Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha taic chuingealaichte aig an dreach brabhsair a tha thu a’ cleachdadh airson CSS. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brabhsair ùraichte (no gun cuir thu dheth modh co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). Aig an aon àm, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh sinn a’ taisbeanadh an làraich gun stoidhlichean agus JavaScript.
Bidh morphogenesis gut daonna a’ stèidheachadh feartan crypt-villus de mhicroarchitecture epithelial 3D agus eagrachadh spàsail. Tha feum air an structar sònraichte seo gus homeostasis gut a chumail suas le bhith a’ dìon an àite cealla gas anns a’ crypt basal bho antigens microbial exogenous agus na metabolites aca. A bharrachd air an sin, tha villi intestinal agus mucus secreting a’ taisbeanadh ceallan epithelial eadar-dhealaichte gu gnìomhach le cnap-starra dìon air uachdar mucosal intestinal. Mar sin, tha ath-chruthachadh structaran epithelial 3D deatamach airson togail mhodalan gut in vitro. Gu sònraichte, faodaidh an gut-on-a-chip mimetic organach morphogenesis 3D spontaneous den epithelium intestinal a bhrosnachadh le gnìomhan fiseòlasach agus bith-mheacanaig nas fheàrr. An seo, tha sinn a’ toirt seachad protocol ath-riochdachadh gus morphogenesis intestinal a bhrosnachadh gu làidir anns a’ ghut air chip microfluidic a bharrachd air ann an chip hybrid leabaithe Transwell. Tha sinn a’ toirt cunntas air dòighean mionaideach airson saothrachadh innealan, cultar ceallan epithelial organoid Caco-2 no intestinal ann an suidheachaidhean àbhaisteach a bharrachd air àrd-ùrlar microfluidic, brosnachadh morphogenesis 3D, agus comharrachadh. de epithelium 3D stèidhichte a’ cleachdadh iomadh modh ìomhaighean. Bidh am protocol seo a’ coileanadh ath-nuadhachadh meanbh-ailtireachd gut gnìomhach le bhith a’ cumail smachd air sruthadh lionn basolateral airson 5 latha. Bidh an dòigh morphogenesis in vitro againn a’ cleachdadh cuideam gearraidh a tha buntainneach gu fiseòlasach agus gluasad meacanaigeach agus chan fheum e innleadaireachd cealla no làimhseachadh iom-fhillte, a dh’ fhaodadh a bhith nas fheàrr na dòighean eile a th’ ann mar-thà. Tha sinn a’ faicinn gum faodadh buaidh fharsaing a bhith aig a’ phròtacal a tha sinn a’ moladh air a’ choimhearsnachd rannsachaidh bith-mheidigeach, a’ toirt seachad dòigh airson sreathan epithelial intestinal 3D ath-nuadhachadh in vitro airson tagraidhean bith-mheidigeach, clionaigeach agus cungaidh-leigheis.
Tha deuchainnean a’ sealltainn gum faod ceallan Caco-2 epithelial intestinal a chaidh a chultarachadh ann an innealan microfluidic gut-on-a-chip1,2,3,4,5 no dà-fhilleadh6,7 morphogenesis 3D spontaneous a dhol tro in vitro gun tuigse shoilleir air a’ mheacanism bunaiteach. Anns an sgrùdadh o chionn ghoirid againn, fhuair sinn a-mach gu bheil toirt air falbh luchd-bacadh morphogen a tha air an dìomhaireachd gu basolateral bho innealan cultar riatanach agus gu leòr gus morphogenesis epithelial 3D a bhrosnachadh in vitro, a chaidh a dhearbhadh le Caco-2 agus organoids intestinal a thig bho euslaintich. Chaidh dearbhadh a dhèanamh air ceallan epithelial. Anns an sgrùdadh seo, chuir sinn fòcas gu sònraichte air cinneasachadh cealla agus sgaoileadh dùmhlachd antagonist Wnt cumhachdach, Dickkopf-1 (DKK-1), ann an gut-on-a-chip agus innealan microfluidic atharraichte anns a bheil cuir-a-steach Transwell, ris an canar “Hybrid Chip”. Tha sinn a’ sealltainn gu bheil cur luchd-bacadh Wnt exogenous (leithid DKK-1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, no Soggy-1) ris a’ ghut air-chip a’ cur bacadh air morphogenesis no a’ cur dragh air an t-sreath epithelial 3D ro-structaraichte, a’ moladh gur e cuideam antagonistic rè cultar a tha an urra ri morphogenesis intestinal in vitro. Mar sin, is e dòigh-obrach phractaigeach airson morphogenesis làidir a choileanadh aig an eadar-aghaidh epithelial ìrean antagonists Wnt a thoirt air falbh no a chumail suas gu ìre as ìsle anns an roinn basolateral le bhith a’ sruthadh gu gnìomhach (me, ann an àrd-ùrlaran gut-on-a-chip no hybrid-on-a-chip) no sgaoileadh. Meadhanan basolateral (me, bho chuir-a-steach Transwell a-steach do stòran mòra basolateral ann an tobraichean).
Anns a’ phròtacal seo, tha sinn a’ toirt seachad dòigh mhionaideach airson meanbh-innealan gut-on-a-chip agus sgoltagan tar-chinealach a ghabhas a chuir a-steach le Transwell a dhèanamh (ceumannan 1-5) gus ceallan epithelial intestinal a chultarachadh air membranan porous stèidhichte air polydimethylsiloxane (PDMS) (ceumannan 6A, 7A, 8, 9) no membranan polyester de chuir-a-steach Transwell (ceumannan 6B, 7B, 8, 9) agus morphogenesis 3D a bhrosnachadh in vitro (ceum 10). Chomharraich sinn cuideachd feartan ceallach is moileciuil a tha a’ nochdadh histogenesis sònraichte do fhigheagan agus eadar-dhealachadh ceallach an urra ri loidhne-shligheach le bhith a’ cur iomadh modh ìomhaighean an sàs (ceumannan 11-24). Bidh sinn a’ brosnachadh morphogenesis a’ cleachdadh ceallan epithelial intestinal daonna, leithid Caco-2 no organoids intestinal, ann an dà chruth cultar le mion-fhiosrachadh teicnigeach a’ gabhail a-steach atharrachadh uachdar membranan porous, cruthachadh monolayers 2D, agus bith-cheimiceach intestinal agus Ath-riochdachadh den mhicro-àrainneachd bith-mheacanaigeach. in vitro. Gus morphogenesis 3D a bhrosnachadh bho monolayers epithelial 2D, thug sinn air falbh morphogen. luchd-bacadh anns an dà chruth chultaraichte le bhith a’ sruthadh a’ mheadhain a-steach don roinn basolateral den chultar. Mu dheireadh, tha sinn a’ toirt seachad riochdachadh de ghoireasachd sreath epithelial 3D ath-ghinealach a dh’ fhaodar a chleachdadh gus fàs epithelial an urra ri morphogen a mhodaladh, co-chultaran aoigh-microbiome fad-ùine, galar pathogen, leòn sèididh, mì-ghnìomhachd bacadh epithelial, agus leigheasan stèidhichte air probiotic Eisimpleir. buaidhean.
Dh’fhaodadh ar pròtacal a bhith feumail do raon farsaing de luchd-saidheans ann am bun-rannsachadh (me, bith-eòlas mucosal intestinal, bith-eòlas gas cealla, agus bith-eòlas leasachaidh) agus rannsachadh gnìomhaichte (me, deuchainnean dhrogaichean ro-clionaigeach, modaladh ghalaran, innleadaireachd clò, agus gastroenterology) buaidh fharsaing. Air sgàth ath-riochdachadh agus neart ar pròtacal gus morphogenesis 3D den epithelium intestinal a bhrosnachadh in vitro, tha sinn a’ faicinn gum faodar an ro-innleachd theicnigeach againn a sgaoileadh gu luchd-èisteachd a tha a’ sgrùdadh daineamaigs comharran cealla rè leasachadh, ath-nuadhachadh no homeostasis intestinal. A bharrachd air an sin, tha ar pròtacal feumail airson galair a cheasnachadh fo dhiofar riochdairean gabhaltach leithid Norovirus 8, Coronavirus Syndrome Analach Géar Trom 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 no Vibrio cholerae. Tha luchd-èisteachd air pathology agus pathogenesis galair feumail cuideachd. Dh’ fhaodadh cleachdadh siostam meanbh-fhiseòlas gut air-chip co-chultar fad-ùine a cheadachadh 10 agus measadh às deidh sin air dìon an aoigh, freagairtean dìonachd agus càradh leòn co-cheangailte ri pathogens anns an t-slighe gastrointestinal (GI) 11. Faodar eas-òrdughan GI eile co-cheangailte ri sionndrom gut leaky, galar celiac, galar Crohn, colitis ulcerative, pouchitis, no sionndrom caolan irritable a shamhlachadh nuair a thèid sreathan epithelial intestinal 3D ullachadh a’ cleachdadh sreathan epithelial intestinal 3D an euslaintich, tha na galairean sin a’ toirt a-steach atrophy villous, giorrachadh crypt, milleadh mucosal, no bacadh epithelial lag. Organoids intestinal a thig bho biopsy no gascheallan 12,13. Gus modaladh nas fheàrr a dhèanamh air iom-fhillteachd nas àirde na h-àrainneachd galair, faodaidh luchd-leughaidh beachdachadh air seòrsachan cealla buntainneach do ghalaran a chur ris, leithid ceallan mononuclear fala iomaill euslaintich (PBMCn), ri modalan anns a bheil meanbh-ailtireachd villus-crypt intestinal 3D. ceallan dìon sònraichte do fhigheagan, 5.
Leis gum faodar meanbh-structar epithelial 3D a shuidheachadh agus a shealltainn gun a bhith a’ cleachdadh a’ phròiseis earrannan, is dòcha gum bi ùidh aig luchd-amhairc a tha ag obair air tar-sgrìobhadh spàsail agus ìomhaighean àrd-rèiteachaidh no sàr-rèiteachaidh anns a’ mhapadh againn de dh’fhìneamaigs spàsail-ùine ginean agus phròtainean air àiteachan epithelial. Ùidh ann an teicneòlas. Freagairt do bhrosnachaidhean meanbh-fhàs-bheairtean no dìonachd. A bharrachd air an sin, faodar crois-labhairt fad-ùine aoigh-microbiome 10, 14 a bhios a’ co-òrdanachadh homeostasis gut a stèidheachadh anns an t-sreath mucosal intestinal 3D le bhith a’ co-chultarachadh diofar ghnèithean meanbh-fhàs-bheairtean, coimhearsnachdan meanbh-fhàs-bheairtean no meanbh-fhàs-bheairtean fecal, gu sònraichte anns a’ ghut-air-chip. san àrd-ùrlar. Tha an dòigh-obrach seo gu sònraichte tarraingeach do luchd-èisteachd a tha ag ionnsachadh imdhíon-eòlas mucosal, gastroenterology, meanbh-bhitheagan daonna, cultar-eòlas agus meanbh-bhitheòlas clionaigeach a tha a’ feuchainn ri meanbh-bhitheagan gut nach deach a chultarachadh roimhe a àiteachadh san obair-lann. Ma ghabhas ar protocol morphogenesis in vitro atharrachadh gu cruthan cultar sgèileachail, leithid cuir a-steach ioma-tholl ann am pleitean 24, 96 no 384 tobar a bhios ag ath-lìonadh roinnean basolateral gu leantainneach, faodar am protocol a sgaoileadh cuideachd dhaibhsan a tha a’ leasachadh àrd-ùrlaran sgrìonaidh no dearbhaidh cungaidh-leigheis, bith-mheidigeach no àrd-toradh airson gnìomhachas a’ bhidhe. Mar dhearbhadh-prionnsapal, sheall sinn o chionn ghoirid comasachd siostam morphogenesis ioma-fhillte àrd-toradh a ghabhas sgèileachadh gu cruth pleit 24-tobar. A bharrachd air an sin, chaidh iomadh toradh organ-air-sliseag a mhalairteachadh16,17,18. Mar sin, faodar dearbhadh ar dòigh morphogenesis in vitro a luathachadh agus a ghabhail os làimh le mòran obair-lannan rannsachaidh, gnìomhachas no buidhnean riaghaltais agus riaghlaidh gus ath-phrògramadh ceallach morphogenesis gut in vitro a thuigsinn aig an ìre transcriptomic gus drogaichean no bith-leigheasan a dhearbhadh. Tha an gabhail a-steach agus Chaidh còmhdhail thagraichean dhrogaichean a mheasadh le bhith a’ cleachdadh ionaid 3D gut no a’ cleachdadh modalan organ-air-sliseag gnàthaichte no malairteach gus measadh a dhèanamh air ath-riochdachadh pròiseas morfogenesis gut.
Chaidh àireamh chuingealaichte de mhodalan deuchainneach buntainneach do dhaoine a chleachdadh gus sgrùdadh a dhèanamh air morphogenesis epithelial intestinal, gu h-àraidh air sgàth dìth phròtacalan a ghabhas cur an gnìomh gus morphogenesis 3D a bhrosnachadh in vitro. Gu dearbh, tha mòran den eòlas làithreach mu morphogenesis gut stèidhichte air sgrùdaidhean bheathaichean (me, iasg sebra20, luchagan21 no cearcan22). Ach, tha iad dian air saothair agus cosgais, faodaidh iad a bhith teagmhach gu beusach, agus nas cudromaiche, chan eil iad a’ dearbhadh pròiseasan leasachaidh daonna gu mionaideach. Tha na modailean sin cuideachd glè chuingealaichte nan comas a bhith air an deuchainn ann an dòigh ioma-shligheach sgalachail. Mar sin, tha ar pròtacal airson structaran clò 3D ath-nuadhachadh in vitro a’ coileanadh nas fheàrr na modailean bheathaichean in vivo a bharrachd air modalan cultar cealla 2D statach traidiseanta eile. Mar a chaidh a mhìneachadh roimhe, leig cleachdadh structaran epithelial 3D leinn sgrùdadh a dhèanamh air suidheachadh fànais cheallan eadar-dhealaichte ann an axis crypt-villus mar fhreagairt do dhiofar bhrosnachaidhean mucosal no dìonachd. Faodaidh sreathan epithelial 3D àite a thoirt seachad airson sgrùdadh a dhèanamh air mar a bhios ceallan meanbh-fhàs-bheairtean a’ farpais gus àiteachan fànais agus mean-fhàs eag-eòlasach a chruthachadh mar fhreagairt do fhactaran aoigheachd (me, sreathan mucus a-staigh an aghaidh sreathan a-muigh, secretion de IgA agus peptides an-aghaidh meanbh-fhàs-bheairtean). A bharrachd air an sin, faodaidh morf-eòlas epithelial 3D leigeil leinn tuigse fhaighinn air mar a bhios microbiota a’ ghut a’ structaradh a choimhearsnachdan agus a’ dèanamh metabolites meanbh-fhàs-bheairtean gut ann an co-obrachadh (me, searbhagan geir slabhraidh ghoirid) a bhios a’ cumadh eagrachadh ceallach agus àiteachan cealla gas anns na crioptan bunaiteach. Chan urrainnear na feartan seo a nochdadh ach nuair a thèid sreathan epithelial 3D a stèidheachadh in vitro.
A bharrachd air an dòigh againne airson structaran epithelial intestinal 3D a chruthachadh, tha grunn dhòighean in vitro ann. Tha cultar organoid intestinal na dhòigh innleadaireachd clò ùr-nodha stèidhichte air àiteachadh cheallan gas intestinal fo chumhachan morphogen sònraichte23,24,25.Ach, tha cleachdadh mhodalan organoid 3D airson mion-sgrùdadh còmhdhail no co-chultaran aoigh-microbiome gu tric dùbhlanach leis gu bheil lumen intestinal dùinte taobh a-staigh an organoid agus, mar sin, tha toirt a-steach co-phàirtean luminal leithid ceallan microbial no antigens exogenous cuingealaichte. Faodar ruigsinneachd gu lumens organoid a leasachadh le bhith a’ cleachdadh microinjector,26,27 ach tha an dòigh seo ionnsaigheach agus saothair-dian agus feumaidh e eòlas sònraichte airson a choileanadh.A bharrachd air an sin, chan eil cultaran organoid traidiseanta a tha air an cumail ann an sgafaill hydrogel fo chumhachan statach a’ nochdadh bith-mheacanaig gnìomhach in vivo gu ceart.
Bidh dòighean eile a bhios grunn bhuidhnean rannsachaidh a’ cleachdadh a’ cleachdadh sgafaill hydrogel 3D ro-structaraichte gus structar epithelial a’ ghut aithris le bhith a’ cultar cheallan caolan daonna iomallach air uachdar a’ ghel. Dèan sgafaill hydrogel a’ cleachdadh molltairean clò-bhuailte 3D, micro-mhuileann, no lithografach. Tha an dòigh seo a’ sealltainn an rèiteachadh fèin-eagraichte de cheallan epithelial iomallach in vitro le ìrean morphogen buntainneach gu fiseòlasach, a’ stèidheachadh structar epithelial co-mheas taobh àrd agus crosstalk stroma-epithelial le bhith a’ toirt a-steach ceallan stromal anns an sgafaill. Ach, faodaidh nàdar nan sgafaill ro-structaraichte casg a chuir air taisbeanadh a’ phròiseis morphogenetic spontáineach fhèin. Chan eil na modailean sin cuideachd a’ toirt seachad sruthadh luminal no interstitial fiùghantach, agus chan eil an cuideam rùsgadh fluid aca a dh’ fheumas ceallan caolan gus morphogenesis a dhol tro agus gnìomh fiseòlasach fhaighinn. Chleachd sgrùdadh o chionn ghoirid eile sgafaill hydrogel ann an àrd-ùrlar microfluidic agus structaran epithelial intestinal pàtranach a’ cleachdadh dhòighean laser-etching. Bidh organoids intestinal luchag a’ leantainn phàtranan gràbhalaichte gus structaran tiùbal intestinal a chruthachadh, agus faodar sruthadh fluid intraluminal ath-aithris a’ cleachdadh a modúl meanbh-shruthanachd. Ach, chan eil am modail seo a’ taisbeanadh phròiseasan morphogenetic gun spionnadh agus chan eil gluasadan meacana-bhitheòlasach a’ ghut air an gabhail a-steach. Bha dòighean clò-bhualaidh 3D bhon aon bhuidheann comasach air tiùban beaga bìodach a chruthachadh le pròiseasan morphogenetic gun spionnadh. A dh’ aindeoin saothrachadh iom-fhillte diofar earrannan gut taobh a-staigh an tiùba, chan eil sruthadh lionn luminal agus deformachadh meacanaigeach aig a’ mhodail seo cuideachd. A bharrachd air an sin, is dòcha gu bheil obrachadh a’ mhodail cuibhrichte, gu sònraichte às deidh don phròiseas bioprinting a bhith deiseil, a’ cur dragh air suidheachaidhean deuchainneach no eadar-obrachaidhean cealla-gu-cealla. An àite sin, tha am pròtacal a tha sinn a’ moladh a’ toirt seachad morphogenesis gut gun spionnadh, cuideam rùsgadh a tha buntainneach gu fiseòlasach, bith-mheacanaig a bhios ag atharrais air gluasad gut, ruigsinneachd air roinnean apical agus basolateral neo-eisimeileach, agus ath-chruthachadh meanbh-àrainneachdan bith-eòlasach iom-fhillte de mhodalachd. Mar sin, is dòcha gum bi am pròtacal morphogenesis 3D in vitro againn a’ toirt seachad dòigh-obrach co-phàirteach gus faighinn thairis air dùbhlain nan dòighean a th’ ann mar-thà.
Tha ar pròtacal gu tur ag amas air morphogenesis epithelial 3D, le dìreach ceallan epithelial ann an cultar agus gun sheòrsachan eile de cheallan mun cuairt leithid ceallan mesenchymal, ceallan endothelial, agus ceallan dìon. Mar a chaidh a mhìneachadh roimhe, is e cridhe ar pròtacal brosnachadh morphogenesis epithelial le bhith a’ toirt air falbh luchd-bacadh morphogen a tha air an dìomhaireachd aig taobh basolateral a’ mheadhain a chaidh a thoirt a-steach. Ged a leigeas modularachd làidir ar gut-on-a-chip agus hybrid-on-a-chip leinn an sreath epithelial 3D tonnach ath-chruthachadh, tha iom-fhillteachd bith-eòlasach a bharrachd leithid eadar-obrachaidhean epithelial-mesenchymal33,34, tasgadh Matrix extracellular (ECM)35 agus, anns a’ mhodail againn, feartan crypt-villus a bhios a’ giùlan àiteachan cealla gas ann an crypts basal fhathast ri bheachdachadh tuilleadh. Tha ceallan stromal (me, fibroblasts) anns a’ mesenchyme a’ cluich prìomh dhreuchd ann an cinneasachadh phròtainean ECM agus riaghladh morphogenesis intestinal in vivo35,37,38. Cur ri ceallan mesenchymal don mhodail againn, leasaich e am pròiseas morfogenetach agus èifeachdas ceangail cealla. Tha pàirt chudromach aig an t-sreath endothelial (ie, capillaries no lymphatics) ann a bhith a’ riaghladh còmhdhail moileciuil39 agus fastadh cheallan dìon40 ann am microàrainneachd a’ ghut. A bharrachd air an sin, tha co-phàirtean vasculature a dh’ fhaodar a cheangal eadar modalan clò riatanach nuair a thèid modalan clò a dhealbhadh gus eadar-obrachaidhean ioma-organ a nochdadh. Mar sin, is dòcha gum feumar ceallan endothelial a thoirt a-steach gus feartan fiseòlasach nas cruinne a mhodaladh le rùn aig ìre organ. Tha ceallan dìon a thig bho euslaintich cuideachd riatanach airson freagairtean dìonach innte, taisbeanadh antigen, crosstalk dìonach atharrachail innte, agus dìonachd sònraichte do fhigheagan a thaisbeanadh ann an co-theacsa a bhith ag atharrais air galar intestinal.
Tha cleachdadh sgoltagan tar-chinealach nas sìmplidh na gut-on-a-chip leis gu bheil suidheachadh an uidheim nas sìmplidh agus le bhith a’ cleachdadh cuir-a-steach Transwell, faodar epithelium a’ ghut a chultarachadh gu sgèileil. Ach, chan eil cuir-a-steach Transwell a tha rim faighinn gu malairteach le membran polyester elastagach agus chan urrainn dhaibh gluasadan coltach ri peristaltics ath-chruthachadh. A bharrachd air an sin, dh’fhan roinn apical cuir-a-steach Transwell a chaidh a chuir anns a’ chip tar-chinealach gun cuideam rùsgaidh air an taobh apical. Gu soilleir, is ann ainneamh a leigeas na feartan statach anns an roinn apical le co-chultar bacterial fad-ùine ann an sgoltagan tar-chinealach. Ged as urrainn dhuinn morphogenesis 3D a bhrosnachadh gu làidir ann an cuir-a-steach Transwell nuair a bhios sinn a’ cleachdadh sgoltagan tar-chinealach, is dòcha gum bi gainnead bith-mheacanaig a tha buntainneach gu fiseòlasach agus sruthadh lionn apical a’ cuingealachadh comas àrd-ùrlaran sgoltagan tar-chinealach airson tagraidhean a dh’fhaodadh a bhith ann.
Chan eil ath-thogail làn-sgèile de axis crypt-villus daonna ann an cultaran gut-on-a-chip agus hybrid-on-a-chip air an stèidheachadh gu h-iomlan. Leis gu bheil morphogenesis a’ tòiseachadh bho monolayer epithelial, chan eil meanbh-ailtireachd 3D gu riatanach a’ toirt seachad coltas morf-eòlach ri crypts in vivo. Ged a chomharraich sinn an sluagh cealla a bha a’ iomadachadh faisg air raon crypt basal anns an epithelium 3D microinnleadaichte, cha robh na roinnean crypt agus villous air an comharrachadh gu soilleir. Ged a tha seanalan àrda nas àirde air a’ chip ag adhbhrachadh àirde nas àirde den epithelium microinnleadaichte, tha an àirde as àirde fhathast cuibhrichte gu ~300–400 µm. Tha doimhneachd fhìor crypts intestinal daonna anns a’ bhroinn bheag agus mhòr ~135 µm agus ~400 µm, fa leth, agus tha àirde villi a’ bhroinn bhig ~600 µm41.
Bho shealladh ìomhaighean, is dòcha gu bheil ìomhaighean in situ aig rùn-sàr-mhath de mhicro-ailtireachd 3D cuingealaichte ris a’ ghut air sliseag, leis gu bheil an t-astar obrach a tha a dhìth bhon lionsa amas chun an t-sreath epithelial timcheall air beagan mhìlemeatairean. Gus an duilgheadas seo a sheachnadh, is dòcha gum bi feum air amas fad às. A bharrachd air an sin, tha e dùbhlanach earrannan tana a dhèanamh airson ullachadh sampall ìomhaighean air sgàth cho sùbailte ‘s a tha PDMS. A bharrachd air an sin, leis gu bheil meanbh-saothrachaidh sreath-air-shreath a’ ghut air sliseag a’ toirt a-steach greamachadh maireannach eadar gach sreath, tha e air leth dùbhlanach an sreath àrd fhosgladh no a thoirt air falbh gus structar uachdar an t-sreath epithelial a sgrùdadh. Mar eisimpleir, le bhith a’ cleachdadh miocroscop dealanach sganaidh (SEM).
Tha hydrophobicity PDMS air a bhith na fheart cuibhrichte ann an sgrùdaidhean stèidhichte air microfluidic a tha a’ dèiligeadh ri moileciuilean beaga hydrophobic, leis gu bheil PDMS comasach air na moileciuilean hydrophobic sin a ghabhail a-steach gu neo-shònraichte. Faodar beachdachadh air roghainnean eile an àite PDMS le stuthan polymeric eile. Air an làimh eile, faodar beachdachadh air atharrachadh uachdar PDMS (me, còmhdach le stuthan lipophilic 42 no poly(ethylene glycol) 43) gus gabhail ri moileciuilean hydrophobic a lughdachadh.
Mu dheireadh, chan eil an dòigh againn air a bhith air a chomharrachadh gu math a thaobh a bhith a’ toirt seachad sgrìonadh àrd-toraidh no àrd-ùrlar deuchainneach “aon-mheud-a-fhreagras-air-a-h-uile duine” a tha furasta a chleachdadh. Tha am pròtacal làithreach ag iarraidh pumpa steallaire gach micro-inneal, a bhios a’ gabhail àite ann an goireadair CO2 agus a’ cur casg air deuchainnean mòra. Faodar an cuingealachadh seo a leasachadh gu mòr le bhith a’ leudachadh chruthan cultar ùr-ghnàthach (me, cuir-a-steach porous 24-tobar, 96-tobar, no 384-tobar a leigeas le ath-lìonadh leantainneach agus toirt air falbh meadhanan basolateral).
Gus morphogenesis 3D de epithelium intestinal daonna a bhrosnachadh in vitro, chleachd sinn inneal intestinal chip microfluidic anns an robh dà mhicro-sheanail co-shìnte agus membran porous elastagach eatarra gus eadar-aghaidh lumen-capillary a chruthachadh. Bidh sinn cuideachd a’ sealltainn cleachdadh inneal microfluidic aon-seanail (chip hybrid) a bheir seachad sruth basolateral leantainneach fo shreathan epithelial polarichte a tha air fàs air cuir-a-steach Transwell. Anns an dà àrd-ùrlar, faodar morphogenesis diofar cheallan epithelial intestinal daonna a nochdadh le bhith a’ cur an sàs làimhseachadh stiùiridh air sruth gus luchd-bacadh morphogen a thoirt air falbh bhon roinn basolateral. Tha an dòigh-obrach deuchainneach gu lèir (Figear 1) air a dhèanamh suas de chòig pàirtean: (i) microsaothrachadh a’ chip gut no a’ chip hybrid a ghabhas cuir a-steach Transwell (ceumannan 1-5; Bogsa 1), (ii) ullachadh cheallan epithelial intestinal (ceallan Caco-2) no organoids intestinal daonna; bogsaichean 2-5), (iii) cultar cheallan epithelial intestinal air sliseagan intestinal no sliseagan tar-chinealach (ceumannan 6-9), (iv) brosnachadh morphogenesis 3D in vitro (ceum 10) agus (v)) gus meanbh-structar epithelial 3D a chomharrachadh (ceumannan 11-24). Mu dheireadh, chaidh buidheann smachd iomchaidh (air a dheasbad nas fhaide gu h-ìosal) a dhealbhadh gus dearbhadh a dhèanamh air èifeachdas morphogenesis in vitro le bhith a’ dèanamh coimeas eadar morphogenesis epithelial agus smachdan spàsail, sealach, cumhach, no modh-obrach.
Chleachd sinn dà àrd-ùrlar cultar eadar-dhealaichte: gut-on-a-chip le seanalan dìreach no seanalan toinnte neo-loidhneach, no sgoltagan tar-chinealach anns a bheil cuir-a-steach Transwell (TW) ann an inneal microfluidic, air a dhèanamh mar a tha air a mhìneachadh ann am Bogsa 1, agus ceum 1-5. Tha “Dèanamh Innealan” a’ sealltainn na prìomh cheumannan ann a bhith a’ dèanamh aon chip no chip tar-chinealach. Tha “Cultar Cheallan Epithelial Innidh Daonna” a’ mìneachadh stòr nan ceallan (Caco-2 no organoids innidh daonna) agus modh-obrach cultar a thathar a’ cleachdadh sa phròtacal seo. Tha “Morphogenesis In vitro” a’ sealltainn nan ceumannan iomlan anns a bheil ceallan epithelial a thig bho Caco-2 no organoid air an cultarachadh air chip innidh no air cuir-a-steach Transwell de chip tar-chinealach, agus an uairsin a’ toirt a-steach morphogenesis 3D agus cruthachadh structar epithelial air a chomharrachadh. Tha àireamh ceum a’ phrògraim no àireamh a’ bhogsa air a thaisbeanadh fo gach saighead. Tha an tagradh a’ toirt seachad eisimpleirean de mar as urrainnear sreathan epithelial innidh stèidhichte a chleachdadh, mar eisimpleir, ann an comharrachadh eadar-dhealachaidh cealla, sgrùdaidhean fiseòlas innidh, stèidheachadh eag-shiostaman aoigh-microbiome, agus modaladh ghalaran. Immunofluorescence ìomhaighean ann an “Cell Differentiation” a’ sealltainn niuclasan, F-actin agus MUC2 air an cur an cèill anns an t-sreath epithelial 3D Caco-2 a chaidh a chruthachadh air a’ chip gut. Tha comharradh MUC2 an làthair ann an ceallan goblet agus mucus air a leigeil ma sgaoil bho uachdar mucosal. Tha ìomhaighean fluorescent ann an Gut Physiology a’ sealltainn mucus air a thoirt gu buil le bhith a’ dathadh airson searbhag sialic agus fuigheall N-acetylglucosamine a’ cleachdadh agglutinin germ cruithneachd fluorescent. Tha an dà ìomhaigh a tha a’ dol thairis air a chèile ann an “Host-Microbe Co-Cultures” a’ sealltainn co-chultaran riochdachail aoigh-microbiome anns a’ ghut air chip. Tha am pannal clì a’ sealltainn co-chultar E. coli a’ cur an cèill pròtain fluorescent uaine (GFP) le ceallan epithelial 3D Caco-2 air an innleadaireachd gu mòr. Tha am pannal deas a’ sealltainn suidheachadh GFP E. coli air a cho-chultarachadh le ceallan epithelial 3D Caco-2, agus an uairsin air a dhathadh immunofluorescence le F-actin (dearg) agus niuclasan (gorm). Tha modaladh galair a’ nochdadh gut fallain an aghaidh gut aoidionach ann an sliseagan sèid gut fo dhùbhlan fiseòlasach le antigens bacterial (me, lipopolysaccharide, LPS) agus ceallan dìon (me, PBMC; uaine).Chaidh ceallan Caco-2 a chultarachadh gus sreath epithelial 3D a stèidheachadh.Bàr-sgèile, 50 µm.Ìomhaighean anns an t-sreath gu h-ìosal: “Eadar-dhealachadh cheallan” air atharrachadh le cead bho iomradh.2. Oxford University Press; Air ath-riochdachadh le cead bho Ref.5. NAS; “Co-Chultar Host-Microbe” air atharrachadh le cead bho iomradh.3. NAS; “Modaladh Galar” air atharrachadh le cead bho iomradh.5. NAS.
Chaidh sgoltagan gut-on-chip agus hibrid a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh leth-bhreacan PDMS a chaidh a thoirt a-mach à molltairean silicon le lithography bog1,44 agus air am pàtranadh le SU-8. Tha dealbhadh nam meanbh-sheanalan anns gach sgolt air a dhearbhadh le bhith a’ beachdachadh air hydrodynamics leithid cuideam rùsgaidh agus cuideam hydrodynamic1,4,12. Tha an dealbhadh gut-on-a-chip tùsail (Figear Dàta Leudaichte 1a), a bha air a dhèanamh suas de dhà mhicro-sheanal dìreach co-shìnte ri taobh a chèile, air a thighinn gu bhith na gut-on-a-chip iom-fhillte (Figear Dàta Leudaichte 1b) anns a bheil paidhir de mhicro-sheanalan lùbte gus ùine còmhnaidh fluid nas motha, pàtrain sruthadh neo-loidhneach, agus deformachadh ioma-axial de cheallan cultarach (Figear 2a–f)12 a bhrosnachadh. Nuair a dh’ fheumar bith-mheacanaig gut nas iom-fhillte ath-chruthachadh, faodar gut-on-a-chips iom-fhillte a thaghadh. Tha sinn air sealltainn gu bheil an Gut-Chip toinnte cuideachd ag adhbhrachadh morphogenesis 3D gu làidir ann an frèam-ama coltach ris le ìre coltach ri fàs epithelial an taca ris an fhear thùsail. Gut-Chip, ge bith dè an seòrsa cealla a chaidh a chultarachadh. Mar sin, gus morphogenesis 3D a bhrosnachadh, tha dealbhadh gut air-chip loidhneach agus iom-fhillte eadar-ghluasadach. Thug leth-bhreacan PDMS air an leigheas air molltairean silicone le pàtrain SU-8 feartan àicheil às deidh an toirt air falbh (Figear 2a). Gus an gut air chip a dhèanamh, chaidh an sreath PDMS àrd ullaichte a cheangal gu sreathmhor ri film PDMS porous agus an uairsin a cho-thaobhadh ris an t-sreath PDMS ìosal le ceangal neo-atharrachail a’ cleachdadh inneal-làimhseachaidh corona (Figear 2b–f). Gus sliseagan tar-chinealach a dhèanamh, chaidh leth-bhreacan PDMS leigheasach a cheangal ri sleamhnagan glainne gus innealan microfluidic aon-sianal a chruthachadh a dh’ fhaodadh a bhith a’ gabhail ri cuir-a-steach Transwell (Figear 2h agus Dàta Leudaichte Figear 2). Tha am pròiseas ceangail air a dhèanamh le bhith a’ làimhseachadh uachdar an leth-bhreac PDMS agus glainne le plasma ocsaidean no làimhseachadh corona. Às deidh sterilachadh an inneil microsaothraichte a bha ceangailte ris an tiùb silicone, bha suidheachadh an inneil deiseil airson morphogenesis 3D den epithelium intestinal a dhèanamh (Figear 2g).
a, Dealbh sgemataigeach de ullachadh phàirtean PDMS bho mhullaichean silicon le pàtran SU-8. Chaidh am fuasgladh PDMS neo-leigheasta a dhòrtadh air molltair silicon (clì), a leigheas aig 60 °C (meadhan) agus a thoirt às a’ mhullaich (deas). Chaidh am PDMS a chaidh a thoirt às a’ mhullaich a ghearradh na phìosan agus a ghlanadh airson a chleachdadh a-rithist.b, Dealbh den mhulltair silicon a chaidh a chleachdadh gus an ìre àrd de PDMS ullachadh.c, Dealbh den mhulltair silicon a chaidh a chleachdadh gus am membran porous PDMS a dhèanamh.d, Sreath de dhealbhan de na pàirtean PDMS àrda is ìosal agus an inneal intestinal air-chip a chaidh a chruinneachadh.e, Dealbh sgemataigeach de cho-thaobhadh nam pàirtean PDMS àrda, membranach is ìosal. Tha gach ìre ceangailte gu neo-sheasmhach le làimhseachadh plasma no corona.f, Dealbh sgemataigeach den inneal gut-on-a-chip a chaidh a dhèanamh le meanbh-sheanalan fillte agus seòmraichean falamh air an cur thairis.g, Suidheachadh gut-on-a-chip airson cultar cealla microfluidic. Chaidh an gut air chip a chaidh a dhèanamh a chaidh a chruinneachadh le tiùb silicone agus steallaire a chuir air còmhdach-slip. Chaidh an inneal chip a chuir air an mullach mias Petri 150 mm airson giollachd. Tha an ceanglaiche air a chleachdadh gus an tiùb silicone a dhùnadh.h, Dealbhan-sgrìn lèirsinneach de dhèanamh sliseagan tar-chinealach agus morphogenesis 3D a’ cleachdadh sliseagan tar-chinealach. Chaidh cuir-a-steach Transwell a chaidh ullachadh gu neo-eisimeileach gus monolayers 2D de cheallan epithelial intestinal a chultarachadh a chuir a-steach don chip tar-chinealach gus morphogenesis 3D intestinal a bhrosnachadh. Tha am meadhan air a shruthadh tro mhicro-sheanalan fon t-sreath cealla a chaidh a stèidheachadh air cuir-a-steach Transwell. Bàr sgèile, 1 cm.h Air ath-chlò-bhualadh le cead bho iomradh.4. Elsevier.
Anns a’ phròtacal seo, chaidh loidhne cealla Caco-2 agus organoids intestinal a chleachdadh mar thùsan epithelial (Figear 3a). Chaidh an dà sheòrsa cealla a chultarachadh gu neo-eisimeileach (Bogsa 2 agus Bogsa 5) agus chaidh an cleachdadh gus na meanbh-sheanalan còmhdaichte le ECM de chuir-a-steach gut air-chip no Transwell a shìolachadh. Nuair a bhios ceallan co-shruthach (> 95% còmhdach ann am flasgaichean), thèid ceallan Caco-2 a chaidh a chultarachadh gu cunbhalach (eadar slighean 10 agus 50) ann am flasgaichean-T a bhuain gus crochaidhean cealla dealaichte ullachadh le lionn trypsinization (bogsa 2). Chaidh organoids intestinal daonna bho bhithopsies intestinal no resections lannsaichte a chultarachadh ann an cruinneagan sgafaill Matrigel ann am pleitean 24-tobar gus taic a thoirt don mhicro-àrainneachd structarail. Chaidh meadhan anns a bheil morphogens riatanach (leithid Wnt, R-spondin, agus Noggin) agus factaran fàis air an ullachadh mar a chaidh a mhìneachadh ann am Bogsa 3 a chur ris a h-uile latha eile gus an do dh’fhàs na h-organoids gu ~500 µm ann an trast-thomhas. Thèid organoids làn-fhàs a bhuain agus a sgaradh ann an ceallan singilte airson a’ cur sìol air cuir-a-steach gut no Transwell air sliseag (Bogsa 5). Mar a dh’innis sinn roimhe, faodar a dhealachadh a rèir seòrsa galair12,13 (me colitis ulcerative, galar Crohn, aillse colorectal, no tabhartaiche àbhaisteach), làrach lesion (me, lesion an aghaidh raon neo-lesion) agus àite gastrointestinal anns an t-slighe (me, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, no rectum). Tha sinn a’ toirt seachad protocol leasaichte ann am Bogsa 5 airson organoids colonic (coloids) a chultarachadh a bhios mar as trice ag iarraidh dùmhlachdan nas àirde de morphogens na organoids caolan beag.
a, Sruth-obrach airson morphogenesis gut a bhrosnachadh anns a’ chip gut. Tha epithelium intestinal daonna Caco-2 agus organoids intestinal air an cleachdadh sa phròtacal seo gus morphogenesis 3D a nochdadh. Chaidh na ceallan epithelial iomallach a chur san inneal gut-on-a-chip ullaichte (ullachadh chip). Cho luath ‘s a thèid ceallan a chur (sìolachadh) agus a cheangal (ceangailte) ris a’ membran porous PDMS air latha 0 (D0), thèid sruthadh apical (AP) a thòiseachadh agus a chumail suas airson a’ chiad 2 latha (sruthadh, AP, D0-D2). Tha sruthadh basolateral (BL) cuideachd air a thòiseachadh còmhla ri gluasadan sìneadh cearcallach (sìneadh, sruthadh, AP agus BL) nuair a thèid monolayer 2D iomlan a chruthachadh. Thachair morphogenesis 3D intestinal gu spontaineach às deidh 5 latha de chultar microfluidic (morphogenesis, D5). Tha ìomhaighean eadar-dhealachaidh ìre a’ sealltainn morphogenesis riochdachail de cheallan Caco-2 aig gach ceum deuchainneach no puing ùine (graf bàr, 100 µm). Ceithir diagraman sgemataigeach a’ mìneachadh nan easan co-fhreagarrach de morphogenesis gut (gu h-àrd air an làimh dheis). An dashed Tha saighdean san sgeama a’ riochdachadh stiùireadh sruthadh na leaghan.b, Ìomhaigh SEM a’ sealltainn topo-eòlas uachdar an epithelium Caco-2 3D a chaidh a stèidheachadh (clì). Tha an t-inset a tha a’ soilleireachadh an raoin mheudaichte (bogsa geal le stiallan) a’ sealltainn na microvilli ath-nuadhaichte air an t-sreath Caco-2 3D (deas).c, Sealladh aghaidh chòmhnard de Caco-2 3D a chaidh a stèidheachadh, claudin (ZO-1, dearg) agus membranan crìche bruis leantainneach le bileagan F-actin (uaine) agus niuclasan (gorm) Lèirsinn confocal immunofluorescence de cheallan epithelial air sliseagan intestinal. Tha saighdean a’ comharrachadh an sgeama mheadhain a’ comharrachadh àite a’ phlèana fhòcasach airson gach sealladh confocal.d, Cùrsa ùine atharrachaidhean morf-eòlach ann an organoids air an cultar air sliseag a fhuaireadh le microscopy eadar-dhealachaidh ìre air làithean 3, 7, 9, 11, agus 13. Tha an t-inset (gu h-àrd air an làimh dheis) a’ sealltainn meudachadh àrd na h-ìomhaigh a chaidh a thoirt seachad.e, Photomicrograph DIC de epithelium 3D organoid a chaidh a stèidheachadh anns a’ ghut air sliseag a chaidh a thogail air latha 7.f, Ìomhaighean immunofluorescence thairis air an cur thairis a’ sealltainn comharran airson ceallan gas (LGR5; magenta), ceallan goblet (MUC2; uaine), F-actin (liath) agus niuclasan (cyan) air an fàs air sliseagan gut airson 3 latha, fa leth (Clì) agus organoids 13-latha (meadhan) air an t-sreath epithelial. Faic cuideachd Dàta Leudaichte Figear 3, a tha a’ soilleireachadh comharran LGR5 às aonais comharran MUC2. Dealbhan fluorescence a’ sealltainn meanbh-structar epithelial (deas) de epithelium organoid 3D a chaidh a stèidheachadh anns a’ ghut air sliseag le bhith a’ dathadh an membran plasma le dath CellMask (deas) air latha 13 de chultar. Tha am bàr sgèile 50 μm mura h-eilear ag ràdh a chaochladh. b Air ath-chlò-bhualadh le cead bho iomradh. 2. Oxford University Press; c Air atharrachadh le cead bho Iomradh. 2. Oxford University Press; e agus f air an atharrachadh le cead le iomradh. 12 Fo Chead Creative Commons CC BY 4.0.
Anns a’ ghut air sliseag, tha e riatanach uachdar hydrophobic membran porous PDMS atharrachadh airson còmhdach ECM soirbheachail. Anns a’ phròtacal seo, bidh sinn a’ cleachdadh dà dhòigh eadar-dhealaichte gus hydrophobicity membranes PDMS atharrachadh. Airson ceallan Caco-2 a chultarachadh, bha gnìomhachadh uachdar le làimhseachadh UV / òson leis fhèin gu leòr gus hydrophobicity uachdar PDMS a lughdachadh, an ECM a chòmhdach agus ceallan Caco-2 a cheangal ris a’ membran PDMS. Ach, feumaidh cultar microfluidic de epithelium organoid gnìomhachd uachdar stèidhichte air ceimigean gus tasgadh èifeachdach de phròtainean ECM a choileanadh le bhith a’ cur polyethyleneimine (PEI) agus glutaraldehyde an sàs gu sreathmhor ann am microchannels PDMS. Às deidh atharrachadh uachdar, chaidh pròtainean ECM a thasgadh gus uachdar PDMS gnìomhaichte a chòmhdach agus an uairsin a thoirt a-steach don epithelium organoid iomallach. Às deidh na ceallan a bhith ceangailte, bidh cultar cealla microfluidic a’ tòiseachadh le bhith a’ perfusing dìreach am meadhan a-steach don microchannel àrd gus am bi na ceallan a’ cruthachadh monolayer iomlan, fhad ‘s a chumas am microchannel ìosal suidheachaidhean statach. Leigidh an dòigh leasaichte seo airson gnìomhachadh uachdar agus còmhdach ECM le ceangal organoid epithelium gus morphogenesis 3D a bhrosnachadh air uachdar PDMS.
Feumaidh cultaran Transwell còmhdach ECM cuideachd mus tèid ceallan a chur; ge-tà, chan fheum cultaran Transwell ceumannan ro-làimhseachaidh iom-fhillte gus uachdar nan cuir-a-steach porous a ghnìomhachadh. Airson ceallan Caco-2 fhàs air cuir-a-steach Transwell, bidh còmhdach ECM air cuir-a-steach porous a’ luathachadh ceangal cheallan Caco-2 neo-cheangailte (<1 uair a thìde) agus cruthachadh bacadh teann snaim (<1-2 latha). Gus organoids a fhàs air cuir-a-steach Transwell, thèid organoids iomallach a chur air cuir-a-steach còmhdaichte le ECM, a cheangal ri uachdar a’ membran (<3 uair a thìde) agus a chumail suas gus am bi na h-organoids a’ cruthachadh monolayer iomlan le ionracas bacadh. Thèid cultaran Transwell a dhèanamh ann am pleitean 24-tobar gun a bhith a’ cleachdadh sgoltagan tar-chinealach.
Faodar morphogenesis 3D in vitro a thòiseachadh le bhith a’ cur sruthadh leaghan an sàs ann an taobh basolateral de shreath epithelial stèidhichte. Anns a’ ghut air sliseag, thòisich morphogenesis epithelial nuair a chaidh am meadhan a phumpadh a-steach do na microchannels àrda is ìosal (Figear 3a). Mar a chaidh a mhìneachadh roimhe, tha e deatamach sruthadh leaghan a thoirt a-steach don roinn ìochdarach (basolateral) airson cuir às leantainneach de luchd-bacadh morphogen dìomhair stiùirichte. Gus beathachadh agus serum gu leòr a thoirt do cheallan a tha ceangailte ri membranan porous agus gus cuideam rùsgaidh luminal a chruthachadh, mar as trice bidh sinn a’ cur sruthadh dùbailte an sàs anns a’ ghut air sliseag. Ann an sliseagan tar-chinealach, chaidh cuir-a-steach Transwell anns an robh monolayers epithelial a chuir a-steach do na sliseagan tar-chinealach. An uairsin, chaidh am meadhan a chuir an sàs fo thaobh basolateral an cuir-a-steach Transwell porous tron ​​​​​​microchannel. Thachair morphogenesis intestinal 3-5 latha às deidh tòiseachadh sruthadh basolateral anns an dà àrd-ùrlar cultar.
Faodar feartan morf-eòlach sreathan epithelial 3D meanbh-innleadaichte a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh diofar mhodhan ìomhaighean, a’ gabhail a-steach microscopaidh eadar-dhealachaidh ìre, microscopaidh eadar-dhealachaidh eadar-theachd eadar-dhealaichte (DIC), SEM, no microscopaidh confocal immunofluorescence (Figearan 3 agus 4). Faodar ìomhaighean eadar-dhealachaidh ìre no DIC a dhèanamh gu furasta aig àm sam bith rè cultar gus sùil a chumail air cumadh agus ro-shealladh sreathan epithelial 3D. Air sgàth follaiseachd optigeach PDMS agus filmichean polyester, faodaidh an dà chuid àrd-ùrlaran gut-on-a-chip agus chip hybrid ìomhaighean fìor-ùine in situ a thoirt seachad gun fheum air roinneadh no dì-chruinneachadh an inneil. Nuair a bhios ìomhaighean immunofluorescence gan dèanamh (Figearan 1, 3c, f agus 4b, c), mar as trice bidh ceallan air an socrachadh le 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), agus an uairsin Triton X-100 agus 2% (wt/vol) ) albumin serum bovine (BSA), ann an òrdugh. A rèir an t-seòrsa cealla, faodar diofar shocraichean, treòitearan, agus riochdairean bacadh a chleachdadh. Antibodies bun-sgoile a’ targaideadh Bithear a’ cleachdadh comharran cealla no roinne a tha an urra ri loidhne-shliochd gus ceallan a tha air an gluasad in situ air a’ chip a shoilleireachadh, agus an uairsin antibodies àrd-sgoile còmhla ri dath-aghaidh a tha ag amas air an dàrna cuid niùclas (me, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) no F-actin (me, phalloidin le bileag fluorescent). Faodar ìomhaighean beò stèidhichte air fluorescence a dhèanamh in situ cuideachd gus cinneasachadh mucus a lorg (Figear 1, “Eadar-dhealachadh cealla” agus “Fiseòlas gut”), coloineachadh air thuaiream de cheallan meanbh-fhàs-bheairtean (Figear 1, “Co-chultar aoigh-mheanbh-fhàs-bheairtean”), fastadh cheallan dìon (Figear 1, ‘Modaladh Galar’) no cumaidhean morf-eòlas epithelial 3D (Figear 3c,f agus 4b,c). Nuair a bhios tu ag atharrachadh a’ ghut air a’ chip gus an ìre àrd a sgaradh bhon ìre microchannel as ìsle, mar a tha air a mhìneachadh ann an ref. Mar a chithear ann am Figear 2, faodar morf-eòlas epithelial 3D a bharrachd air na microvilli air a’ chrìoch bhruis apical fhaicinn le SEM. (Figear 3b). Faodar measadh a dhèanamh air mar a tha comharran eadar-dhealachaidh gan cur an cèill le bhith a’ dèanamh PCR5 cainneachdail no sreath RNA aon-chealla. Anns a’ chùis seo, bidh sreathan 3D de cheallan epithelial a chaidh fhàs ann an sgoltagan gut no sgoltagan tar-chinealach air am buain le trypsinachadh agus an uairsin air an cleachdadh airson mion-sgrùdadh moileciuil no ginteil.
a, Sruth-obrach airson morphogenesis intestinal a bhrosnachadh ann an sliseag hibrid. Tha Caco-2 agus organoids intestinal air an cleachdadh sa phròtacal seo gus morphogenesis 3D a nochdadh ann an àrd-ùrlar sliseag hibrid. Chaidh ceallan epithelial sgaraichte a chur ann an cuir-a-steach Transwell ullaichte (ullachadh TW; faic an dealbh gu h-ìosal). Aon uair ‘s gun deach ceallan a chur ann an sìol (sìol) agus a cheangal ri membran polyester ann an cuir-a-steach Transwell, chaidh na ceallan uile a chultarachadh fo chumhachan statach (cultar TW). Às deidh 7 latha, chaidh cuir-a-steach Transwell singilte anns an robh monolayer 2D de cheallan epithelial a thoirt a-steach do sliseag hibrid gus sruthadh basolateral a thoirt a-steach (Flow, BL), a lean gu gineadh sreath epithelial 3D (morphogenesis). Micreagrafan eadar-dhealachaidh ìre a’ sealltainn feartan morphologach de cheallan epithelial organ daonna a thàinig bho choloin tabhartaiche àbhaisteach (loidhne C103) a’ dìreadh aig gach ceum deuchainneach no puing ùine. Tha na sgeamaichean anns na sreathan àrda a’ sealltainn an rèiteachadh deuchainneach airson gach ceum.b, Faodaidh sliseagan hibrid (sgeama clì) leantainn gu morphogenesis 3D de cheallan epithelial organoid le Seallaidhean maicreasgopaidh confocal bho mhullach gu bonn air an togail aig diofar shuidheachaidhean Z (àrd, meadhan, agus ìosal; faic an sgeama deas agus na loidhnichean dotaichte co-fhreagarrach). sheall iad feartan morf-eòlach follaiseach. F-actin (cyan), niùclas (liath). c, Micreagrafan confocal fluorescence (sealladh ceàrnach 3D) de cheallan epithelial a thàinig bho organoid air an cultar ann an Transwell statach (TW; cuir a-steach taobh a-staigh bogsa geal le stiallan) an aghaidh sliseag tar-chinealach (an dealbh slàn as motha) a’ dèanamh coimeas eadar morf-eòlas 2D an aghaidh 3D, fa leth. Tha paidhir de sheallaidhean gearraidh-tarsainn dìreach 2D (cuir a-steach san oisean gu h-àrd air an làimh dheis; “XZ”) cuideachd a’ sealltainn feartan 2D agus 3D. Bàr sgèile, 100 µm. c Air ath-chlò-bhualadh le cead bho iomradh. 4. Elsevier.
Faodar smachdan ullachadh le bhith a’ cultar nan aon cheallan (Caco-2 no ceallan epithelial organoid intestinal) ann an sreathan mono dà-thaobhach fo chumhachan cultar statach àbhaisteach. Gu sònraichte, dh’ fhaodadh crìonadh beathachaidh tachairt air sgàth comas meud cuibhrichte nan meanbh-sheanalan (ie ~4 µL anns a’ phrìomh sheanal air an dealbhadh gut-chip tùsail). Mar sin, faodar morf-eòlas epithelial ro agus às deidh cur an sàs sruth basolateral a choimeas cuideachd.
Bu chòir am pròiseas litagrafaireachd bog a dhèanamh ann an seòmar glan. Airson gach sreath air a’ chip (sreathan àrda is ìosal agus membranan) agus sgoltagan tar-chinealach, chaidh diofar mhasgaichean-foto a chleachdadh agus a dhèanamh air wafers silicon fa leth leis gu robh àirdean nan seanalan beaga eadar-dhealaichte. Tha àirdean targaid nan seanalan beaga àrda is ìosal den ghut air a’ chip 500 µm agus 200 µm, fa leth. Tha àirde targaid seanail a’ chip tar-chinealach 200 µm.
Cuir uabhar silicon 3-òirleach ann am mias le acetone. Cuairtich am plàta gu socair airson 30 diogan, an uairsin tiormaich an uabhar san adhar. Gluais an uabhar gu plàta le IPA, an uairsin snìomh am plàta airson 30 diogan airson a ghlanadh.
Faodar fuasgladh piranha (measgachadh de haidridean piorocsaid agus searbhag sulfarach dùmhail, 1:3 (vol/vol)) a chleachdadh gu roghainneil gus an ìre as motha de dh’fhuasgladh organach a thoirt air falbh bho uachdar a’ chliath-shìonaig.
Tha fuasgladh piranha gu math creimneach agus a’ gineadh teas. Feumar ceumannan sàbhailteachd a bharrachd. Airson faighinn cuidhteas sgudail, leig leis an fhuasgladh fuarachadh agus gluais e gu soitheach sgudail glan, tioram. Cleachd soithichean àrd-sgoile agus cuir bileagan ceart air soithichean sgudail. Feuch an lean thu stiùiridhean sàbhailteachd an ionaid airson modhan-obrach nas mionaidiche.
Tiormaich na wafers le bhith gan cur air truinnsear teth 200 °C airson 10 mionaidean. Às dèidh tiormachadh, chaidh an wafer a chrathadh còig tursan san adhar gus fuarachadh.
Dòirt timcheall air 10g de photoresist SU-8 2100 air meadhan a’ chliath-shìonaig a chaidh a ghlanadh. Cleachd clobhaichean gus an photoresist a sgaoileadh gu cothromach air a’ chliath-shìonaig. Aig amannan cuir a’ chliath-shìonaig air truinnsear teth 65°C gus am bi an photoresist nas lugha steigeach agus nas fhasa a sgaoileadh. Na cuir a’ chliath-shìonaig gu dìreach air a’ phlàta teth.
Chaidh SU-8 a sgaoileadh gu cothromach air an wafer le bhith a’ ruith snìomh-chòmhdach. Prògramaich rothlachd a-steach den SU-8 airson 5–10 diogan gus sgaoileadh aig 500 rpm aig luathachadh de 100 rpm/s. Suidhich am prìomh snìomh airson pàtranachadh tiugh 200 µm aig 1,500 rpm, no coilean tiugh 250 µm (a’ dèanamh àirde 500 µm airson an ìre as àirde den ghut air a’ chip; faic “Ceumannan deatamach” gu h-ìosal) air a shuidheachadh aig luathachadh de 300 rpm/s 30 diogan aig 1,200 rpm.
Faodar prìomh astar an snìomh atharrachadh a rèir tighead targaid pàtran SU-8 air a’ chliath-shìonaig.
Gus pàtrain SU-8 de dh’àirde 500 µm a dhèanamh airson an ìre as àirde den ghut air a’ chip, chaidh na ceumannan còmhdach snìomh agus bèicearachd bog den bhogsa seo (ceumannan 7 agus 8) ath-aithris às dèidh a chèile (faic ceum 9) gus dà shreath de shreath 250 µm de thighead de SU-8 a thoirt gu buil, a ghabhas sreathan a chur còmhla agus a cheangal ri chèile le bhith gan nochdadh do sholas UV ann an ceum 12 den bhogsa seo, a’ dèanamh sreath 500 µm a dh’àirde.
Bèicear na wafers còmhdaichte le SU-8 gu socair le bhith gan cur gu faiceallach air truinnsear teth aig 65 °C airson 5 mionaidean, an uairsin atharraich an suidheachadh gu 95 °C agus goir airson 40 mionaid a bharrachd.
Gus àirde 500 μm den phàtran SU-8 a choileanadh anns a’ mhicro-sheanal àrd, ath-aithris ceumannan 7 agus 8 gus dà shreath SU-8 250 μm de thighead a chruthachadh.
A’ cleachdadh an UV Mask Aligner, dèan deuchainn lampa a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh gus ùine nochdaidh a’ wafer obrachadh a-mach. (ùine nochdaidh, ms) = (dòs nochdaidh, mJ/cm2)/(cumhachd lampa, mW/cm2).
Às dèidh dhut an ùine nochdaidh a dhearbhadh, cuir am masg-foto air giùlan masg an ailineadair masg UV agus cuir am masg-foto air an uabhar còmhdaichte le SU-8.
Cuir uachdar clò-bhuailte an foto-masg gu dìreach air taobh còmhdaichte le SU-8 den wafer silicon gus sgaoileadh UV a lughdachadh.
Nochdaich an uabhar còmhdaichte le SU-8 agus am foto-masg gu dìreach ri 260 mJ/cm2 de sholas UV airson na h-ùine nochdaidh ro-shuidhichte (faic ceum 10 den bhogsa seo).
Às dèidh nochdadh do sholas UV, chaidh uaifearan silicon còmhdaichte le SU-8 a bhèicearachd aig 65°C airson 5 mionaidean agus 95°C airson 15 mionaidean air gach truinnsear teth gus pàtrain a dhèanamh le àirde 200 μm. Leudaich an ùine iar-bhèicearachd aig 95°C gu 30 mionaid gus pàtrain a dhèanamh le àirde 500 µm.
Tha an leasaiche air a dhòrtadh a-steach do mhias glainne, agus tha an t-uaifear bèiceichte air a chur anns a’ mhias. Faodaidh meud an leasaiche SU-8 atharrachadh a rèir meud a’ phlàta glainne. Dèan cinnteach gun cleachd thu gu leòr de leasaiche SU-8 gus SU-8 neo-fhoillsichte a thoirt air falbh gu tur. Mar eisimpleir, nuair a bhios tu a’ cleachdadh mias glainne le trast-thomhas de 150 mm agus comas 1 L, cleachd ~300 mL de leasaiche SU-8. Leasaich am molltair airson 25 mionaidean le rothladh socair bho àm gu àm.
Sruthlaich am molltair a chaidh a leasachadh le ~10 mL de leasaiche ùr agus an uair sin IPA le bhith a’ frasadh an fhuasglaidh le pipette.
Cuir an wafer ann an inneal-glanaidh plasma agus nochd e do phlasma ocsaidean (gas àileach, cuideam targaid 1 × 10−5 Torr, cumhachd 125 W) airson 1.5 mionaid.
Cuir an t-uaif ann an tiormaiche falamh le sleamhnag glainne a-staigh. Faodar uaifearan agus sleamhnagan a chur taobh ri taobh. Ma tha an tiormaiche falamh air a roinn ann an grunn shreathan le plàta, cuir na sleamhnagan anns an t-seòmar ìosal agus na h-uaifearan anns an t-seòmar uachdarach. Leig às 100 μL de fhuasgladh trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane air sleamhnag glainne agus cuir falamh an sàs airson silanachadh.
Leagh fial de cheallan Caco-2 reòta ann an amar-uisge 37°C, agus an uair sin gluais na ceallan leaghte gu flasg T75 anns a bheil 15 mL de mheadhan Caco-2 ro-theth aig 37°C.
Gus ceallan Caco-2 a thoirt seachad aig ~90% co-shruthadh, blàthaich an toiseach meadhan Caco-2, PBS, agus 0.25% trypsin/1 mM EDTA ann an amar-uisge 37°C.
Tarraing a-mach am meadhan le tarraing falamh. nigh na ceallan dà uair le 5 mL de PBS blàth le bhith ag ath-aithris an tarraing falamh agus a’ cur PBS ùr ris.