Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Tha thu a’ cleachdadh dreach brobhsair le taic CSS cuibhrichte.Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).A bharrachd air an sin, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh sinn a 'sealltainn an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
A’ taisbeanadh carousel de thrì sleamhnagan aig an aon àm.Cleachd na putanan Roimhe agus Air adhart gus gluasad tro thrì sleamhnagan aig an aon àm, no cleachd na putanan sleamhnag aig an deireadh gus gluasad tro thrì sleamhnagan aig an aon àm.
Tha an cnap-starra fuil-eanchainn agus an cnap-starra fuil-eanchainn a’ cur casg air riochdairean bith-leigheas bho bhith a’ ruighinn an targaidean anns a’ phrìomh shiostam nèamhach, agus mar sin a’ cur bacadh air làimhseachadh èifeachdach air galairean eanchainn.Gus faighinn a-mach mu luchd-còmhdhail eanchainn ùr-nodha ann am vivo, thug sinn a-steach leabharlann peptide T7 phage agus fuil agus lionn cerebrospinal (CSF) a chaidh a chruinneachadh gu sreathach a’ cleachdadh modal amar mòr mothachail de radain.Chaidh clones phage sònraichte a bheairteachadh gu mòr ann an CSF às deidh ceithir cuairtean taghaidh.Nochd deuchainnean air peptides tagraiche fa leth barrachd air beairteas 1000-fhillte ann an CSF.Chaidh bith-ghnìomhachd an lìbhrigidh peptide-meadhanaichte don eanchainn a dhearbhadh le lùghdachadh 40% anns an ìre de amyloid-β anns an lionn cerebrospinal a ’cleachdadh inneal-dìon peptide BACE1 ceangailte ris a’ peptide gluasaid nobhail a chaidh ainmeachadh.Tha na co-dhùnaidhean sin a’ moladh gum faodadh na peptides a chaidh an comharrachadh le dòighean taghaidh in vivo phage a bhith nan carbadan feumail airson lìbhrigeadh siostamach de macromolecules don eanchainn le buaidh therapach.
Tha rannsachadh leigheas cuimsichte air an t-siostam nearbhach meadhanach (CNS) air fòcas mòr a chuir air a bhith a’ comharrachadh dhrogaichean agus riochdairean làn-leasaichte a tha a’ nochdadh feartan a tha ag amas air CNS, le nas lugha oidhirp air faighinn a-mach dè na h-innealan a tha a’ stiùireadh lìbhrigeadh dhrogaichean gnìomhach don eanchainn.Tha seo a’ tòiseachadh ag atharrachadh a-nis leis gu bheil lìbhrigeadh dhrogaichean, gu sònraichte moileciuilean mòra, na phàirt riatanach de leasachadh dhrogaichean eun-eòlais an latha an-diugh.Tha àrainneachd a’ phrìomh shiostam nèamhach air a dhìon gu math leis an t-siostam cnap-starra cerebrovascular, a tha a’ toirt a-steach an cnap-starra fuil-eanchainn (BBB) ​​agus an cnap-starra fuil-eanchainn (BCBB)1, ga dhèanamh dùbhlanach drogaichean a lìbhrigeadh don eanchainn1,2.Thathas den bheachd gu bheil cha mhòr a h-uile droga mòr moileciuil agus còrr air 98% de dhrogaichean beaga moileciuil air an cuir às an eanchainn3.Sin as coireach gu bheil e glè chudromach siostaman còmhdhail eanchainn ùra a chomharrachadh a bheir seachad lìbhrigeadh èifeachdach agus sònraichte de dhrogaichean teirpeach don CNS 4,5.Ach, tha am BBB agus BCSFB cuideachd a’ toirt deagh chothrom airson lìbhrigeadh dhrogaichean fhad ‘s a bhios iad a’ dol a-steach agus a ’dol a-steach do gach structar den eanchainn tro a vasculature farsaing.Mar sin, tha na h-oidhirpean a th’ ann an-dràsta gus dòighean lìbhrigidh neo-ionnsaigheach a chleachdadh don eanchainn stèidhichte gu ìre mhòr air uidheamachd còmhdhail receptor-mediated (PMT) a’ cleachdadh an gabhadair BBB6 endogenous.A dh’aindeoin prìomh adhartasan o chionn ghoirid a’ cleachdadh slighe gabhadair tar-chuir7,8, tha feum air tuilleadh leasachaidh air siostaman lìbhrigidh ùra le togalaichean leasaichte.Chun na crìche seo, b’ e ar n-amas peptides a chomharrachadh a bha comasach air còmhdhail CSF a mheadhanachadh, oir dh’ fhaodadh iad ann am prionnsapal a bhith air an cleachdadh gus macromolecules a lìbhrigeadh don CNS no gus slighean gabhadair ùra fhosgladh.Gu sònraichte, faodaidh gabhadairean sònraichte agus luchd-còmhdhail an t-siostam cerebrovascular (BBB agus BSCFB) a bhith nan targaidean a dh’ fhaodadh a bhith ann airson lìbhrigeadh gnìomhach agus sònraichte dhrogaichean bith-leigheas.Tha lionn cerebrospinal (CSF) na thoradh dìomhair den choroid plexus (CS) agus tha e ann an conaltradh dìreach ri lionn eadar-roinneil an eanchainn tron ​​​​fhànais subarachnoid agus an àite ventricular4.O chionn ghoirid chaidh a shealltainn gu bheil lionn cerebrospinal subarachnoid a’ sgaoileadh cus a-steach do interstitium an eanchainn9.Tha sinn an dòchas faighinn chun àite parenchymal a’ cleachdadh an t-slighe in-sruth subarachnoid seo no gu dìreach tron ​​​​BBB.Gus seo a choileanadh, chuir sinn an gnìomh ro-innleachd taghaidh in vivo phage làidir a tha gu h-iomchaidh a’ comharrachadh peptides air an giùlan le aon den dà shlighe shònraichte sin.
Tha sinn a-nis a’ toirt cunntas air dòigh sgrìonaidh taisbeanaidh in vivo phage le samplachadh CSF còmhla ri sreath àrd trochur (HTS) gus sùil a chumail air cuairtean taghaidh tùsail leis an iomadachd leabharlainn as àirde.Chaidh sgrìonadh a dhèanamh air radain mothachail le cannula cisterna mòr (CM) a chaidh a chuir a-steach gu maireannach gus truailleadh fala a sheachnadh.Gu cudromach, tha an dòigh-obrach seo a’ taghadh an dà chuid cuimseachadh eanchainn agus peptides le gnìomhachd còmhdhail thairis air a’ chnap-starra cerebrovascular.Chleachd sinn phages T7 air sgàth cho beag ‘s a bha iad (~ 60 nm)10 agus mhol sinn gu bheil iad freagarrach airson bileagan a ghiùlan a leigeas le bhith a’ dol thairis air a ’chnap-starra endothelial agus / no epithelial-medulla.Às deidh ceithir cuairtean de panning, chaidh àireamhan phage a chuir air leth a ’sealltainn beairteas làidir in vivo CSF ​​agus ceangal cerebral microvessel.Gu cudromach, bha e comasach dhuinn ar co-dhùnaidhean a dhearbhadh le bhith a’ sealltainn gu bheil na peptidean tagraiche as fheàrr leotha agus a tha air an co-chur gu ceimigeach comasach air bathar pròtain a ghiùlan a-steach don lionn cerebrospinal.An toiseach, chaidh buaidhean pharmacodynamic an CNS a stèidheachadh le bhith a’ cothlamadh prìomh peptide gluasaid le neach-dìon den peptide BACE1.A bharrachd air a bhith a’ sealltainn gum faod ro-innleachdan sgrìonaidh gnìomh in vivo peptides còmhdhail eanchainn ùr-nodha a chomharrachadh mar luchd-giùlan bathair pròtain èifeachdach, tha sinn an dùil gum bi dòighean-obrach taghaidh gnìomh coltach ri bhith cudromach ann a bhith a’ comharrachadh slighean còmhdhail eanchainn ùr-nodha.
Stèidhichte air aonadan cruthachadh plac (PFU), às deidh a ’cheum pacaidh phage, chaidh leabharlann de pheptides sreathach T7 phage sreathach 12-mer le measgachadh de mu 109 a dhealbhadh agus a chruthachadh (faic Stuthan agus Dòighean).Tha e cudromach toirt fa-near gun do rinn sinn mion-sgrùdadh faiceallach air an leabharlann seo mus deach sinn a-steach ann am vivo.Leudachadh PCR air sampallan leabharlann phage a’ cleachdadh primers atharraichte a’ gineadh amplicons a bha gu dìreach a’ buntainn ri HTS (Fig. 1a Leasachail).Air sgàth a) mearachdan sreathachaidh HTS11, b) buaidh air càileachd primers (NNK) 1-12, agus c) làthaireachd seòrsa fiadhaich (wt) phage (cuir a-steach cnàimhneach) anns an leabharlann cùl-taic, chaidh modh sìolaidh sreath a chuir an gnìomh gus dìreach fiosrachadh sreath dearbhte a thoirt a-mach (Fig. 1b a bharrachd).Tha na ceumannan sìoltachain seo a’ buntainn ris a h-uile leabharlann sreathachaidh HTS.Airson an leabharlann àbhaisteach, chaidh 233,868 leughadh gu h-iomlan fhaighinn, agus chaidh 39% dhiubh sin seachad air na slatan-tomhais sìoltachain agus chaidh an cleachdadh airson mion-sgrùdadh leabharlainn agus taghadh airson cuairtean às deidh sin (Figear Leasachail 1c – e).B’ e na leughaidhean sa mhòr-chuid iomadan de phaidhrichean bonn 3 de dh’ fhaid le stùc aig 36 nucleotides (Fig. 1c Leasachail), a’ dearbhadh dealbhadh an leabharlainn (NNK) 1-12.Gu sònraichte, bha timcheall air 11% de bhuill an leabharlainn a’ toirt a-steach cuir a-steach cnàimh-droma 12-meudach de sheòrsa fiadhaich (wt) PAGISRELVDKL, agus bha cuir a-steach no cuir às ann an faisg air leth de na sreathan (49%).Dhaingnich HTS leabharlann an leabharlainn an iomadachd àrd de pheptidean anns an leabharlann: cha deach barrachd air 81% de shreathan peptide a lorg ach aon turas agus cha do thachair ach 1.5% ann an leth-bhreacan ≥4 (Fig. 2a a bharrachd).Bha tricead amino-aigéid (aa) aig a h-uile suidheachadh 12 anns an stòr co-cheangailte gu math ris na triceadan ris an robh dùil airson an àireamh de chodons a chaidh a chruthachadh leis an repertoire NKK degenerate (Fig. 2b).Bha tricead fuigheall aa a chaidh a chòdachadh leis na cuir a-steach sin co-cheangailte gu math ris an tricead àireamhaichte (r = 0.893) (Fig. 2c a bharrachd).Tha ullachadh leabharlannan phage airson in-stealladh a ‘toirt a-steach ceumannan leudachaidh agus toirt air falbh endotoxin.Thathas air sealltainn roimhe seo gum faodadh seo lùghdachadh a dhèanamh air iomadachd leabharlannan phage12,13.Mar sin, chuir sinn sreath de leabharlann phage leudaichte le truinnsear a chaidh tro thoirt air falbh endotoxin agus rinn sinn coimeas eadar e agus an leabharlann tùsail gus tuairmse a dhèanamh air tricead AA.Chaidh co-dhàimh làidir (r = 0.995) a choimhead eadar an linne tùsail agus an amar meudaichte is fìor-ghlan (Fig. 2d Leasachail), a’ nochdadh nach do dh’ adhbharaich farpais eadar clones meudaichte air truinnsearan a’ cleachdadh phage T7 claonadh mòr.Tha an coimeas seo stèidhichte air tricead motifan tripeptide anns gach leabharlann, leis nach urrainnear iomadachd leabharlannan (~ 109) a ghlacadh gu h-iomlan eadhon le HTS.Nochd mion-sgrùdadh tricead aa aig gach suidheachadh claonadh beag a bha an urra ri suidheachadh anns na trì dreuchdan mu dheireadh den stòr a chaidh a-steach (Fig. 2e a bharrachd).Ann an co-dhùnadh, cho-dhùin sinn gun robh càileachd agus iomadachd an leabharlainn iomchaidh agus cha deach ach atharrachaidhean beaga ann an iomadachd fhaicinn mar thoradh air leudachadh agus ullachadh leabharlannan phage eadar grunn chuairtean taghaidh.
Faodar samplachadh lionn cerebrospinal sreathach a dhèanamh le bhith a’ cuir a-steach cannula a-steach don CM de radain mothachail gus comharrachadh T7 phage air a stealladh gu taobh a-staigh na bhroinn (iv) tron ​​​​BBB agus / no BCSFB (Fig. 1a-b).Chleachd sinn dà ghàirdean taghaidh neo-eisimeileach (gàirdeanan A agus B) anns a’ chiad trì cuairtean de thaghadh in vivo (Fig. 1c).Mean air mhean mheudaich sinn cho teann sa bha an taghadh le bhith a’ lughdachadh na h-àireimh iomlan de phage a chaidh a thoirt a-steach anns a’ chiad trì cuairtean taghaidh.Airson a’ cheathramh cuairt de phannal, chuir sinn còmhla sampallan bho mheuran A agus B agus rinn sinn trì taghaidhean neo-eisimeileach a bharrachd.Gus sgrùdadh a dhèanamh air feartan in vivo mìrean phage T7 anns a’ mhodail seo, chaidh phage seòrsa fiadhaich (prìomh chuir a-steach PAGISRELVDKL) a chuir a-steach do radain tron ​​vein earbaill.Sheall ath-bheothachadh phages bho lionn cerebrospinal agus fuil aig diofar amannan gu robh ìre fuasglaidh tòiseachaidh luath aig ìrean beaga T7 icosahedral bhon roinn fala (Fig. 3 Leasachail).Stèidhichte air na titers a chaidh a thoirt seachad agus meud fala nam radain, rinn sinn a-mach nach robh ach mu 1% wt.chaidh phage bhon dòs a chaidh a thoirt seachad a lorg san fhuil 10 mionaidean às deidh in-stealladh intravenous.Às deidh a’ chiad chrìonadh luath seo, chaidh cead bun-sgoile nas slaodaiche a thomhas le leth-beatha de 27.7 mionaidean.Gu cudromach, cha deach ach glè bheag de phages fhaighinn air ais bhon roinn CSF, a’ nochdadh cùl-raon ìosal airson imrich phage seòrsa fiadhaich a-steach don roinn CSF (Fig. 3 a bharrachd).Gu cuibheasach, cha deach ach mu 1 x 10-3% titers de T7 phage san fhuil agus 4 x 10-8% de phages a chaidh a thoirt a-steach an toiseach a lorg anns an lionn cerebrospinal thar na h-ùine samplachaidh gu lèir (0-250 min).Gu sònraichte, bha an leth-bheatha (25.7 min) de phage seòrsa fiadhaich ann an lionn cerebrospinal coltach ris an fhear a chaidh fhaicinn ann am fuil.Tha an dàta seo a’ sealltainn gu bheil a’ chnap-starra a tha a’ sgaradh roinn CSF bhon fhuil iomlan ann am radain CM-canach, a’ ceadachadh taghadh in vivo de leabharlannan phage gus clones a chomharrachadh a tha furasta an giùlan bhon fhuil a-steach don roinn CSF.
(a) A’ stèidheachadh dòigh airson lionn cerebrospinal (CSF) ath-shamplachadh bho linne mòr.(b) Diagram a’ sealltainn suidheachadh ceallach cnap-starra an t-siostam nearbhach meadhanach (CNS) agus an ro-innleachd taghaidh a thathas a’ cleachdadh gus peptides a chomharrachadh a tha a’ dol tarsainn air a’ chnap-starra fuil-eanchainn (BBB) ​​agus a’ chnap-starra fuil-eanchainn.(c) Clàr-sruth taisbeanaidh taisbeanaidh in vivo phage.Anns gach cuairt de thaghadh, chaidh phages (aithnichearan bheathaichean taobh a-staigh nan saighdean) a chuir a-steach gu taobh a-staigh na h-uinneige.Tha dà mheur neo-eisimeileach eile (A, B) air an cumail air leth gus an 4mh cuairt taghaidh.Airson cuairtean taghaidh 3 agus 4, chaidh gach clon phage a chaidh a thoirt a-mach à CSF a chuir ann an òrdugh le làimh.(d) Kinetics de phage air a sgaradh bho fhuil (cearcallan dearga) agus lionn cerebrospinal (triantan uaine) anns a’ chiad chuairt de thaghadh ann an dà radain canach às deidh in-stealladh intravenous de leabharlann peptide T7 (2 x 1012 phages / beathach).Tha ceàrnagan gorma a 'sealltainn a' chiad ìre cuibheasach de phage san fhuil, air a thomhas bhon àireamh de phage a chaidh a stealladh, a 'gabhail a-steach an àireamh iomlan de fhuil.Tha na ceàrnagan dubha a’ comharrachadh a’ phuing far a bheil an loidhne y a’ tighinn a-mach à dùmhlachd fala phage.(e, f) Thoir seachad tricead agus cuairteachadh coimeasach gach motif tripeptide a tha a’ dol thairis air a chèile a lorgar anns a’ pheptide.Tha an àireamh de motifan a chaidh a lorg ann an 1000 leughadh air a shealltainn.Tha motifan beairteach (p <0.001) air an comharrachadh le dotagan dearga.(e) Ploc sgapaidh co-dhàimh a’ dèanamh coimeas eadar tricead coimeasach motif tripeptide an leabharlainn stealladh le phage a thàinig bho fhuil bho bheathaichean #1.1 agus #1.2.(f) Ploc sgapaidh co-dhàimh a’ dèanamh coimeas eadar tricead coimeasach motifan phage tripeptide bheathaichean #1.1 agus #1.2 iomallach ann am fuil agus lionn cerebrospinal.(g, h) Riochdachadh ID sreath de phage air a bheairteachadh ann am fuil (g) an aghaidh leabharlannan stealladh agus phage beairteach ann an CSF (h) an aghaidh fuil às deidh cuairt de thaghadh in vivo anns an dà bheathach.Tha meud a’ chòd aon-litir a’ sealltainn cho tric sa bhios an aminoidid sin a’ tachairt aig an t-suidheachadh sin.Uaine = polar, purpaidh = neodrach, gorm = bunaiteach, dearg = searbhagach agus dubh = amino-aigéid hydrophobic.Chaidh Figear 1a, b a dhealbhadh agus a dhèanamh le Eduard Urich.
Chuir sinn a-steach leabharlann phage peptide a-steach do dhà radain ionnstramaid CM (cladan A agus B) agus phage iomallach bho lionn cerebrospinal agus fuil (Figear 1d).Cha robh a’ chiad fhuadach luath den leabharlann cho follaiseach an taca ris a’ phage seòrsa fiadhaich.B 'e leth-beatha cuibheasach an leabharlainn stealladh anns an dà bheathach 24.8 mionaidean ann am fuil, coltach ri phage seòrsa fiadhaich, agus 38.5 mionaidean ann an CSF.Chaidh sampallan fala agus lionn cerebrospinal bho gach beathach a thoirt gu HTS agus chaidh a h-uile peptides comharraichte a sgrùdadh airson làthaireachd motif tripeptide goirid.Chaidh motifan tripeptide a thaghadh leis gu bheil iad a’ toirt seachad bunait bheag airson cruthachadh structar agus eadar-obrachaidhean peptide-protein14,15.Lorg sinn co-dhàimh math ann an cuairteachadh motifan eadar an leabharlann phage stealladh agus clones a chaidh a thoirt a-mach à fuil an dà bheathach (Fig. 1e).Tha an dàta a’ nochdadh nach eil ach beagan saidhbhreas anns an roinn fala ann an co-dhèanamh an leabharlainn.Chaidh tuilleadh mion-sgrùdadh a dhèanamh air tricead aminoideach agus sreathan co-aontachd aig gach suidheachadh a’ cleachdadh atharrachadh air bathar-bog Weblogo16.Gu inntinneach, lorg sinn beairteas làidir ann am fuigheall glycine fala (Fig. 1g).Nuair a chaidh coimeas a dhèanamh eadar fuil agus clones a chaidh a thaghadh bho CSF, chaidh taghadh làidir agus cuid de na suaicheantais a chaidh a dhì-thaghadh a choimhead (Fig. 1f), agus b’ fheàrr le cuid de amino-aigéid an làthair aig dreuchdan ro-shuidhichte anns a’ bhall 12 (Fig. 1h).Gu sònraichte, bha beathaichean fa leth gu math eadar-dhealaichte ann an lionn cerebrospinal, ach chaidh beairteas glycine fala fhaicinn anns an dà bheathach (Fig. 4a–j).Às deidh sìoladh teann de dhàta sreath ann an lionn cerebrospinal bheathaichean # 1.1 agus # 1.2, chaidh 964 agus 420 peptides 12-mer sònraichte fhaighinn gu h-iomlan (Fig. 1d-e Leasachail).Chaidh na clones phage iomallach a mheudachadh agus chaidh an toirt gu dàrna cuairt de thaghadh in vivo.Bha Phage a chaidh a thoirt a-mach às an dàrna cuairt de thaghadh fo smachd HTS anns gach beathach agus chaidh a h-uile peptides comharraichte a chleachdadh mar chur-a-steach do phrògram aithne motif gus sgrùdadh a dhèanamh air mar a thachair motifan tripeptide (Fig. 2a, b, ef).An coimeas ris a’ chiad chearcall den phage a chaidh fhaighinn air ais bho CSF, chunnaic sinn tuilleadh taghaidh agus dì-thaghadh mòran motifan ann an CSF ann an geugan A agus B (Fig. 2).Chaidh algorithm aithneachaidh lìonra a chuir an sàs gus faighinn a-mach an robh iad a’ riochdachadh diofar phàtranan de shreath chunbhalach.Bha coltas soilleir air fhaicinn eadar na sreathan 12-mheudach a fhuair CSF air ais ann an còmhdach eile A (Fig. 2c, d) agus còmhdach B (Fig. 2g, h).Nochd an anailis còmhla anns gach meur diofar phròifil taghaidh airson peptides 12-mer (Fig. 5c,d a bharrachd) agus àrdachadh anns a’ cho-mheas CSF / titer fala thar ùine airson clones cruinnichte às deidh an dàrna cuairt de thaghadh an taca ris a’ chiad chuairt taghaidh (Fig. 5e Leasachail).).
Saibhreachadh motifan agus peptides ann an lionn cerebrospinal le dà chuairt leantainneach de thaghadh taisbeanaidh phage gnìomh in vivo.
Chaidh a h-uile phage lionn cerebrospinal a chaidh fhaighinn air ais bhon chiad chuairt de gach beathach (beathaichean # 1.1 agus # 1.2) a thoirt còmhla, àrdachadh, HT-seicheamh agus ath-stealladh còmhla (2 x 1010 phages / beathach) 2 radain cannach SM (#1.1 → #).2.1 agus 2.2, 1.2 → 2.3 agus 2.4).(a, b, e,f) Plocan scatter co-dhàimh a’ dèanamh coimeas eadar tricead coimeasach motifan tripeptide de gach figear a thig bho CSF ​​anns a’ chiad agus an dàrna cuairt taghaidh.Tricead coimeasach agus cuairteachadh motifan a’ riochdachadh a h-uile tripeptides thar-tharraingeach a lorgar ann am peptides anns gach taobh.Tha an àireamh de motifan a chaidh a lorg ann an 1000 leughadh air a shealltainn.Tha motifan a chaidh an taghadh gu mòr (p < 0.001) air an taghadh no air an dùnadh a-mach ann an aon de na leabharlannan coimeasach air an comharrachadh le dotagan dearga.(c, d, g, h) Riochdachadh suaicheantas sreath de na sreathan fada aminoideach 12 làn CSF stèidhichte air cuairtean 2 agus 1 de thaghadh in vivo.Tha meud a’ chòd aon-litir a’ sealltainn cho tric sa bhios an aminoidid sin a’ tachairt aig an t-suidheachadh sin.Gus an suaicheantas a riochdachadh, thathas a’ dèanamh coimeas eadar tricead sreathan CSF a chaidh a thoirt a-mach à beathaichean fa-leth eadar dà chuairt taghaidh agus tha na sreathan beairteach san dàrna cuairt air an sealltainn: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 agus (h) #1.2–#2.4.Na h-amino-aigéid as beairtiche aig suidheachadh sònraichte ann an (c, d) beathaichean no.2.1 agus chan eil.2.2 no (g, h) ann am beathaichean àireamh.2.3 agus chan eil.Tha 2.4 air an sealltainn ann an dath.Uaine = polar, purpaidh = neodrach, gorm = bunaiteach, dearg = searbhagach agus dubh = amino-aigéid hydrophobic.
Às deidh an treas cuairt de thaghadh, chomharraich sinn 124 sreath peptide sònraichte (#3.1 agus #3.2) bho 332 clones phage ath-chruthaichte CSF air an sgaradh bho dhà bheathach (Fig. 6a a bharrachd).Anns an t-sreath LGSVS (18.7%) bha a ’chuibhreann coimeasach as àirde, air a leantainn le cuir a-steach seòrsa fiadhaich PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), agus SARGSWREIVSLS (2.2%).Anns a 'cheathramh cuairt mu dheireadh, chruinnich sinn dà mheur air an taghadh gu neo-eisimeileach bho thrì beathaichean fa leth (Fig. 1c).De na clones phage sreath 925 a chaidh fhaighinn air ais bho CSF, anns a’ cheathramh cuairt lorg sinn 64 sreathan peptide sònraichte (Fig. 6b a bharrachd), am measg an do thuit a’ chuibhreann coimeasach de phage seòrsa fiadhaich gu 0.8%.B’ e na clonan CSF as cumanta anns a’ cheathramh cuairt LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) agus RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Tha raon faid nam peptides taghte mar thoradh air cuir a-steach / cuir às nucleotide no còdan stad ro-luath ann am prìomhairean an leabharlainn nuair a bhios iad a’ cleachdadh còdan degenerate airson dealbhadh leabharlann NNK.Bidh codons stad ro-luath a’ gineadh peptides nas giorra agus tha iad air an taghadh leis gu bheil am motif aa fàbharach annta.Faodaidh peptidean nas fhaide a bhith mar thoradh air cuir a-steach / cuir às ann am prìomhairean nan leabharlannan synthetigeach.Bidh seo a’ suidheachadh a’ chòd stad dealbhaichte taobh a-muigh an fhrèam agus ga leughadh gus an nochd codon stad ùr sìos an abhainn.San fharsaingeachd, rinn sinn cunntas air feartan beairteachaidh airson na ceithir cuairtean taghaidh le bhith a’ dèanamh coimeas eadar an dàta cuir a-steach agus an dàta toraidh sampall.Airson a’ chiad chuairt de sgrìonadh, chleachd sinn titers phage seòrsa fiadhaich mar chùl-fhiosrachadh neo-shònraichte.Gu h-inntinneach, bha taghadh phage àicheil gu math làidir anns a’ chiad chearcall CSF, ach chan ann ann am fuil (Fig. 3a), a dh’ fhaodadh a bhith mar thoradh air an coltachd ìosal de sgaoileadh fulangach a ’mhòr-chuid de bhuill den leabharlann peptide a-steach don roinn CSF no tha fages càirdeach buailteach a bhith air an cumail no air an toirt air falbh bhon fhuil fhuil na bacteriophages.Ach, anns an dàrna cuairt de panning, chaidh taghadh làidir de phages ann an CSF fhaicinn anns an dà chlad, a’ moladh gun robh a’ chuairt roimhe sin air a bheairteachadh le phages a’ nochdadh peptides a bhrosnaicheas gabhail CSF (Fig. 3a).A-rithist, às aonais beairteas fuil mòr.Cuideachd anns an treas agus an ceathramh cuairt, chaidh na clones phage a bheairteachadh gu mòr ann an CSF.A’ dèanamh coimeas eadar tricead coimeasach gach sreath peptide sònraichte eadar an dà chuairt taghaidh mu dheireadh, lorg sinn gu robh na sreathan eadhon nas beairtiche anns a’ cheathramh cuairt de thaghadh (Fig. 3b).Chaidh motifan tripeptide 931 gu h-iomlan a thoirt a-mach às a h-uile sreath peptide sònraichte 64 a ’cleachdadh an dà thaobh peptide.Chaidh na suaicheantais as beairtiche sa cheathramh cuairt a sgrùdadh nas mionaidiche airson am pròifilean beairteachaidh thar a h-uile cuairt an taca ris an leabharlann stealladh (gearradh dheth: beairteas 10%) (Fig. 6c a bharrachd).Sheall pàtrain taghaidh coitcheann gun deach a’ mhòr-chuid de na h-adhbharan a chaidh a sgrùdadh a dhèanamh beairteach anns a h-uile cuairt roimhe den dà mheur taghaidh.Ach, bha cuid de motifan (me SGL, VSG, LGS GSV) gu ìre mhòr bho chlade A eile, agus bha cuid eile (me FGW, RTN, WGF, NTR) air am saidhbhreachadh ann an clade eile B.
Dearbhadh air còmhdhail CSF de pheptides air an taisbeanadh le phage le beairteas CSF agus peptides stiùiriche biotinylated ceangailte ri luchdan pàighidh streptavidin.
(a) Co-mheasan beairteas air an tomhas anns na ceithir cuairtean (R1-R4) stèidhichte air titers phage stealladh (cuir a-steach = I) (PFU) agus titers phage CSF dearbhte (toradh = O).Chaidh factaran beairteas airson na trì cuairtean mu dheireadh (R2-R4) a thomhas an coimeas ris a’ chuairt roimhe agus a’ chiad chuairt (R1) le dàta cuideam.Tha bàraichean fosgailte nan lionn cerebrospinal, is e plasma a th’ ann am bàraichean dubhar.(*** p <0.001, stèidhichte air deuchainn-t nan oileanach).(b) Liosta de na peptides phage as pailte, air an rangachadh a rèir an tomhas coimeasach ris a h-uile ìre a chaidh a chruinneachadh ann an CSF às deidh cuairt 4 de thaghadh.Tha na sia clonan phage as cumanta air an comharrachadh ann an dath, air an àireamhachadh agus na feartan beairteachaidh aca eadar cuairtean 3 agus 4 de thaghadh (insets).(c, d) Chaidh na sia clones phage as beairtiche, phage falamh agus leabharlannan peptide phage phàrantan bho chuairt 4 a sgrùdadh leotha fhèin ann am modal samplachaidh CSF.Chaidh sampallan CSF agus fala a chruinneachadh aig na puingean ùine ainmichte.(c) Meudan co-ionann de 6 clones phage tagraiche (2 x 1010 phages / beathaichean), phages falamh (#1779) (2 x 1010 phages / ainmhidhean) agus leabharlannan peptide phage stoc (2 x 1012 phages / beathaichean) Tha in-stealladh co-dhiù 3 CM air a thoirt don bheathach cannulated air leth tron ​​​​bheathach cannulated.Tha pharmacokinetics CSF de gach leabharlann phage clone agus phage peptide thar ùine air a shealltainn.(d) a’ sealltainn a’ cho-mheas cuibheasach CSF/fuil airson gach phages/mL a chaidh fhaighinn air ais thar na h-ùine samplachaidh.(e) Chaidh ceithir peptides stiùiriche synthetigeach agus aon smachd sgrìobte a cheangal ri biotin gu streptavidin tron ​​​​N-terminus aca (taisbeanadh tetramer) agus an uairsin in-stealladh (vein earbaill iv, 10 mg streptavidin / kg).Co-dhiù trì radain a chaidh a thoirt a-steach (N = 3).).Chaidh sampallan CSF a chruinneachadh aig na puingean ùine ainmichte agus chaidh dùmhlachd streptavidin a thomhas le CSF anti-streptavidin ELISA (nd = cha deach a lorg).(* p <0.05, **p<0.01, ***p <0.001, stèidhichte air deuchainn ANOVA).(f) Coimeas eadar an t-sreath amino-aigéid den clone phage peptide as beairtiche #2002 (purpaidh) le clones phage peptide taghte eile bhon 4mh cuairt taghaidh.Tha pìosan amino-aigéid co-ionann agus coltach ri còd dath.
A-mach às a h-uile ìre beairteach sa cheathramh cuairt (Fig. 3b), chaidh sia clones tagraiche a thaghadh airson tuilleadh mion-sgrùdadh fa leth ann am modal samplachaidh CSF.Chaidh suimean co-ionann de shia tagraiche phage, phage falamh (gun cuir a-steach) agus leabharlannan peptide fàidheadaireachd a chuir a-steach do thrì beathaichean CM cannulated, agus chaidh pharmacokinetics a dhearbhadh ann am measaidhean CSF (Fig. 3c) agus fuil (Fig. 7 Leasachail).Bha a h-uile clones phage a chaidh a dhearbhadh ag amas air an roinn CSF aig ìre 10-1000 uair nas àirde na ìre a’ phage smachd falamh (#1779).Mar eisimpleir, bha timcheall air 1000 uair nas àirde de ìrean CSF aig clones #2020 agus #2077 na smachd phage.Tha ìomhaigh pharmacokinetic gach peptide taghte eadar-dhealaichte, ach tha comas dachaigh àrd CSF aca uile.Chunnaic sinn lùghdachadh cunbhalach thar ùine airson clones #1903 agus #2011, agus airson clones #2077, #2002 agus #2009 dh’fhaodadh àrdachadh anns a’ chiad 10 mionaidean a bhith a’ comharrachadh còmhdhail gnìomhach ach feumar a dhearbhadh.Shocraich clones #2020, #2002, agus #2077 aig ìrean àrda, fhad ‘s a chaidh dùmhlachd clone CSF #2009 sìos gu slaodach às deidh a’ chiad àrdachadh.Rinn sinn coimeas an uairsin air tricead coimeasach gach tagraiche CSF leis an ìre fala aige (Fig. 3d).Sheall an co-dhàimh eadar titer cuibheasach gach tagraiche CSF leis an titer fala aige aig a h-uile àm samplachaidh gu robh trì de na sia tagraichean air am beairteachadh gu mòr ann am fuil CSF.Gu inntinneach, sheall clone #2077 seasmhachd fala nas àirde (Figear Leasachail 7).Gus dearbhadh gu bheil na peptides fhèin comasach air bathar a bharrachd a bharrachd air mìrean phage a ghiùlan a-steach don roinn CSF, rinn sinn co-chur air ceithir peptides stiùiriche air an toirt a-mach le biotin aig an N-terminus far a bheil na peptides a ’ceangal ris a’ ghràin phage.Chaidh peptides biotinylated (àireamhan 2002, 2009, 2020 agus 2077) a chur còmhla ri streptavidin (SA) gus foirmean ioma-mheadhanach fhaighinn a bha ag atharrais air geoimeatraidh phage.Leig an cruth seo leinn cuideachd foillseachadh SA a thomhas ann am fuil agus lionn cerebrospinal mar peptides pròtain a tha a’ giùlan bathar.Gu cudromach, dh ’fhaodadh dàta phage a bhith air ath-riochdachadh gu tric nuair a chaidh peptides synthetigeach a thoirt seachad anns a’ chruth SA-conjugated seo (Fig. 3e).Bha nas lugha de nochdadh tùsail aig na peptides scrambled agus cead CSF nas luaithe le ìrean nach gabh aithneachadh taobh a-staigh 48 uairean.Gus sealladh fhaighinn air slighean lìbhrigidh nan clones phage peptide sin a-steach don àite CSF, rinn sinn mion-sgrùdadh air sgìreachadh buillean peptide phage fa leth a’ cleachdadh immunohistochemistry (IHC) gus mìrean phage a lorg gu dìreach 1 uair às deidh in-stealladh intravenous in vivo.Gu sònraichte, dh’ fhaodadh clones #2002, #2077, agus #2009 a bhith air an lorg le staining làidir ann an capillaries eanchainn, fhad ‘s nach deach smachd a chumail air phage (#1779) agus clone #2020 (Figear Leasachail 8).Tha seo a’ moladh gu bheil na peptidean sin a’ cur ris a’ bhuaidh air an eanchainn gu dìreach le bhith a’ dol tarsainn air a’ BBB.Tha feum air tuilleadh mion-sgrùdadh gus am beachd seo a dhearbhadh, oir dh’ fhaodadh slighe BSCFB a bhith an sàs cuideachd.Nuair a thathar a’ dèanamh coimeas eadar an t-sreath amino-aigéid den chlon as beairtiche (#2002) le peptides taghte eile, chaidh a thoirt fa-near gu bheil leudachaidhean amino-aigéid coltach ri cuid dhiubh, a dh’ fhaodadh a bhith a’ comharrachadh dòigh còmhdhail coltach ris (Fig. 3f).
Air sgàth a phròifil plasma gun samhail agus àrdachadh mòr ann an CSF thar ùine, chaidh clon taisbeanaidh phage #2077 a sgrùdadh tuilleadh thar ùine 48-uair nas fhaide agus bha e comasach dha an àrdachadh luath ann an CSF ath-riochdachadh an co-bhonn ri ìrean SA seasmhach (Fig. 4a).A thaobh clones phage eile a chaidh a chomharrachadh, bha #2077 air a dhath gu làidir airson capillaries eanchainn agus sheall e colocalization mòr le lectin comharran capillary nuair a choimheadas e air rùn nas àirde agus is dòcha beagan staining san àite parenchymal (Figear 4b).Gus sgrùdadh a dhèanamh an gabhadh buaidhean cungaidh-leigheis peptide-meadhanaichte fhaighinn anns an CNS, rinn sinn deuchainn anns an deach dreachan biotinylated de i) an #2077 transit peptide agus ii) am peptide inhibitor BACE1 a mheasgachadh le SA aig dà cho-mheas eadar-dhealaichte.Airson aon mheasgachadh cha do chleachd sinn ach an neach-dìon peptide BACE1 agus airson an fhear eile chleachd sinn co-mheas 1: 3 de neach-dìon peptide BACE1 gu #2077 peptide.Chaidh an dà shampall a thoirt seachad gu h-inntinneach agus chaidh ìrean fala agus cerebrospinal de peptide beta-amyloid 40 (Abeta40) a thomhas thar ùine.Chaidh Abeta40 a thomhas ann an CSF oir tha e a’ nochdadh casg BACE1 ann am parenchyma na h-eanchainn.Mar a bhiodh dùil, lùghdaich an dà iom-fhillte gu mòr ìrean fala Abetta40 (Fig. 4c, d).Ach, chan eil ach sampaill anns a bheil measgachadh de peptide no.2077 agus neach-dìon den peptide BACE1 a chaidh a cheangal ri SA air adhbhrachadh lùghdachadh mòr ann an Abeta40 anns an lionn cerebrospinal (Fig. 4c).Tha an dàta a 'sealltainn gu bheil peptide no.Tha 2077 comasach air pròtain 60 kDa SA a ghiùlan a-steach don CNS agus cuideachd a’ toirt a-steach buaidhean cungaidh-leigheis le luchd-dìon SA-conjugated den peptide BACE1.
(a) In-stealladh clonal (2 × 10 phages / beathach) de T7 phage a’ sealltainn pròifilean pharmacokinetic fad-ùine de CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) agus phage smachd gun stealladh (#1779) ann an co-dhiù trì radain CM-intubated.(b) Ìomhaigh microscopach confocal de mhicro-shoithichean cortical riochdachail ann am radain le stealladh phage (2 × 10 10 phages / beathach) a’ sealltainn cuir an-aghaidh peptide #2077 agus soithichean (lectin).Chaidh na clonan phage sin a thoirt do 3 radain agus chaidh cead a thoirt dhaibh cuairteachadh airson 1 uair ro perfusion.Chaidh brains a roinn agus a dhath le antibodies le bileagan polyclonal FITC an aghaidh capsid phage T7.Deich mionaidean mus deach perfusion agus an socrachadh às deidh sin, chaidh lectin le bileag DyLight594 a thoirt seachad taobh a-staigh na bodhaig.Ìomhaighean flùraiseach a’ sealltainn staining lectin (dearg) de thaobh luminal microvessels agus phages (uaine) ann an lumen capillaries agus clò eanchainn perivascular.Tha am bàr-sgèile a’ freagairt ri 10 µm.(c, d) Chaidh peptide bacaidh BACE1 biotinylated leis fhèin no an co-bhonn ri peptide gluasaid biotinylated #2077 a cheangal ri streptavidin agus an uairsin in-stealladh intravenous de co-dhiù trì radain CM cannulated (10 mg streptavidin / kg).Chaidh lùghdachadh BACE1 peptide inhibitor-mediated ann an Aβ40 a thomhas le Aβ1-40 ELISA ann am fuil (dearg) agus lionn cerebrospinal (orains) aig na puingean ùine ainmichte.Airson soilleireachd nas fheàrr, tha loidhne dotagach air a tharraing air a’ ghraf aig sgèile 100%.(c) Lùghdachadh sa cheud ann an Aβ40 ann am fuil (triantan dearg) agus lionn cerebrospinal (triantan orains) ann am radain air an làimhseachadh le streptavidin co-cheangailte ri gluasad peptide #2077 agus peptide bacaidh BACE1 ann an co-mheas 3: 1.(d) Lùghdachadh sa cheud ann am fuil Aβ40 (cearcallan dearga) agus lionn cerebrospinal (cearcallan orains) de radain air an làimhseachadh le streptavidin còmhla ri peptide bacaidh BACE1 a-mhàin.B’ e an dùmhlachd Aβ anns an smachd 420 pg/ml (claon àbhaisteach = 101 pg/ml).
Chaidh taisbeanadh Phage a chuir an sàs gu soirbheachail ann an grunn raointean de rannsachadh bith-mheidigeach17.Chaidh an dòigh seo a chleachdadh airson sgrùdaidhean iomadachd vascùrach in vivo18,19 a bharrachd air sgrùdaidhean a tha ag amas air soithichean cerebral20,21,22,23,24,25,26.Anns an sgrùdadh seo, leudaich sinn cleachdadh an dòigh taghaidh seo chan ann a-mhàin gu comharrachadh dìreach peptides a tha ag amas air soithichean cerebral, ach cuideachd gu bhith a’ lorg thagraichean le feartan còmhdhail gnìomhach gus a dhol thairis air a’ chnap-starra fuil-eanchainn.Tha sinn a-nis a’ toirt cunntas air leasachadh modh taghaidh in vivo ann am radain a tha air an toirt a-steach le CM agus a’ sealltainn a chomas air peptides a chomharrachadh le togalaichean homing CSF.A ’cleachdadh an phage T7 a’ taisbeanadh leabharlann de pheptidean air thuaiream 12-mer, bha e comasach dhuinn sealltainn gu bheil am phage T7 beag gu leòr (timcheall air 60 nm ann an trast-thomhas)10 airson a bhith air atharrachadh gu cnap-starra fuil-eanchainn, agus mar sin a ’dol thairis air a’ chnap-starra fuil-eanchainn no plexus choroid.Chunnaic sinn gu robh buain CSF bho radain CM cannulated na dhòigh sgrìonaidh gnìomh in vivo air a dheagh smachdachadh, agus gu robh am phage a chaidh a thoirt a-mach chan ann a-mhàin ceangailte ris an vasculature ach cuideachd ag obair mar neach-còmhdhail thairis air a’ chnap-starra fuil-eanchainn.A bharrachd air an sin, le bhith a’ cruinneachadh fala aig an aon àm agus a’ cur HTS an sàs ann an CSF agus phages a thàinig bho fhuil, dhearbh sinn nach robh buaidh aig beairteas fala no fallaineachd airson leudachadh eadar cuairtean taghaidh air ar roghainn CSF.Ach, tha an roinn fala mar phàirt den mhodh taghaidh, oir feumaidh phages a tha comasach air an roinn CSF a ruighinn a bhith beò agus a chuairteachadh san t-sruth fala fada gu leòr gus iad fhèin a neartachadh san eanchainn.Gus fiosrachadh sreath earbsach a thoirt a-mach à dàta amh HTS, chuir sinn sìoltachain an gnìomh a chaidh an atharrachadh gu mearachdan sreathachaidh àrd-ùrlar sònraichte ann an sruth-obrach an anailis.Le bhith a’ toirt a-steach paramadairean cinneachail a-steach don dòigh sgrìonaidh, dhearbh sinn pharmacokinetics luath de phages T7 fiadhaich (t½ ~ 28 min) ann am fuil24, 27, 28 agus dhearbh sinn cuideachd an leth-beatha ann an lionn cerebrospinal (t½ ~ 26 min) gach mionaid).A dh ’aindeoin pròifilean cungaidh-leigheis coltach ri chèile ann am fuil agus CSF, cha b’ urrainnear ach 0.001% den dùmhlachd fala de phage a lorg ann an CSF, a ’nochdadh gluasad cùl-raon ìosal de phage T7 fiadhaich thairis air a’ chnap-starra fuil-eanchainn.Tha an obair seo a’ soilleireachadh cho cudromach sa tha a’ chiad chuairt de thaghadh nuair a bhios tu a’ cleachdadh ro-innleachdan panning in vivo, gu sònraichte airson siostaman phage a tha air am fuadach gu sgiobalta bhon chuairteachadh, leis nach eil mòran clones comasach air roinn CNS a ruighinn.Mar sin, anns a 'chiad chuairt, bha an lùghdachadh ann an iomadachd leabharlainn gu math mòr, oir cha deach ach àireamh bheag de chlonan a chruinneachadh mu dheireadh anns a' mhodail CSF fìor theann seo.Bha an ro-innleachd panning in vivo seo a’ toirt a-steach grunn cheumannan taghaidh leithid cruinneachadh gnìomhach anns an roinn CSF, mairsinn clone anns an roinn fala, agus toirt air falbh clones phage T7 bhon fhuil taobh a-staigh a’ chiad 10 mionaidean (Fig. 1d agus Fig. 4M a bharrachd).).Mar sin, às deidh a’ chiad chuairt, chaidh clones phage eadar-dhealaichte a chomharrachadh ann an CSF, ged a chaidh an aon lòn tùsail a chleachdadh airson beathaichean fa-leth.Tha seo a’ moladh gu bheil grunn cheumannan taghaidh teann airson leabharlannan stòr le àireamhan mòra de bhuill leabharlainn a’ leantainn gu lùghdachadh mòr ann an iomadachd.Mar sin, bidh tachartasan air thuaiream gu bhith nam pàirt riatanach den phròiseas taghaidh tùsail, a’ toirt buaidh mhòr air an toradh.Tha e coltach gu robh mòran de na clones anns an leabharlann thùsail glè choltach ri beairteas beairteach CSF.Ach, eadhon fo na h-aon chumhachan deuchainneach, faodaidh toraidhean taghaidh a bhith eadar-dhealaichte air sgàth an àireamh bheag de gach clon sònraichte anns a’ chiad amar.
Tha na motifan a tha beairteach ann an CSF eadar-dhealaichte bhon fheadhainn san fhuil.Gu inntinneach, thug sinn fa-near a ’chiad ghluasad a dh’ ionnsaigh peptides làn glycine ann am fuil bheathaichean fa-leth.(Fig. 1g, Figs Leasachail. 4e, 4f).Dh'fhaodadh gum bi Phage anns a bheil glycine peptides nas seasmhaiche agus nas buailtiche a bhith air a thoirt a-mach à cuairteachadh.Ach, cha deach na peptidean làn glycine seo a lorg anns na sampallan lionn cerebrospinal, a’ moladh gun deach na leabharlannan leigheasach tro dhà cheum taghaidh eadar-dhealaichte: aon san fhuil agus fear eile ceadaichte cruinneachadh anns an lionn cerebrospinal.Chaidh deuchainn farsaing a dhèanamh air clones le beairteas CSF mar thoradh air a’ cheathramh cuairt de thaghadh.Chaidh cha mhòr a h-uile clones a chaidh a dhearbhadh leotha fhèin a dhearbhadh gu bhith beairteach ann an CSF an taca ri phage smachd bàn.Chaidh aon bhuille peptide (#2077) a sgrùdadh nas mionaidiche.Sheall e leth-beatha plasma nas fhaide an coimeas ri buillean eile (Figear 3d agus Figear Leasachail 7), agus gu h-inntinneach, bha fuigheall cysteine ​​​​anns a’ pheptide seo aig an C-terminus.Chaidh a shealltainn o chionn ghoirid gum faod cur-ris cysteine ​​ri peptides na feartan cungaidh-leigheis aca a leasachadh le bhith a’ ceangal albumin 29 .Chan eil fios air seo an-dràsta airson peptide #2077 agus tha feum air tuilleadh sgrùdaidh.Sheall cuid de pheptides eisimeileachd valence ann an beairteachadh CSF (dàta nach deach a shealltainn), a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ri geoimeatraidh uachdar taisbeanaidh an capsid T7.Sheall an siostam T7 a chleachd sinn 5-15 leth-bhreac de gach peptide gach pìos phage.Chaidh IHC a dhèanamh air clones phage luaidhe tagraiche a chaidh a chuir a-steach gu taobh a-staigh cortex cerebral radain (Fig. 8 a bharrachd).Sheall an dàta gun robh co-dhiù trì clones (Àir. 2002, Àir. 2009 agus Àir. 2077) ag eadar-obrachadh leis a’ BBB.Tha e fhathast ri dhearbhadh a bheil an eadar-obrachadh BBB seo a’ leantainn gu cruinneachadh CSF no gluasad nan clones sin gu dìreach chun BCSFB.Gu cudromach, tha sinn a’ sealltainn gu bheil na peptides taghte a’ cumail an comas còmhdhail CSF nuair a thèid an co-chur agus an ceangal ris a’ chargu pròtain.Tha ceangal peptides biotinylated N-terminal gu SA gu bunaiteach ag ath-aithris na toraidhean a fhuaireadh leis na clones phage aca ann am fuil agus lionn cerebrospinal (Fig. 3e).Mu dheireadh, tha sinn a’ sealltainn gu bheil am peptide luaidhe #2077 comasach air gnìomhachd eanchainn neach-dìon peptide biotinylated de BACE1 co-cheangailte ri SA a bhrosnachadh, ag adhbhrachadh buaidhean pharmacodynamic follaiseach anns an CNS le bhith a’ lughdachadh gu mòr ìrean Abeta40 ann an CSF (Fig. 4).Cha b’ urrainn dhuinn homologues sam bith a chomharrachadh san stòr-dàta le bhith a’ dèanamh sgrùdadh homologach sreath peptide de gach buille.Tha e cudromach cuimhneachadh gu bheil meud an leabharlainn T7 timcheall air 109, agus is e meud an leabharlainn teòiridheach airson 12-mers 4 x 1015. Mar sin, cha do thagh sinn ach bloigh bheag de dh’ àite iomadachd an leabharlann peptide 12-mer, a dh’ fhaodadh a bhith a’ ciallachadh gum faodar peptides nas fheàrr a chomharrachadh le bhith a’ measadh farsaingeachd sreath faisg air làimh de na buillean comharraichte sin.Gu beachd-bharail, is dòcha gur e aon de na h-adhbharan nach do lorg sinn homologues nàdurrach sam bith de na peptidean sin a bhith air an dì-thaghadh aig àm mean-fhàs gus casg a chuir air faighinn a-steach gu neo-riaghlaidh cuid de motifan peptide a-steach don eanchainn.
Air an gabhail còmhla, tha na co-dhùnaidhean againn a’ toirt bunait airson obair san àm ri teachd gus siostaman còmhdhail a’ chnap-starra cerebrovascular in vivo a chomharrachadh agus a chomharrachadh ann am barrachd mionaideachd.Tha suidheachadh bunaiteach an dòigh seo stèidhichte air ro-innleachd taghaidh gnìomh a tha chan ann a-mhàin a’ comharrachadh clones le feartan ceangail cerebral vascùrach, ach cuideachd a’ toirt a-steach ceum riatanach anns a bheil gnìomhachd gnèitheach aig clones soirbheachail gus a dhol thairis air cnapan-starra bith-eòlasach ann am vivo a-steach don roinn CNS.is e sin dòigh còmhdhail nam peptidean sin a shoilleireachadh agus an roghainn aca a bhith a’ ceangal ris a ’microvasculature a tha sònraichte do roinn na h-eanchainn.Dh’ fhaodadh seo leantainn gu lorg slighean ùra airson a bhith a’ giùlan BBB agus gabhadan.Tha sinn an dùil gum faod na peptidean comharraichte ceangal gu dìreach ri gabhadan cerebrovascular no ri ligands a tha air an giùlan tron ​​​​BBB no BSFB.Thèid tuilleadh sgrùdaidh a dhèanamh air na vectaran peptide le gnìomhachd còmhdhail CSF a chaidh a lorg san obair seo.Tha sinn an-dràsta a’ sgrùdadh sònrachas eanchainn nam peptidean sin airson an comas a dhol tarsainn air a’ BBB agus/no BCSFB.Bidh na peptides ùra sin nan innealan air leth luachmhor airson a bhith a’ lorg gabhadan no slighean ùra agus airson àrd-ùrlaran fìor èifeachdach a leasachadh airson macromolecules a lìbhrigeadh, leithid bith-eòlas, don eanchainn.
Cannulate an cisterna mòr (CM) a’ cleachdadh atharrachadh air an dòigh a chaidh a mhìneachadh roimhe.Chaidh radain Wistar anesthetized (200-350 g) a chuir suas air inneal stereotaxic agus chaidh incrise meadhanach a dhèanamh thairis air a’ chraiceann a bha air a bhruthadh agus air ullachadh aseptic gus an claigeann a nochdadh.Dril dà thuill ann an raon an t-sash àrd agus ceangail na sgriothan rèiteachaidh anns na tuill.Chaidh toll a bharrachd a dhrileadh anns an suaicheantas taobhach taobhach airson stiùireadh stereotactic de cannula stàilinn gun staoin a-steach don CM.Cuir saimeant fhiaclan timcheall a’ chanàil agus tèarainte le sgriothan.Às deidh làimhseachadh dhealbhan agus cruadhachadh saimeant, chaidh an leòn craiceann a dhùnadh le sùghadh 4/0 supramid.Tha suidheachadh ceart an canan air a dhearbhadh le bhith ag aoidion gu spontaneous de lionn cerebrospinal (CSF).Thoir air falbh an radan bhon inneal stereotaxic, faigh cùram postoperative iomchaidh agus riaghladh pian, agus leig leis faighinn air ais airson co-dhiù seachdain gus an tèid comharran fala fhaicinn anns an lionn cerebrospinal.Chaidh radain Wistar (Crl:WI/Han) fhaighinn bho Charles River (An Fhraing).Chaidh a h-uile radain a chumail fo chumhachan sònraichte gun pathogen.Chaidh a h-uile deuchainn beathach aontachadh le Oifis Lighiche-sprèidh Cathair-bhaile Basel, an Eilbheis, agus chaidh an coileanadh a rèir Cead Ainmhidhean Àireamh 2474 (Measadh air Còmhdhail Gnìomhach Brain le bhith a’ Tomhais Ìrean Tagraichean Teirpeach anns an Cerebrospinal Fluid agus Brain of Rat).
Cùm gu socair an radan mothachail leis an canan CM na làimh.Thoir air falbh Datura bhon chanula agus cruinnich 10 µl de lionn cerebrospinal a tha a’ sruthadh gu spontaneously.Leis gun deach foighidinn an canain a chuir an cunnart aig a’ cheann thall, cha robh ach sampallan soilleir de lionn cerebrospinal gun fhianais air truailleadh fala no dath dath air an toirt a-steach don sgrùdadh seo.Aig an aon àm, chaidh timcheall air 10-20 μl de fhuil a thoirt bho incis bheag aig bàrr an earbaill a-steach do phìoban le heparin (Sigma-Aldrich).Chaidh CSF agus fuil a chruinneachadh aig diofar amannan às deidh in-stealladh intravenous de phage T7.Chaidh timcheall air 5 - 10 μl de lionn a chuir air falbh mus deach gach sampall CSF a chruinneachadh, a tha a rèir meud marbh a ’chathetr.
Chaidh leabharlannan a chruthachadh a’ cleachdadh an vectar T7Select 10-3b mar a chaidh a mhìneachadh ann an leabhar-làimhe siostam T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Ann an ùine ghoirid, chaidh cuir a-steach DNA 12-mer air thuaiream a cho-chur anns a’ chruth a leanas:
Chaidh an codon NNK a chleachdadh gus còdan stad dùbailte agus cus cuideam aminoideach a sheachnadh anns an cuir a-steach.Tha N na cho-mheas equimolar measgaichte le làimh de gach nucleotide, agus tha K na cho-mheas equimolar measgaichte le làimh de nucleotides adenine agus cytosine.Chaidh roinnean le sreathan singilte atharrachadh gu DNA le sreathan dùbailte le tuilleadh brosnachaidh le dNTP (Novagen) agus enzyme Klenow (New England Biolabs) ann am bufair Klenow (New England Biolabs) airson 3 uairean aig 37 ° C.Às deidh an ath-bhualadh, chaidh DNA dà-shreath fhaighinn air ais le sileadh EtOH.Chaidh an DNA a thàinig às a sin a chuairteachadh le enzyman cuibhreachaidh EcoRI agus HindIII (an dà chuid à Roche).Chaidh an cuir a-steach cleaved and purified (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) an uairsin a cheangal ann am frèam a-steach do vectar T7 ro-ghlan às deidh amino-aigéad 348 den ghine capsid 10B.Chaidh ath-bheachdan lasachaidh a bhrosnachadh aig 16 ° C. airson 18 uairean ro phacaid in vitro.Chaidh pacadh Phage in vitro a dhèanamh a rèir an stiùiridh a chaidh a thoirt seachad leis an inneal clonaidh T7Select 10-3b (Novagen) agus chaidh am fuasgladh pacaidh àrdachadh aon uair gu lysis a’ cleachdadh Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Bha na lysates air an centrifuged, air an titrated agus air an reothadh aig -80 ° C. mar fhuasgladh stoc de glycerol.
Meudachadh dìreach PCR de roinnean caochlaideach phage air an leudachadh ann am broth no truinnsear a’ cleachdadh primers fusion seilbh 454 / Roche-amplicon.Anns an primer fusion air adhart tha sreathan ri taobh na roinne caochlaideach (NNK) 12 (teamplaid-sònraichte), GS FLX Titanium Adapter A, agus sreath iuchair leabharlann ceithir-bhunait (TCAG) (Figear Leasachail 1a):
Anns an primer fusion cùil cuideachd tha biotin ceangailte ri grìogagan glacaidh agus an GS FLX Titanium Adapter B a tha riatanach airson leudachadh clonal rè emulsion PCR:
Bha na h-amplicons an uairsin fo smachd pyrosequencing 454 / Roche a rèir protocol Titanium 454 GS-FLX.Airson sreath làimhe Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), chaidh T7 phage DNA a mheudachadh le PCR agus a chuir an òrdugh leis na paidhrichean primer a leanas:
Chaidh cuir a-steach bho chlàran fa leth a chuir an sàs ann an leudachadh PCR a’ cleachdadh an Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (a rèir stiùireadh an neach-dèanamh).Dèan tòiseachadh teth (10 mion aig 95 ° C) agus 35 cearcallan brosnachaidh (50 s aig 95 ° C, 1 min aig 50 ° C, agus 1 min aig 72 ° C).
Chaidh Phage bho leabharlannan, phage seòrsa fiadhaich, phage air a shàbhaladh bho CSF ​​agus fuil, no clones fa leth àrdachadh ann an Escherichia coli BL5615 ann am broth TB (Sigma Aldrich) no ann an soithichean 500 cm2 (Thermo Scientific) airson 4 h aig 37 ° C.Chaidh Phage a thoirt a-mach às na truinnsearan le bhith a’ sruthadh nan truinnsearan le bufair Tris-EDTA (Fluka Analytical) no le bhith a’ cruinneachadh nam placaichean le molaidhean pìobaireachd sterile.Chaidh Phage a sgaradh bho chultar supernatant no bufair às-tharraing le aon chuairt de fhrasadh polyethylene glycol (PEG 8000) (Promega) agus ath-chuiridh ann am bufair Tris-EDTA.
Chaidh am phage leudaichte a chuir fo 2-3 cuairtean de thoirt air falbh endotoxin a’ cleachdadh grìogagan toirt air falbh endotoxin (Miltenyi Biotec) mus deach an in-stealladh intravenous (IV) (500 μl / beathach).Anns a’ chiad chuairt, chaidh phages 2 × 1012 a thoirt a-steach;anns an dàrna, 2 × 1010 pìosan;anns an treas agus an ceathramh cuairt taghaidh, 2 × 109 phages gach beathach.Chaidh susbaint Phage ann an CSF agus sampallan fala a chaidh a chruinneachadh aig na puingean ùine ainmichte a dhearbhadh le bhith a’ cunntadh clàr a rèir stiùireadh an neach-dèanamh (leabhar-làimhe siostam T7Select).Chaidh taghadh Phage a dhèanamh le in-stealladh intravenous de leabharlannan fìor-ghlan a-steach don vein earbaill no le bhith ag ath-stealladh phage a chaidh a thoirt a-mach à CSF bhon chuairt taghaidh roimhe, agus chaidh buain às deidh sin a dhèanamh aig 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, agus 240 min fa leth CSF agus sampallan fala.Chaidh ceithir cuairtean de phannal in vivo a dhèanamh anns an deach an dà mheur taghte a stòradh agus a sgrùdadh air leth anns a’ chiad trì cuairtean taghaidh.Bha a h-uile cuir a-steach phage a chaidh a thoirt a-mach à CSF bhon chiad dà chuairt taghaidh fo smachd pyrosequencing 454 / Roche, fhad ‘s a bha a h-uile clones a chaidh a thoirt a-mach à CSF bhon dà chuairt taghaidh mu dheireadh air an òrdachadh le làimh.Bha a h-uile ìre fala bhon chiad chuairt taghaidh cuideachd fo smachd pyrosequencing 454 / Roche.Airson in-stealladh clones phage, chaidh phages taghte a mheudachadh ann an E. coli (BL5615) air truinnsearan 500 cm2 aig 37 ° C airson 4 uairean.Chaidh clones a chaidh an taghadh leotha fhèin agus an òrdugh le làimh a ghluasad ann am meadhan TB.Às deidh às-tharraing phage, glanadh agus toirt air falbh endotoxin (mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd), chaidh phages 2 × 1010 / beathach ann an 300 μl a chuir a-steach gu taobh a-staigh aon vein earbaill.
Ro-phròiseasadh agus sìoladh càileachdail de dhàta sreath.Chaidh dàta Raw 454 / Roche atharrachadh bho chruth mapa sruth àbhaisteach dà-chànanach (sff) gu cruth a ghabhas leughadh le daonna Pearson (fasta) a’ cleachdadh bathar-bog reiceadair.Chaidh tuilleadh giollachd den t-sreath nucleotide a dhèanamh a’ cleachdadh prògraman seilbhe C agus sgriobtaichean (pasgan bathar-bog nach deach fhoillseachadh) mar a tha air a mhìneachadh gu h-ìosal.Tha mion-sgrùdadh dàta bun-sgoile a’ toirt a-steach modhan sìolaidh ioma-ìre teann.Gus leughaidhean a shìoladh anns nach robh sreath DNA cuir a-steach dligheach 12mer, bha na leughaidhean air an co-thaobhadh ann an sreath ri leubail tòiseachaidh (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), leubail stad (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) agus cuir a-steach cùl-fhiosrachadh (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) a’ cleachdadh an deuchainn cruinne Needleman-Wunsch.co-thaobhadh a’ ceadachadh suas ri 2 neo-chunbhalachd gach co-thaobhadh31.Mar sin, chaidh leughaidhean gun tagaichean tòiseachaidh is stad agus leughaidhean anns an robh cuir a-steach cùl-fhiosrachaidh, ie, co-thaobhadh a tha nas àirde na an àireamh ceadaichte de mhì-chothromachadh, a thoirt a-mach às an leabharlann.A thaobh na leughaidhean a bha air fhàgail, chaidh an t-sreath DNA N-mer a bha a’ leudachadh bhon chomharra tòiseachaidh agus a’ crìochnachadh mus deach an comharra stad a chuir a-mach às an t-sreath leughaidh tùsail agus a phròiseasadh a bharrachd (ris an canar “cuir a-steach” an-seo).Às deidh eadar-theangachadh den cuir a-steach, thèid a’ chuibhreann às deidh a ’chiad codon stad aig ceann 5 ′ den primer a thoirt air falbh bhon cuir a-steach.A bharrachd air an sin, chaidh nucleotides a bha a’ leantainn gu còdan neo-choileanta aig ceann 3 ′ den primer a thoirt air falbh cuideachd.Gus cuir a-steach anns nach robh ach sreathan cùl-fhiosrachaidh, chaidh cuir a-steach eadar-theangaichte a ’tòiseachadh leis a’ phàtran aminoideach “PAG” a thoirt air falbh cuideachd.Chaidh peptides le fad iar-eadar-theangachaidh nas lugha na 3 amino-aigéid a thoirt a-mach às an leabharlann.Mu dheireadh, thoir air falbh call obrach anns an amar cuir a-steach agus dearbhaich tricead gach cuir a-steach sònraichte.Bha toraidhean an sgrùdaidh seo a’ toirt a-steach liosta de shreathan nucleotide (cuir a-steach) agus na triceadan (leugh) aca (Figearan Leasachail 1c agus 2).
Buidheann N-mer DNA a’ cuir a-steach a rèir sreath coltachd: Gus cuir às do mhearachdan sreathachaidh 454 / Roche-sònraichte (leithid duilgheadasan le leudachadh homopolymer ann an òrdugh) agus cuir às do dhreuchdan nach eil cho cudromach, tha cuir a-steach sreath DNA N-mer a chaidh a shìoladh roimhe (cuir a-steach) air an òrdachadh a rèir coltachd.cuir a-steach (suas ri 2 bhunait neo-ionann ceadaichte) a’ cleachdadh algairim ath-aithriseach air a mhìneachadh mar a leanas: tha cuir a-steach air an òrdachadh an toiseach a rèir am tricead (as àirde gu as ìsle), agus ma tha iad mar an ceudna, a rèir an seòrsa àrd-sgoile a rèir faid (as fhaide gu as giorra).Mar sin, tha na cuir a-steach as trice agus as fhaide a’ mìneachadh a’ chiad “buidheann”.Tha tricead buidhne air a shuidheachadh chun phrìomh tricead.An uairsin, chaidh feuchainn ri gach cuir a-steach a bha air fhàgail san liosta eagraichte a chuir ris a’ bhuidheann le co-thaobhadh pairwise Needleman-Wunsch.Mura h-eil an àireamh de mhì-chothromachadh, cuir a-steach, no cuir às ann an co-thaobhadh nas àirde na stairsneach de 2, thèid cuir a-steach a chuir ris a’ bhuidheann, agus thèid tricead iomlan na buidhne àrdachadh le cho tric sa chaidh an cuir a-steach a chuir ris.Tha cuir a-steach a chaidh a chur ri buidheann air an comharrachadh mar a chaidh a chleachdadh agus air an dùnadh a-mach à tuilleadh giollachd.Mura h-urrainnear an t-sreath cuir a-steach a chur ri buidheann a th’ ann mar-thà, thathas a’ cleachdadh an t-sreath cuir a-steach gus buidheann ùr a chruthachadh leis an tricead cuir a-steach iomchaidh agus air a chomharrachadh mar a chaidh a chleachdadh.Thig an tionndadh gu crìch nuair a thèid gach sreath cuir a-steach a chleachdadh gus buidheann ùr a chruthachadh no faodar a thoirt a-steach do bhuidheann a tha ann mar-thà.Às deidh na h-uile, bidh cuir a-steach ann am buidhnean anns a bheil nucleotides air an eadar-theangachadh gu sreathan peptide (leabharlannan peptide).Is e toradh an anailis seo seata de chuir-a-steach agus na triceadan co-fhreagarrach aca a tha a’ dèanamh suas an àireamh de leughaidhean leantainneach (Fig. 2 a bharrachd).
Gineadh motif: Stèidhichte air liosta de pheptidean gun samhail, chaidh leabharlann a chruthachadh anns an robh a h-uile pàtran aminoideach (aa) mar a chithear gu h-ìosal.Chaidh a h-uile pàtran de dh'fhaid 3 a thoirt a-mach às a 'pheptide agus chaidh a phàtran cas a chur ris còmhla ri leabharlann motif cumanta anns an robh a h-uile pàtran (tripeptides).Chaidh leabharlannan le motifan fìor ath-aithris a chuir an òrdugh agus chaidh call obrach a thoirt air falbh.An uairsin, airson gach tripeptide anns an leabharlann motif, rinn sinn sgrùdadh airson a làthaireachd anns an leabharlann a’ cleachdadh innealan coimpiutaireachd.Anns a ’chùis seo, thèid tricead a’ pheptide anns a bheil an tripeptide motif a chaidh a lorg a chur ris agus a shònrachadh don motif anns an leabharlann motif (“àireamh de motifan”).Is e toradh gineadh motifan sreath dà-mheudach anns a bheil a h-uile tachartas de tripeptides (motifan) agus na luachan aca, is e sin an àireamh de leughaidhean sreathachaidh a bheir gu buil am motif co-fhreagarrach nuair a thèid na leughaidhean a shìoladh, a chruinneachadh agus eadar-theangachadh.Metrics mar a chaidh a mhìneachadh gu mionaideach gu h-àrd.
Normalachadh àireamh motifan agus scatterplots co-fhreagarrach: Chaidh an àireamh de motifan airson gach sampall a dhèanamh àbhaisteach le bhith a’ cleachdadh
far a bheil ni an àireamh de leughaidhean anns a bheil cuspair i.Mar sin, tha vi a’ riochdachadh tricead sa cheud de leughaidhean (no peptides) anns a bheil motif i san sampall.Chaidh luachan P airson an àireamh neo-àbhaisteach de motifan a thomhas a’ cleachdadh dearbh dheuchainn Fisher.A thaobh correlograms den àireamh de adhbharan, chaidh co-dhàimhean Spearman a thomhas a’ cleachdadh an àireamh àbhaisteach de adhbharan le R.
Gus susbaint amino-aigéid fhaicinn aig gach suidheachadh anns an leabharlann peptide, chaidh logograman lìn 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) a chruthachadh.An toiseach, tha susbaint amino-aigéid aig gach suidheachadh den peptide 12-mer air a stòradh ann am matrix 20 × 12.An uairsin, tha seata de 1000 peptides anns a bheil an aon susbaint aminoideach coimeasach aig gach suidheachadh air a chruthachadh ann an cruth fasta-sequence agus air a thoirt seachad mar chur-a-steach gu suaicheantas lìn 3, a ghineas riochdachadh grafaigeach den t-susbaint aminoideach càirdeach aig gach suidheachadh.airson leabharlann peptide sònraichte.Gus dàta ioma-thaobhach fhaicinn, chaidh mapaichean teas a chruthachadh a’ cleachdadh inneal a chaidh a leasachadh a-staigh ann an R (biosHeatmap, pasgan R a tha fhathast ri leigeil ma sgaoil).Chaidh na dendrograms a tha air an taisbeanadh anns na mapaichean teas a thomhas a’ cleachdadh dòigh cruinneachadh rangachaidh Ward leis an astar meatrach Euclidean.Airson mion-sgrùdadh staitistigeil air dàta sgòradh motif, chaidh luachan P airson sgòradh neo-àbhaisteach a thomhas a’ cleachdadh dearbh dheuchainn Fisher.Chaidh luachan-P airson stòran-dàta eile a thomhas ann an R a’ cleachdadh deuchainn-t nan Oileanach no ANOVA.
Chaidh clones phage taghte agus phages gun cuir a-steach a chuir a-steach gu taobh a-staigh na vein earbaill (2 × 1010 phages / beathach ann an 300 μl PBS).Deich mionaidean mus deach perfusion agus socrachadh às deidh sin, chaidh na h-aon bheathaichean a thoirt a-steach gu intravenously le 100 μl de lectin le bileag DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 mionaidean às deidh in-stealladh phage, chaidh radain a spìonadh tron ​​​​chridhe le 50 ml PBS agus an uairsin 50 ml 4% PFA / PBS.Chaidh sampallan eanchainn a shuidheachadh cuideachd thar oidhche ann an 4% PFA / PBS agus air am bogadh ann an sucrose 30% thar oidhche aig 4 ° C.Tha sampaill air am lasadh reòta anns a’ mheasgachadh OCT.Chaidh mion-sgrùdadh immunohistochemical de shamhlaichean reòta a dhèanamh aig teòthachd an t-seòmair air cryosections 30 µm air am bacadh le 1% BSA agus air an toirt a-steach le antibodies le bileagan polyclonal FITC an aghaidh T7 phage (Novus NB 600-376A) aig 4 ° C.Goir thairis air an oidhche.Mu dheireadh, chaidh na h-earrannan a nighe 3 tursan le PBS agus an sgrùdadh le miocroscop laser confocal (Leica TCS SP5).
Chaidh a h-uile peptides le fìor-ghlan de 98% a cho-chur le GenScript USA, biotinylated agus lyophilized.Tha biotin air a cheangal tro spacer glycine trì-fhillte a bharrachd aig an N-terminus.Thoir sùil air a h-uile peptides a 'cleachdadh mass spectrometry.
Chaidh Streptavidin (Sigma S0677) a mheasgachadh le cus equimolar 5-fold de peptide biotinylated, peptide bacaidh BACE1 biotinylated, no measgachadh (co-mheas 3: 1) de peptide bacaidh BACE1 biotinylated agus peptide bacaidh BACE1 ann an 5-10% DMSO / air a bhrosnachadh ann am PSO.1 uair aig teòthachd an t-seòmair ron in-stealladh.Chaidh peptides le streptavidin-conjugated a thoirt a-steach gu intravenously aig dòs de 10 mg / kg a-steach do aon de na veins earball radain le cuas cerebral.
Chaidh an ìre de cho-fhilltean streptavidin-peptide a mheasadh le ELISA.Chaidh pleitean microtiter Nunc Maxisorp (Sigma) a chòmhdach thar oidhche aig 4 ° C le antibody anti-streptavidin luchag 1.5 μg / ml (Thermo, MA1-20011).Às deidh dha bacadh (bufair bacaidh: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) aig teòthachd an t-seòmair airson 2 uair, nigh a ’phlàta le 0.05% Tween-20 / PBS (bufair nighe) airson 3 An dàrna àite, chaidh sampaill toplasma 1 eadar-dhealaichte a chuir ris le toplasma 010, bacadh plasma gu math eadar-dhealaichte. , CSF 1:115).Chaidh an truinnsear an uairsin a bhrosnachadh thar oidhche aig 4 ° C le antibody lorg (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Às deidh trì ceumannan nighe, chaidh streptavidin a lorg le goir ann am fuasgladh substrate TMB (Roche) airson suas ri 20 min.Às deidh stad a chuir air leasachadh dath le 1M H2SO4, tomhas an sùghadh aig 450 nm.
Chaidh gnìomh an toinnte inhibitor streptavidin-peptide-BACE1 a mheasadh le Aβ (1-40) ELISA a rèir protocol an neach-dèanamh (Wako, 294-64701).Ann an ùine ghoirid, chaidh sampallan CSF a lagachadh ann an caolachadh àbhaisteach (1: 23) agus an gortachadh thar oidhche aig 4 ° C ann am pleitean tobar 96 air an còmhdach le BNT77 a ’glacadh antibody.Às deidh còig ceumannan nighe, chaidh antibody BA27 le HRP-conjugated a chur ris agus a bhrosnachadh airson 2 uair aig 4 ° C., air a leantainn le còig ceumannan nighe.Chaidh Aβ(1-40) a lorg le bhith a’ goir ann am fuasgladh TMB airson 30 mionaid aig teòthachd an t-seòmair.Às deidh leasachadh dath a bhith air a stad le fuasgladh stad, tomhas an sùghadh aig 450 nm.Chaidh sampallan plasma a thoirt a-mach gu ìre cruaidh ro Aβ (1-40) ELISA.Chaidh plasma a chuir ri 0.2% DEA (Sigma) ann an truinnsearan 96-tobar agus a bhrosnachadh aig teòthachd an t-seòmair airson 30 mionaid.Às deidh dha na truinnsearan SPE (Oasis, 186000679) a nighe le uisge agus 100% methanol, chaidh sampallan plasma a chuir ris na truinnsearan SPE agus chaidh a h-uile leaghan a thoirt air falbh.Chaidh sampaill a nighe (an toiseach le 5% methanol an uairsin 30% methanol) agus an cuir a-mach le 2% NH4OH / 90% methanol.Às deidh an eluate a thiormachadh aig 55 ° C airson 99 min aig sruth seasmhach N2, chaidh na sampallan a lughdachadh ann an diluents àbhaisteach agus chaidh Aβ (1-40) a thomhas mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd.
Mar a bheir thu luaidh air an artaigil seo: Urich, E. et al.Lìbhrigeadh bathair don eanchainn a’ cleachdadh peptides gluasaid air an comharrachadh ann am vivo.an saidheans.5, 14104;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB agus Moos T. Lìbhrigeadh dhrogaichean macromolecular don eanchainn a’ cleachdadh leigheas cuimsichte.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., agus Martinez-Martinez, P. Lìbhrigeadh dhrogaichean peptide agus pròtain thairis air cnap-starra fuil-eanchainn.Prògram Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM An cnap-starra fuil-eanchainn: cnap-starra ann an leasachadh dhrogaichean eanchainn.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, agus Byrd, A. Ro-shealladh airson lìbhrigeadh dhrogaichean nas fheàrr agus cuimseachadh air an eanchainn tro shlighe choroid plexus-CSF.Rannsachadh Cungaidh-leigheis 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Ùrachadh biopharmaceuticals le eich Trojan moileciuil airson lìbhrigeadh eanchainn.Ceimigear Bioconjug 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, còmhdhail peptide WM receptor-mediated thairis air a’ chnap-starra fuil-eanchainn.Endocr An t-Urr 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Meudaich dol-a-steach eanchainn agus èifeachd antibodies teirpeach a’ cleachdadh shuttles moileciuil monovalent.Neuron 81, 49–60, 10.1016/g.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Bidh còmhdhail receptor Transferrin (TfR) a 'dearbhadh cleachdadh eanchainn de dh' atharrachaidhean dàimh de antibodies TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).