Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Chan eil mòran taic aig an tionndadh brobhsair a tha thu a’ cleachdadh airson CSS. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir dheth modh co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). San eadar-ama, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, seallaidh sinn an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
Tha feum air an structar sònraichte seo gus homeostasis gut a chumail suas le bhith a’ dìon an àite cealla-cealla anns a’ chrios basal bho antigens microbial exogenous agus na metabolites aca. Gu sònraichte, faodaidh an gut-on-a-chip mimetic organach morphogenesis 3D spontaneous den epithelium intestinal a bhrosnachadh le gnìomhan eòlas-inntinn leasaichte agus biomechanics. co-2 no ceallan epithelial organoid intestinal ann an suidheachaidhean gnàthach a bharrachd air àrd-ùrlar microfluidic, inntrigeadh morphogenesis 3D, agus comharrachadh epithelia 3D stèidhichte a’ cleachdadh modhan ioma-ìomhaigheachd. Tha sinn a’ faicinn gum faodadh builean farsaing a bhith aig a’ phròtacal a tha sinn a’ moladh don choimhearsnachd rannsachaidh bith-mheidigeach, a’ toirt seachad dòigh gus sreathan epithelial intestinal 3D ath-nuadhachadh ann an vitro airson tagraidhean bith-mheidigeach, clionaigeach agus cungaidh-leigheis.
Tha deuchainnean a’ sealltainn gum faod ceallan Caco-2 epithelial intestinal a tha air an àiteachadh ann an gut-on-a-chip1,2,3,4,5 no innealan microfluidic bilayer6,7 a dhol tro morphogenism 3D spontaneous in vitro gun tuigse shoilleir air an inneal bunaiteach. air a dhearbhadh le Caco-2 agus organoids intestinal a thig bho euslaintich.Anns an sgrùdadh seo, chuir sinn fòcas gu sònraichte air cinneasachadh cealla agus cuairteachadh dùmhlachd antagonist cumhachdach Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), ann an gut-on-a-chip agus innealan microfluidic atharraichte anns a bheil cuir a-steach Transwell, ris an canar “Hybrid Chip”. Tha Soggy-1) chun an t-sgoltadh air-chip a 'bacadh morphosis no a' cur dragh air an t-sreath epithelial 3D ro-structaraichte, a 'moladh gu bheil cuideam antagonistic rè cultar an urra ri morphogenesis intestinal in vitro. -a-chip àrd-chabhsairean) no sgaoilidh .Basolateral meadhanan (me, bho Transwell cuir a-steach a-steach mòr basolateral lochan-tasgaidh ann an tobraichean).
Anns a’ phròtacal seo, tha sinn a’ toirt seachad dòigh mhionaideach airson a bhith a’ saothrachadh microdevices gut-on-a-chip agus sgoltagan tar-chinealach Transwell-insertable (ceumannan 1-5) gus ceallan epithelial intestinal a chultar air membranan porous stèidhichte air polydimethylsiloxane (PDMS) (ceumannan 6A, 7A, 8, 9) no buill-bodhaig polyester de Transwell inserts, 73B, in-steidhidh B, 73 (ceumannan 6A, 7A, 8, 9) no polyester membranes de Transwell a-steach, ceum 7, 73, 73 agus 73. in vitro (ceum 10). Chomharraich sinn cuideachd feartan ceallach is moileciuil a tha a’ nochdadh histogenesis a tha sònraichte do fhighe agus eadar-dhealachadh cealla a tha an urra ri loidhne le bhith a’ cleachdadh modhan ioma-ìomhaigheachd (ceumannan 11-24). Gus morphogenesis 3D a thoirt a-steach bho monolayers epithelial 2D, thug sinn air falbh antagonists morphogen anns an dà chruth cultarach le bhith a’ sruthadh a-steach don roinn basolateral den chultar. gabhaltachd, leòn sèid, eas-òrdugh cnap-starra epithelial, agus leigheasan stèidhichte air probiotic Example.buaidhean.
Faodaidh am protocol againn a bhith feumail do raon farsaing de luchd-saidheans ann am bun-buaidh fharsaing (me, bith-eòlas mucosal intestinal, bith-eòlas cealla gas, agus bith-eòlas leasachaidh) agus rannsachadh gnìomhaichte (me, deuchainn dhrogaichean preclinical, modaladh galair, innleadaireachd clò, agus gastroenterology) buaidh fharsaing. A bharrachd air an sin, tha am protocol againn feumail airson a bhith a’ sgrùdadh ghalaran fo dhiofar riochdairean gabhaltach leithid Norovirus 8, Syndrome analach Trom Acrach Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 no Vibrio cholerae.Faodaidh cleachdadh siostam microphysiology gut air-chip cead a thoirt do cho-chultar fad-ùine 10 agus measadh às deidh sin air dìon aoigheachd, freagairtean dìon agus càradh leòn co-cheangailte ri pathogen anns an t-slighe gastrointestinal (GI) 11 . Tha sreathan epithelial air an ullachadh le bhith a’ cleachdadh sreathan epithelial intestinal 3D an euslaintich, tha na galairean sin a’ toirt a-steach atrophy villous, giorrachadh crypto, milleadh mucosal, no cnap-starra epithelial le duilgheadas.Biopsy no organoids intestinal stèidhichte air gas12,13. microarchitectures villus-crypt.ceallan dìon sònraichte, 5.
Leis gum faodar microstructure epithelial 3D a shuidheachadh agus fhaicinn às aonais a’ phròiseas roinneachaidh, is dòcha gum biodh ùidh aig luchd-amhairc a tha ag obair air tar-sgrìobhadh spàsail agus ìomhaighean àrd-rèiteachaidh no àrd-rèiteachaidh anns a’ mhapadh againn air daineamaigs spatiotemporal ghinean agus phròtainean air raointean epithelial.Ùidh ann an teicneòlasTha an dòigh-obrach seo gu sònraichte tarraingeach do luchd-èisteachd a tha a’ sgrùdadh imdhun-eòlas mucosal, gastroenterology, meanbh-bhitheòlas daonna, culturomics agus meanbh-bhitheòlas clionaigeach a tha a’ feuchainn ri microbiota gut neo-chultarach àiteachadh san obair-lann. Dhaibhsan a tha a’ leasachadh àrd-ùrlaran sgrìonaidh no dearbhaidh cungaidh-leigheis, bith-mheidigeach no àrd-toraidh airson gnìomhachas a’ bhidhe.Mar dhearbhadh air prionnsapal, sheall sinn o chionn ghoirid ion-dhèantachd siostam morphogenesis àrd-treòrachadh ioma-fhillte a ghabhas scalladh gu cruth truinnsear 24-tobar. deuchainn-lannan, gnìomhachas no riaghaltas agus buidhnean riaghlaidh gus ath-chlàradh ceallach de morphogenesis in vitro gut a thuigsinn aig an ìre tar-sgrìobhaidh gus drogaichean no bith-leigheas a dhearbhadh Chaidh gabhail a-steach agus giùlan thagraichean dhrogaichean a mheasadh le bhith a’ cleachdadh gut surrogates 3D no a’ cleachdadh modalan àbhaisteach no malairteach organ-air-a-chip gus ath-riochdachadh pròiseas gut morphogenesis a mheasadh.
Chaidh àireamh chuingealaichte de mhodalan deuchainneach a tha a’ buntainn ri daoine a chleachdadh gus sgrùdadh a dhèanamh air morphogenesis epithelial intestinal, gu h-àraidh air sgàth dìth phròtacalan so-ghnìomhaichte gus morphogenesis 3D a bhrosnachadh ann an vitro. Tha na modailean seo cuideachd glè chuingealaichte nan comas a bhith air an deuchainn ann an dòigh scalable ioma-shligheach. Faodaidh sreathan D epithelial àite a thoirt seachad airson sgrùdadh a dhèanamh air mar a bhios ceallan microbial a’ farpais gus raointean spàsail agus mean-fhàs eag-eòlasach a chruthachadh mar fhreagairt air factaran aoigheachd (me, sreathan mucus a-staigh agus a-muigh, secretion IgA agus peptides antimicrobial). Chan urrainnear na feartan seo a shealltainn ach nuair a thèid sreathan epithelial 3D a stèidheachadh ann an vitro.
A bharrachd air an dòigh againn air structaran epithelial intestinal 3D a chruthachadh, tha grunn dhòighean in vitro ann. Tha cultar organoid intestinal na dhòigh innleadaireachd clò ùr-nodha stèidhichte air àiteachadh bun-cheallan caolain fo chumhachan sònraichte morphogen23,24,25. ceallan bial no antigens exogenous cuingealaichte.Faodar ruigsinneachd air lumens organoid a leasachadh le bhith a’ cleachdadh microinjector,26,27 ach tha an dòigh seo ionnsaigheach agus dian-saothair agus feumach air eòlas sònraichte airson a choileanadh.
Bidh dòighean-obrach eile air an cleachdadh le grunn bhuidhnean rannsachaidh a’ cleachdadh sgaffaldan hydrogel 3D ro-structaraichte gus atharrais a dhèanamh air structar epithelial gut le bhith ag àrach cheallan caolan daonna iomallach air uachdar gel.Fabricate sgaffaldan hidrogel a’ cleachdadh molltairean clò-bhuailte 3D, meanbh-mheilte, no dèanta gu lithografach. Ach, faodaidh nàdar sgafaill ro-structaraichte casg a chuir air a’ phròiseas morphogenetic spontaneous fhèin a thaisbeanadh. Bidh organoids intestinal a’ leantainn phàtranan eitse gus structaran tubular intestinal a chruthachadh, agus faodar sruth lionn intraluminal ath-aithris le bhith a’ cleachdadh modal microfluidics. A bharrachd air an sin, dh’ fhaodadh comas obrachaidh modail a bhith cuibhrichte, gu sònraichte às deidh don phròiseas bioprinting a bhith coileanta, a ’cur dragh air suidheachaidhean deuchainneach no eadar-obrachadh cealla-gu-cealla. ity.Mar sin, is dòcha gum bi am protocol morphogenesis in vitro 3D againn a’ toirt seachad dòigh-obrach taiceil gus faighinn thairis air na dùbhlain a th’ aig na dòighean a th’ ann mar-thà.
Tha am protocol againn gu tur ag amas air morphogenesis epithelial 3D, le dìreach ceallan epithelial ann an cultar agus gun sheòrsa sam bith eile de cheallan mun cuairt leithid ceallan mesenchymal, ceallan endothelial, agus ceallan dìon. gus an còmhdach epithelial tonn 3D ath-chruthachadh, tha iom-fhillteachd bith-eòlasach a bharrachd leithid eadar-obrachaidhean epithelial-mesenchymal33,34, tasgadh extracellular Matrix (ECM) 35 agus, anns a’ mhodail againn, feartan crypt-villus a tha a ’toirt seachad raointean bun-cheallan ann an crypts basal fhathast ri bheachdachadh. Le bhith a' cur cheallan mesenchymal ris a' mhodail againn, leasaich am pròiseas morphogenetic agus èifeachdas ceangail cealla. dh’ fhaodadh gum feumar ceallan othelial a bhith air an toirt a-steach gus feartan fios-eòlais nas cruinne a mhodaladh le rùn ìre-organach.
Tha cleachdadh chips tar-chinealach nas sìmplidhe na gut-on-a-chip leis gu bheil suidheachadh an uidheim nas sìmplidhe agus tha cleachdadh cuir a-steach Transwell a’ ceadachadh cultar scalable den epithelium gut. Is ann ainneamh a bhios togalaichean anns an roinn apical a’ comasachadh co-chultar bacteriach fad-ùine ann an chips tar-chinealach.
Chan eil ath-thogail làn-sgèile air an axis crypt-villus daonna ann an cultaran gut-on-a-chip agus hybrid-on-a-chip air an làn stèidheachadh. Leis gu bheil morphogenesis a’ tòiseachadh bho monolayer epithelial, chan eil microarchitectures 3D gu riatanach a’ toirt seachad coltas morphologach ri crypts ann an vivo. Ged a tha seanalan àrda nas àirde air a’ chip a’ leantainn gu àrdachadh àirde an epithelium meanbh-innleadaireachd, tha an àirde as àirde fhathast cuingealaichte gu ~300–400 µm. Is e fìor dhoimhneachd criosan caolain daonna anns na caolan beaga is mòra ~135 µm agus ~ 400 µm, fa leth, agus vi.
A thaobh ìomhaighean, dh’ fhaodadh gum bi ìomhaighean fìor-rùn in situ de microarchitectures 3D air an cuingealachadh ris an t-sgoltadh air sliseag, leis gu bheil an astar obrach a tha a dhìth bhon lionsa amas chun an t-sreath epithelial air òrdugh beagan mhilleanan-tomhais. Tha an gut air chip a’ toirt a-steach adhesion maireannach eadar gach còmhdach, tha e air leth dùbhlanach an ìre àrd fhosgladh no a thoirt air falbh gus sgrùdadh a dhèanamh air structar uachdar an t-sreath epithelial.Mar eisimpleir, le bhith a’ cleachdadh miocroscop dealanach sganaidh (SEM).
Tha hydrophobicity PDMS air a bhith na fheart cuibhrichte ann an sgrùdaidhean stèidhichte air microfluidic a’ dèiligeadh ri moileciuilean beaga hydrophobic, leis gum faod PDMS a bhith a’ toirt a-steach a leithid de mholacilean hydrophobic gu neo-shònraichte. Faodar beachdachadh air roghainnean eile gu PDMS le stuthan polymeric eile. molecailean phobic.
Mu dheireadh, chan eil an dòigh-obrach againn air a bhith air a dheagh chomharrachadh a thaobh a bhith a’ toirt seachad sgrìonadh àrd-thruaillidheachd no àrd-ùrlar deuchainneach “aon-mheud-freagarrach dha na h-uile” a tha furasta a chleachdadh. toirt air falbh agus toirt air falbh meadhanan basolateral).
Gus morphogenesis 3D de epithelium intestinal daonna in vitro a thoirt a-steach, chleachd sinn inneal intestinal chip microfluidic anns an robh dà mhicrochannel co-shìnte agus membran porous elastagach eatarra gus eadar-aghaidh lumen-capillary a chruthachadh. Tha an dòigh-obrach deuchainneach gu lèir (Figear 1) air a dhèanamh suas de chòig phàirtean: (i) microfabrication of the gut chip no Transwell insertable hybrid chip (ceumannan 1-5; Bogsa 1), (ii) ullachadh cheallan epithelial intestinal (Caco organ-2);bogsaichean 2-5), (iii) cultar de cheallan epithelial intestinal air sgoltagan caolan no sgoltagan dà-chonnaidh (ceumannan 6-9), (iv) inntrigeadh 3D morphogenesis in vitro (ceum 10) agus (v) ) gus microstructure epithelial 3D a chomharrachadh (ceumannan 11-24). ri smachdan spàsail, ùineail, cumhach no modhan-obrach.
Chleachd sinn dà àrd-ùrlar cultair eadar-dhealaichte: gut-on-a-chip le seanalan dìreach no seanalan iom-fhillte neo-loidhneach, no sgoltagan tar-chinealach anns a bheil cuir a-steach Transwell (TW) ann an inneal microfluidic, dèanta mar a chaidh a mhìneachadh ann am Bogsa 1, agus ceum 1 -5. Tha an dòigh-obrach air a chleachdadh anns a’ phròtacal seo. t sgrùdaidhean eòlas-eòlas, stèidheachadh eag-shiostaman aoigheachd-microbiome, agus modaladh galair. Ìomhaighean immunofluorescence ann an “Cell Differentiation” a ’sealltainn nèimhean, F-actin agus MUC2 air an cur an cèill anns an t-sreath epithelial 3D Caco-2 a chaidh a chruthachadh air an gut chip.MUC2 tha comharran an làthair ann an ceallan goblet agus mucus air a chuir a-mach à ìomhaighean mucosal bho uachdar mucosal agus staining mucosal le bhith a’ nochdadh uachdar mucosal searbhagach. Tha an dà ìomhaigh thar-tharraingeach ann an “Host-Microbe Co-Cultures” a’ sealltainn co-chultaran aoigheachd-microbiome riochdachail anns an t-sgoltadh air chip. -cultar le ceallan epithelial 3D Caco-2, air a leantainn le staining immunofluorescence le F-actin (dearg) agus niuclasan (gorm).uaine).Chaidh ceallan Caco-2 a chuartachadh gus bàr còmhdach epithelial 3D a stèidheachadh.Scale, 50 µm.Images san t-sreath gu h-ìosal: “Differentiation of cells” air atharrachadh le cead bho iomradh.2.Clò Oilthigh Oxford;Air ath-riochdachadh le cead bho Ref.5.NAS;“Co-chultar Host-Microbe” air atharrachadh le cead bho ref.3.NAS;“Galar Modeling” air atharrachadh le cead bho iomradh.5.NAS.
Chaidh an dà chuid gut-on-chip agus sgoltagan tar-chinealach a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh mac-samhail PDMS a chaidh a leagail bho mholltair sileacain le lithography bog1,44 agus le pàtran le SU-8. air fàs gu bhith na gut-on-a-chip iom-fhillte (Dàta Leudaichte Fig. 1b) a tha a’ toirt a-steach paidhir de mhicro-sheanalan lùbte gus barrachd ùine còmhnaidh siùbhlach a bhrosnachadh, pàtrain sruthadh neo-loidhneach, agus deformachadh ioma-aiseach de cheallan cultarach (Fig. 2a–f) 12.Nuair a dh’ fheumar biomechanics gut nas iom-fhillte ath-chruthachadh, tha Gut-Ch. a’ toirt a-steach morphogenesis 3D ann an frèam-ama coltach ri ìre coltach ri fàs epithelial an coimeas ris an Gut-Chip tùsail, ge bith dè an seòrsa cealla cultarach.2a). ed Data Fig. 2).Tha am pròiseas ceangail air a dhèanamh le bhith a’ làimhseachadh uachdar mac-samhail PDMS agus glainne le plasma ocsaidean no làimhseachadh corona.An dèidh sterilization den inneal microfabricated ceangailte ris an tiùb silicone, bha suidheachadh an inneal deiseil airson morphogenesis 3D den epithelium intestinal a dhèanamh (Figear 2g).
a, Dealbh sgeamach air ullachadh phàirtean PDMS bho mhodailean sileacain le pàtran SU-8. Chaidh am fuasgladh PDMS neo-chùramach a dhòrtadh air molltair sileacain (clì), air a leigheas aig 60 ° C (meadhan) agus air a leagail (deas).b. sreath de dhealbhan de na co-phàirtean PDMS àrd is ìosal agus an inneal intestinal air-chip cruinn.e, Sgeama co-thaobhadh nan co-phàirtean PDMS àrd, membran, agus ìosal. Tha gach còmhdach ceangailte gu neo-sheasmhach le plasma no làimhseachadh corona. Chaidh an inneal chip a chuir air mullach mias Petri 150 mm airson a phròiseasadh. duce intestinal 3D morphogenesis.Tha am meadhan air a bhualadh tro mhicrochannels fon ìre cealla a chaidh a stèidheachadh air bàr insert.Scale Transwell, 1 cm.h Air ath-chlò-bhualadh le cead bho iomradh.4.Elsevier.
Anns a’ phròtacal seo, chaidh loidhne cealla Caco-2 agus organoids intestinal a chleachdadh mar thùsan epithelial (Fig. 3a).Bha an dà sheòrsa cealla air an àiteachadh gu neo-eisimeileach (Bogsa 2 agus Bogsa 5) agus air an cleachdadh gus meanbh-sheanalan còmhdaichte le ECM de gut air-chip no cuir a-steach Transwell a shìolachadh. air am buain gus crochaidhean cealla dissociated ullachadh le trypsinization fluid (bogsa 2). Chaidh organoids intestinal daonna bho biopsies intestinal no resections lannsaireachd a chultarachadh ann an cromagan sgafallachd Matrigel ann am pleitean 24-tobar gus taic a thoirt don mhicro-àrainneachd structarail. µm ann an trast-thomhas. Bithear a’ buain organoids làn fhàs agus gan ceangal ann an ceallan singilte airson sìolachadh air gut no cuir a-steach Transwell air sliseag (Bogsa 5). jejunum, ileum, cecum, colon, no rectum). Bidh sinn a’ toirt seachad protocol làn-leasaichte ann am Bogsa 5 airson a bhith ag àiteachadh organoids coloinidh (coloids) a bhios mar as trice a’ feumachdainn dùmhlachdan nas àirde de morphogens na organoids beaga caolan.
a, Sruth-obrach airson inntrigeadh gut morphogenesis anns an gut chip.Caco-2 epithelium intestinal daonna agus organoids intestinal air an cleachdadh anns a’ phròtacal seo gus 3D morphogenesis a nochdadh.Chaidh na ceallan epithelial iomallach a shìolachadh anns an inneal gut-on-a-chip ullaichte (ullachadh chip). agus air a chumail suas airson a’ chiad 2 latha (sruth, AP, D0-D2).Tha sruth bas-thaobhach (BL) cuideachd air a thòiseachadh còmhla ri gluasadan sìnte cearcallach (sìneadh, sruthadh, AP agus BL) nuair a thèid monolayer 2D iomlan a chruthachadh. graf, 100 µm).Ceithir diagraman sgeamach a’ sealltainn na cascades co-fhreagarrach de gut morphogenesis (gu h-àrd air an làimh dheis). deas).c, Sealladh aghaidh còmhnard de Caco-2 3D stèidhichte, claudin (ZO-1, dearg) agus buill-bodhaig crìche bhruis leantainneach leis an ainmeachadh F-actin (uaine) agus nuclei (gorm) Immunofluorescence confocal fradharc de cheallan epithelial air chips intestinal. le microscopy iomsgaradh ìre air làithean 3, 7, 9, 11, agus 13.magenta), ceallan goblet (MUC2; uaine), F-actin (liath) agus nuclei (cyan) air fàs air chips gut airson 3 latha, fa leth (clì) agus organoids 13-latha (meadhan) air an epithelial layer. air a stèidheachadh anns an t-sgoltadh air sliseag le bhith a’ staining an membran plasma le dath CellMask (deas) air latha 13 de culture.Scale bar 50 μm mura h-eilear ag ràdh a chaochladh.b Air ath-chlò-bhualadh le cead bho iomradh.2.Clò Oilthigh Oxford;c Air atharrachadh le cead bho Iomradh.2.Clò Oilthigh Oxford;e agus f air an atharrachadh le cead le iomradh.12 Fo Creative Commons License CC BY 4.0.
Anns a’ phròtacal seo, bidh sinn a’ cleachdadh dà dhòigh eadar-dhealaichte gus hydrophobicity membranes PDMS atharrachadh. Feumaidh oid epithelium gnìomhachd uachdar stèidhichte air ceimigeach gus tasgadh èifeachdach de phròtainean ECM a choileanadh le bhith a’ cur a-steach polyethyleneimine (PEI) agus glutaraldehyde ann an sreath gu microchannels PDMS.An dèidh atharrachadh uachdar, chaidh pròtanan ECM a thasgadh gus uachdar PDMS gnìomhaichte a chòmhdach agus an uairsin a thoirt a-steach don epithelium organoid iomallach, às deidh a bhith a’ tòiseachadh na ceallan àrdach a-steach don chill àrd a-mhàin le bhith a ’tòiseachadh na ceallan perfusid. Tha an dòigh leasaichte seo airson gnìomhachd uachdar agus còmhdach ECM a’ comasachadh epithelium organoid a cheangal gus morphogenesis 3D a bhrosnachadh air uachdar PDMS.
Feumaidh cultaran Transwell cuideachd còmhdach ECM mus tèid sìolachadh cealla;Ach, chan fheum cultaran Transwell ceumannan iom-fhillte ro-làimh gus uachdar cuir-a-steach porous a chuir an gnìomh. Airson ceallan Caco-2 a tha a’ fàs air cuir a-steach Transwell, bidh còmhdach ECM air cuir a-steach porous a’ luathachadh ceangal ceallan Caco-2 dissociated (<1 uair) agus cruthachadh cnap-starra snaim teann (<1-2 latha). monolayer iomlan le ionracas cnap-starra .Transwell cultaran air an coileanadh ann an truinnsearan 24-tobar gun a bhith a 'cleachdadh hybrid chips.
Faodar morphogenesis in vitro 3D a thòiseachadh le bhith a’ cur a-steach sruth siùbhlach gu taobh basolateral còmhdach epithelial stèidhichte.Anns a’ ghut air sliseag, thòisich morphogenesis epithelial nuair a chaidh am meadhan a spìonadh a-steach do na microchannels àrda is ìosal (Fig. 3a). Ann an sgoltagan tar-chinealach, chaidh cuir a-steach Transwell anns an robh monolayers epithelial a chuir a-steach do na sgoltagan tar-chinealach.
Faodar feartan moirfeòlais sreathan epithelial 3D microengineered a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh diofar mhodhan ìomhaighean, a’ gabhail a-steach microscopy iomsgaradh ìre, miocroscop follaiseachd eadar-aghaidh eadar-dhealaichte (DIC), SEM, no microscopaidh confocal immunofluorescence (Figearan 3 agus 4). agus filmichean polyester, faodaidh an dà chuid na h-àrd-ùrlaran gut-on-a-chip agus chip tar-chinealach ìomhaighean fìor-ùine in situ a thoirt seachad gun fheum air an inneal a roinn no a thoirt às a chèile. um albumin (BSA), ann an òrdugh. ann an (me, phalloidin le bileag flùraiseach).1, “Cell differentiation” agus “Gut physiology”), tuineachadh air thuaiream de cheallan microbial (Fig. 1, “Co-chultar aoigheachd-microbe”) ), fastadh cheallan dìon (Fig. 1, ‘Galar Modeling’) no na cumaidhean de morphology epithelial 3D (Fig. 3c,f). mar a chaidh a mhìneachadh ann an ref. air a chleachdadh airson mion-sgrùdadh moileciuil no ginteil.
a, Sruth-obrach airson inntrigeadh morphogenesis intestinal ann an chip hybrid.Caco-2 agus organoids intestinal air an cleachdadh anns a’ phròtacal seo gus morphogenesis 3D a nochdadh ann an àrd-ùrlar chip hybrid.Chaidh ceallan epithelial dissociated a shìolachadh ann an cuir a-steach Transwell ullaichte (TW prep; faic am figear gu h-ìosal). anns an robh monolayer 2D de cheallan epithelial air fhilleadh a-steach do chip tar-chinealach gus sruthadh basolateral (Flow, BL) a thoirt a-steach, a lean gu gineadh còmhdach epithelial 3D (morphogenesis). faodaidh sgoltagan drochaid (sgeama clì) leantainn gu morphogenesis 3D de cheallan epithelial organoid le seallaidhean microscopy confocal bhon mhullach sìos air an toirt aig diofar shuidheachaidhean Z (àrd, meadhan, agus nas ìsle;faic loidhnichean ceart sgeamach agus dotagach co-fhreagarrach).F-actin (cyan), niuclas (liath).c, micrographs confocal fluorescence (sealladh ceàrnach 3D) de cheallan epithelial a thàinig bho organoid air an àiteachadh ann an Transwell statach (TW; inset taobh a-staigh bogsa le dash geal) an aghaidh chip hybrid (sealladh slàn as motha) a’ dèanamh coimeas eadar morphology 2D an aghaidh 3D seallaidhean; oisean gu h-àrd air an làimh dheis “XZ”) cuideachd a’ sealltainn feartan 2D is 3D.Scale bar, 100 µm.c Air ath-chlò-bhualadh le cead bho iomradh.4.Elsevier.
Faodar smachdan ullachadh le bhith ag àiteachadh na h-aon cheallan (Caco-2 no ceallan epithelial organoid intestinal) gu monolayers dà-thaobhach fo chumhachan cultar staitigeach gnàthach.
Bu chòir am pròiseas lithography bog a bhith air a dhèanamh ann an seòmar glan. µm.
Cuir wafer sileaconach 3-òirleach ann am mias le acetone.Gently swirl a’ phlàta airson 30 diog, an uairsin tiormaich an wafer.Transfer an wafer gu truinnsear le IPA, an uairsin snìomh a’ phlàta airson 30 diog airson a ghlanadh.
Faodar fuasgladh piranha (measgachadh de hydrogen peroxide agus searbhag sulfarach tiugh, 1: 3 (vol / vol)) a chleachdadh gu roghnach gus fuigheall organach a thoirt air falbh bhon uachdar wafer silicon.
Tha fuasgladh piranha gu math creimneach agus a’ gineadh teas.Tha feum air ceumannan sàbhailteachd a bharrachd. Airson faighinn cuidhteas sgudal, leig leis an fhuasgladh fuarachadh agus gluasad gu inneal sgudail glan, tioram.
Dehydrate na wafers le bhith gan cur air truinnsear teth 200 ° C airson 10 mionaidean. Às deidh dìth uisgeachadh, chaidh an wafer a chrathadh còig tursan san adhar gus fuarachadh.
Thoir ~ 10 g de photoresist SU-8 2100 air meadhan an wafer sileacain ghlan. Cleachd clò-bhualadairean gus an photoresist a sgaoileadh gu cothromach air an wafer.
Bha SU-8 air a chuairteachadh gu cothromach air an wafer le bhith a’ ruith còmhdach snìomh.Prògram cuairteachaidh a-steach den SU-8 airson 5–10 s gus iomadachadh aig 500 rpm aig luathachadh 100 rpm/s. gut air a’ chip; faic “Ceumannan èiginneach” gu h-ìosal) suidhichte aig luathachadh 300 rpm / s 30 diogan aig 1,200 rpm.
Faodar am prìomh astar snìomh atharrachadh a rèir tighead targaid pàtran SU-8 air an wafer silicon.
Gus pàtrain SU-8 de dh’ àirde 500 µm a dhèanamh airson an ìre àrd den t-sgoltadh air a’ chip, chaidh an còmhdach snìomh agus ceumannan bèicearachd bog a’ bhogsa seo (ceumannan 7 agus 8) ath-aithris ann an òrdugh (faic ceum 9) gus dà shreath de 250 µm còmhdach tiugh de SU-8 a thoirt a-mach, a dh’ fhaodar a chòmhdach agus a cheangal le còmhdach UV de bhogsa àrd 0.0, a’ dèanamh a’ bhogsa àrd seo ann an ceum 0.0µ
Bèicear na wafers còmhdaichte le SU-8 gu faiceallach le bhith a’ cur na wafers gu faiceallach air truinnsear teth aig 65 ° C airson 5 mionaidean, an uairsin atharraich an suidheachadh gu 95 ° C agus goir airson 40 mionaid a bharrachd.
Gus àirde 500 μm de phàtran SU-8 a choileanadh anns a ’mhic-channel àrd, cuir a-rithist ceumannan 7 agus 8 gus dà shreath SU-8 250 μm tiugh a ghineadh.
A’ cleachdadh an UV Mask Aligner, dèan deuchainn lampa a rèir stiùireadh an neach-dèanamh gus ùine nochdaidh an wafer obrachadh a-mach. (ùine nochdaidh, ms) = (dòs nochdaidh, mJ / cm2) / (cumhachd lampa, mW / cm2).
Às deidh dhut an ùine nochdaidh a dhearbhadh, cuir am photomask air neach-gleidhidh masg an co-thaobhadh masg UV agus cuir am photomask air an wafer còmhdaichte le SU-8.
Cuir uachdar clò-bhuailte an photomask gu dìreach air an taobh còmhdaichte le SU-8 den wafer silicon gus an sgaoileadh UV a lughdachadh.
Cuir a-mach an wafer còmhdaichte le SU-8 agus photomask gu dìreach gu 260 mJ / cm2 de sholas UV airson an ùine nochdaidh ro-shuidhichte (faic ceum 10 den bhogsa seo).
Às deidh nochdadh UV, chaidh wafers silicon còmhdaichte le SU-8 a bhruich aig 65 ° C airson 5 min agus 95 ° C airson 15 min air gach truinnsear teth gus pàtrain a dhèanamh le àirde 200 μm.
Tha an leasaiche air a dhòrtadh a-steach do mhias glainne, agus tha an wafer bèice air a chuir a-steach don mhias.Faodaidh meud an leasaiche SU-8 atharrachadh a rèir meud a’ phlàta glainne.Dèan cinnteach gun cleachd thu leasaiche SU-8 gu leòr gus SU-8.
Rinse am molltair leasaichte le ~ 10 mL de leasaiche ùr agus an uairsin IPA le bhith a ’frasadh an fhuasglaidh le bhith a’ cleachdadh pìob.
Cuir an wafer ann an inneal-glanaidh plasma agus nochdaidh e do phlasma ocsaidean (gas àile, cuideam targaid 1 × 10 - 5 Torr, cumhachd 125 W) airson 1.5 min.
Cuir an wafer ann an desiccator falamh le sleamhnag glainne a-staigh.Faodar wafers agus sleamhnagan a chuir taobh ri taobh. .
Leudaich vial de cheallan reòta Caco-2 ann an amar uisge 37 ° C, agus an uairsin gluais na ceallan a tha air an leaghadh gu flasg T75 anns a bheil 15 mL de mheadhan Caco-2 prewarmed 37 ° C.
Gus a dhol seachad air ceallan Caco-2 aig ~ 90% confluency, an toiseach blàth Caco-2 meadhanach, PBS, agus 0.25% trypsin / 1 mM EDTA ann an amar uisge 37 ° C.
Aspirate am meadhan le vacuum aspiration.Nigh ceallan dà uair le 5 mL de PBS blàth le bhith ag ath-aithris miann falamh agus a’ cur PBS ùr ris.