Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Chan eil ach beagan taic CSS aig an tionndadh brobhsair a tha thu a’ cleachdadh.Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).Anns an eadar-ama, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bheir sinn seachad an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
Tha biopsy leaghan (LB) na bhun-bheachd a tha a’ fàs mòr-chòrdte gu luath ann an raon bith-mheidigeach.Tha cuid bheag de na pìosan sin a’ tighinn bho fhigheagan neo fàs-bheairtean cèin (cèin).Anns an obair a th’ againn an-dràsta, tha sinn air a’ bhun-bheachd seo a chuir an sàs ann am feusgain, gnè sentinel a tha ainmeil airson an comas sìoltachaidh uisge-mara àrd.Tha na co-dhùnaidhean againn a 'sealltainn gu bheil mìrean DNA ann an hemolymph feusgain a tha gu math eadar-dhealaichte ann am meud, bho 1 gu 5 kb.Sheall seicheamh gunna-gunna gu bheil àireamh mhòr de mhìrean DNA de thùs miocròbach cèin.
Thathas a’ creidsinn gu bheil àite cudromach aig SS ann am bàsan mòra, a tha na fhìor dhuilgheadas airson riaghladh eag-shiostaman mara cruinne [5, 6].Tha seo na chùis chudromach leis a’ bhuaidh eaconamach, eag-eòlasach agus beathachaidh a tha aig mòran de ghnèithean mara.Tha seo gu sònraichte fìor airson dà-bhalbhaichean a tha a’ fuireach anns na roinnean pòla, far a bheil buaidhean CK nas luaithe agus nas cruaidhe [6, 7].Gu dearbh, tha dà-bhalbhaichean mar Mytilus spp.air an cleachdadh gu farsaing airson sùil a chumail air buaidh CC air eag-shiostaman mara. 在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）, 但在患 有各种病理或承劏琏-5 10 倍,从而导致组织损伤.在 健康个体中, ccfdna 的 浓度较低 （（<10 ng/ml）增加 5-10 倍, 从而 组织, 。。。损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤 Tha meud mìrean ccfDNA ag atharrachadh gu farsaing, ach mar as trice bidh iad eadar 150 agus 200 bp.Ach, gheibhear ccfDNA bho thùsan cèin leithid ccfDNA bho cheallan fetal fhad ‘s a tha iad trom no bho bhuill air an tar-chuir [14,15,16,17].Tha na sgrùdaidhean sin a’ sealltainn gum faodar bith-iomadachd meanbh-bhitheòlas cuairteachaidh organism a mheasadh le bhith a’ cleachdadh mion-sgrùdadh ccfDNA.Ach, gu o chionn ghoirid, bha am bun-bheachd seo air a chleachdadh a-mhàin ann an daoine agus, gu ìre nas lugha, ann an vertebrates eile [20, 21].
Tha sreathan viral ann an hemolymph ccfDNA cuideachd a thàinig bho bhìorasan le diofar raointean aoigheachd.Lorg sinn cuideachd criomagan DNA bho bheathaichean ioma-cheallach leithid iasg tòidheach, anemonaidhean mara, lìonanaich agus biastagan.

Tha protocol ruigsinneachd fosgailte an-asgaidh airson a’ phrògram seo ri fhaighinn air-loidhne (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Gu h-aithghearr, chaidh hemolymph LB a chruinneachadh bho fhèithean abductor mar a chaidh a mhìneachadh [22].Chaidh an hemolymph a shoilleireachadh le centrifugation aig 1200 × g airson 3 mionaidean, bha an supernatant reòta (-20 ° C) gus an deach a chleachdadh.ccfDNA air a stòradh aig -80 ° C gus an tèid tuilleadh sgrùdaidh a dhèanamh.Ann an cuid de dheuchainnean, chaidh ccfDNA a sgaradh agus a ghlanadh le bhith a’ cleachdadh an QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Chaidh DNA puraichte a thomhas a’ cleachdadh assay àbhaisteach PicoGreen.
Chaidh inneal-atharrachaidh àbhaisteach (BioO) a chleachdadh.Tha faidhlichean dàta amh rim faighinn bho Thasglann Leughaidh Sequence NCBI (SRR8924808 agus SRR8924809).Chaidh Trimmomatic [24] a chleachdadh airson innealan-atharrachaidh a ghearradh agus leughaidhean de dhroch chàileachd. Chaidh leughaidhean a roinn ann an dà bhuidheann: co-cheangailte ri sreathan dà-thaobhach (ris an canar fèin-leughaidh an seo) agus neo-cheangailte (neo-fhèin-leughaidh).Chaidh dà bhuidheann a chruinneachadh air leth a’ cleachdadh MEGAHIT gus contigs a ghineadh [27].Chaidh na kmers as fheàrr a dhearbhadh mar kmers-59 bho na deuchainnean tòiseachaidh againn. 然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据 库, agus 值< 1e-10 和60% Aig an aon àm, chaidh comharran buidhne neo-fhèin a chomharrachadh le BLASTN (stòr-dàta nt NCBI, luach e <1e-10 agus homology 60%). Aig an aon àm, chaidh comharran buidhne neo-fhèin a chomharrachadh le BLASTN (stòr-dàta nt NCBI, luach e <1e-10 agus homology 60%). Aig an aon àm, chaidh contigs buidhnean cèin a chomharrachadh le BLASTN (stòr-dàta NT NCBI, luach e <1e-10 agus homology 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据 库, agus 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据 库, agus 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Aig an aon àm, chaidh contigs buidhne neo-fhèin a chomharrachadh le BLASTN (stòr-dàta nt NCBI, luach e <1e-10 agus homology 60%). Chaidh BLASTX a dhèanamh cuideachd air contigs neo-fhèin a’ cleachdadh stòran-dàta pròtain nr agus RefSeq NCBI (e luach <1e−10 agus homology 60%). Chaidh BLASTX a dhèanamh cuideachd air contigs neo-fhèin a’ cleachdadh stòran-dàta pròtain nr agus RefSeq NCBI (e luach <1e−10 agus homology 60%). Chaidh BLASTX a dhèanamh cuideachd air contigs neo-fhèin a’ cleachdadh stòran-dàta pròtain nr agus RefSeq NCBI (e luach <1e-10 agus homology 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据 库对 非自身重叠群进行了BLASTX（e 值 < 1e-10 和扐 。 怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼 怼 怼 怼 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据 库对 非自身重叠群进行了BLASTX（e 值 < 1e-10 和扐 。 怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼 怼 怼 怼 。 Chaidh BLASTX a dhèanamh cuideachd air contigs neo-fhèin a’ cleachdadh stòran-dàta pròtain nr agus RefSeq NCBI (e luach <1e-10 agus homology 60%).Tha amaran BLASTN agus BLASTX de neo-fhèin-contigs a’ riochdachadh nan contigs deireannach (faic am faidhle a bharrachd).
Tha na primers a chleachdar airson PCR air an liostadh ann an Clàr S1..
Chaidh feusgain (Mytilus spp.) a chleachdadh ann an uisge mara le ocsaidean 500 ml (32 PSU) airson 24 uairean aig 4 ° C.Chaidh DNA plasma anns a bheil cuir a-steach a’ còdachadh an t-sreath daonna galectin-7 cDNA (àireamh aontachaidh NCBI L07769) a chur ris an vial aig dùmhlachd deireannach de 190 μg / μl.B' e feusgain a bh' air an goir fo na h-aon chumhachan gun DNA a bharrachd a bhith fo smachd.Anns an treas tanca smachd bha DNA gun fheusgain.Gus sùil a chumail air càileachd DNA ann an uisge na mara, chaidh sampallan uisge mara (20 μl; trì ath-aithris) a thoirt bho gach tanca aig an àm ainmichte.Airson lorg DNA plasmid, chaidh feusgain LB a bhuain aig na h-amannan ainmichte agus chaidh an sgrùdadh le qPCR agus ddPCR.Mar thoradh air an ìre àrd de shalainn ann an uisge na mara, chaidh aliquots a lagachadh ann an uisge càileachd PCR (1:10) ro gach measaidhean PCR.
Chaidh droplet didseatach PCR (ddPCR) a dhèanamh a’ cleachdadh protocol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada).Cleachd am pròifil teòthachd gus an teòthachd as fheàrr a dhearbhadh (Clàr S1).Chaidh drops a chruthachadh a’ cleachdadh gineadair drop QX200 (BioRad).Chaidh ddPCR a dhèanamh mar a leanas: 95 ° C airson 5 min, 50 cearcallan 95 ° C airson 30 s agus teòthachd analachaidh sònraichte airson 1 min agus 72 ° C airson 30 s, 4 ° C airson 5 mion agus 90 ° C taobh a-staigh 5 mionaidean.Chaidh an àireamh de thuitean agus ath-bheachdan adhartach (àireamh leth-bhreacan / µl) a thomhas a’ cleachdadh leughadair tuiteam QX200 (BioRad).Chaidh sampaill le nas lugha na 10,000 boinneagan a dhiùltadh.Cha deach smachd pàtrain a dhèanamh a h-uile uair a chaidh ddPCR a ruith.

Leis gu bheil feusgain ainmeil airson an ìre sìolachaidh àrd aca, rinn sinn sgrùdadh an-toiseach am b’ urrainn dhaibh pìosan DNA a tha ann an uisge na mara a shìoladh agus a chumail.Bha ùidh againn cuideachd ann an cruinnich na pìosan sin anns an t-siostam lymphatic leth-fhosgailte aca.Dh’fhuasgail sinn a’ chùis seo gu deuchainneach le bhith a’ lorg mar a thachair do phìosan DNA solubhail a chaidh a chur ri tancaichean feusgain ghorm.Bidh ddPCR a’ lorg mìrean DNA plasmid ann an uisge na mara agus feusgain.Tha na co-dhùnaidhean againn a’ sealltainn ma dh’fhuirich an ìre de mhìrean DNA ann an uisge na mara an ìre mhath seasmhach thar ùine (suas ri 7 latha) às aonais feusgain, an uairsin ann an làthaireachd feusgain dh’ fhalbh an ìre seo cha mhòr gu tur taobh a-staigh 8 uairean (Fig. 1a,b).
C Cruinneachadh de DNA plasmid anns an hemolymph agus lionn valvular feusgain aig diofar amannan às deidh DNA plasmid a chur ris.Tha toraidhean air an taisbeanadh mar leth-bhreacan iomlan air an lorg / mL (±SE).
An ath rud, rinn sinn sgrùdadh air cò às a thàinig ccfDNA ann am feusgain a chaidh a chruinneachadh bho leapannan feusgain air na h-Eileanan Kerguelen, buidheann iomallach de dh'eileanan le glè bheag de bhuaidh antropogenic.Airson an adhbhair seo, chaidh cccDNA bho hemolymphs feusgain a sgaradh agus a ghlanadh le dòighean a chleachdar gu cumanta airson cccDNA daonna a ghlanadh [32, 33].Fhuair sinn a-mach gu bheil cuibhreannan cuibheasach hemolymph ccfDNA ann am feusgain anns na micrograman ìosal gach ml de raon hemolymph (faic Clàr S2, Fiosrachadh Leasachail).Tha an raon co-chruinneachaidhean seo mòran nas motha na ann an daoine fallain (nanograman ìosal gach mililiter), ach ann an cùisean ainneamh, ann an euslaintich aillse, faodaidh an ìre ccfDNA grunn mhicrograman gach mìleliotair a ruighinn [34, 35].Sheall sgrùdadh air cuairteachadh meud hemolymph ccfDNA gu bheil na pìosan sin ag atharrachadh gu mòr ann am meud, bho 1000 bp gu 1000 bp.Chaidh toraidhean co-chosmhail fhaighinn a’ cleachdadh an Kit Rannsachaidh QIAamp stèidhichte air silica, dòigh a thathas a’ cleachdadh gu cumanta ann an saidheans forensic gus DNA genomic a sgaradh agus a ghlanadh gu luath bho shampaill DNA dùmhlachd ìosal, a’ toirt a-steach ccfDNA [36].

Tha stòr cèin aig timcheall air 1% de ccfDNA ann an daoine agus prìomhairean [21, 37].Leis an t-siostam cuairteachaidh leth-fhosgailte de dhà-bhalbhaichean, uisge mara làn microbial, agus cuairteachadh meud feusgain ccfDNA, bha sinn a’ smaoineachadh gum faodadh cruinneachadh beairteach agus eadar-mheasgte de DNA microbial a bhith ann an hemolymph feusgain ccfDNA.Gus am beachd-bharail seo a dhearbhadh, chuir sinn an òrdugh hemolymph ccfDNA bho Aulacomya atra sampaill a chaidh a chruinneachadh bho na h-Eileanan Kerguelen, a’ toirt a-mach còrr air 10 millean leughadh, agus chaidh 97.6% dhiubh sin seachad air smachd càileachd.Chaidh na leughaidhean an uairsin a sheòrsachadh a rèir stòran fèin agus neo-fhèin a’ cleachdadh stòran-dàta dà-bhalbhaich BLASTN agus NCBI (Fig. S1, Fiosrachadh Leasachail).
Ann an daoine, faodar an dà chuid DNA niùclasach agus mitochondrial a leigeil ma sgaoil don t-sruth fala [38].Ach, anns an sgrùdadh seo, cha robh e comasach cunntas mionaideach a thoirt air an DNA genomic niùclasach de fheusgain, leis nach eil an genoma A. atra air a leantainn no air a mhìneachadh.Ach, b’ urrainn dhuinn grunn chriomagan ccfDNA den tùs againn fhèin a chomharrachadh a’ cleachdadh an leabharlann dà-bhalbhaich (Fig. S2, Fiosrachadh Leasachail).Dhaingnich sinn cuideachd gu robh pìosan DNA den tùs againn fhèin ann le leudachadh PCR stiùiridh air na ginean A. atra sin a chaidh an òrdugh (Fig. 3).Mar an ceudna, leis gu bheil an genoma mitochondrial de A. atra ri fhaighinn ann an stòran-dàta poblach, gheibhear fianais air làthaireachd mìrean ccfDNA mitochondrial ann an hemolymph A. atra.Chaidh làthaireachd mìrean DNA mitochondrial a dhearbhadh le leudachadh PCR (Fig. 3).
Bha diofar ghinean mitochondrial an làthair ann an hemolymph A. atra (dotagan dearga – àireamh stoc: SRX5705969) agus M. platensis (dotagan gorma – àireamh stoc: SRX5705968) air an àrdachadh le PCR.
Gus seo a dhèanamh, bidh sinn a’ cleachdadh dà ro-innleachd eadar-dhealaichte.Chleachd a ’chiad ro-innleachd Kraken2, prògram seòrsachaidh sreath stèidhichte air algorithm a dh’ aithnicheas sreathan microbial le cruinneas coimeasach ri BLAST agus innealan eile [28]. Anns a ’chùis seo, chaidh leughaidhean a bha a’ dol thairis air a chruinneachadh mar leughaidhean deireadh càraideach agus chaidh an seòrsachadh mar thùs fèin (dà-bhlasta) no neo-fhèin a ’cleachdadh BLASTN agus luach e de 1e−3 agus gearradh dheth le> 90% homology. Anns a ’chùis seo, chaidh leughaidhean a bha a’ dol thairis air a chruinneachadh mar leughaidhean deireadh càraideach agus chaidh an seòrsachadh mar thùs fèin (dà-bhlasta) no neo-fhèin a ’cleachdadh BLASTN agus luach e de 1e−3 agus gearradh dheth le> 90% homology. Anns a ’chùis seo, chaidh leughaidhean tar-tharraingeach a chruinneachadh mar leughaidhean le crìoch paidhir agus chaidh an seòrsachadh mar dhùthchasach (dà-thaobhach) no neo-thùsail a’ cleachdadh BLASTN agus luach e 1e-3 agus gearradh dheth le> 90% homology.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数，并使 用BLASTN 和1e-3的e怼和>9分类为自身（双壳类）或非自身来源。在这种情况下, 重叠读数 组装 为 配末端 读数, 使用使用 使璔 blast 1 倌 倌 和 猄 倌 猄 用 使 用 使璔 blast 1 倌 倌 猄 倌 猄 倌 猄 倌 猄 倌 用 数 用 使 用 使璔 blast 1 倌 倌0% 同源性 的 分类自身 (双 壳类) 非 自身。。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения случае парными концами и классибифицица устворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 % и погоми-3. Anns a’ chùis seo, chaidh leughaidhean tar-tharraingeach a chruinneachadh mar leughaidhean le crìoch paidhir agus an seòrsachadh mar iad fhèin (dà-bhlasta) no neo-thùsail a’ cleachdadh luachan e BLASTN agus 1e-3 agus stairsneach homology> 90%.Leis nach deach an genoma A. atra a chuir ann an òrdugh fhathast, chleachd sinn an ro-innleachd cruinneachaidh de novo aig inneal-cruinneachaidh MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Chaidh còrr air leth (57%) de na mìrean DNA sin fhaighinn bho bacteria, gu h-àraidh bho symbionts gill, a’ toirt a-steach symbionts sulfotrophic, agus bho symbionts gill Solemya velum (Fig. 5).
Pailteas coimeasach aig ìre seòrsa.B Iomadachd microbial de dhà phrìomh phyla (Firmicutes agus Proteobacteria).Meudachadh riochdachail de ddPCR C Vibrio spp.
Chaidh sgrùdadh a dhèanamh air 482 contigs cruinnichte.Pròifil coitcheann air cuairteachadh tacsonomaigeach de notaichean metagenomic contig (prokaryotes agus eukaryotes).B Sgaoileadh mionaideach de mhìrean DNA bacterial air an comharrachadh le BLASTN agus BLASTX.
Sheall mion-sgrùdadh Kraken2 cuideachd gu robh mìrean DNA àrsaidh ann an ccfDNA feusgain, a’ gabhail a-steach mìrean DNA de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), agus Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Cha bu chòir làthaireachd mìrean DNA a thàinig bho Euryarchaeota agus Crenarchaeota, a chaidh a lorg roimhe seo ann an coimhearsnachd microbial feusgain California, a bhith na iongnadh [42].Ged a tha Euryarchaeota gu tric co-cheangailte ri fìor dhroch shuidheachaidhean, thathas a-nis ag aithneachadh gu bheil an dà chuid Euryarchaeota agus Crenarcheota am measg nan prokaryotes as cumanta ann an àrainneachd cryogenic mara [43, 44].Chan eil e na iongnadh gu bheil meanbh-fhàs-bheairtean methanogenic ann am feusgain, leis na h-aithisgean o chionn ghoirid mu aodion meatan farsaing bho aoidion as ìsle air àrd-ùrlar Kerguelen [45] agus toradh meatan microbial a chaidh fhaicinn far oirthir nan Eileanan Kerguelen [46].
Ghluais ar n-aire an uairsin gu leughaidhean bho bhìorasan DNA.Cho fad ‘s as aithne dhuinn, is e seo a’ chiad sgrùdadh far-targaid air susbaint bhìorasach feusgain.Mar a bhiodh dùil, lorg sinn mìrean DNA de bacteriophages (Caudovirales) (Fig. 6b).Ach, tha an DNA bhìorasach as cumanta a’ tighinn bho phylum de nucleocytoviruses, ris an canar cuideachd am bhìoras DNA mòr cytoplasmic niùclasach (NCLDV), aig a bheil an genoma as motha de bhìoras sam bith.Taobh a-staigh a 'phylum seo, buinidh a' mhòr-chuid de shreathan DNA do na teaghlaichean Mimimidoviridae (58%) agus Poxviridae (21%), aig a bheil luchd-aoigheachd nàdarra a 'gabhail a-steach vertebrates agus artrapod, agus tha cuid bheag de na sreathan DNA sin a' buntainn ri lìonanaich virological aithnichte.A 'toirt buaidh air lìonanaich eukaryotic mara.Chaidh na sreathan fhaighinn cuideachd bhon bhìoras Pandora, am bhìoras mòr leis a’ mheud genome as motha de ghinean viral sam bith aithnichte.Gu inntinneach, bha an raon de luchd-aoigheachd air an robh an galar leis a’ bhìoras, mar a chaidh a dhearbhadh le sreath hemolymph ccfDNA, an ìre mhath mòr (Figear S3, Fiosrachadh Leasachail).Tha e a’ toirt a-steach bhìorasan a bheir buaidh air biastagan leithid Baculoviridae agus Iridoviridae, a bharrachd air bhìorasan a bheir buaidh air amoeba, lìonanaich agus druim-altachain.Lorg sinn cuideachd sreathan a bha a’ maidseadh genoma Pithovirus sibericum.Chaidh pitoviruses (ris an canar cuideachd “bhìorasan zombie”) a sgaradh an toiseach bho permafrost 30,000 bliadhna a dh'aois ann an Siberia [47].Mar sin, tha na co-dhùnaidhean againn co-chòrdail ri aithisgean roimhe a sheallas nach eil a h-uile gnè ùr de na bhìorasan sin air a dhol à bith [48] agus gum faodadh na bhìorasan sin a bhith an làthair ann an eag-shiostaman mara subarctic iomallach.
Mu dheireadh, rinn sinn deuchainn feuch an lorgadh sinn mìrean DNA bho bheathaichean ioma-cheallach eile.Chaidh 482 contigs cèin gu h-iomlan a chomharrachadh le BLASTN agus BLASTX le leabharlannan nt, nr agus RefSeq (genomic agus pròtain).Tha na co-dhùnaidhean againn a’ sealltainn gur e DNA de chnàmhan tòidheach as motha am measg nam pìosan cèin de ccfDNA de bheathaichean ioma-cheallach (Fig. 5).Chaidh mìrean DNA bho bhiastagan agus gnèithean eile a lorg cuideachd.Cha deach pàirt an ìre mhath mòr de na mìrean DNA aithneachadh, is dòcha air sgàth fo-riochdachadh àireamh mhòr de ghnèithean mara ann an stòran-dàta genomic an coimeas ri gnèithean talmhainn [49].
Anns a’ phàipear a th’ ann an-dràsta, bidh sinn a’ cleachdadh bun-bheachd LB ri feusgain, ag argamaid gum faod seicheamh peilear hemolymph ccfDNA sealladh a thoirt seachad air co-dhèanamh eag-shiostaman cladaich mara.Gu sònraichte, lorg sinn gu bheil 1) hemolymph feusgain a 'toirt a-steach co-chruinneachaidhean coimeasach àrd (ìrean microgram) de mhìrean DNA a tha an ìre mhath mòr (~ 1-5 kb) a' cuairteachadh;2) tha na mìrean DNA sin an dà chuid neo-eisimeileach agus neo-eisimeileach 3) Am measg stòran cèin nam mìrean DNA sin, lorg sinn DNA bacterial, arc-eòlach agus viral, a bharrachd air DNA de bheathaichean ioma-cheallach eile;4) Bidh cruinneachadh nam mìrean ccfDNA cèin sin anns an hemolymph a’ tachairt gu luath agus a’ cur ri gnìomhachd sìoltachaidh feusgain a-staigh.Gu crìch, tha an sgrùdadh againn a’ sealltainn gu bheil bun-bheachd LB, a chaidh a chleachdadh gu ruige seo sa mhòr-chuid ann an raon bith-mheidigeach, a’ còdachadh stòr eòlais beairteach ach nach deach a sgrùdadh a ghabhas cleachdadh gus tuigse nas fheàrr fhaighinn air an eadar-obrachadh eadar gnèithean sentinel agus an àrainneachd aca.
A bharrachd air prìomhairean, chaidh aithris air iomallachd ccfDNA ann am mamalan, a’ toirt a-steach luchagan, coin, cait is eich [50, 51, 52].Ach, gu ar n-eòlas, is e an sgrùdadh againn a’ chiad fhear a thug cunntas air lorg agus sreath ccfDNA ann an gnèithean mara le siostam cuairteachaidh fosgailte.Faodaidh am feart anatomical seo agus comas sìoltachaidh feusgain, gu ìre co-dhiù, mìneachadh a dhèanamh air na feartan meud eadar-dhealaichte ann a bhith a’ cuairteachadh mìrean DNA an taca ri gnèithean eile.Ann an daoine, tha a’ mhòr-chuid de mhìrean DNA a tha a’ cuairteachadh san fhuil nam mìrean beaga le meud bho 150 gu 200 bp.le stùc as àirde de 167 bp [34, 53].Tha cuibhreann beag ach cudromach de mhìrean DNA eadar 300 agus 500 bp ann am meud, agus tha timcheall air 5% nas fhaide na 900 bp.[54].Is e an t-adhbhar airson an sgaoileadh meud seo gu bheil prìomh thùs ccfDNA ann am plasma a 'tachairt mar thoradh air bàs cealla, an dàrna cuid mar thoradh air bàs cealla no mar thoradh air necrosis de bhith a' cuairteachadh ceallan hematopoietic ann an daoine fallain no mar thoradh air apoptosis de cheallan tumhair ann an euslaintich aillse (ris an canar DNA tumhair a chuairteachadh)., ctDNA).Bha an cuairteachadh meud hemolymph ccfDNA a lorg sinn ann am feusgain eadar 1000 agus 5000 bp, a’ moladh gu bheil tùs eadar-dhealaichte aig feusgain ccfDNA.Is e beachd loidsigeach a tha seo, leis gu bheil siostam falamh leth-fhosgailte aig feusgain agus a’ fuireach ann an àrainneachdan uisgeach mara anns a bheil dùmhlachdan àrd de DNA genomic microbial.Gu dearbh, tha na deuchainnean obair-lann againn a’ cleachdadh DNA exogenous air sealltainn gu bheil feusgain a’ cruinneachadh mìrean DNA ann an uisge na mara, co-dhiù às deidh beagan uairean a thìde bidh iad air an truailleadh às deidh gabhail ri cealla agus / no air an leigeil ma sgaoil agus / no air an stòradh ann an grunn bhuidhnean.Leis cho gann ‘s a tha ceallan (an dà chuid prokaryotic agus eukaryotic), lughdaichidh cleachdadh roinnean intravalvular na tha de ccfDNA bho fhèin-stòran a bharrachd air bho thùsan cèin.A’ beachdachadh air cho cudromach sa tha dìonachd dhùthchasach dà-chonnaidh agus an àireamh mhòr de phagocytes a tha a’ cuairteachadh, rinn sinn tuilleadh beachd-bharail gu bheil eadhon ccfDNA cèin air a bheairteachadh ann a bhith a’ cuairteachadh phagocytes a bhios a’ cruinneachadh DNA cèin nuair a thèid meanbh-fhàs-bheairtean agus / no sprùilleach cealla a ghlacadh.Air an gabhail còmhla, tha na co-dhùnaidhean againn a’ sealltainn gu bheil hemolymph dà-thaobhach ccfDNA na stòr sònraichte de fhiosrachadh moileciuil agus a’ daingneachadh an inbhe mar ghnè sentinel.
Tha an dàta againn a’ nochdadh gum faod sreath agus mion-sgrùdadh air pìosan hemolymph ccfDNA a thig bho bacteria prìomh fhiosrachadh a thoirt seachad mu fhlùraichean bacterial aoigheachd agus na bacteria a tha an làthair anns an eag-shiostam mara mun cuairt.Tha dòighean seicheamh peilear air sreathan de na bacteria commensal A. atra gill a nochdadh a bhiodh air an call nan robhar a’ cleachdadh modhan àbhaisteach aithneachaidh rRNA 16S, gu ìre mar thoradh air claonadh leabharlainn iomraidh.Gu dearbh, sheall ar cleachdadh de dhàta LB a chaidh a chruinneachadh bho M. platensis anns an aon ìre feusgain ann an Kerguelen gun robh co-dhèanamh symbionts bactaraidh co-cheangailte ri gill an aon rud airson gach gnè feusgain (Fig. S4, Fiosrachadh Leasachail).Dh’ fhaodadh an coltas seo de dhà fheusgain a tha eadar-dhealaichte gu ginteil a bhith a’ nochdadh co-dhèanamh choimhearsnachdan bactaraidh ann an tasgaidhean fuar, pronnasg agus bholcànach Kerguelen [55, 56, 57, 58].Thathas air deagh mhìneachadh a dhèanamh air ìrean nas àirde de meanbh-fhàs-bheairtean a tha a’ lughdachadh pronnasg nuair a thathar a’ buain feusgain bho sgìrean cladaich bioturbated [59], leithid oirthir Port-au-France.Is e comas eile a th’ ann gum faodadh tar-chuir chòmhnard buaidh a thoirt air lusan feusgain commensal [60, 61].Tha feum air tuilleadh rannsachaidh gus faighinn a-mach an dàimh eadar àrainneachd na mara, uachdar grunnd na mara, agus co-dhèanamh bacteria symbiotic ann am feusgain.Tha na sgrùdaidhean sin a’ dol air adhart an-dràsta.
Tha fad agus dùmhlachd ccfDNA hemolymph, cho furasta ‘s a tha e glanadh, agus càileachd àrd gus seicheamh gunna-gunna luath a cheadachadh cuid de na mòran bhuannachdan bho bhith a’ cleachdadh feusgain ccfDNA gus bith-iomadachd a mheasadh ann an eag-shiostaman cladaich mara.Tha an dòigh-obrach seo gu sònraichte èifeachdach airson a bhith a’ comharrachadh choimhearsnachdan viral (viromes) ann an eag-shiostam sònraichte [62, 63].Eu-coltach ri bacteria, archaea, agus eukaryotes, chan eil ginean a tha glèidhte gu h-ealanta leithid sreathan 16S ann an genomes viral.Tha na co-dhùnaidhean againn a’ nochdadh gum faodar biopsies liùlach bho ghnèithean comharrachaidh leithid feusgain a chleachdadh gus àireamhan coimeasach mòr de chriomagan bhìoras ccfDNA a chomharrachadh a tha aithnichte a bheir buaidh air luchd-aoigheachd a bhios mar as trice a’ fuireach ann an eag-shiostaman mara cladaich.Tha seo a 'gabhail a-steach bhìorasan a tha aithnichte gu bheil iad a' toirt buaidh air protozoa, artrapod, biastagan, lusan, agus bhìorasan bactaraidh (me, bacteriophages).Chaidh cuairteachadh coltach ris a lorg nuair a rinn sinn sgrùdadh air an hemolymph ccfDNA virome de fheusgain ghorm (M. platensis) a chaidh a chruinneachadh anns an aon ìre feusgain aig Kerguelen (Clàr S2, Fiosrachadh Leasachail).Tha seicheamh gunna-gunna de ccfDNA gu dearbh na dhòigh-obrach ùr a tha a’ faighinn spionnadh ann a bhith a’ sgrùdadh virome dhaoine no gnèithean eile [21, 37, 64].Tha an dòigh-obrach seo gu sònraichte feumail airson a bhith a’ sgrùdadh bhìorasan DNA le sreathan dùbailte, leis nach eil ginean singilte air an gleidheadh ​​​​am measg a h-uile bhìoras DNA le sreathan dùbailte, a’ riochdachadh a’ chlas bhìorasan as eadar-mheasgte agus as fharsainge ann am Baltimore [65].Ged a tha a 'mhòr-chuid de na bhìorasan sin fhathast neo-sheòrsaichte agus faodaidh iad a bhith a' gabhail a-steach bhìorasan bho phàirt gu tur neo-aithnichte den t-saoghal viral [66], lorg sinn gu bheil na viromes agus raointean aoigheachd nam feusgain A. atra agus M. platensis a 'tuiteam eadar an dà ghnè.mar an ceudna (faic figear S3, fiosrachadh a bharrachd).Chan eil an coltas seo na iongnadh, oir is dòcha gu bheil e a’ nochdadh dìth roghnaiche ann an gabhail DNA a tha an làthair san àrainneachd.Tha feum air sgrùdaidhean san àm ri teachd a’ cleachdadh RNA fìor-ghlan gus an virome RNA a chomharrachadh.
Anns an sgrùdadh againn, chleachd sinn loidhne-phìoban gu math teann a chaidh atharrachadh bho obair Kowarski agus co-obraichean [37], a chleachd cuir às dà cheum de leughaidhean còmhla agus contigs ro agus às deidh co-chruinneachadh ccfDNA dùthchasach, a’ leantainn gu ìre àrd de leughaidhean gun mhapa.Mar sin, chan urrainn dhuinn a bhith a’ cumail a-mach gur dòcha gu bheil tùs fhathast aig cuid de na leughaidhean neo-mhìnichte sin, gu h-àraidh leis nach eil genoma iomraidh againn airson a’ ghnè feusgain seo.Chleachd sinn an loidhne-phìoban seo cuideachd oir bha dragh oirnn mun chimeras eadar fèin-leughaidh agus neo-fhèin-leughaidh agus na faid leughaidh a chruthaich an Illumina MiSeq PE75.Is e adhbhar eile airson a’ mhòr-chuid de leughaidhean neo-chlàraichte nach deach mòran de mhicroban mara, gu sònraichte ann an sgìrean iomallach leithid Kerguelen, a chomharrachadh.Chleachd sinn Illumina MiSeq PE75, a’ gabhail ris gu bheil pìosan ccfDNA coltach ri ccfDNA daonna.Airson sgrùdaidhean san àm ri teachd, leis na toraidhean againn a’ sealltainn gu bheil leughaidhean nas fhaide aig hemolymph ccfDNA na daoine agus/no mamalan, tha sinn a’ moladh àrd-ùrlar sreathachaidh a chleachdadh a tha nas freagarraiche airson pìosan ccfDNA nas fhaide.Nì an cleachdadh seo e mòran nas fhasa barrachd chomharran a chomharrachadh airson mion-sgrùdadh nas doimhne.Le bhith a’ faighinn an t-sreath iomlan de A. atra genome niuclasach nach eil ri fhaighinn an-dràsta chuidicheadh ​​sin gu mòr le leth-bhreith ccfDNA bho thùsan fèin agus neo-fhèin.Leis gu bheil an rannsachadh againn air fòcas a chuir air comasachd a’ bhun-bheachd de biopsy liùlach a chuir an sàs ann am feusgain, tha sinn an dòchas mar a bhios am bun-bheachd seo air a chleachdadh ann an rannsachadh san àm ri teachd, gun tèid innealan agus pìoban ùra a leasachadh gus comas an dòigh seo a mheudachadh gus sgrùdadh a dhèanamh air iomadachd microbial feusgain.eag-shiostam na mara.
Mar biomarker clionaigeach neo-ionnsaigheach, tha ìrean plasma daonna àrdaichte de ccfDNA co-cheangailte ri diofar ghalaran, milleadh clò, agus suidheachaidhean cuideam [67,68,69].Tha an àrdachadh seo co-cheangailte ri bhith a’ leigeil ma sgaoil mìrean DNA de a thùs fhèin às deidh milleadh clò.Thug sinn aghaidh air a’ chùis seo le bhith a’ cleachdadh cuideam teas mòr, far an robh feusgain fosgailte airson ùine ghoirid gu teòthachd 30 ° C.Rinn sinn am mion-sgrùdadh seo air trì diofar sheòrsaichean feusgain ann an trì deuchainnean neo-eisimeileach.Ach, cha do lorg sinn atharrachadh sam bith ann an ìrean ccfDNA às deidh cuideam teas gann (faic Figear S5, fiosrachadh a bharrachd).Dh’ fhaodadh an lorg seo mìneachadh, gu ìre co-dhiù, gu bheil siostam cuairteachaidh leth-fhosgailte aig feusgain agus gu bheil iad a’ cruinneachadh mòran de DNA cèin mar thoradh air an obair sìolaidh àrd aca.Air an làimh eile, is dòcha gum bi feusgain, mar iomadh neo-dhruim-altachain, nas seasmhaiche ri milleadh maothraidh air adhbhrachadh le cuideam, agus mar sin a’ cuingealachadh sgaoileadh ccfDNA anns an hemolymph aca [70, 71].
Gu ruige seo, tha mion-sgrùdadh DNA air bith-iomadachd ann an eag-shiostaman uisgeach air fòcas sònraichte a chuir air metabarcoding DNA àrainneachd (eDNA).Ach, mar as trice bidh an dòigh seo cuingealaichte ann an mion-sgrùdadh bith-iomadachd nuair a thèid primers a chleachdadh.Tha cleachdadh seicheamh gunna-gunna a’ dol timcheall air crìochan PCR agus taghadh claon de sheataichean primer.Mar sin, ann an dòigh, tha an dòigh againn nas fhaisge air an dòigh seicheamhachaidh àrd-thruaillidheachd eDNA Shotgun a chaidh a chleachdadh o chionn ghoirid, a tha comasach air DNA sgapte a chuir an òrdugh gu dìreach agus sgrùdadh a dhèanamh air cha mhòr a h-uile fàs-bheairt [72, 73].Ach, tha grunn chùisean bunaiteach ann a tha ag eadar-dhealachadh LB bho dhòighean àbhaisteach eDNA.Gu dearbh, is e am prìomh eadar-dhealachadh eadar eDNA agus LB cleachdadh luchd-aoigheachd sìoltachain nàdarra.Chaidh aithris air cleachdadh gnèithean mara leithid spongan agus dà-bhalbhaichean (Dresseina spp.) mar shìoltachan nàdarra airson sgrùdadh eDNA [74, 75].Ach, chleachd sgrùdadh Dreissena biopsies clò às an deach DNA a thoirt a-mach.Chan fheum mion-sgrùdadh ccfDNA bho LB biopsy clò, uidheamachd sònraichte agus uaireannan daor agus logistics co-cheangailte ri eDNA no biopsy clò.Gu dearbh, dh 'innis sinn o chionn ghoirid gum faodar ccfDNA bho LB a stòradh agus a sgrùdadh le taic FTA gun a bhith a' cumail slabhraidh fuar, a tha na dhùbhlan mòr airson rannsachadh ann an sgìrean iomallach [76].Tha toirt a-mach ccfDNA bho biopsies leaghaidh cuideachd sìmplidh agus a’ toirt seachad DNA de chàileachd àrd airson sreath ghunnaichean agus mion-sgrùdadh PCR.Tha seo na bhuannachd mhòr leis gu bheil cuid de na cuingeadan teicnigeach co-cheangailte ri mion-sgrùdadh eDNA [77].Tha sìmplidheachd agus cosgais ìosal an dòigh samplachaidh cuideachd gu sònraichte freagarrach airson prògraman sgrùdaidh fad-ùine.A bharrachd air an comas sìolaidh àrd, is e feart ainmeil eile de dhà-bhalbhaichean an cumadh mucopolysaccharide ceimigeach den mhucus aca, a bhrosnaicheas gabhail a-steach bhìorasan [78, 79].Tha seo a’ dèanamh dà-bhalbhaichean nan sìoltachan nàdarra air leth freagarrach airson comharrachadh bith-iomadachd agus buaidh atharrachadh clìomaid ann an eag-shiostam uisgeach sònraichte.Ged a chithear gu bheil mìrean DNA bho luchd-aoigheachd air fhaicinn mar chuingealachadh air an dòigh an coimeas ri eDNA, tha a’ chosgais co-cheangailte ri bhith a’ faighinn ccfDNA cho dùthchasach an coimeas ri eDNA aig an aon àm ri thuigsinn airson an uiread de dh’fhiosrachadh a tha ri fhaotainn airson sgrùdaidhean slàinte.òstair dheth.Tha seo a ‘toirt a-steach làthaireachd sreathan viral air am filleadh a-steach do genoma an neach-aoigheachd.Tha seo gu sònraichte cudromach dha feusgain, leis gu bheil retroviruses leukemic air an tar-chuir gu còmhnard ann am bivalves [80, 81].Is e buannachd eile a tha aig LB thairis air eDNA gu bheil e a’ gabhail brath air gnìomhachd phagocytic a bhith a’ cuairteachadh cheallan fala anns an hemolymph, a bhios a’ cuairteachadh meanbh-fhàs-bheairtean (agus an genomes).Is e phagocytosis prìomh obair cheallan fala ann am bivalves [82].Mu dheireadh, tha an dòigh-obrach a’ gabhail brath air comas sìoltachaidh àrd feusgain (cuibheasach 1.5 l/h de dh’uisge-mara) agus cuairteachadh dà latha, a tha ag àrdachadh measgachadh diofar shreathan de dh’uisge na mara, a’ leigeil le eDNA heterologous a ghlacadh.[83, 84].Mar sin, tha mion-sgrùdadh ccfDNA feusgain na shlighe inntinneach leis a’ bhuaidh beathachaidh, eaconamach agus àrainneachd a tha aig feusgain.Coltach ris an anailis air LB a chaidh a chruinneachadh bho dhaoine, tha an dòigh seo cuideachd a ’fosgladh a’ chomas air atharrachaidhean ginteil agus epigenetic ann an DNA aoigheachd a thomhas mar fhreagairt do stuthan exogenous.Mar eisimpleir, faodar teicneòlasan sreath treas-ghinealach a dhealbhadh gus mion-sgrùdadh methylation genome-wide a dhèanamh ann an ccfDNA dùthchasach a’ cleachdadh sreath nanopore.Bu chòir am pròiseas seo a bhith air a dhèanamh nas fhasa leis gu bheil fad nam mìrean ccfDNA feusgain gu math co-chòrdail ri àrd-ùrlaran seicheamhan fada-leughaidh a leigeas le mion-sgrùdadh methylation DNA genome air feadh an t-sreath sreath singilte gun fheum air cruth-atharrachaidhean ceimigeach.Mar sin, faodaidh e sealladh luachmhor a thoirt seachad air na h-innealan bunaiteach a tha a’ riaghladh freagairt às deidh a bhith fosgailte do atharrachadh clìomaid no truailleadh [87].Ach, chan eil cleachdadh LB gun chrìochan.Chan fheumar a ràdh, feumaidh seo làthaireachd ghnèithean comharrachaidh san eag-shiostam.Mar a chaidh a ràdh gu h-àrd, le bhith a’ cleachdadh LB airson measadh a dhèanamh air bith-iomadachd eag-shiostam sònraichte tha feum air loidhne-phìoban bioinformatics teann a bheir aire do làthaireachd mìrean DNA bhon stòr.Is e prìomh dhuilgheadas eile gu bheil genomes iomraidh rim faighinn airson gnèithean mara.Thathas an dòchas gun cuidich iomairtean leithid Pròiseact Genomes Mamalan Mara agus am pròiseact Fish10k a chaidh a stèidheachadh o chionn ghoirid [88] an leithid de mhion-sgrùdadh san àm ri teachd.Tha cleachdadh bun-bheachd LB ri fàs-bheairtean beathachaidh sìoltachan cuideachd co-chosmhail ris na h-adhartasan as ùire ann an teicneòlas seicheamhan, ga fhàgail gu math freagarrach airson leasachadh bith-chomharran ioma-ohm gus fiosrachadh cudromach a thoirt seachad mu shlàinte àrainnean mara mar fhreagairt air cuideam àrainneachd.
Chaidh dàta seicheamhan genome a thasgadh ann an Tasglann Leughaidh Sequence NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 fo Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Buaidh atharrachadh clìomaid air beatha mara agus eag-shiostaman.Bith-eòlas Cole.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Beachdaich air na buaidhean co-cheangailte ri atharrachadh clìomaid agus cuideaman ionadail eile air àrainneachd na mara.àrainneachd saidheansail coitcheann.2021; 755: 142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Saidheans a 'chiad latha den Mhàrt.2020; 7:48.
Tha Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Lùghdachadh fo fhulangas teas fo chumhachan cuideam teas ath-aithris a 'mìneachadh bàsmhorachd àrd feusgain ghorm as t-samhradh.Aithisg saidheansail 2019;
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Atharrachaidhean o chionn ghoirid ann am tricead, adhbharan agus ìre bàsan bheathaichean.Proc Natl Acad Sci USA.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Is dòcha gu bheil iomadach pathogen neo-ghnèitheach air bàs mòr de Pinna nobilis adhbhrachadh.Beatha.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.A’ bhuaidh a dh’ fhaodadh a bhith aig atharrachadh clìomaid air galairean zoonotic Artaigeach.Int J Circumpolar slàinte.2005;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Ailean IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Feusgain ghorm (Mytilus edulis spp.) mar fhàs-bheairtean comharraichte ann an sgrùdadh truailleadh cladaich: lèirmheas.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Amalachadh biopsy liùlach ann an làimhseachadh aillse.Nat Urr Glan Oncol.2017;14:531-48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Aibachadh biopsy leaghan: A’ leigeil le DNA tumhair cuairteachadh.Nat Urr Cancer.2017; 17:223–38.
Mandel P., Metais P. Aigéid niuclasach ann am plasma daonna.Geàrr-chunntas coinneamh de fho-chompanaidhean Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Dreuchd ùr airson DNA gun cheallan mar chomharradh moileciuil airson làimhseachadh aillse.Tomhas mion-sgrùdadh biomolar.2019; 17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy a’ tighinn a-steach don chlinic - cùisean buileachaidh agus dùbhlain san àm ri teachd.Nat Urr Clin Oncol.2021;18:297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW agus feadhainn eile.Tha DNA fetal an làthair ann am plasma màthaireil agus serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Sgrùdadh air cùrsa torrachas agus na duilgheadasan aige le bhith a’ cuairteachadh RNA extracellular ann am fuil boireannaich fhad ‘s a tha iad trom.Dopediatrics.2020; 8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsy leaghan: bithear a’ cleachdadh DNA gun cheallan tabhartais gus lotan allogeneic a lorg ann an graft dubhaig.Nat Urr Nephrol.2021;17: 591-603.
Juan FC, Lo YM Ùr-ghnàthachaidhean ann an breithneachadh ro-bhreith: sreath genoma plasma màthaireil.Ann MD.2016; 67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Lorgadh pathogen luath le sreath metagenomic an ath ghinealach de lionntan bodhaig gabhaltach.Leigheas Nat.2021; 27: 115-24.