Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá tacaíocht theoranta do CSS sa leagan brabhsálaí atá in úsáid agat. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, déanfaimid an suíomh a rindreáil gan stíleanna ná JavaScript.
Modhanna nua imdhíoneolaíocha agus mais-speictriméadracha le haghaidh anailís chasta ar oligosaccharides leanúnacha i stóbhar arbhair réamhchóireáilte le AFEX. Is rogha inbhuanaithe seachas breoslaí iontaise í bithmhais lignocellulosic agus úsáidtear go forleathan í chun biteicneolaíochtaí a fhorbairt le haghaidh táirgeadh táirgí ar nós bia, beatha, breoslaí agus ceimiceán. Is í an eochair do na teicneolaíochtaí seo forbairt próiseas iomaíoch ó thaobh costais de chun carbaihiodráití casta atá i láthair i mballaí cealla plandaí a thiontú ina siúcraí simplí ar nós glúcós, xilós agus arabinose. Ós rud é go bhfuil bithmhais lignocellulosic an-righin, ní mór í a chur faoi chóireálacha teirmiceimiceacha (m.sh., dífholú snáithín amóinia (AFEX), aigéid chaolaithe (DA), leachtanna ianacha (IL)) agus cóireálacha bitheolaíocha (m.sh., hidrealú einsímeach agus coipeadh miocróbach) i gcomhar le chéile chun an táirge atá ag teastáil a fháil. . Mar sin féin, nuair a úsáidtear einsímí fungasacha tráchtála sa phróiseas hidrealú, níl ach 75-85% de na siúcraí intuaslagtha a fhoirmítear ina monaisaccharides, agus is oligosaccharides intuaslagtha, do-réitithe an 15-25% atá fágtha, nach bhfuil ar fáil i gcónaí do mhiocrorgánaigh. Roimhe seo, d'éirigh linn olaigisacáirídí righne intuaslagtha a aonrú agus a íonú trí úsáid a bhaint as meascán de dheighilt carbóin agus cré diatomaceous agus crómatagrafaíocht eisiaimh méide, agus rinneamar imscrúdú ar a n-airíonna coisctheacha einsíme freisin. Fuaireamar amach go bhfuil sé níos deacra olaigisacáirídí ina bhfuil malartuithe aigéad úrónach meitile polaiméirithe (DP) ar chéim níos airde a phróiseáil le meascáin einsímí tráchtála ná olaigisacáirídí DP íseal agus neodracha. Anseo, tuairiscímid úsáid roinnt modhanna breise, lena n-áirítear próifíliú glicán ag baint úsáide as antasubstaintí monachlónacha (mAbs) atá sainiúil do ghlicáin bhithmhaise plandaí chun bannaí glicán i mballaí cealla plandaí agus hidrealáisí einsímeacha a thréithriú, ianú dí-asúcháin léasair le cúnamh maitrís, mais-speictriméadracht ama eitilte. . Úsáideann MALDI-TOF-MS) buaicphointí diagnóiseacha faisnéiseacha struchtúir a fhaightear trí speictreascópacht tar éis meath tánaisteach ian diúltach, crómatagrafaíocht gháis agus mais-speictriméadracht (GC-MS) chun bannaí olaigisacáiríde le agus gan díorthú a thréithriú. Mar gheall ar mhéid beag na n-olaigisacáirídí (DP 4–20), tá sé deacair na móilíní seo a úsáid le haghaidh ceangail agus tréithrithe mAb. Chun an fhadhb seo a shárú, chuireamar modh nua imghluaiseachta oligosaccharide bunaithe ar chomhchuingiú biotin i bhfeidhm a lipéadaigh formhór na n-oligosaccharides intuaslagtha íseal-DP go rathúil ar dhromchla an mhicreaphláta, a úsáideadh ansin i gcóras mAb ard-tréchuir le haghaidh anailíse ligation sonrach. Éascóidh an modh nua seo forbairt aistí glúcóim ard-tréchuir níos forbartha sa todhchaí ar féidir iad a úsáid chun oligosaccharides atá i láthair i mbithmharcóirí a leithlisiú agus a thréithriú chun críocha diagnóiseacha.
Is ábhar cothaithe ionchasach í bithmhais lignocellulosic, atá comhdhéanta d'ábhair talmhaíochta, foraoiseachta, féar agus adhmadacha, chun táirgí bithbhunaithe a tháirgeadh, lena n-áirítear bia, beatha, breosla agus réamhtheachtaithe ceimiceacha chun táirgí níos airde luacha a tháirgeadh1. Déantar carbaihiodráití (amhail ceallalós agus hemiceallalós) atá i láthair i mballaí cealla plandaí a dhípholaiméiriú ina monaisiúicrídí trí phróiseáil cheimiceach agus bithchlaochlú (amhail hidrealú einsímeach agus coipeadh miocróbach). I measc na réamhchóireálacha coitianta tá leathnú snáithín amóinia (AFEX), aigéad caolaithe (DA), leacht ianach (IL), agus pléascadh gaile (SE), a úsáideann meascán de cheimiceáin agus teas chun táirgeadh lignocellulos a laghdú trí bhallaí cealla plandaí3,4 a oscailt. 5. Déantar hidrealú einsímeach ag ualach ard solad ag baint úsáide as einsímí tráchtála gníomhacha ina bhfuil carbaihiodráit (CAZymes) agus coipeadh miocróbach ag baint úsáide as giostaí nó baictéir thrasghéineacha chun breoslaí agus ceimiceáin bithbhunaithe a tháirgeadh6.
Is meascán casta einsímí iad CAZímí in einsímí tráchtála a scoilteann naisc chasta carbaihiodráite-siúcra go sineirgisteach chun monaisiúicrídí a fhoirmiú2,7. Mar a thuairiscigh muid níos luaithe, déanann an líonra casta polaiméirí aramatacha lignin le carbaihiodráití iad an-docht a réiteach, rud a fhágann go mbíonn tiontú siúcra neamhiomlán, agus go gcarnaítear 15-25% d'olaigisiúicrídí gnéis nach dtáirgtear le linn hidrealú einsímeach na bithmhaise réamhchóireáilte. Is fadhb choitianta í seo le modhanna éagsúla réamhchóireála bithmhaise. I measc cuid de na cúiseanna leis an mbac seo tá cosc ​​​​ar einsímí le linn hidrealú, nó easpa nó leibhéil ísle einsímí riachtanacha atá riachtanach chun naisc siúcra a bhriseadh i mbithmhais plandaí. Cabhróidh tuiscint ar chomhdhéanamh agus ar shaintréithe struchtúracha siúcraí, amhail na naisc siúcra in olaigisiúicrídí, linn tiontú siúcra a fheabhsú le linn hidrealú, rud a fhágfaidh go mbeidh próisis bhiththeicneolaíochta iomaíoch ó thaobh costais de le táirgí díorthaithe ó pheitriliam.
Is dúshlán é struchtúr carbaihiodráití a chinneadh agus éilíonn sé meascán de mhodhanna ar nós crómatagrafaíocht leachtach (LC)11,12, speictreascópacht athshondais mhaighnéadaigh núicléach (NMR)13, leictreafóiréis ribeach (CE)14,15,16 agus mais-speictriméadracht (MS)17. ,ocht déag. Is modh ildánach iad modhanna MS ar nós mais-speictriméadracht am-eitilte le dí-asú léasair agus ianú ag baint úsáide as maitrís (MALDI-TOF-MS) chun struchtúir charbaihiodráití a aithint. Le déanaí, is forleithne a úsáideadh MS tandem Dícheangal Imbhuailte-Spreagtha (CID) d'adducts ian sóidiam chun méarloirg a aithint a fhreagraíonn do shuíomhanna ceangail oligosaccharide, cumraíochtaí anaiméireacha, seichimh, agus suíomhanna brainseála 20, 21.
Is uirlis den scoth í anailís glicáin chun naisc charbaihiodráite a aithint go mion22. Úsáideann an modh seo antashubstaintí monachlónacha (mAbanna) atá dírithe ar glicán bhalla cealla plandaí mar tóireadóirí chun naisc chasta carbaihiodráite a thuiscint. Tá níos mó ná 250 mAb ar fáil ar fud an domhain, atá deartha i gcoinne oligosaccharides líneacha agus brainseacha éagsúla ag baint úsáide as saccharides éagsúla24. Úsáideadh roinnt mAbanna go forleathan chun struchtúr, comhdhéanamh agus modhnuithe bhalla cealla plandaí a shainiú, toisc go bhfuil difríochtaí suntasacha ann ag brath ar chineál cealla plandaí, orgán, aois, céim forbartha agus timpeallacht fáis25,26. Le déanaí, úsáideadh an modh seo chun tuiscint a fháil ar dhaonraí veicile i gcórais plandaí agus ainmhithe agus a róil faoi seach in iompar glicáin mar a chinntear le marcóirí focheallacha, céimeanna forbartha nó spreagthaigh chomhshaoil, agus chun gníomhaíocht einsímeach a chinneadh. I measc cuid de na struchtúir éagsúla de ghlicáin agus xiláin atá aitheanta tá peictin (P), xilan (X), mannan (M), xiloglúcáin (XylG), glúcáin nasc measctha (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), aigéad glúcurónach-arabinoxylan (GArbX) agus arabino-galactan (ArbG)29.
Mar sin féin, in ainneoin na n-iarrachtaí taighde seo go léir, níor dhírigh ach cúpla staidéar ar nádúr carnadh oligosaccharide le linn hidrealú ualaigh solad ard (HSL), lena n-áirítear scaoileadh oligosaccharide, athruithe ar fhad slabhra oligiméireach le linn hidrealú, polaiméirí éagsúla DP íseal, agus a gcuar. dáiltí 30,31,32. Idir an dá linn, cé gur chruthaigh anailís glicáin a bheith ina huirlis úsáideach chun anailís chuimsitheach a dhéanamh ar struchtúr glicáin, tá sé deacair oligosaccharides DP íseal intuaslagtha in uisce a mheas ag baint úsáide as modhanna antashubstaintí. Ní cheanglaíonn oligosaccharides DP níos lú a bhfuil meáchan móilíneach níos lú ná 5-10 kDa acu le plátaí ELISA 33, 34 agus nitear iad sula gcuirtear antashubstaintí leis.
Anseo, den chéad uair, taispeánaimid measúnacht ELISA ar phlátaí atá brataithe le avidin ag baint úsáide as antashubstaintí monachlónacha, ag comhcheangal nós imeachta bith-thiniliúcháin aonchéime le haghaidh oligosaccharides teasfhulangacha intuaslagtha le hanailís glúcóim. Rinneadh bailíochtú ar ár gcur chuige maidir le hanailís glúcóim trí anailís bunaithe ar MALDI-TOF-MS agus GC-MS ar naisc oligosaccharide comhlántacha ag baint úsáide as díorthú trímheitilsilile (TMS) ar chomhdhéanamh siúcra hidrealaithe. Is féidir an cur chuige nuálach seo a fhorbairt mar mhodh ard-tréchur sa todhchaí agus feidhmchlár níos leithne a fháil i dtaighde bithleighis35.
Bíonn tionchar ag modhnuithe iar-aistriúcháin ar einsímí agus ar antashubstaintí, amhail gliocóisiliú,36 ar a ngníomhaíocht bhitheolaíoch. Mar shampla, bíonn ról tábhachtach ag athruithe i nglicóisiliú próitéiní serum in airtríteas athlastach, agus úsáidtear athruithe i nglicóisiliú mar mharcóirí diagnóiseacha37. Tuairiscíodh sa litríocht go mbíonn glicáin éagsúla le feiceáil go héasca i réimse galair, lena n-áirítear galair athlastacha ainsealacha an chonair gastraistéigeach agus an ae, ionfhabhtuithe víreasacha, ailse ubhagánach, chíche agus próstatach38,39,40. Trí thuiscint a fháil ar struchtúr glicáin ag baint úsáide as modhanna ELISA glicáin atá bunaithe ar antashubstaintí, cuirfear muinín bhreise ar fáil i ndiagnóis galair gan úsáid a bhaint as modhanna casta MS.
Léirigh ár staidéar roimhe seo nár hidrealaíodh oligosacáirídí righne tar éis réamhchóireála agus hidrealú einsímeach (Fíor 1). Inár gcuid oibre a foilsíodh roimhe seo, d'fhorbraíomar modh eastósctha céim sholadaigh gualaigh ghníomhachtaithe chun oligosacáirídí a leithlisiú ó hidrealúite stover arbhair réamhchóireáilte le AFEX (ACSH)8. Tar éis an eastósctha agus an deighilte tosaigh, rinneadh na oligosacáirídí a chodánú tuilleadh trí chrómatagrafaíocht eisiaimh méide (SEC) agus bailíodh iad in ord meáchain mhóilíneach. Rinneadh anailís ar mhonaiméirí siúcra agus oligosacáirídí a scaoileadh ó réamhchóireálacha éagsúla trí anailís ar chomhdhéanamh siúcra. Agus ábhar oligosacáirídí siúcra a fhaightear trí mhodhanna réamhchóireála éagsúla á chur i gcomparáid, is fadhb choitianta í láithreacht oligosacáirídí righne i gcomhshó bithmhaise go monaisacáirídí agus is féidir leis laghdú ar tháirgeacht siúcra de 10-15% ar a laghad agus fiú suas le 18% a bheith mar thoradh air. Úsáidtear an modh seo le haghaidh táirgeadh breise ar scála mór codáin oligosacáiríde. Baineadh úsáid as an ACH mar thoradh air agus a chodáin ina dhiaidh sin le meáchain mhóilíneacha éagsúla mar ábhar turgnamhach chun oligosacáirídí a thréithriú san obair seo.
Tar éis réamhchóireála agus hidrealú einsímeach, d'fhan oligosaccharides leanúnacha gan hidrealú. Seo (A) modh deighilte oligosaccharide ina ndéantar oligosaccharides a leithlisiú ó hidrealúáit stover arbhair réamhchóireáilte le AFEX (ACSH) ag baint úsáide as leaba phacáilte de charbón gníomhachtaithe agus cré diatomaceous; (B) Modh chun oligosaccharides a dheighilt. Rinneadh na oligosaccharides a dheighilt tuilleadh trí chrómatagrafaíocht eisiamh méide (SEC); (C) Monaiméirí agus oligosaccharides a scaoileadh ó réamhchóireálacha éagsúla (aigéad caolaithe: DA, leacht ianach: IL agus AFEX). Coinníollacha hidrealú einsímeacha: luchtú solad ard de 25% (m/m) (luchtú glúcáin thart ar 8%), hidrealú 96 uair an chloig, luchtú einsím tráchtála 20 mg/g (cóimheas Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) agus (D) Monaiméirí siúcra agus oligosaccharides glúcóis, xilóis agus arabinose a scaoileadh ó stover arbhair réamhchóireáilte le AFEX (ACS).
Tá anailís glicáin cruthaithe mar uirlis úsáideach le haghaidh anailíse struchtúraí cuimsitheach ar ghlicáin i sleachta atá scartha ó iarmhair bhithmhaise soladacha. Mar sin féin, níl mórán saicrídí intuaslagtha in uisce ionadaithe ag baint úsáide as an modh traidisiúnta seo41 toisc go bhfuil sé deacair oligosacrídí meáchan móilíneach íseal a dhíghluaiseacht ar phlátaí ELISA agus nitear amach iad sula gcuirtear antashubstaintí leis. Dá bhrí sin, chun antashubstaintí a cheangal agus a thréithriú, úsáideadh modh bith-thinilithe aonchéime chun oligosacrídí intuaslagtha, neamhchomhlíontacha a chóta ar phlátaí ELISA atá brataithe le avidin. Rinneadh tástáil ar an modh seo ag baint úsáide as ár ACSH a táirgeadh roimhe seo agus codán bunaithe ar a mheáchan móilíneach (nó céim polaiméirithe, DP). Úsáideadh bith-thinilithe aonchéime chun claonadh ceangailteach oligosacríde a mhéadú trí bhiotín-LC-hidrazíd a chur leis an deireadh laghdaitheach den charbaihiodráit (Fíor 2). I dtuaslagán, imoibríonn an grúpa hemiacetal ag an deireadh laghdaitheach leis an ngrúpa hiodrazíde de bhiotín-LC-hidrazíd chun nasc hiodrazóin a fhoirmiú. I láthair an ghníomhaire laghdaitheach NaCNBH3, laghdaítear an nasc hiodrazóin go táirge deiridh bith-thinilithe cobhsaí. Leis an modhnú ar an taobh laghdaithe siúcra, bhí ceangal olaigisacarídí íseal-DP le plátaí ELISA indéanta, agus inár staidéar rinneadh é seo ar phlátaí atá brataithe le avidin ag baint úsáide as mAbs dírithe ar glicán.
Scagthástáil antashubstaintí monachlónacha bunaithe ar ELISA le haghaidh oligosaccharides bith-thinilte. Anseo (A) comhcheanglaítear bith-thinilteadh oligosaccharides agus scagthástáil ELISA ina dhiaidh sin le mAbs dírithe ar glicán ar phlátaí atá brataithe le NeutrAvidin agus (B) taispeánann sé nós imeachta aonchéime le haghaidh bith-thinilteadh táirgí imoibrithe.
Cuireadh plátaí brataithe le avidin agus antasubstaintí comhchuingithe oligosaccharide leis na hantashubstaintí príomhúla agus tánaisteacha agus nite iad i meán íogair ó thaobh solais agus ama de. Tar éis an ceangal antasubstainte de a bheith críochnaithe, cuirtear foshraith TMB leis chun an pláta a ghoradh. Cuireadh stop leis an imoibriú ar deireadh le haigéad sulfarach. Rinneadh anailís ar na plátaí goraithe ag baint úsáide as léitheoir ELISA chun neart ceangailteach gach antashubstainte a chinneadh chun trasnascadh antashubstainte-shonrach a bhrath. Le haghaidh sonraí agus paraiméadair an turgnaimh, féach an chuid chomhfhreagrach “Ábhair agus Modhanna”.
Léirímid úsáideacht an mhodha nuafhorbartha seo le haghaidh feidhmeanna sonracha trí na holaigisacáirídí intuaslagtha atá i láthair in ACSH a shainiú chomh maith le codáin holaigisacáirídí amha agus íonaithe atá scartha ó hidrealáisí lignocellulosacha. Mar a thaispeántar i bhFíor 3, is iad na xiláin eipitóp-ionadaithe is coitianta a shainaithnítear in ACSH ag baint úsáide as modhanna measúnachta glúcóim bithaicilithe ná arabinagalactáin úrónacha (U) nó meitilúrónacha (MeU) agus peicteacha. Fuarthas an chuid is mó díobh freisin inár staidéar roimhe seo ar anailís glicán solad neamh-hidrealaithe (UHS)43.
Brath ar eipitóip oligosaccharide righne ag baint úsáide as antashubstaint monachlónach atá dírithe ar an nglicán balla cille. Is é an codán "neodrach" an codán ACN agus is é an codán FA an codán "aigéadach". Léiríonn dearg níos gile ar an léarscáil teasa cion eipitóip níos airde, agus léiríonn gorm níos gile cúlra bán. Tá luachanna datha ar an scála bunaithe ar luachanna OD amha le haghaidh foirmlithe N=2. Taispeántar na príomh-eipitóip a aithníonn na hantashubstaintí ar dheis.
Ní fhéadfaí na struchtúir neamhcheallalósa seo a scoilteadh leis na ceallalásaí agus na hemiceallaláisí is coitianta sa mheascán einsím tráchtála a tástáladh, lena n-áirítear na heinsímí tráchtála is coitianta a úsáidtear. Dá bhrí sin, tá gá le heinsímí cúnta nua dá hidrealú. Gan na heinsímí cúnta neamhcheallalósa riachtanacha, cuireann na naisc neamhcheallalósa seo cosc ​​ar chomhshó iomlán go monaisiúicrídí, fiú má dhéantar a bpolaiméirí siúcra tuismitheora a hidrealú go fairsing i mblúirí níos giorra agus a thuaslagadh ag baint úsáide as meascáin einsím tráchtála.
Léirigh staidéar breise ar dháileadh comhartha agus a neart ceangailteach go raibh eipitóip cheangailteach níos ísle i gcodáin siúcra ard-DP (A, B, C, DP suas le 20+) ná i gcodáin íseal-DP (D, E, F, DP) i ndiméirí) (Fíor 1). Tá blúirí aigéid níos coitianta in eipitóip neamh-cheallalósacha ná blúirí neodracha. Tá na feiniméin seo comhsheasmhach leis an bpatrún a breathnaíodh inár staidéar roimhe seo, áit a raibh codanna ard-DP agus aigéid níos frithsheasmhaí in aghaidh hidrealú einsímeach. Dá bhrí sin, is féidir le láithreacht eipitóip glicán neamh-cheallalósacha agus ionaduithe U agus MeU cur go mór le cobhsaíocht na n-olagasacarídí. Ba chóir a thabhairt faoi deara gur féidir le héifeachtúlacht cheangailteach agus braite a bheith ina fhadhb d'olagasacarídí íseal-DP, go háirithe má tá an eipitóp ina olagasacaríd démhéireach nó trímhéireach. Is féidir é seo a thástáil ag baint úsáide as olagasacarídí tráchtála de fhaid éagsúla, agus gach ceann acu ina bhfuil eipitóp amháin a cheanglaíonn le mAb ar leith.
Dá bhrí sin, nocht úsáid antashubstaintí struchtúr-shonracha cineálacha áirithe bannaí righne. Ag brath ar an gcineál antashubstainte a úsáideadh, an patrún ceangailteachta cuí, agus neart an chomhartha a tháirgeann sé (an ceann is flúirseach agus an ceann is lú flúirseach), is féidir einsímí nua a aithint agus a chur leis an meascán einsímí go leathchainníochtúil le haghaidh tiontú glice níos iomláine. Agus anailís oligosaccharides ACSH á glacadh mar shampla, is féidir linn bunachar sonraí de naisc glicáin a chruthú do gach ábhar bithmhaise. Ba chóir a thabhairt faoi deara anseo gur cheart an gaolmhaireacht dhifriúil idir antashubstaintí a chur san áireamh, agus mura bhfuil a ngaolmhaireacht ar eolas, cruthóidh sé seo deacrachtaí áirithe agus comharthaí antashubstaintí éagsúla á gcomparáid. Ina theannta sin, d'fhéadfadh comparáid bannaí glicáin a bheith níos fearr idir samplaí don antashubstaint chéanna. Is féidir na naisc righne seo a nascadh ansin leis an mbunachar sonraí CAZyme, as ar féidir linn einsímí a aithint, einsímí iarrthóra a roghnú agus tástáil a dhéanamh ar einsímí briste bannaí, nó córais mhiocróbacha a fhorbairt chun na heinsímí seo a chur in iúl lena n-úsáid i mbith-scaglanna44.
Chun meastóireacht a dhéanamh ar an gcaoi a gcomhlánaíonn modhanna imdhíoneolaíocha modhanna malartacha chun olaigisacairídí ísealmheáchain mhóilíneacha atá i láthair i hidrealáisí lignocellulosacha a shainiú, rinneamar MALDI (Fíor 4, S1-S8) agus anailís ar shacairídí díorthaithe ó TMS bunaithe ar GC-MS ar an bpainéal céanna (Fíor 5) den chuid olaigisacáiríde. Úsáidtear MALDI chun comparáid a dhéanamh i dtaobh an bhfuil dáileadh maise na móilíní olaigisacáiríde ag teacht leis an struchtúr beartaithe. Ar Fíor 4 taispeántar MS de na comhpháirteanna neodracha ACN-A agus ACN-B. Dheimhnigh anailís ACN-A raon siúcraí peantóise ó DP 4–8 (Fíor 4) go DP 22 (Fíor S1), a bhfuil a meáchain ag freagairt d'olaigisacáirídí MeU-xylan. Dheimhnigh anailís ACN-B an tsraith peantóise agus glúcocsailáin le DP 8-15. In ábhar forlíontach amhail Fíor S3, taispeánann léarscáileanna dáilte maise cuid aigéadach FA-C raon siúcraí peantóis ionadaithe (Me)U le DP de 8-15 atá comhsheasmhach leis na xiláin ionadaithe a fhaightear i scagadh mAb bunaithe ar ELISA. Tá na heipitóip comhsheasmhach.
Speictream MALDI-MS d'olaigisacrídí neamhchomhlíontacha intuaslagtha atá i láthair in ACS. Anseo, (A) codáin íseal-mheáchain ACN-A ina bhfuil aigéad úrónach meitilithe (DP 4-8) ina n-ionadaíodh olaigisacrídí glúcurocsailáin agus (B) xilán ACN-B agus olaigisacrídí aigéad úrónach meitilithe ina n-ionadaíodh glúcurocsailán (DP 8-15).
Anailís ar chomhdhéanamh iarmhair glicáin olaigisacáirídí teasfhulangacha. Anseo (A) Comhdhéanamh olaigisacáiríde TMS de chodáin olaigisacáiríde éagsúla a fuarthas ag baint úsáide as anailís GC-MS. (B) Struchtúir siúcraí éagsúla díorthaithe ó TMS atá i láthair in olaigisacáirídí. ACN – codán aicéatóinítre ina bhfuil olaigisacáirídí neodracha agus FA – codán aigéad feiriúil ina bhfuil olaigisacáirídí aigéadacha.
Baineadh conclúid spéisiúil eile as anailís LC-MS ar an gcodán oligosaccharide, mar a thaispeántar i bhFíor S9 (is féidir modhanna a fheiceáil san ábhar forlíontach leictreonach). Breathnaíodh blúirí de ghrúpaí heacsóis agus -OAc arís agus arís eile le linn ligáil an chodáin ACN-B. Ní hamháin go ndeimhníonn an fhionnachtain seo an ilroinnt a breathnaíodh in anailís glúcóim agus MALDI-TOF, ach soláthraíonn sé faisnéis nua faoi dhíorthaigh charbaihiodráite féideartha i mbithmhais lignocellulosic réamhchóireáilte.
Chomh maith leis sin, rinneamar anailís ar chomhdhéanamh glicáin ar chodáin oligosaccharide ag baint úsáide as díorthú glicáin TMS. Ag baint úsáide as GC-MS, chinn muid comhdhéanamh na siúcraí néaracha (neamhdhíorthaigh) agus aigéadacha (GluA agus GalA) sa chodán oligosaccharide (Fíor 5). Faightear aigéad glúcarónach i gcomhpháirteanna aigéadacha C agus D, agus faightear aigéad galactarónach i gcomhpháirteanna aigéadacha A agus B, ar comhpháirteanna ard-DP de shiúcraí aigéadacha iad araon. Ní hamháin go ndeimhníonn na torthaí seo ár sonraí ELISA agus MALDI, ach tá siad comhsheasmhach freisin lenár staidéir roimhe seo ar charnadh oligosaccharide. Dá bhrí sin, creidimid gur leor modhanna imdhíoneolaíocha nua-aimseartha a úsáideann bithiniliú oligosaccharides agus scagadh ELISA ina dhiaidh sin chun oligosaccharides intuaslagtha righne a bhrath i samplaí bitheolaíocha éagsúla.
Ós rud é gur bailíochtúigh roinnt modhanna éagsúla modhanna scagthástála mAb bunaithe ar ELISA, theastaigh uainn acmhainneacht an mhodha chainníochtúil nua seo a iniúchadh tuilleadh. Ceannaíodh agus tástáladh dhá olaigisaccharide tráchtála, olaigisaccharide xiloheicseaccharide (XHE) agus 23-α-L-arabinofuranosyl-xilotriose (A2XX), ag baint úsáide as cur chuige nua mAb a dhíríonn ar an nglicán bhalla cille. Taispeánann Fíor 6 comhghaol líneach idir an comhartha ceangailteach bithitinithe agus tiúchan loga an olaigisaccharide, rud a thugann le fios go bhfuil samhail ionsúcháin Langmuir ann. I measc na mAbs, bhí comhghaol idir CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, agus CCRC-M151 agus XHE, agus bhí comhghaol idir CCRC-M108, CCRC-M109, agus LM11 agus A2XX thar raon ó 1 nm go 100 nano. Mar gheall ar infhaighteacht theoranta antashubstaintí le linn an turgnaimh, rinneadh turgnaimh theoranta le gach tiúchan olaigisaccharide. Ba chóir a thabhairt faoi deara anseo go n-imoibríonn roinnt antashubstaintí go han-difriúil leis an oligosaccharide céanna mar shubstráit, is dócha toisc go gceanglaíonn siad le heipitóip beagán difriúla agus go bhféadfadh claontaí ceangailteach an-difriúla a bheith acu. Beidh na meicníochtaí agus na himpleachtaí a bhaineann le heipitóip chruinn a aithint i bhfad níos casta nuair a chuirfear an cur chuige nua mAb i bhfeidhm ar shamplaí fíor.
Baineadh úsáid as dhá oligosaccharide tráchtála chun raon braite mAbanna éagsúla atá dírithe ar glicán a chinneadh. Anseo, léiríonn comhghaolta líneacha le tiúchan log tiúchan oligosaccharide patrúin ionsúcháin Langmuir do (A) XHE le mAb agus (B) A2XX le mAb. Léiríonn na heipitóip chomhfhreagracha struchtúir na n-oligosaccharide tráchtála a úsáideadh mar foshraitheanna sa mheasúnacht.
Is uirlis chumhachtach í úsáid antashubstaintí monachlónacha dírithe ar glicán (anailís glicómach nó scagadh mAb bunaithe ar ELISA) chun tréithriú domhain a dhéanamh ar fhormhór na nglicán móra i mballa cealla a dhéanann bithmhais plandaí. Mar sin féin, ní dhéanann anailís chlasaiceach glicán tréithriú ach ar ghlicáin bhalla cealla níos mó, toisc nach mbíonn an chuid is mó d'olaigisiúicrídí imghluaiste go héifeachtach ar phlátaí ELISA. Sa staidéar seo, rinneadh hidrealú einsímeach ar stover arbhair réamhchóireáilte le AFEX ag cion ard solad. Baineadh úsáid as anailís siúcra chun comhdhéanamh carbaihiodráití athléimneacha balla cealla san hidrealúáit a chinneadh. Mar sin féin, déantar anailís mAb ar olaigisiúicrídí níos lú in hidrealúáití a mheas faoina luach, agus tá gá le huirlisí breise chun olaigisiúicrídí a imghluaiste go héifeachtach ar phlátaí ELISA.
Tuairiscímid anseo modh nua agus éifeachtach um imghluaiseacht oligosaccharide le haghaidh scagthástáil mAb trí bhithitiniliú oligosaccharide a chomhcheangal agus scagthástáil ELISA ar phlátaí atá brataithe le NeutrAvidin™. Léirigh na holigosaccharides bithitinilte neamhghluaiseachta leordhóthanach claonadh don antashubstaint chun braiteadh tapa agus éifeachtach oligosaccharides righne a chumasú. Dheimhnigh anailís ar chomhdhéanamh na n-oligosaccharides righne seo bunaithe ar mhais-speictriméadracht torthaí an chur chuige nua seo maidir le himdhíon-scagtha. Dá bhrí sin, léiríonn na staidéir seo gur féidir an teaglaim de bhithitiniliú oligosaccharide agus scagthástáil ELISA le hantashubstaintí monachlónacha dírithe ar glicán a úsáid chun trasnaisc a bhrath in oligosaccharides agus gur féidir é a chur i bhfeidhm go forleathan i staidéir bithcheimiceacha eile a thréithríonn struchtúr oligosaccharides.
Is í an modh próifílithe glicáin seo atá bunaithe ar bhiotín an chéad tuarascáil atá in ann imscrúdú a dhéanamh ar na naisc charbaihiodráite righne atá ag olaigisacáirídí intuaslagtha i mbithmhais plandaí. Cuidíonn sé seo le tuiscint a fháil ar an gcúis go bhfuil codanna áirithe den bhithmhais chomh righin sin maidir le táirgeadh bithbhreosla. Líonann an modh seo bearna thábhachtach i modhanna anailíse glicóin agus leathnaíonn sé a chur i bhfeidhm chuig raon níos leithne foshraitheanna thar olaigisacáirídí plandaí. Amach anseo, féadfaimid róbataic a úsáid le haghaidh bithitiniúcháin agus an modh atá forbartha againn le haghaidh anailíse ard-tréchur ar shamplaí ag baint úsáide as ELISA a úsáid.
Bailíodh tuí arbhair (CS) a fhásadh ó shíolta hibrideacha Pioneer 33A14 sa bhliain 2010 ó Fheirmeacha Kramer i Ray, Colorado. Le cead ón úinéir talún, is féidir an bhithmhais seo a úsáid le haghaidh taighde. Stóráladh na samplaí tirim < 6% taise i málaí zip-ghlas ag teocht an tseomra. Stóráladh na samplaí tirim < 6% taise i málaí zip-ghlas ag teocht an tseomra. Образцы хранились сухими при влажности < 6% sa phacáiste с застежкой-mолнией при комнатной темеу. Stóráladh na samplaí tirim ag <6% taise i málaí zipéirithe ag teocht an tseomra.样品在室温下以干燥<6%的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Breac síos sa phacastáin sa mhargadh-molнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Stóráiltear samplaí i málaí zipper ag teocht an tseomra le taise < 6%.Chomhlíon an staidéar treoirlínte áitiúla agus náisiúnta. Rinneadh anailís chomhdhéanamh ag baint úsáide as prótacal NREL. Fuarthas amach go raibh 31.4% glúcán, 18.7% xilán, 3.3% arabinán, 1.2% galactán, 2.2% aicéitil, 14.3% lignin, 1.7% próitéin agus 13.4% luaithreach sa chomhdhéanamh.
Is meascán casta de cheallaláis, β-glúcósídas agus Cellic® HTec2 (157 mg próitéin/ml, baisc VHN00001) ó Novozymes (Franklinton, Carolina Thuaidh, SAM) é Cellic® CTec2 (138 mg próitéin/ml, baisc VHN00001). Bronnadh Multifect Pectinase® (72 mg próitéin/ml), meascán casta d'einsímí a dhíghrádaíonn peictin, ag DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, SAM). Cinneadh tiúchan próitéine einsíme trí mheasúnú a dhéanamh ar an ábhar próitéine (agus ranníocaíocht nítrigine neamhphróitéine a dhealú) ag baint úsáide as anailís nítrigine Kjeldahl (modh AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, SAM). Ceannaíodh cré diatomáiseach 545 ó EMD Millipore (Billerica, MA). Ceannaíodh carbón gníomhachtaithe (DARCO, gráinníní 100 mogalra), Avicel (PH-101), xilán feá, agus na ceimiceáin eile go léir ó Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Rinneadh réamhchóireáil AFEX ag GLBRC (Saotharlann Taighde Comhshó Bithmhaise, MSU, Lansing, MI, SAM). Rinneadh an réamhchóireáil ag 140°C ar feadh 15 nóiméad. Bhí 46 nóiméad ann ar feadh am fanachta ag cóimheas 1:1 d'amóinia anhidriúil le bithmhais ag luchtú 60% (m/m) in imoibreoir baisce barrchruach cruach dhosmálta (Parr Instruments Company). Thóg sé 30 nóiméad. Tugadh an t-imoibreoir go 140°C agus scaoileadh an amóinia go tapa, rud a lig don bhithmhais filleadh go teocht an tseomra go tapa. Bhí comhdhéanamh an arbhair réamhchóireáilte AFEX (ACS) cosúil le comhdhéanamh an arbhair neamhchóireáilte (UT-CS).
Ullmhaíodh ACSH 25% (m/m) ard-sholaid (thart ar 8% luchtú deasctran) mar ábhar tosaigh le haghaidh táirgeadh oligosaccharides ar scála mór. Rinneadh hidrealú einsímeach ar ACS ag baint úsáide as meascán einsímí tráchtála lena n-áirítear Cellic® Ctec2 10 mg próitéine/g glúcán (i mbithmhais réamhchóireáilte), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg próitéine/g glúcán, agus Multifect Pectinase (Genencor Inc, SAM). ), 5 mg próitéine/g deasctran. Rinneadh hidrealú einsímeach i mbith-imoibreoir 5 lítear le toirt oibre 3 lítear, pH 4.8, 50°C agus 250 rpm. Tar éis hidrealú ar feadh 96 uair an chloig, bailíodh an hidrealú trí lártheifneoiriú ag 6000 rpm ar feadh 30 nóiméad agus ansin ag 14000 rpm ar feadh 30 nóiméad chun solaid neamh-hidrealú a bhaint. Ansin rinneadh scagadh steiriúil ar an hidrealáiséad trí bhéicéar scagaire 0.22 mm. Stóráladh an hidrealáiséad scagtha i mbuidéil steiriúla ag 4°C agus ansin rinneadh codánú air ar charbón.
Anailís ar chomhdhéanamh samplaí bithmhaise bunaithe ar eastóscáin de réir nósanna imeachta anailíse saotharlainne NREL: ullmhú samplaí le haghaidh anailíse comhdhéanaimh (NREL/TP-510-42620) agus cinneadh carbaihiodráití struchtúracha agus lignin i mbithmhais (NREL/TP-510 – 42618)47.
Rinneadh anailís oligosaccharide ar an sruth hidrealaithe ar scála 2 ml ag baint úsáide as modh hidrealú aigéid bunaithe ar uathchlaobh. Measc an sampla hidrealaithe le 69.7 µl d'aigéad sulfarach 72% i bhfeadán cultúir le caipín scriú 10 ml agus gor ar feadh 1 uair an chloig ar bhinse ag 121 °C, fuaraigh ar oighear agus scag isteach i bhfial crómatagrafaíocht leachta ardfheidhmíochta (HPLC). Cinneadh tiúchan na n-oligosaccharides trí thiúchan na monascarides sa sampla neamh-hidrealúite a dhealú ón tiúchan siúcra iomlán sa sampla hidrealaithe le haigéad.
Rinneadh anailís ar thiúchan glúcóis, xilóis, agus arabinóis sa bhithmhais hidrealaithe le haigéad ag baint úsáide as córas HPLC Shimadzu atá feistithe le huathshamplóir, téitheoir colúin, caidéal iseacrátach, agus brathadóir innéacs athraonta ar cholún Bio-Rad Aminex HPX-87H. Coinníodh an colún ag 50°C agus rinneadh é a eluáil le 0.6 ml/nóim 5 mM H2SO4 in uisce.
Caolaíodh an forshnáithín hidrealaithe agus rinneadh anailís air le haghaidh cion monaiméire agus oligosaccharide. Rinneadh anailís ar shiúcraí monaiméireacha a fuarthas tar éis hidrealú einsímeach trí HPLC a raibh colún Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P agus colún garda fuinseoige feistithe ann. Coinníodh teocht an cholúin ag 80°C, úsáideadh uisce mar an chéim shoghluaiste le ráta sreafa de 0.6 ml/nóim. Cinneadh oligosaccharides trí hidrealú in aigéad caolaithe ag 121°C de réir na modhanna a thuairiscítear i dtagairtí 41, 48, 49.
Rinneadh anailís sacairíde ar iarmhair bhithmhaise amha, réamhchóireáilte AFEX agus gach iarmhair bhithmhaise neamh-hidrealúite (lena n-áirítear táirgeadh sleachta balla cealla sraitheacha agus a scagadh mAb) ag baint úsáide as nósanna imeachta a thuairiscíodh roimhe seo 27, 43, 50, 51. Chun anailís glúcóim a dhéanamh, ullmhaítear iarmhair dothuaslagtha in alcól d'ábhar balla cealla plandaí ó iarmhair bhithmhaise agus déantar iad a eastóscadh go sraitheach le himoibrithe atá ag éirí níos ionsaithí amhail ocsalát amóiniam (50 mM), carbónáit sóidiam (50 mM agus 0.5% m/v), CON. (1M agus 4M, an dá cheann le borohidríd sóidiam 1% m/v) agus clóirít aigéad mar a thuairiscíodh roimhe seo 52,53. Ansin rinneadh ELISA ar na sleachta i gcoinne painéal casta de mAb50anna a dhíríodh ar an nglicán balla cealla, agus cuireadh na frithghníomhartha ceangailteach mAb i láthair mar léarscáil teasa. Ceannaíodh mAbs a dhírigh ar ghlicán balla cealla plandaí ó stoic saotharlainne (sraith CCRC, JIM agus MAC).
Bith-thiniliú aonchéime oligosaccharides. Rinneadh comhchuingiú carbaihiodráití le biotin-LC-hidrazíd ag baint úsáide as an nós imeachta seo a leanas. Tuaslagadh biotin-LC-hidrazíd (4.6 mg/12 μmol) i sulfoxíd démheitil (DMSO, 70 μl) trí mheascadh bríomhar agus téamh ag 65°C ar feadh 1 nóiméad. Cuireadh aigéad aicéiteach oighreach (30 μl) leis agus doirteadh an meascán ar chianabóróhidríd sóidiam (6.4 mg/100 μmol) agus tuaslagadh go hiomlán é tar éis téamh ag 65°C ar feadh thart ar 1 nóiméad. Ansin, cuireadh 5 go 8 μl den mheascán imoibrithe leis an oligosaccharide triomaithe (1-100 nmol) chun farasbarr mólar 10 n-uaire nó níos mó den lipéad a fháil thar an taobh laghdaitheach. Rinneadh an t-imoibriú ag 65°C ar feadh 2 uair an chloig, agus ina dhiaidh sin íonaíodh na samplaí láithreach. Níor úsáideadh cianabóróhidríd sóidiam sna turgnaimh lipéadaithe gan laghdú, agus imoibrigh na samplaí ag 65°C ar feadh 2.5 uair an chloig.
Sciath ELISA agus níochán samplaí d'olaigisacáirídí bith-thinilte. Cuireadh 25 μl de shamplaí bith-thinilte (100 μl de gach sampla tiubhaithe caolaithe i 5 ml de thuaslagán maolánach Tris 0.1 M (TBS)) le gach tobar den phláta atá brataithe le avidin. Sciathaíodh na toibreacha rialaithe le 50 μl de bhiotin ag tiúchan 10 μg/ml i 0.1 M TBS. Baineadh úsáid as uisce dí-ianaithe mar sciath le haghaidh tomhais bána. Goradh an táibléad ar feadh 2 uair an chloig ag teocht an tseomra sa dorchadas. Nigh an pláta 3 huaire le bainne bearrtha 0.1% i 0.1 M TBS ag baint úsáide as clár uimh. 11 do Grenier flat 3A.
Antashubstaintí príomhúla a chur leis agus a ní. Cuir 40 µl d'antashubstaint phríomhúil le gach tobar. Gor an micreaphláta ar feadh 1 uair an chloig ag teocht an tseomra sa dorchadas. Ansin nigh na plátaí 3 huaire le bainne 0.1% i 0.1M TBS ag baint úsáide as clár níocháin #11 do Grenier Flat 3A.
Cuir antashubstaint thánaisteach leis agus nigh. Cuir 50 µl d'antashubstaint thánaisteach luch/francach (caolaithe 1:5000 i mbainne 0.1% i 0.1 M TBS) le gach tobar. Gor an micreaphláta ar feadh 1 uair an chloig ag teocht an tseomra sa dorchadas. Ansin nigh na micreaphlátaí 5 huaire le bainne 0.1% i 0.1 M TBS ag baint úsáide as clár níocháin pláta Grenier Flat 5A #12.
Foshraith a chur leis. Cuir 50 µl de 3,3′,5,5′-teitreameitilbeinsidín (TMB) leis an mbunfhoshraith (trí 2 bhraon de mhaolán, 3 bhraon de TMB, 2 bhraon de shárocsaíd hidrigine a chur le 15 ml d'uisce dí-ianaithe). Ullmhaigh an foshraith TMB agus déan vortex air roimh úsáid). Gor an micreaphláta ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad. Sa dorchadas.
Comhlánaigh an chéim agus léigh an táibléad. Cuir 50 µl d’aigéad sulfarach 1 N le gach tobar agus taifead an ionsú ó 450 go 655 nm ag baint úsáide as léitheoir ELISA.
Ullmhaigh tuaslagáin 1 mg/ml de na hanailítí seo in uisce dí-ianaithe: arabinós, ramnós, fúcós, xilós, aigéad galactúrónach (GalA), aigéad glúcúrónach (GlcA), mannós, glúcós, galachtós, lachtós, N-aicéitilmannosaimín (manNAc), N-aicéitilglúcósamín (glcNAc), N-aicéitilgalactosaimín (galNAc), inositol (caighdeán inmheánach). Ullmhaíodh dhá chaighdeán trí na tuaslagáin siúcra 1 mg/ml a thaispeántar i dTábla 1 a chur leis. Reoitear na samplaí agus déantar iad a lioifileáil ag -80°C go dtí go mbaintear an t-uisce go léir (de ghnáth thart ar 12-18 uair an chloig).
Cuir 100–500 µg den sampla le feadáin scriú-chaipín ar mheáchan anailíseach. Taifead an méid a cuireadh leis. Is fearr an sampla a thuaslagadh i dtiúchan sonrach tuaslagóra agus é a chur leis an bhfeadán mar shliocht leachtach. Bain úsáid as 20 µl de 1 mg/ml inositol mar chaighdeán inmheánach do gach feadán samplach. Caithfidh méid an chaighdeáin inmheánaigh a chuirtear leis an sampla a bheith mar an gcéanna leis an méid den chaighdeán inmheánaigh a cuireadh leis an bhfeadán caighdeánach.
Cuir 8 ml de meatánól anhidriúil i bhfialán le caipín scriú. Ansin cuir 4 ml de thuaslagán meatánóil HCl 3 N leis, cuir an caipín air agus croith é. Ní úsáideann an próiseas seo uisce.
Cuir 500 µl de thuaslagán meatánóil 1 M HCl leis na samplaí oligosaccharide agus na feadáin chaighdeánacha TMS. Goradh na samplaí thar oíche (168 uair an chloig) ag 80°C i mbloc teirmeach. Triomaigh an táirge meatánóilíse ag teocht an tseomra ag baint úsáide as ilchodach triomúcháin. Cuir 200 µl MeOH leis agus triomaigh arís é. Déantar an próiseas seo a athdhéanamh faoi dhó. Cuir 200 µl meatánóil, 100 µl piridín agus 100 µl ainhidríd aicéiteach leis an sampla agus measc go maith. Goradh na samplaí ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad agus triomaigh iad. Cuir 200 µl meatánóil leis agus triomaigh arís é.
Cuir 200 µl de Tri-Sil leis agus teas an feadán le caipín ar feadh 20 nóiméad. Go 80°C, ansin fuaraigh go teocht an tseomra é. Bain úsáid as ilchodach triomúcháin chun an sampla a thriomú tuilleadh go dtí toirt de thart ar 50 µl. Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara nár lig muid do na samplaí triomú go hiomlán.
Cuir 2 ml heacsáin leis agus measc go maith trí vortexáil. Líon bairr na bpípéad Pasteur (5-8 mm) le píosa olann gloine tríd an olann gloine a chur ar bharr pípéad 5-3/4 orlach ar trastomhas. Lártheifneoiríodh na samplaí ag 3000 g ar feadh 2 nóiméad. Deascadh aon iarmhair dothuaslagtha. Triomaigh an sampla go 100-150 µl. Instealladh toirt de thart ar 1 μl isteach sa GC-MS ag teocht tosaigh 80 °C agus am tosaigh 2.0 nóiméad (Tábla 2).