Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha taic CSS cuibhrichte aig an dreach brabhsair a tha thu a’ cleachdadh. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brabhsair ùraichte (no gun cuir thu dheth Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). Aig an aon àm, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, nì sinn an làrach-lìn gun stoidhlichean agus JavaScript.
Tha biopsy leaghaidh (LB) na bhun-bheachd a tha a’ sìor fhàs mòr-chòrdte anns an raon bith-mheidigeach. Tha a’ bhun-bheachd stèidhichte sa mhòr-chuid air lorg pìosan de DNA taobh a-muigh a’ chuairteachaidh (ccfDNA), a thèid a leigeil ma sgaoil sa mhòr-chuid mar phìosan beaga às deidh bàs cealla ann an diofar fhigheagan. Tha cuibhreann beag de na pìosan seo a’ tighinn bho fhigheagan no fàs-bheairtean cèin. Anns an obair làithreach, tha sinn air a’ bhun-bheachd seo a chuir an sàs ann am feusgain, gnè faire a tha aithnichte airson an comas sìolaidh uisge na mara àrd. Bidh sinn a’ cleachdadh comas feusgain a bhith nan sìoltachain nàdarra gus pìosan DNA àrainneachdail a ghlacadh bho ghrunn stòran gus fiosrachadh a thoirt seachad mu bhith-iomadachd eag-shiostaman mara cladaich. Tha na toraidhean againn a’ sealltainn gu bheil pìosan DNA ann an hemolymph feusgain a tha ag atharrachadh gu mòr ann am meud, bho 1 gu 5 kb. Sheall sreath ghunnaichean-spreadhaidh gu bheil àireamh mhòr de phìosan DNA de thùs meanbh-bhitheach cèin. Nam measg, lorg sinn pìosan DNA bho bacteria, archaea, agus bhìorasan, a’ gabhail a-steach bhìorasan a tha aithnichte airson galair a thoirt do ghrunn aoighean a lorgar gu cumanta ann an eag-shiostaman mara cladaich. Mar cho-dhùnadh, tha an sgrùdadh againn a’ sealltainn gu bheil bun-bheachd LB a chaidh a chur an sàs ann am feusgain a’ riochdachadh stòr eòlais beairteach ach gun sgrùdadh fhathast mu iomadachd mhiocrobach ann an eag-shiostaman mara cladaich.
Tha buaidh atharrachadh clìomaid (CC) air bith-iomadachd eag-shiostaman mara na raon rannsachaidh a tha a’ fàs gu luath. Chan e a-mhàin gu bheil blàthachadh na cruinne ag adhbhrachadh cuideaman fiseòlasach cudromach, ach bidh e cuideachd a’ putadh crìochan mean-fhàsach seasmhachd teirmeach fàs-bheairtean mara, a’ toirt buaidh air àrainn grunn ghnèithean, gan brosnachadh gus suidheachaidhean nas fàbharach a lorg [1, 2]. A bharrachd air buaidh a thoirt air bith-iomadachd metazoans, bidh CC a’ cur dragh air cothromachadh cugallach eadar-obrachaidhean aoigh-mhiocróbach. Tha an dysbacteriosis miocrobach seo a’ bagairt gu mòr air eag-shiostaman mara oir tha e a’ dèanamh fàs-bheairtean mara nas buailtiche do pathogens gabhaltach [3, 4]. Thathas a’ creidsinn gu bheil pàirt chudromach aig SS ann am bàsan mòra, a tha na dhuilgheadas mòr airson riaghladh eag-shiostaman mara cruinneil [5, 6]. Tha seo na chùis chudromach leis na buaidhean eaconamach, eag-eòlasach agus beathachaidh a tha aig mòran ghnèithean mara. Tha seo gu sònraichte fìor airson dà-mhogallan a tha a’ fuireach anns na roinnean pòla, far a bheil buaidhean CK nas sa bhad agus nas cruaidhe [6, 7]. Gu dearbh, tha dà-mhogallan leithid Mytilus spp. air an cleachdadh gu farsaing gus sùil a chumail air buaidhean CC air eag-shiostaman mara. Chan eil e na iongnadh gu bheil àireamh mhòr de chomharran bith-eòlasach air an leasachadh gus sùil a chumail air an slàinte, gu tric a’ cleachdadh dòigh-obrach dà-ìre anns a bheil comharran bith-eòlasach gnìomhach stèidhichte air gnìomhachd enzymatic no gnìomhan ceallach leithid beòshlaint cealla agus gnìomhachd fagocytic [8]. Tha na modhan sin cuideachd a’ toirt a-steach tomhas dùmhlachd chomharran cuideam sònraichte a chruinnicheas ann an clò bog às deidh gabhail a-steach meudan mòra de dh’uisge na mara. Ach, tha comas sìolaidh àrd agus siostam cuairteachaidh leth-fhosgailte dà-bhalbh a’ toirt cothrom comharran bith-eòlasach hemolymph ùra a leasachadh a’ cleachdadh bun-bheachd biopsy leaghaidh (LB), dòigh-obrach shìmplidh agus as lugha ionnsaigheach airson riaghladh euslaintich. sampallan fala [9, 10]. Ged a gheibhear grunn sheòrsaichean de mholacilean cuairteachaidh ann an LB daonna, tha a’ bhun-bheachd seo stèidhichte sa mhòr-chuid air mion-sgrùdadh sreath DNA de mhìrean DNA taobh a-muigh a’ chuairteachaidh (ccfDNA) ann am plasma. Gu dearbh, tha fios gu bheil DNA a’ cuairteachadh ann am plasma daonna bho mheadhan an 20mh linn [11], ach chan eil ann ach anns na bliadhnachan mu dheireadh a tha tighinn gu bith dòighean sreath àrd-toraidh air leantainn gu breithneachadh clionaigeach stèidhichte air ccfDNA. Tha làthaireachd nan earrannan DNA seo a tha a’ cuairteachadh mar thoradh gu ìre air leigeil ma sgaoil fulangach DNA genomic (niùclasach agus mitochondrial) às deidh bàs cealla. Ann an daoine fallain, mar as trice bidh dùmhlachd ccfDNA ìosal (<10 ng/mL) ach faodaidh e a bhith air a mheudachadh 5–10 uiread ann an euslaintich a tha a’ fulang le diofar pathologies no a tha fo chuideam, agus mar thoradh air sin bidh milleadh air clò. Ann an daoine fallain, mar as trice bidh dùmhlachd ccfDNA ìosal (<10 ng/mL) ach faodaidh e a bhith air a mheudachadh 5–10 uiread ann an euslaintich a tha a’ fulang le diofar pathologies no a tha fo chuideam, agus mar thoradh air sin bidh milleadh air clò. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), no может повышаться в раЅьшаться в раЅьшаться в раЅьшаться в раЅььься в раЅьыься в 5–10 patologией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Ann an daoine fallain, mar as trice bidh dùmhlachd cccDNA ìosal (<10 ng/mL), ach faodaidh e àrdachadh 5–10 uiread ann an euslaintich le diofar pathologies no fo chuideam a dh’ adhbhraicheas milleadh clò.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL;在 健康个体中, ccfdna 的 浓度较低 （（<10 ng/ml）可 增加 5-10 倍, 从而 组织。。。 损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤 seo.Концентрации CCFDNA Обычно н мдей) раз у Пациентов СNациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Mar as trice bidh dùmhlachdan ccfDNA ìosal (<10 ng/ml) ann an daoine fallain, ach faodaidh iad a bhith air an àrdachadh 5-10 uiread ann an euslaintich le diofar pathologies no cuideam, agus mar thoradh air sin bidh milleadh air clò.Tha meud nam pìosan ccfDNA ag atharrachadh gu mòr, ach mar as trice bidh e eadar 150 agus 200 bp. [12]. Faodar mion-sgrùdadh air ccfDNA fèin-thùsail, i.e., ccfDNA bho cheallan aoigheachd àbhaisteach no atharraichte, a chleachdadh gus atharrachaidhean ginteil agus epigenetic a lorg a tha an làthair anns a’ ghinòm niùclasach agus/no mitochondrial, agus mar sin a’ cuideachadh luchd-clionaigeach gus leigheasan sònraichte a tha ag amas air moileciuilean a thaghadh [13]. Ach, faodar ccfDNA fhaighinn bho thùsan cèin leithid ccfDNA bho cheallan fetal rè torrachas no bho bhuill-bodhaig a chaidh a thar-chur [14,15,16,17]. Tha ccfDNA cuideachd na thùs fiosrachaidh cudromach airson làthaireachd searbhagan niùclasach àidseant gabhaltach (cèin) a lorg, a leigeas le lorg neo-ionnsaigheach a dhèanamh air galairean farsaing nach eil air an comharrachadh le cultaran fala, a’ seachnadh biopsy ionnsaigheach de fhigheagan gabhaltach [18]. Gu dearbh, tha sgrùdaidhean o chionn ghoirid air sealltainn gu bheil stòr fiosrachaidh beairteach ann am fuil dhaoine a dh’ fhaodar a chleachdadh gus pathogens bhìorasach agus bacteriach a chomharrachadh, agus gu bheil timcheall air 1% den ccfDNA a lorgar ann am plasma daonna de thùs cèin [19]. Tha na sgrùdaidhean seo a’ sealltainn gum faodar bith-iomadachd meanbh-bhitheagan cuairteachaidh organsaigh a mheasadh le bhith a’ cleachdadh mion-sgrùdadh ccfDNA. Ach, gus o chionn ghoirid, cha robh am bun-bheachd seo air a chleachdadh ach ann an daoine agus, gu ìre nas lugha, ann an veirteabraich eile [20, 21].
Anns a’ phàipear seo, bidh sinn a’ cleachdadh comas LB gus sgrùdadh a dhèanamh air ccfDNA Aulacomya atra, gnè a deas a lorgar gu cumanta anns na h-Eileanan Kerguelen fo-Antartaigeach, buidheann de dh’eileanan air mullach àrdchlàr mòr a chaidh a chruthachadh 35 millean bliadhna air ais. spreadhadh bholcànach. A’ cleachdadh siostam deuchainneach in vitro, fhuair sinn a-mach gu bheil mìrean DNA ann an uisge na mara air an toirt a-steach gu sgiobalta le feusgain agus a’ dol a-steach don roinn hemolymph. Tha sreath ghunnaichean-spreadhaidh air sealltainn gu bheil mìrean DNA den tùs fhèin agus nach eil fhèin ann an ccfDNA hemolymph feusgain, a’ gabhail a-steach bacteria symbiotic agus mìrean DNA bho bhith-eòlasan a tha àbhaisteach do eag-shiostaman cladaich mara bholcànach fuar. Tha sreathan bhìorasach ann an ccfDNA hemolymph cuideachd a thig bho bhìorasan le raointean aoigheachd eadar-dhealaichte. Lorg sinn cuideachd mìrean DNA bho bheathaichean ioma-cheallach leithid iasg cnàimheach, anemonaidhean mara, algaich agus biastagan. Mar cho-dhùnadh, tha an sgrùdadh againn a’ sealltainn gum faodar bun-bheachd LB a chuir an sàs gu soirbheachail ann an neo-dhruim-altachain mara gus repertoire genomic beairteach a chruthachadh ann an eag-shiostaman mara.
Chaidh feusgain ghorm inbheach (55-70 mm a dh'fhaid) Mytilus platensis (M. platensis) agus Aulacomya atra (A. atra) a chruinneachadh bho chladaichean creagach eadar-mara Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.). Eileanan Kerguelen san Dùbhlachd 2018. Fhuaireadh feusgain ghorm inbheach eile (Mytilus spp.) bho sholaraiche malairteach (PEI Mussel King Inc., Eilean a’ Phrionnsa Eideard, Canada) agus chaidh an cur ann an tanca èadhairichte le smachd teothachd (4°C) anns an robh 10–20 L de sàile fuadain 32‰. (salann mara fuadain Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Airson gach deuchainn, chaidh fad agus cuideam nan sligean fa leth a thomhas.
Tha pròtacal ruigsinneachd fosgailte an-asgaidh airson a’ phrògraim seo ri fhaighinn air-loidhne (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Gu h-aithghearr, chaidh hemolymph LB a chruinneachadh bho fhèithean fuadachaidh mar a chaidh a mhìneachadh [22]. Chaidh an hemolymph a shoilleireachadh le bhith ga centrifugachadh aig 1200 × g airson 3 mionaidean, chaidh an t-supernatant a reothadh (-20 ° C) gus an deach a chleachdadh. Airson aonaranachd agus glanadh cfDNA, chaidh sampallan (1.5-2.0 ml) a leaghadh agus a phròiseasadh a’ cleachdadh pasgan cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh. Chaidh ccfDNA a stòradh aig -80 ° C gus an deach tuilleadh mion-sgrùdaidh a dhèanamh. Ann an cuid de dheuchainnean, chaidh ccfDNA a aonaranachadh agus a ghlanadh a’ cleachdadh Pasgan Rannsachaidh DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Chaidh DNA glan a thomhas a’ cleachdadh deuchainn PicoGreen àbhaisteach. Chaidh sgaoileadh nam pìosan den ccfDNA aonaraichte a sgrùdadh le electrophoresis capillary a’ cleachdadh bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) a’ cleachdadh Pasgan DNA High Sensitivity. Chaidh an deuchainn a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh 1 µl den sampall ccfDNA a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh.
Airson sreathanachadh earrannan ccfDNA hemolymph, dh’ullaich Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) leabharlannan gunna-spreadhaidh a’ cleachdadh pasgan measgachadh DNA Illumina den phasgan Illumina MiSeq PE75. Chaidh inneal-atharrachaidh àbhaisteach (BioO) a chleachdadh. Tha faidhlichean dàta amh rim faighinn bho Thasglann Leughaidh Sreath NCBI (SRR8924808 agus SRR8924809). Chaidh càileachd leughaidh bunaiteach a mheasadh a’ cleachdadh FastQC [23]. Chaidh Trimmomatic [24] a chleachdadh airson innealan-atharrachaidh bearraidh agus leughaidhean de dhroch chàileachd. Chaidh leughaidhean gunna-spreadhaidh le cinn paidhir a chur còmhla le FLASH ann an leughaidhean singilte nas fhaide le co-dhiù 20 bp de thar-lùbadh gus mì-cho-fhreagarrachd a sheachnadh [25]. Chaidh leughaidhean co-aonaichte a chomharrachadh le BLASTN a’ cleachdadh stòr-dàta Tacsonomaidh dà-mhogallach NCBI (luach e < 1e−3 agus 90% co-chosmhail), agus chaidh masgadh sreathan ìosal-iom-fhillteachd a dhèanamh a’ cleachdadh DUST [26]. Chaidh leughaidhean co-aonaichte a chomharrachadh le BLASTN a’ cleachdadh stòr-dàta Tacsonomaidh dà-mhogallach NCBI (luach e < 1e−3 agus 90% co-chosmhail), agus chaidh masgadh sreathan ìosal-iom-fhillteachd a dhèanamh a’ cleachdadh DUST [26]. Mar a dhèiligeas tu ris an t-seinneadair BLASTN agus an t-ainm a th' air an t-saoghal моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 agus 90% гомологии), agus маскирование последовательностей низкой сложност использованием DUST [26] . Chaidh leughaidhean cruinnichte a chomharrachadh le BLASTN a’ cleachdadh stòr-dàta tacsonamaidh dà-mhogallan NCBI (luach e < 1e-3 agus 90% co-chosmhail), agus chaidh masgadh sreath ìosal-iom-fhillteachd a dhèanamh a’ cleachdadh DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据 库（e 值< 1e-3 90% 同 源性）用BLASTN 注释 合并的读数 6进行低复杂度序列的掩蔽.使 用 双 壳类 ncbi 分类 (（<1e-3 和 90% 同源) 用 用 用 注释 合并 读溕 duslach]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BlasTN agus использованием таксономической базы двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 agus 90% гомологии), а маскирование последовательностей значение e <1e-3 agus 90% гомологии), а маскирование последовательностей жожо ниложо ничелоно. выполнено с использованием DUST [26]. Chaidh leughaidhean cruinnichte a chomharrachadh le BLASTN a’ cleachdadh stòr-dàta tacsonamach dà-mhogallan NCBI (luach e <1e-3 agus 90% co-chosmhail), agus chaidh masgadh sreath ìosal iom-fhillteachd a dhèanamh a’ cleachdadh DUST [26].Chaidh na leughaidhean a roinn ann an dà bhuidheann: co-cheangailte ri sreathan dà-mhagach (ris an canar fèin-leughaidhean an seo) agus neo-cheangailte (neo-fhèin-leughaidhean). Chaidh dà bhuidheann a chruinneachadh air leth a’ cleachdadh MEGAHIT gus contigs a chruthachadh [27]. Aig an aon àm, chaidh sgaoileadh tacsonamach leughaidhean meanbh-bhitheagan coimheach a sheòrsachadh a’ cleachdadh Kraken2 [28] agus a riochdachadh gu grafaigeach le clàr-pì Krona air Galaxy [29, 30]. Chaidh an kmers as fheàrr a dhearbhadh mar kmers-59 bho na deuchainnean tòiseachaidh againn. Chaidh fèin-contigs an uair sin a chomharrachadh le bhith gan co-thaobhadh ri BLASTN (stòr-dàta NCBI dà-mhogallach, luach e < 1e−10 agus 60% homology) airson nota deireannach. Chaidh fèin-contigs an uair sin a chomharrachadh le bhith gan co-thaobhadh ri BLASTN (stòr-dàta NCBI dà-mhogallach, luach e < 1e−10 agus 60% homology) airson nota deireannach. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворюковлюсон значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Chaidh fèin-contigs an uair sin a chomharrachadh le bhith gan maidseadh an aghaidh BLASTN (stòr-dàta dà-mhogallan NCBI, luach e <1e-10 agus 60% homology) airson an anotachadh mu dheireadh.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据 库, agus 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最 终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据 库, agus 值< 1e-10 和60% Затем были дентифицированы собственные контиги для окончательной anнотации путем сопоставления NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 agus гомология 60%). Chaidh fèin-contigs an uair sin a chomharrachadh airson anotachadh deireannach le bhith gan maidseadh an aghaidh BLASTN (stòr-dàta dà-mhogallan NCBI, luach e <1e-10 agus 60% co-chosmhaileachd). Aig an aon àm, chaidh contigs buidhne neo-fhèin a chomharrachadh le BLASTN (stòr-dàta nt NCBI, luach e < 1e−10 agus 60% co-chosmhaileachd). Aig an aon àm, chaidh contigs buidhne neo-fhèin a chomharrachadh le BLASTN (stòr-dàta nt NCBI, luach e < 1e−10 agus 60% co-chosmhaileachd). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI" 1 гомогия 60%). Aig an aon àm, chaidh contigs buidhne cèin a chomharrachadh le BLASTN (stòr-dàta NT NCBI, luach e <1e-10 agus 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据 库, agus 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据 库, agus 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (банЋ NC) значение e <1e-10 и гомология 60%). Aig an aon àm, chaidh contigs buidhne neo-fhèin a chomharrachadh le BLASTN (stòr-dàta nt NCBI, luach e <1e-10 agus 60% co-chosmhaileachd). Chaidh BLASTX a dhèanamh cuideachd air contigs neo-fhèin a’ cleachdadh stòran-dàta pròtain nr agus RefSeq NCBI (luach e < 1e−10 agus 60% co-chosmhaileachd). Chaidh BLASTX a dhèanamh cuideachd air contigs neo-fhèin a’ cleachdadh stòran-dàta pròtain nr agus RefSeq NCBI (luach e < 1e−10 agus 60% co-chosmhaileachd). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах сиспользованием баз dannых белка nr и NCелка и RefЇен <1e-10 agus гомология 60%). Chaidh BLASTX a dhèanamh cuideachd air contigs neo-fèin-ghluasadach a’ cleachdadh stòran-dàta pròtain nr agus RefSeq NCBI (luach e < 1e-10 agus 60% co-chosmhaileachd).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据 库对 叠 群进行了BLASTX（e 值 < 1e-10 和扐 。 怼 怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼 怼 和 60 % 和还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据 库对 叠 群进行了BLASTX（e 值 < 1e-10 和扐 。 怼 怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼 怼 和 60 % 和 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах сиспользованием баз данных белка nr NCи-1 RefSeq agus гомология 60%). Chaidh BLASTX a dhèanamh cuideachd air contigs neo-fèin-ghluasadach a’ cleachdadh stòran-dàta pròtain nr agus RefSeq NCBI (luach e <1e-10 agus 60% co-chosmhaileachd).Tha na buidhnean BLASTN agus BLASTX de neo-fhèin-contigs a’ riochdachadh na contigs deireannach (faic am faidhle a bharrachd).
Tha na prìomaran a chaidh a chleachdadh airson PCR air an liostadh ann an Clàr S1. Chaidh poilimearase DNA Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) a chleachdadh gus na ginean targaid ccfDNA a leudachadh. Chaidh na cumhaichean ath-bhualadh a leanas a chleachdadh: dì-nàdarrachadh aig 95°C airson 3 mionaidean, 95°C airson 1 mhionaid, teòthachd annealing suidhichte airson 1 mhionaid, sìneadh aig 72°C airson 1 mhionaid, 35 cearcallan, agus mu dheireadh 72°C taobh a-staigh 10 mionaidean. Chaidh toraidhean PCR a sgaradh le electrophoresis ann an gels agarose (1.5%) anns an robh SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) aig 95 V.
Chaidh feusgain (Mytilus spp.) a dhèanamh freagarrach ann an 500 ml de dh’uisge mara ocsaideanaichte (32 PSU) airson 24 uair aig 4°C. Chaidh DNA plasmid anns an robh cuir-a-steach a’ còdachadh sreath cDNA galectin-7 daonna (àireamh inntrigidh NCBI L07769) a chur ris a’ bhial aig dùmhlachd deireannach de 190 μg/μl. B’ e feusgain a chaidh a ghoir fo na h-aon chumhachan gun DNA a bharrachd a bh’ anns a’ bhuidheann smachd. Bha DNA gun fheusgain anns an treas tanca smachd. Gus càileachd an DNA ann an uisge na mara a sgrùdadh, chaidh sampallan uisge na mara (20 μl; trì ath-aithris) a thoirt bho gach tanca aig an àm ainmichte. Airson lorg DNA plasmid, chaidh feusgain LB a bhuain aig na h-amannan ainmichte agus an sgrùdadh le qPCR agus ddPCR. Air sgàth susbaint àrd salainn uisge na mara, chaidh aliquots a lagachadh ann an uisge càileachd PCR (1:10) mus deach a h-uile deuchainn PCR a dhèanamh.
Chaidh PCR boinneagan didseatach (ddPCR) a dhèanamh a’ cleachdadh protocol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada). Cleachd am pròifil teòthachd gus an teòthachd as fheàrr a dhearbhadh (Clàr S1). Chaidh boinneagan a chruthachadh a’ cleachdadh gineadair boinneagan QX200 (BioRad). Chaidh ddPCR a dhèanamh mar a leanas: 95°C airson 5 mionaidean, 50 cearcall de 95°C airson 30 diogan agus teòthachd annealing sònraichte airson 1 mionaid agus 72°C airson 30 diogan, 4°C airson 5 mionaidean agus 90°C taobh a-staigh 5 mionaidean. Chaidh an àireamh de bhoinneagan agus ath-bheachdan adhartach (àireamh lethbhric/µl) a thomhas a’ cleachdadh leughadair boinneagan QX200 (BioRad). Chaidh sampallan le nas lugha na 10,000 boinneagan a dhiùltadh. Cha deach smachd pàtrain a dhèanamh a h-uile uair a chaidh ddPCR a ruith.
Rinneadh qPCR le bhith a’ cleachdadh Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Astràilia) agus prìmearan sònraichte LGALS7. Rinneadh a h-uile PCR cainneachdail ann an 20 µl le bhith a’ cleachdadh an QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). Thòisicheadh ​​qPCR le goir 15 mionaid aig 95°C agus an uair sin 40 cearcall aig 95°C airson 10 diogan agus aig 60°C airson 60 diogan le aon chruinneachadh dàta. Chaidh lùban leaghaidh a chruthachadh le bhith a’ cleachdadh tomhais leantainneach aig 95°C airson 5 diogan, 65°C airson 60 diogan, agus 97°C aig deireadh an qPCR. Rinneadh gach qPCR ann an trì leth-bhreac, ach a-mhàin airson sampallan smachd.
Leis gu bheil feusgain ainmeil airson an ìre sìolaidh àrd aca, rinn sinn sgrùdadh an toiseach an gabhadh leotha criomagan DNA a tha an làthair ann an uisge na mara a shìoladh agus a chumail. Bha ùidh againn cuideachd an robh na criomagan seo a’ cruinneachadh anns an t-siostam limfeach leth-fhosgailte aca. Rinn sinn fuasgladh air a’ chùis seo gu deuchainneach le bhith a’ lorg mar a thachair do chriomagan DNA so-sgaoilte a chaidh a chur ri tancaichean feusgain ghorm. Gus lorg criomagan DNA a dhèanamh nas fhasa, chleachd sinn DNA plasmid cèin (chan e fèin-dhèanta) anns an robh an gine galectin-7 daonna. Bidh ddPCR a’ lorg criomagan DNA plasmid ann an uisge na mara agus feusgain. Tha na toraidhean againn a’ sealltainn ma dh’fhan an ìre de chriomagan DNA ann an uisge na mara an ìre mhath seasmhach thar ùine (suas ri 7 latha) às aonais feusgain, an uairsin ann an làthair feusgain dh’fhalbh an ìre seo cha mhòr gu tur taobh a-staigh 8 uairean a thìde (Figear 1a, b). Chaidh criomagan de DNA exogenous a lorg gu furasta taobh a-staigh 15 mionaidean ann an lionn intravalvular agus hemolymph (Figear 1c). Dh’fhaodadh na criomagan seo a bhith air an lorg fhathast suas ri 4 uairean a thìde às deidh nochdadh. Tha an gnìomhachd sìolaidh seo a thaobh criomagan DNA co-chosmhail ri gnìomhachd sìolaidh bacteria agus algaich [31]. Tha na toraidhean seo a’ moladh gum faod feusgain DNA cèin a shìoladh agus a chruinneachadh anns na roinnean lionn aca.
Dùmhlachdan coimeasach de DNA plasmid ann an uisge na mara an làthair (A) no neo-làthaireachd (B) feusgain, air an tomhas le ddPCR. Ann an A, tha na toraidhean air an cur an cèill mar cheudadan, le crìochan nam bogsaichean a’ riochdachadh an 75mh agus an 25mh peirceintealan. Tha an lùb logarithmach iomchaidh air a shealltainn ann an dearg, agus tha an raon le sgàil liath a’ riochdachadh an eadar-ama earbsa 95%. Ann am B, tha an loidhne dhearg a’ riochdachadh a’ chuibheasaich agus tha an loidhne ghorm a’ riochdachadh an eadar-ama earbsa 95% airson an dùmhlachd. C Cruinneachadh de DNA plasmid ann an hemolymph agus lionn bhalbhaichean feusgain aig diofar amannan às deidh DNA plasmid a chur ris. Tha na toraidhean air an taisbeanadh mar lethbhric iomlan a chaidh a lorg/mL (±SE).
An ath rud, rinn sinn sgrùdadh air tùs ccfDNA ann am feusgain a chaidh a chruinneachadh bho leapannan feusgain air Eileanan Kerguelen, buidheann iomallach de dh’eileanan le buaidh chuingealaichte antropogenic. Airson an adhbhair seo, chaidh cccDNA bho hemolymphs feusgain a sgaradh agus a ghlanadh le dòighean a thathas a’ cleachdadh gu cumanta gus cccDNA daonna a ghlanadh [32, 33]. Fhuair sinn a-mach gu bheil dùmhlachdan cuibheasach ccfDNA hemolymph ann am feusgain anns an raon ìosal micrograman gach ml hemolymph (faic Clàr S2, Fiosrachadh a bharrachd). Tha an raon dùmhlachdan seo mòran nas motha na ann an daoine fallain (nanograman ìosal gach milliliter), ach ann an cùisean ainneamh, ann an euslaintich aillse, faodaidh ìre ccfDNA grunn micrograman gach milliliter a ruighinn [34, 35]. Sheall mion-sgrùdadh air sgaoileadh meud ccfDNA hemolymph gu bheil na pìosan sin ag atharrachadh gu mòr ann am meud, a’ dol bho 1000 bp gu 1000 bp. suas gu 5000 bp (Figear 2). Fhuaireadh toraidhean coltach ris le bhith a’ cleachdadh an QIAamp Investigator Kit stèidhichte air silica, dòigh a thathas a’ cleachdadh gu cumanta ann an saidheans fòireansach gus DNA genomic a sgaradh agus a ghlanadh gu luath bho shampaill DNA le dùmhlachd ìosal, a’ gabhail a-steach ccfDNA [36].
Electrophoregram riochdachail ccfDNA de hemolymph feusgain. Air a thoirt a-mach le NucleoSnap Plasma Kit (gu h-àrd) agus QIAamp DNA Investigator Kit. B Plot fidheall a’ sealltainn sgaoileadh dùmhlachdan ccfDNA hemolymph (±SE) ann am feusgain. Tha na loidhnichean dubha is dearga a’ riochdachadh a’ mheadhain agus a’ chiad is an treas cairteal, fa leth.
Tha timcheall air 1% de ccfDNA ann an daoine agus prìomhaidean a’ tighinn bho thùs cèin [21, 37]. Leis an t-siostam cuairteachaidh leth-fhosgailte aig dà-mhogallan, uisge mara làn meanbh-fhàs-bheairtean, agus sgaoileadh meud ccfDNA feusgain, bha sinn den bheachd gum faodadh amar beairteach is eadar-mheasgte de DNA meanbh-fhàs-bheairtean a bhith ann an hemolymph ccfDNA feusgain. Gus an beachd-bharail seo a dhearbhadh, rinn sinn sreath de ccfDNA hemolymph bho shampaill Aulacomya atra a chaidh a chruinneachadh bho Eileanan Kerguelen, a’ toirt a-mach còrr air 10 millean leughadh, agus chaidh 97.6% dhiubh seachad air smachd càileachd. Chaidh na leughaidhean an uairsin a sheòrsachadh a rèir stòran fèin agus neo-fhèin a’ cleachdadh stòran-dàta dà-mhogallan BLASTN agus NCBI (Figear S1, Fiosrachadh a bharrachd).
Ann an daoine, faodar DNA niùclasach agus mitochondrial a leigeil ma sgaoil a-steach don t-sruth fala [38]. Ach, anns an sgrùdadh seo, cha robh e comasach DNA genomic niùclasach feusgain a mhìneachadh gu mionaideach, leis nach deach genome A. atra a sheicheamh no a mhìneachadh. Ach, bha sinn comasach air grunn phìosan ccfDNA den thùs againn fhèin a chomharrachadh a’ cleachdadh leabharlann dà-mhogallan (Figear S2, Fiosrachadh a bharrachd). Dhearbh sinn cuideachd gu robh pìosan DNA den thùs againn fhèin ann le bhith a’ leudachadh PCR stiùirichte air na ginean A. atra sin a chaidh a sheicheamh (Figear 3). San aon dòigh, leis gu bheil genome mitochondrial A. atra ri fhaighinn ann an stòran-dàta poblach, gheibhear fianais airson làthaireachd pìosan ccfDNA mitochondrial ann an hemolymph A. atra. Chaidh làthaireachd pìosan DNA mitochondrial a dhearbhadh le bhith a’ leudachadh PCR (Figear 3).
Bha diofar ghinean mitochondrial an làthair ann an hemolymph A. atra (dotagan dearga – àireamh stoc: SRX5705969) agus M. platensis (dotagan gorma – àireamh stoc: SRX5705968) air an leudachadh le PCR. Figear air atharrachadh bho Breton et al., 2011 B Meudachadh air supernatant hemolymph bho A. atra Air a stòradh air pàipear FTA. Cleachd punch 3 mm gus a chur gu dìreach ris an tiùb PCR anns a bheil am measgachadh PCR.
Leis cho pailt ’s a tha susbaint mhiocrobach ann an uisge na mara, chuir sinn fòcas an toiseach air comharrachadh sreathan DNA mhiocrobach ann an hemolymph. Gus seo a dhèanamh, bidh sinn a’ cleachdadh dà ro-innleachd eadar-dhealaichte. Chleachd a’ chiad ro-innleachd Kraken2, prògram seòrsachaidh sreath stèidhichte air algairim as urrainn sreathan mhiocrobach a chomharrachadh le cruinneas co-chosmhail ri BLAST agus innealan eile [28]. Chaidh barrachd air 6719 leughaidhean a dhearbhadh mar thùs bacteriach, agus bha 124 agus 64 bho archaea agus bhìorasan, fa leth (Figear 4). B’ e na pìosan DNA bacteriach as pailte Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), agus Bacteroidetes (17%) (Figear 4a). Tha an sgaoileadh seo a rèir sgrùdaidhean roimhe air microbiome feusgain ghorm na mara [39, 40]. B’ e Gammaproteobacteria am prìomh chlas de Proteobacteria (44%), a’ gabhail a-steach mòran Vibrionales (Figear 4b). Dhearbh an dòigh ddPCR gu robh bloighean DNA Vibrio ann an ccfDNA hemolymph A. atra (Figear 4c) [41]. Gus barrachd fiosrachaidh fhaighinn mu thùs bacteriach ccfDNA, chaidh dòigh-obrach a bharrachd a ghabhail (Figear S2, Fiosrachadh a bharrachd). Anns a’ chùis seo, chaidh leughaidhean a bha a’ dol thairis air a chèile a chruinneachadh mar leughaidhean ceann-càraid agus chaidh an seòrsachadh mar thùs fèin (dà-mhogallan) no neo-fhèin a’ cleachdadh BLASTN agus luach e de 1e−3 agus gearradh- dheth le co-chosmhaileachd >90%. Anns a’ chùis seo, chaidh leughaidhean a bha a’ dol thairis air a chèile a chruinneachadh mar leughaidhean ceann-càraid agus chaidh an seòrsachadh mar thùs fèin (dà-mhogallan) no neo-fhèin a’ cleachdadh BLASTN agus luach e de 1e−3 agus gearradh- dheth le co-chosmhaileachd >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения случае парными концами agus быликиан собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN agus значение 3 гомологией> 90%. Anns a’ chùis seo, chaidh leughaidhean a bha a’ dol thairis air a chèile a chruinneachadh mar leughaidhean le cinn paidhir agus chaidh an seòrsachadh mar dhùthchasach (dà-mhogallach) no neo-thùsail a’ cleachdadh BLASTN agus luach e de 1e-3 agus gearradh- dheth le co-chosmhaileachd >90%.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数,并使 用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在这种情况下, 重叠读数 组装 为 末端 读数, 使用使用 使璔 blast 1 皼 倚 用 数 用 使璔 blast 1 值和> 90% 同源性 的分类 自身 （双 壳类） 非 自身, 。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения спарными концами и классифиц собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием знаѹзованием знаѹагени 3 гомологии> 90%. Anns a’ chùis seo, chaidh leughaidhean a bha a’ dol thairis air a chèile a chruinneachadh mar leughaidhean le cinn paidhir agus chaidh an seòrsachadh mar fhèin (dà-mhogallan) no neo-thùsail a’ cleachdadh luachan e BLASTN agus 1e-3 agus stairsneach co-chosmhail >90%.Leis nach deach genome A. atra a shreathachadh fhathast, chleachd sinn ro-innleachd cruinneachaidh de novo inneal-cruinneachaidh MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Chaidh 147,188 contigs gu h-iomlan a chomharrachadh mar eisimeileach (dà-mhogallan) air tùs. Chaidh na contigs sin an uairsin a sgaoileadh le luachan-e de 1e-10 a’ cleachdadh BLASTN agus BLASTX. Leig an ro-innleachd seo leinn 482 criomag neo-dhà-mhogallan a chomharrachadh a tha an làthair ann an ccfDNA A. atra. Fhuaireadh còrr is leth (57%) de na criomagan DNA sin bho bacteria, sa mhòr-chuid bho shiombiontan giollach, a’ gabhail a-steach siombiontan sulfotrofach, agus bho shiombiontan giollach Solemya velum (Figear 5).
Pailteas coimeasach aig ìre an t-seòrsa. B Iomadachd mhiocrobach dà phrìomh phyla (Firmicutes agus Proteobacteria). Leudachadh riochdachail de ddPCR C Vibrio spp. A. Pìosan den ghine 16S rRNA (gorm) ann an trì hemolymphs atra.
Chaidh mion-sgrùdadh a dhèanamh air 482 contig a chaidh a chruinneachadh gu h-iomlan. Pròifil choitcheann air sgaoileadh tacsonamach anotaidhean contig metagenomic (prokaryotes agus eukaryotes). B Sgaoileadh mionaideach de mhìrean DNA bacterial air an comharrachadh le BLASTN agus BLASTX.
Sheall mion-sgrùdadh Kraken2 cuideachd gu robh pìosan DNA arcaeal ann an ccfDNA feusgain, nam measg pìosan DNA de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), agus Thaurmarcheota (11%) (Figear 6a). Cha bu chòir dha a bhith na iongnadh gu bheil pìosan DNA a thàinig bho Euryarchaeota agus Crenarchaeota, a chaidh a lorg roimhe seo ann an coimhearsnachd meanbh-fhàs-bheairtean feusgain Chalafòrnia [42]. Ged a tha Euryarchaeota gu tric co-cheangailte ri suidheachaidhean anabarrach, thathas a-nis ag aithneachadh gu bheil an dà chuid Euryarchaeota agus Crenarcheota am measg nam prokaryotes as cumanta anns an àrainneachd criogenach mara [43, 44]. Chan eil e na iongnadh gu bheil meanbh-fhàs-bheairtean methanogenic ann am feusgain, leis gu bheil aithisgean o chionn ghoirid air aodion meatàn farsaing bho aodion bonn air Àrd-chlàr Kerguelen [45] agus cinneasachadh meatàn meanbh-fhàs-bheairtean a dh’ fhaodadh a bhith ann a chaidh fhaicinn far costa Eileanan Kerguelen [46].
Ghluais ar n-aire an uairsin gu leughaidhean bho bhìorasan DNA. Cho fad ’s as aithne dhuinn, is e seo a’ chiad sgrùdadh far-targaid air susbaint bhìoras feusgain. Mar a bha dùil, lorg sinn bloighean DNA de bacteriophages (Caudovirales) (Figear 6b). Ach, tha an DNA bhìorasach as cumanta a’ tighinn bho phylum de nucleocytoviruses, ris an canar cuideachd am bhìoras mòr DNA cytoplasm niùclasach (NCLDV), aig a bheil an genome as motha de bhìoras sam bith. Taobh a-staigh a’ phylum seo, buinidh a’ mhòr-chuid de shreathan DNA do na teaghlaichean Mimimidoviridae (58%) agus Poxviridae (21%), agus tha na h-aoighean nàdarra aca a’ toirt a-steach veirteabraich agus artrapodan, agus buinidh cuibhreann beag de na sreathan DNA seo do lìonanaich bhìorasach aithnichte. Bidh e a’ galarachadh lìonanaich eukaryotic mara. Fhuaireadh na sreathan cuideachd bhon bhìoras Pandora, am bhìoras mòr leis a’ mheud genome as motha de ghinealach bhìorasach aithnichte sam bith. Gu inntinneach, bha an raon de aoighean aithnichte a bhith air an galarachadh leis a’ bhìoras, mar a chaidh a dhearbhadh le sreath DNA ccf hemolymph, an ìre mhath mòr (Figear S3, Fiosrachadh a bharrachd). Tha e a’ gabhail a-steach bhìorasan a bhios a’ galarachadh bhiastagan leithid Baculoviridae agus Iridoviridae, a bharrachd air bhìorasan a bhios a’ galarachadh amoeba, algaich agus veirteabraich. Lorg sinn cuideachd sreathan a tha a’ freagairt ri genome Pithovirus sibericum. Chaidh pitoviruses (ris an canar cuideachd “bhìorasan zombie”) a sgaradh an toiseach bho reothadh maireannach 30,000 bliadhna a dh'aois ann an Siberia [47]. Mar sin, tha na toraidhean againn a rèir aithisgean roimhe a’ sealltainn nach eil a h-uile gnè ùr-nodha de na bhìorasan sin air a dhol à bith [48] agus gum faodadh na bhìorasan sin a bhith an làthair ann an eag-shiostaman mara fo-Artaigeach iomallach.
Mu dheireadh, rinn sinn deuchainn gus faicinn an lorgadh sinn pìosan DNA bho bheathaichean ioma-cheallach eile. Chaidh 482 contigs cèin a chomharrachadh le BLASTN agus BLASTX le leabharlannan nt, nr agus RefSeq (genomic agus pròtain). Tha na toraidhean againn a’ sealltainn, am measg nam pìosan cèin de ccfDNA de bheathaichean ioma-cheallach, gu bheil DNA chnàmhan cnàimheach a’ faighinn làmh an uachdair (Figear 5). Chaidh pìosan DNA bho bhiastagan agus gnèithean eile a lorg cuideachd. Cha deach pàirt an ìre mhath mòr de na pìosan DNA a chomharrachadh, is dòcha air sgàth dìth riochdachadh àireamh mhòr de ghnèithean mara ann an stòran-dàta genomic an taca ri gnèithean talmhaidh [49].
Anns a’ phàipear seo, bidh sinn a’ cur bun-bheachd LB an sàs ann am feusgain, ag argamaid gum faod sreath-sgrùdadh ccfDNA hemolymph lèirsinn a thoirt seachad air co-dhèanamh eag-shiostaman mara cladaich. Gu sònraichte, fhuair sinn a-mach 1) gu bheil dùmhlachdan an ìre mhath àrd (ìrean microgram) de mhìrean DNA a tha a’ cuairteachadh an ìre mhath mòr (~ 1-5 kb) ann an hemolymph feusgain; 2) gu bheil na mìrean DNA seo an dà chuid neo-eisimeileach agus neo-eisimeileach 3) Am measg nan stòran cèin de na mìrean DNA seo, lorg sinn DNA bacterial, archaeal agus bhìorasach, a bharrachd air DNA bheathaichean ioma-cheallach eile; 4) Bidh cruinneachadh nam mìrean ccfDNA cèin seo anns an hemolymph a’ tachairt gu luath agus a’ cur ri gnìomhachd sìolaidh a-staigh feusgain. Mar cho-dhùnadh, tha an sgrùdadh againn a’ sealltainn gu bheil bun-bheachd LB, a chaidh a chur an sàs gu ruige seo sa mhòr-chuid ann an raon bith-leighis, a’ còdachadh stòr eòlais beairteach ach gun sgrùdadh a dh’ fhaodar a chleachdadh gus tuigse nas fheàrr fhaighinn air an eadar-obrachadh eadar gnèithean sentinel agus an àrainneachd.
A bharrachd air prìomhaidean, chaidh aithris air aonaranachd ccfDNA ann am mamalan, nam measg luchagan, coin, cait, agus eich [50, 51, 52]. Ach, cho fad ’s as aithne dhuinn, ’s e an sgrùdadh againne a’ chiad fhear a tha ag aithris lorg agus sreath ccfDNA ann an gnèithean mara le siostam cuairteachaidh fosgailte. Dh’fhaodadh am feart anatomical seo agus comas sìolaidh feusgain, co-dhiù ann am pàirt, mìneachadh a dhèanamh air na feartan meud eadar-dhealaichte de mhìrean DNA a tha a’ cuairteachadh an taca ri gnèithean eile. Ann an daoine, tha a’ mhòr-chuid de mhìrean DNA a tha a’ cuairteachadh san fhuil nam mìrean beaga a tha a’ dol ann am meud bho 150 gu 200 bp. le mullach as àirde de 167 bp [34, 53]. Tha cuibhreann beag ach cudromach de mhìrean DNA eadar 300 agus 500 bp ann am meud, agus tha timcheall air 5% nas fhaide na 900 bp. [54]. Is e an t-adhbhar airson an sgaoileadh meud seo gu bheil am prìomh thùs ccfDNA ann am plasma a’ tachairt mar thoradh air bàs cealla, an dàrna cuid air sgàth bàs cealla no air sgàth necrosis cheallan hematopoietic a tha a’ cuairteachadh ann an daoine fallain no air sgàth apoptosis cheallan tumhair ann an euslaintich aillse (ris an canar DNA tumhair a tha a’ cuairteachadh). , ctDNA). Bha sgaoileadh meud ccfDNA hemolymph a lorg sinn ann am feusgain eadar 1000 agus 5000 bp, a’ moladh gu bheil tùs eadar-dhealaichte aig ccfDNA feusgain. Tha seo na bharail loidsigeach, leis gu bheil siostam fascular leth-fhosgailte aig feusgain agus gu bheil iad a’ fuireach ann an àrainneachdan uisgeach mara anns a bheil dùmhlachdan àrda de DNA genomic meanbh-bhitheach. Gu dearbh, tha na deuchainnean obair-lann againn a’ cleachdadh DNA exogenous air sealltainn gu bheil feusgain a’ cruinneachadh mìrean DNA ann an uisge na mara, co-dhiù às deidh beagan uairean a thìde bidh iad air an lobhadh às deidh dhaibh a bhith air an gabhail a-steach gu ceallach agus / no air an leigeil ma sgaoil agus / no air an stòradh ann an diofar bhuidhnean. Leis cho tearc ‘s a tha ceallan (gach cuid prokaryotic agus eukaryotic), lughdaichidh cleachdadh roinnean intravalvular an ìre de ccfDNA bho thùsan fhèin a bharrachd air bho thùsan cèin. A’ beachdachadh air cho cudromach sa tha dìonachd dhùthchasach dà-mhogallach agus an àireamh mhòr de fagocytes a tha a’ cuairteachadh, chuir sinn romhainn cuideachd gu bheil eadhon ccfDNA cèin air a bheairteachadh le fagocytes a tha a’ cuairteachadh a bhios a’ cruinneachadh DNA cèin nuair a thèid meanbh-fhàs-bheairtean agus/no sprùilleach ceallach a shlugadh. Còmhla, tha na toraidhean againn a’ sealltainn gu bheil ccfDNA hemolymph dà-mhogallach na stòras sònraichte de fhiosrachadh moileciuil agus a’ neartachadh an inbhe mar ghnèithean faire.
Tha an dàta againn a’ nochdadh gum faod sreath agus mion-sgrùdadh bloighean ccfDNA hemolymph a tha air an toirt bho bacteria fiosrachadh cudromach a thoirt seachad mu fhlùra bacteria an aoigh agus na bacteria a tha an làthair anns an eag-shiostam mara mun cuairt. Tha dòighean sreath-losgaidh air sreathan den bacteria commensal A. atra gill fhoillseachadh nach biodh air an lorg nan deidheadh ​​dòighean-obrach àbhaisteach aithneachaidh rRNA 16S a chleachdadh, gu ìre air sgàth claonadh leabharlann fiosrachaidh. Gu dearbh, sheall an cleachdadh againn de dhàta LB a chaidh a chruinneachadh bho M. platensis san aon shreath feusgain aig Kerguelen gu robh co-dhèanamh nan symbiontan bacterial co-cheangailte ri geòmain mar an ceudna airson an dà ghnè feusgain (Figear S4, Fiosrachadh a bharrachd). Is dòcha gu bheil an coltas seo eadar dà fheusgan a tha eadar-dhealaichte gu ginteil a’ nochdadh co-dhèanamh choimhearsnachdan bacterial anns na tasgaidhean fuar, sulfarach agus bholcànach ann an Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Tha ìrean nas àirde de meanbh-fhàs-bheairtean a lughdaicheas sulfar air an deagh mhìneachadh nuair a thathar a’ buain feusgain bho sgìrean cladaich bioturbated [59], leithid costa Port-au-France. Is e cothrom eile gum faodadh buaidh a bhith aig tar-chur còmhnard air flòra nam feusgain choimheach [60, 61]. Feumar barrachd rannsachaidh gus an ceangal eadar àrainneachd na mara, uachdar grunnd na mara, agus co-dhèanamh bacteria siombaigeach ann am feusgain a dhearbhadh. Tha na sgrùdaidhean seo a’ dol air adhart an-dràsta.
Tha fad agus dùmhlachd ccfDNA hemolymph, cho furasta ‘s a tha e a ghlanadh, agus càileachd àrd gus leigeil le sreath-ghunna luath cuid de na mòran bhuannachdan a tha an lùib a bhith a’ cleachdadh ccfDNA feusgain gus bith-iomadachd a mheasadh ann an eag-shiostaman mara cladaich. Tha an dòigh-obrach seo gu sònraichte èifeachdach airson coimhearsnachdan bhìorasach (viromes) a chomharrachadh ann an eag-shiostam sònraichte [62, 63]. Eu-coltach ri bacteria, archaea, agus eukaryotes, chan eil ginean a tha air an glèidheadh ​​gu filogenetach leithid sreathan 16S ann an genomes bhìorasach. Tha na toraidhean againn a’ nochdadh gum faodar biopsies leaghaidh bho ghnèithean comharrachaidh leithid feusgain a chleachdadh gus àireamhan an ìre mhath mòr de mhìrean bhìoras ccfDNA a chomharrachadh a tha aithnichte airson aoigheachd a ghlacadh a bhios mar as trice a’ fuireach ann an eag-shiostaman mara cladaich. Tha seo a’ toirt a-steach bhìorasan a tha aithnichte airson protozoa, artrapods, biastagan, lusan, agus bhìorasan bacterial (me, bacteriophages) a ghlacadh. Chaidh sgaoileadh coltach ris a lorg nuair a rinn sinn sgrùdadh air virome ccfDNA hemolymph de fheusgain ghorm (M. platensis) a chaidh a chruinneachadh san aon shreath feusgain aig Kerguelen (Clàr S2, Fiosrachadh a bharrachd). Gu dearbh, tha sreath-ghunna de ccfDNA na dhòigh-obrach ùr a tha a’ faighinn spionnadh ann an sgrùdadh bhìoras dhaoine no ghnèithean eile [21, 37, 64]. Tha an dòigh-obrach seo gu sònraichte feumail airson bhìorasan DNA dà-shreathach a sgrùdadh, leis nach eil gine singilte air a ghleidheadh ​​am measg a h-uile bhìoras DNA dà-shreathach, a’ riochdachadh a’ chlas bhìorasan as eadar-mheasgte agus as fharsainge ann am Baltimore [65]. Ged a tha a’ mhòr-chuid de na bhìorasan sin fhathast gun seòrsachadh agus dh’ fhaodadh iad bhìorasan a thoirt a-steach bho phàirt gu tur neo-aithnichte den t-saoghal bhìorasach [66], fhuair sinn a-mach gu bheil bhìorasan agus raointean aoigheachd nam feusgain A. atra agus M. platensis a’ tuiteam eadar an dà ghnè san aon dòigh (faic figear S3, fiosrachadh a bharrachd). Chan eil an coltas seo na iongnadh, oir is dòcha gu bheil e a’ nochdadh dìth roghnachd ann an gabhail DNA a tha an làthair san àrainneachd. Tha feum air sgrùdaidhean san àm ri teachd a’ cleachdadh RNA glan an-dràsta gus mìneachadh a dhèanamh air bhìoras an RNA.
Anns an sgrùdadh againn, chleachd sinn loidhne-phìoban glè theann air atharrachadh bho obair Kowarski agus a cho-obraichean [37], a chleachd cuir às dà-cheum de leughaidhean cruinnichte agus contigs ro agus às deidh cruinneachadh ccfDNA dùthchasach, agus mar thoradh air sin bha cuibhreann àrd de leughaidhean gun mhapadh. Mar sin, chan urrainn dhuinn a dhiùltadh gum faodadh tùs fhèin a bhith aig cuid de na leughaidhean gun mhapadh seo fhathast, gu sònraichte leis nach eil genome iomraidh againn airson a’ ghnè feusgain seo. Chleachd sinn an loidhne-phìoban seo cuideachd leis gu robh dragh oirnn mu na chimeras eadar leughaidhean fèin agus neo-fhèin agus na faid leughaidh a chaidh a chruthachadh leis an Illumina MiSeq PE75. Is e adhbhar eile airson a’ mhòr-chuid de leughaidhean gun chairt nach deach mòran de na meanbh-fhàs-bheairtean mara, gu sònraichte ann an sgìrean iomallach leithid Kerguelen, a chomharrachadh. Chleachd sinn Illumina MiSeq PE75, a’ gabhail ris gu bheil faid earrannan ccfDNA coltach ri ccfDNA daonna. Airson sgrùdaidhean san àm ri teachd, leis gu bheil na toraidhean againn a’ sealltainn gu bheil leughaidhean nas fhaide aig hemolymph ccfDNA na tha aig daoine agus/no mamalan, tha sinn a’ moladh àrd-ùrlar sreath a chleachdadh a tha nas freagarraiche airson earrannan ccfDNA nas fhaide. Nì an cleachdadh seo mòran nas fhasa barrachd chomharran a chomharrachadh airson mion-sgrùdadh nas doimhne. Bhiodh e cuideachd nas fhasa an t-sreath genome niùclasach A. atra iomlan, nach eil ri fhaighinn an-dràsta, a chomharrachadh gu mòr bho thùsan fèin agus thùsan neo-fhèin. Leis gu bheil an rannsachadh againn air fòcas a chuir air a’ chomas bun-bheachd bith-eòlas leaghaidh a chur an sàs ann am feusgain, tha sinn an dòchas, fhad ’s a thèid a’ bhun-bheachd seo a chleachdadh ann an rannsachadh san àm ri teachd, gun tèid innealan agus loidhnichean-phìoban ùra a leasachadh gus comas na dòigh seo a mheudachadh gus iomadachd mhiocrobach feusgain a sgrùdadh ann an eag-shiostam mara.
Mar chomharradh bith-eòlasach clionaigeach neo-ionnsaigheach, tha ìrean àrda de ccfDNA ann am plasma daonna co-cheangailte ri diofar ghalaran, milleadh clò, agus suidheachaidhean cuideam [67,68,69]. Tha an àrdachadh seo co-cheangailte ri leigeil ma sgaoil pìosan DNA den thùs fhèin às deidh milleadh clò. Rinn sinn dèiligeadh ris a’ chùis seo le bhith a’ cleachdadh cuideam teas géar, anns an deach feusgain a nochdadh goirid do theodhachd 30 °C. Rinn sinn an anailis seo air trì diofar sheòrsaichean feusgain ann an trì deuchainnean neo-eisimeileach. Ach, cha d’ fhuair sinn atharrachadh sam bith ann an ìrean ccfDNA às deidh cuideam teas géar (faic Figear S5, fiosrachadh a bharrachd). Is dòcha gu bheil an lorg seo a’ mìneachadh, co-dhiù ann am pàirt, an fhìrinn gu bheil siostam cuairteachaidh leth-fhosgailte aig feusgain agus gu bheil iad a’ cruinneachadh meudan mòra de DNA cèin air sgàth an gnìomhachd sìolaidh àrd. Air an làimh eile, is dòcha gu bheil feusgain, mar mòran neo-dhruim-altachain, nas seasmhaiche ri milleadh clò air adhbhrachadh le cuideam, agus mar sin a’ cuingealachadh leigeil ma sgaoil ccfDNA anns an hemolymph aca [70, 71].
Gu ruige seo, tha mion-sgrùdadh DNA air bith-iomadachd ann an eag-shiostaman uisgeach air a bhith ag amas sa mhòr-chuid air metabarcoding DNA àrainneachdail (eDNA). Ach, mar as trice tha an dòigh seo cuingealaichte ann am mion-sgrùdadh bith-iomadachd nuair a thathar a’ cleachdadh prìomhairean. Tha cleachdadh sreath-ghunna a’ seachnadh crìochan PCR agus an taghadh claon de sheataichean prìomhairean. Mar sin, ann an seagh, tha an dòigh againne nas fhaisge air an dòigh sreath-ghunna àrd-toraidh eDNA a chaidh a chleachdadh o chionn ghoirid, a tha comasach air DNA briste a shreathadh gu dìreach agus cha mhòr a h-uile organsach a sgrùdadh [72, 73]. Ach, tha grunn chùisean bunaiteach ann a tha a’ sgaradh LB bho dhòighean àbhaisteach eDNA. Gu dearbh, is e am prìomh eadar-dhealachadh eadar eDNA agus LB cleachdadh aoighean sìoltachain nàdarra. Chaidh aithris air cleachdadh ghnèithean mara leithid spongan agus dà-mhogallan (Dresseina spp.) mar shìoltachan nàdarra airson sgrùdadh a dhèanamh air eDNA [74, 75]. Ach, chleachd sgrùdadh Dreissena biopsies clò às an deach DNA a thoirt a-mach. Chan eil feum air biopsy clò, uidheamachd sònraichte agus uaireannan daor agus logistics co-cheangailte ri eDNA no biopsy clò airson mion-sgrùdadh ccfDNA bho LB. Gu dearbh, thug sinn cunntas o chionn ghoirid gum faodar ccfDNA bho LB a stòradh agus a sgrùdadh le taic FTA gun slabhraidh fhuar a chumail suas, rud a tha na dhùbhlan mòr do rannsachadh ann an sgìrean iomallach [76]. Tha toirt a-mach ccfDNA bho bhith-eòlasan leaghaidh sìmplidh cuideachd agus a’ toirt seachad DNA àrd-inbhe airson sreath-ghunna agus mion-sgrùdadh PCR. Tha seo na bhuannachd mhòr leis gu bheil cuid de na cuingealachaidhean teicnigeach co-cheangailte ri mion-sgrùdadh eDNA [77]. Tha sìmplidheachd agus cosgais ìosal an dòigh samplachaidh cuideachd gu sònraichte freagarrach airson prògraman sgrùdaidh fad-ùine. A bharrachd air an comas sìolaidh àrd aca, is e feart aithnichte eile de dh’fhiadh-bhiadh-bhiadh an co-dhèanamh mucopolysaccharide ceimigeach den mhucus aca, a bhrosnaicheas gabhail a-steach bhìorasan [78, 79]. Tha seo a’ dèanamh dh’fhiadh-bhiadh-bhiadh nan sìoltachan nàdarra air leth freagarrach airson bith-iomadachd agus buaidh atharrachadh clìomaid ann an eag-shiostam uisgeach sònraichte a chomharrachadh. Ged a dh’ fhaodar làthaireachd earrannan DNA a thig bhon aoigh fhaicinn mar chuingealachadh air an dòigh an taca ri eDNA, tha a’ chosgais co-cheangailte ri bhith a’ faighinn ccfDNA dùthchasach mar sin an taca ri eDNA so-thuigsinn aig an aon àm airson an ìre mhòr fiosrachaidh a tha ri fhaighinn airson sgrùdaidhean slàinte. aoigh air a chothromachadh. Tha seo a’ gabhail a-steach làthaireachd sreathan bhìorasach a tha air an amalachadh ann an genome an aoigh. Tha seo gu sònraichte cudromach airson feusgain, leis gu bheil retrobhìorasan leucemic a thèid a thar-chur gu còmhnard ann am meanbh-bhiastagan [80, 81]. Buannachd eile a tha aig LB thairis air eDNA gu bheil e a’ cleachdadh gnìomhachd phagocytic cheallan fala a tha a’ cuairteachadh anns an hemolymph, a bhios a’ slugadh meanbh-fhàs-bheairtean (agus an genomes). Is e phagocytosis prìomh ghnìomh cheallan fala ann am meanbh-bhiastagan [82]. Mu dheireadh, tha an dòigh a’ gabhail brath air comas sìolaidh àrd feusgain (cuibheasachd de 1.5 l / h de dh’uisge na mara) agus cuairteachadh dà-latha, a tha ag àrdachadh measgachadh diofar shreathan de dh’uisge na mara, a’ leigeil le glacadh eDNA heterologous. [83, 84]. Mar sin, tha mion-sgrùdadh ccfDNA feusgain na shlighe inntinneach leis na buaidhean beathachaidh, eaconamach agus àrainneachdail a tha aig feusgain. Coltach ri mion-sgrùdadh LB a chaidh a chruinneachadh bho dhaoine, tha an dòigh seo cuideachd a’ fosgladh a’ chothruim atharrachaidhean ginteil agus epigenetic a thomhas ann an DNA aoigh mar fhreagairt do stuthan exogenous. Mar eisimpleir, faodar teicneòlasan sreath-ghinealach treas ginealach a shamhlachadh gus mion-sgrùdadh meitileachaidh air feadh a’ ghineim a dhèanamh ann an ccfDNA dùthchasach a’ cleachdadh sreath-ghinealach nanopore. Bu chòir am pròiseas seo a bhith air a dhèanamh nas fhasa leis gu bheil fad nam pìosan ccfDNA feusgain co-chòrdail gu h-iomchaidh ri àrd-ùrlaran sreath-ghinealach fad-leughaidh a leigeas le mion-sgrùdadh meitileachaidh DNA air feadh a’ ghineim bho aon ruith sreath-ghinealach gun fheum air cruth-atharrachaidhean ceimigeach.85,86] Is e cothrom inntinneach a tha seo, oir chaidh a shealltainn gu bheil pàtrain meitileachaidh DNA a’ nochdadh freagairt do chuideam àrainneachdail agus a’ mairsinn thar iomadh ginealach. Mar sin, faodaidh e lèirsinn luachmhor a thoirt seachad air na dòighean bunaiteach a tha a’ riaghladh freagairt às deidh nochdadh do atharrachadh clìomaid no truailleadh [87]. Ach, chan eil cleachdadh LB gun chrìochan. Gu dearbh, tha seo ag iarraidh gum bi gnèithean comharrachaidh an làthair san eag-shiostam. Mar a chaidh ainmeachadh gu h-àrd, tha feum air loidhne-phìoban bith-fhiosrachaidh teann a bheir aire do làthaireachd pìosan DNA bhon stòr gus LB a chleachdadh gus bith-iomadachd eag-shiostam sònraichte a mheasadh. Is e prìomh dhuilgheadas eile ruigsinneachd genomaichean iomraidh airson gnèithean mara. Thathar an dòchas gun cuidich iomairtean leithid Pròiseact Genomes Mamalan Mara agus pròiseact Fish10k a chaidh a stèidheachadh o chionn ghoirid [88] le bhith a’ dèanamh anailis mar sin san àm ri teachd. Tha cleachdadh bun-bheachd LB air fàs-bheairtean mara a bhios ag ithe le sìoltachain cuideachd co-chòrdail ris na h-adhartasan as ùire ann an teicneòlas sreathanachaidh, ga dhèanamh freagarrach airson leasachadh chomharran bith-eòlasach ioma-ohm gus fiosrachadh cudromach a thoirt seachad mu shlàinte àrainnean mara mar fhreagairt do chuideam àrainneachdail.
Chaidh dàta sreath-ghinòma a thasgadh ann an Tasglann Leughaidh Sreath NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 fo Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Buaidh atharrachadh clìomaid air beatha mara agus eag-shiostaman. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Beachdaich air buaidhean còmhlaichte atharrachadh clìomaid agus factaran cuideam ionadail eile air an àrainneachd mhara. àrainneachd saidheansail choitcheann. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Saidheans a 'chiad latha den Mhàrt. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Tha fulangas teas nas lugha fo chumhachan cuideam teas ath-aithriseach a’ mìneachadh bàsmhorachd àrd feusgain ghorm as t-samhradh. Aithisg saidheansail 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Atharrachaidhean o chionn ghoirid ann an tricead, adhbharan agus farsaingeachd bàsan bheathaichean. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Is dòcha gu bheil iomadach pathogen neo-ghnèitheach air bàs mòr de Pinna nobilis adhbhrachadh. Beatha. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Buaidh a dh’fhaodadh a bhith aig atharrachadh clìomaid air galairean zoonotic Artaigeach. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Feusgain ghorm (Mytilus edulis spp.) mar fhàs-bheairtean comharran ann an sgrùdadh truailleadh cladaich: lèirmheas. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Amalachadh bith-eòlas leaghaidh ann an làimhseachadh aillse. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Aibidh bith-eòlas leaghaidh: Leigidh seo le DNA an tumhair cuairteachadh. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Aigéid niùclasach ann am plasma daonna. Geàrr-chunntas coinneamhan fo-chompanaidhean Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Dreuchd ùr airson DNA gun cheallan mar chomharra moileciuil airson làimhseachadh aillse. Meudachadh air mion-sgrùdadh bith-mholair. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Bidh biopsy leaghaidh a’ tighinn a-steach don chlinic – cùisean cur an gnìomh agus dùbhlain san àm ri teachd. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW agus feadhainn eile. Tha DNA fetal an làthair ann am plasma agus serum màthaireil. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Sgrùdadh air cùrsa torrachas agus a dhuilgheadasan a’ cleachdadh RNA taobh a-muigh cealla a tha a’ cuairteachadh ann am fuil boireannaich rè torrachas. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsy leaghaidh: thathar a’ cleachdadh DNA gun cheallan tabhartaiche gus lotan allogeneic a lorg ann an graft dubhaig. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Nuadh-eòlasan ann an breithneachadh ro-bhreith: sreath-sgrùdadh genome plasma màthaireil. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Lorgaireachd luath pathogens le sreath-sgrùdaidh metagenomic an ath ghinealaich de lionntan bodhaig gabhaltach. Nat Medicine. 2021;27:115-24.