir Forlíontach 44).
Chun anailís struis a dhéanamh, ag baint úsáide as na físeáin chéanna a cruthaíodh le haghaidh measúnú síneadh meicniúil, rinneamar rianú ar dtús ar dhá íomhá a léiríonn buaicphointí gluaiseachta (na pointí gluaiseachta is airde (uachtair) agus is ísle (íochtair)) de réir na mbogearraí MUSCLEMOTION. Ansin rinneamar deighilt ar na réigiúin fíocháin agus chuireamar cineál algartam scáthaithe i bhfeidhm ar an bhfíochán deighilte (Fíor Fhorlíontach 2a). Roinneadh an fíochán deighilte ina dheich bhfo-dhromchla ansin, agus ríomhadh an strus ar gach dromchla ag baint úsáide as an gcothromóid seo a leanas: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, áit a seasann Sup agus Sdown do na faid ón gcruth ó scáthanna uachtaracha agus íochtaracha na fabraice, faoi seach (Fíor Fhorlíontach .2b).
Socraíodh codanna croí i 4% paraformaldehyde ar feadh 48 uair an chloig. Díhiodráitíodh fíocháin shocraithe i 10% agus 20% siúcrós ar feadh 1 uair an chloig, ansin i 30% siúcrós thar oíche. Ansin leabaíodh na codanna i gcomhdhúil teocht gearrtha is fearr (comhdhúil OCT) agus reoiteadh de réir a chéile iad i ndabhach isopentáin/oighir thirim. Stóráil bloic leabaithe OCT ag -80 °C go dtí go scaradh iad. Ullmhaíodh na sleamhnáin mar chodanna le tiús 8 μm.
Chun OCT a bhaint as codanna croí, téigh na sleamhnáin ar bhloc téimh ag 95 °C ar feadh 5 nóiméad. Cuir 1 ml PBS le gach sleamhnán agus goradáin ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra, ansin tréscaoil na codanna trí 0.1% Triton-X a chur i PBS ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra. Chun cosc ​​a chur ar antashubstaintí neamhshonracha ceangal leis an sampla, cuir 1 ml de thuaslagán 3% BSA leis na sleamhnáin agus goradáin ar feadh 1 uair an chloig ag teocht an tseomra. Baineadh an BSA ansin agus niteadh na sleamhnáin le PBS. Marcáil gach sampla le peann luaidhe. Cuireadh antasubstaintí príomhúla (caolaithe 1:200 in 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) agus troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) leis thar 90 nóiméad, ansin antasubstaintí tánaisteacha (caolaithe 1:200 in 1% BSA) i gcoinne Alexa Fluor 488 luiche (Thermo Scientific; #A16079), i gcoinne Alexa Fluor 594 coinín (Thermo Scientific; #T6391) ar feadh 90 nóiméad breise. Níodh 3 huaire le PBS iad. Chun idirdhealú a dhéanamh idir an ruaimniú sprice agus an cúlra, níor úsáideadh ach an t-antasubstaint tánaisteach mar rialú. Ar deireadh, cuireadh ruaim núicléach DAPI leis agus cuireadh na sleamhnáin i vectashield (Vector Laboratories) agus séalaíodh iad le snas ingne. (formhéadú -x) agus micreascóp Keyence le formhéadú 40x.
Baineadh úsáid as WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ag 5 μg/ml i PBS le haghaidh ruaimniú WGA agus cuireadh i bhfeidhm é ar rannóga socraithe ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra. Ansin nigh na sleamhnáin le PBS agus cuireadh dubh Sudan le gach sleamhnán agus goradh é ar feadh 30 nóiméad. Ansin nigh na sleamhnáin le PBS agus cuireadh meán leabaithe vectashield leis. Rinneadh na sleamhnáin a shamhlú ar mhicreascóp Keyence ag formhéadú 40x.
Baineadh OCT as na samplaí mar a thuairiscítear thuas. Tar éis an OCT a bhaint, tumadh na sleamhnáin i dtuaslagán Bouin thar oíche. Sruthlaíodh na sleamhnáin ansin le huisce driogtha ar feadh 1 uair an chloig agus cuireadh iad i dtuaslagán aigéad aló fuchsin Bibrich ar feadh 10 nóiméad. Ansin nigheadh ​​na sleamhnáin le huisce driogtha agus cuireadh iad i dtuaslagán de 5% fosfamolaibdéineam/5% aigéad fosfatungstach ar feadh 10 nóiméad. Gan sruthlú, aistrigh na sleamhnáin go díreach isteach sa tuaslagán gorm aniline ar feadh 15 nóiméad. Ansin nigheadh ​​na sleamhnáin le huisce driogtha agus cuireadh iad i dtuaslagán aigéad aicéiteach 1% ar feadh 2 nóiméad. Triomaíodh na sleamhnáin in eatánól 200 N agus aistríodh iad chuig xiléin. Rinneadh na sleamhnáin dhaite a shamhlú ag baint úsáide as micreascóp Keyence le cuspóir 10x. Rinneadh céatadán achar na fibróise a chainníochtú ag baint úsáide as bogearraí Keyence Analyzer.
Measúnacht Inmharthanachta Cealla MTT CyQUANT™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), uimhir chatalóige V13154, de réir phrótacal an mhonaróra le roinnt modhnuithe. Go háirithe, úsáideadh punch máinliachta le trastomhas 6 mm chun méid aonfhoirmeach fíocháin a chinntiú le linn anailíse MTT. Plátáladh fíocháin ina n-aonar i dtobair pláta 12 thobar ina raibh foshraith MTT de réir phrótacal an mhonaróra. Gortar na codanna ag 37°C ar feadh 3 uair an chloig agus meitibileann an fíochán beo an foshraith MTT chun comhdhúil formazan corcra a fhoirmiú. Cuir 1 ml DMSO in ionad an tuaslagáin MTT agus gortar ag 37°C ar feadh 15 nóiméad chun formazan corcra a bhaint as codanna croí. Caolaíodh samplaí 1:10 i DMSO i plátaí bun soiléire 96 thobar agus tomhaiseadh déine datha corcra ag 570 nm ag baint úsáide as léitheoir pláta Cytation (BioTek). Rinneadh na léamha a normalú go meáchan gach slisne den chroí.
Cuireadh meáin ina raibh 1 μCi/ml [5-3H]-glúcós (Moravek Biochemicals, Brea, CA, SAM) in ionad na meán slisne croí le haghaidh measúnacht úsáide glúcóis mar a thuairiscíodh roimhe seo. Tar éis 4 uair an chloig goradáin, cuir 100 µl de mheán le feadán micrea-lártheifneoir oscailte ina raibh 100 µl de 0.2 N HCl. Ansin cuireadh an feadán i bhfeadán scintillithe ina raibh 500 μl de dH2O chun [3H]2O a ghalú ar feadh 72 uair an chloig ag 37°C. Ansin bain an feadán micrea-lártheifneoir as an bhfeadán scintillithe agus cuir 10 ml de shreabhán scintillithe leis. Rinneadh comhaireamh scintillithe ag baint úsáide as anailíseoir scintillithe leachtach Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, SAM). Ansin ríomhadh úsáid glúcóis agus gníomhaíocht shonrach glúcóis [5-3H]-, cothromaíocht agus cúlra neamhiomlán, caolú [5-3H]-go glúcós neamhlipéadaithe, agus éifeachtúlacht an chuntair scintilithe á cur san áireamh. Déantar na sonraí a normalú go mais na gcodanna den chroí.
Tar éis homaiginiú fíocháin i Trizol, leithlisíodh RNA ó chodanna croí ag baint úsáide as an Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 de réir phrótacal an mhonaróra. Rinneadh ullmhú leabharlainne RNAsec, seicheamhú agus anailís sonraí mar seo a leanas:
Úsáideadh 1 μg de RNA in aghaidh an tsampla mar ábhar tosaigh chun an leabharlann RNA a ullmhú. Gineadh leabharlanna seicheamhaithe ag baint úsáide as an Trealamh Ullmhúcháin Leabharlann RNA NEBNext UltraTM do Illumina (NEB, SAM) de réir mholtaí an mhonaróra, agus cuireadh cóid innéacs leis na seichimh tréithe do gach sampla. Go hachomair, íonaíodh mRNA ó RNA iomlán ag baint úsáide as coirníní maighnéadacha ceangailte le holaiginiúicléatídí pola-T. Déantar an scoilteadh ag baint úsáide as caitiain défhiúsacha ag teocht ard i Maolán Imoibrithe Sintéise Céad Snáithe NEBNext (5X). Sintéisíodh cDNA an chéad snáithe ag baint úsáide as tosaitheoirí heicsiméir randamacha agus trascríptáis droim ar ais M-MuLV (RNase H-). Ansin sintéisítear an dara snáithe cDNA ag baint úsáide as polaiméaráis DNA I agus RNase H. Déantar na forchraonta atá fágtha a thiontú go foircinn mhaol trí ghníomhaíocht eiséiniúicléáis/polaiméaráise. Tar éis adenylation foirceann 3′ an blúire DNA, ceangailtear Oiriúntóir NEBNext le struchtúr lúb bioráin leis chun é a ullmhú le haghaidh hibridithe. Chun blúirí cDNA den fhad is fearr 150-200 bp a roghnú. Glanadh blúirí leabharlainne ag baint úsáide as an gcóras AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, SAM). Ansin, úsáideadh 3 μl de Einsím USER (NEB, SAM) le cDNA roghnaithe de réir méide ceangailte le hoiriúnóir ar feadh 15 nóiméad ag 37°C agus ansin ar feadh 5 nóiméad ag 95°C roimh PCR. Rinneadh PCR ansin ag baint úsáide as polaiméaráis DNA Phusion High-Fidelity, tosaitheoirí PCR uilíocha, agus tosaitheoirí Innéacs (X). Ar deireadh, glanadh táirgí PCR (córas AMPure XP) agus rinneadh measúnú ar cháilíocht na leabharlainne ar chóras Agilent Bioanalyzer 2100. Ansin rinneadh seicheamhú ar an leabharlann cDNA ag baint úsáide as seicheamhóir Novaseq. Tiontaíodh comhaid íomhá amha ó Illumina go léamha amha ag baint úsáide as CASAVA Base Calling. Stóráiltear sonraí amha i gcomhaid formáid FASTQ(fq) ina bhfuil seichimh léite agus cáilíochtaí bonn comhfhreagracha. Roghnaigh HISAT2 chun léamha seicheamhaithe scagtha a mheaitseáil leis an ngéanóm tagartha Sscrofa11.1. Go ginearálta, tacaíonn HISAT2 le géanóim d'aon mhéid, lena n-áirítear géanóim atá níos mó ná 4 bhilliún bonn, agus socraítear luachanna réamhshocraithe don chuid is mó de na paraiméadair. Is féidir léamha splaisithe ó shonraí RNA Seq a ailíniú go héifeachtúil ag baint úsáide as HISAT2, an córas is tapúla atá ar fáil faoi láthair, leis an gcruinneas céanna nó níos fearr ná aon mhodh eile.
Léiríonn líonmhaireacht na dtrascríbhinní leibhéal an léirithe géine go díreach. Déantar leibhéil léirithe géine a mheasúnú de réir líonmhaireacht na dtrascríbhinní (líon seicheamhaithe) a bhaineann leis an ngéanóm nó leis na heacsóin. Tá líon na léamha comhréireach le leibhéil léirithe géine, fad an ghéin, agus doimhneacht an seicheamhaithe. Ríomhadh FPKM (blúirí in aghaidh an mhíle péirí bonn de thrascríbhinn seicheamhaithe in aghaidh an mhilliún péirí bonn) agus cinneadh luachanna P an léirithe difreálaigh ag baint úsáide as an bpacáiste DESeq2. Ansin ríomhamar an ráta fionnachtana bréagach (FDR) do gach luach P ag baint úsáide as modh Benjamini-Hochberg9 bunaithe ar an bhfeidhm R ionsuite “p.adjust”.
Rinneadh RNA a leithlisíodh ó rannóga croí a thiontú go cDNA ag tiúchan 200 ng/μl ag baint úsáide as meascán SuperScript IV Vilo Master ó Thermo (Thermo, uimh. cat. 11756050). Rinneadh RT-PCR cainníochtúil ag baint úsáide as pláta imoibrithe trédhearcach 384-tobar Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, uimh. cat. 4483319) agus greamachán optúil microamp (Thermo, uimh. cat. 4311971). Bhí an meascán imoibrithe comhdhéanta de 5 µl de mheascán Taqman Fast Advanced Master (Thermo, uimh. cat. 4444557), 0.5 µl Taqman Primer agus 3.5 µl H2O measctha in aghaidh an tobair. Ritheadh ​​timthriallta caighdeánacha qPCR agus tomhaiseadh luachanna CT ag baint úsáide as ionstraim PCR fíor-ama Quantstudio 5 Applied Biosystems (modúl 384-tobar; uimhir táirge A28135). Ceannaíodh tosaitheoirí Taqman ó Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Rinneadh luachanna CT na samplaí uile a normalú go dtí an ghéin tí GAPDH.
Rinneadh measúnú ar scaoileadh meán NT-ProBNP ag baint úsáide as an trealamh NT-ProBNP (muc) (Uimh. Cat. MBS2086979, MyBioSource) de réir phrótacal an mhonaróra. Go hachomair, cuireadh 250 µl de gach sampla agus caighdeán i ndúblach le gach tobar. Díreach tar éis an sampla a chur leis, cuir 50 µl d'Imoibrí Measúnachta A le gach tobar. Croith an pláta go réidh agus séalaigh le séalántán é. Ansin goradh na táibléid ag 37°C ar feadh 1 uair an chloig. Ansin asúigh an tuaslagán agus nigh na toibreacha 4 huaire le 350 µl de thuaslagán níocháin 1X, ag goradh an tuaslagáin níocháin ar feadh 1-2 nóiméad gach uair. Ansin cuir 100 µl d'Imoibrí Measúnachta B in aghaidh an tobair agus séalaigh le séalántán pláta. Croitheadh ​​an táibléad go réidh agus goradh é ag 37°C ar feadh 30 nóiméad. Asúigh an tuaslagán agus nigh na toibreacha 5 huaire le 350 µl de thuaslagán níocháin 1X. Cuir 90 µl de thuaslagán foshraithe le gach tobar agus séalaigh an pláta. Gor an pláta ag 37°C ar feadh 10-20 nóiméad. Cuir 50 µl de Thuaslagán Stop le gach tobar. Tomhaiseadh an pláta láithreach ag baint úsáide as léitheoir pláta Cytation (BioTek) socraithe ag 450 nm.
Rinneadh anailísí cumhachta chun na méideanna grúpa a roghnú a sholáthróidh cumhacht >80% chun athrú absalóideach 10% sa pharaiméadar a bhrath le ráta earráide Cineál I 5%. Rinneadh anailísí cumhachta chun na méideanna grúpa a roghnú a sholáthróidh cumhacht >80% chun athrú absalóideach 10% sa pharaiméadar a bhrath le ráta earráide Cineál I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обинару1 абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Rinneadh anailís chumhachta chun méideanna grúpaí a roghnú a sholáthródh cumhacht >80% chun athrú absalóideach paraiméadair 10% a bhrath le ráta earráide Cineál I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для ноля для для мощности абсолютного изменения параметров agus 5% частоты ошибок типа I. Rinneadh anailís chumhachta chun méid grúpa a roghnú a sholáthródh cumhacht >80% chun athrú absalóideach paraiméadair 10% agus ráta earráide cineál I 5% a bhrath.Roghnaíodh rannóga fíocháin go randamach roimh an turgnamh. Rinneadh na hanailísí uile dall ar riocht agus níor díchódaíodh na samplaí ach amháin tar éis na sonraí uile a anailísiú. Baineadh úsáid as bogearraí GraphPad Prism (San Diego, CA) chun na hanailísí staitistiúla uile a dhéanamh. I gcás na staitisticí uile, measadh go raibh luachanna p suntasach ag luachanna <0.05. I gcás na staitisticí uile, measadh go raibh luachanna p suntasach ag luachanna <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. I gcás na staitisticí uile, measadh go raibh luachanna p suntasach ag luachanna <0.05.对于所有统计数据，p值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. I gcás na staitisticí uile, measadh go raibh luachanna p suntasach ag luachanna <0.05.Rinneadh tástáil-t déthaobhach an Mhic Léinn ar na sonraí le dhá chomparáid amháin. Baineadh úsáid as ANOVA aonbhealach nó dhábhealach chun suntasacht idir grúpaí iolracha a chinneadh. Agus tástálacha iar-hoc á ndéanamh, cuireadh ceartú Tukey i bhfeidhm chun cuntas a thabhairt ar ilchomparáidí. Tá breithnithe staitistiúla speisialta ag baint le sonraí RNAsec agus FDR agus p.adjust á ríomh mar a thuairiscítear sa rannán Modhanna.
Le haghaidh tuilleadh eolais faoi dhearadh staidéir, féach achoimre ar an Nature Research Report atá nasctha leis an alt seo.