Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha taic chuingealaichte aig an dreach brabhsair a tha thu a’ cleachdadh airson CSS. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brabhsair ùraichte (no gun cuir thu dheth modh co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). Aig an aon àm, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh sinn a’ taisbeanadh an làraich gun stoidhlichean agus JavaScript.
Chaidh mìrean silica porous ullachadh le dòigh sol-gel le beagan atharrachaidhean gus mìrean macroporous fhaighinn. Chaidh na mìrean seo a thoirt a-mach le poilimearachadh gluasad slabhraidh fragmentation cuir-ris reversible (RAFT) le N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) agus styrene gus eadar-chur N-phenylmaleimide de ìre statach polystyrene (PMP) ullachadh. Chaidh colbhan stàilinn gun smal cumhang (100 × 1.8 mm id) a phacadh le pacadh slurry. Chaidh measadh a dhèanamh air dealachadh colbh PMP de mheasgachadh peptide anns a bheil còig peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) coileanadh cromagrafach) agus cnàmhadh trypsin de albumin serum daonna (HAS). Fo chumhachan elution as fheàrr, tha cunntadh plàta teòiridheach a’ mheasgachaidh peptide cho àrd ri 280,000 plàta / m². A’ dèanamh coimeas eadar coileanadh dealachaidh a’ cholbh leasaichte leis an Ascentis Express malairteach. Colbh RP-Amide, chaidh fhaicinn gu robh coileanadh dealachaidh colbh PMP nas fheàrr na a’ cholbh mhalairteach a thaobh èifeachdas dealachaidh agus rùn.
Anns na bliadhnachan mu dheireadh, tha gnìomhachas nan bith-chungaidhean air fàs gu bhith na mhargaidh chruinneil a tha a’ leudachadh le àrdachadh mòr ann an roinn a’ mhargaidh. Leis an fhàs spreadhaidh ann an gnìomhachas nan bith-chungaidhean1,2,3, tha mion-sgrùdadh peptides agus pròtainean gu math miannaichte. A bharrachd air a’ peptide targaid, bidh grunn neo-chunbhalachdan air an gineadh rè co-chur peptide, agus mar sin feumar glanadh cromagrafach gus peptides den ghlanachd a tha thu ag iarraidh fhaighinn. Tha mion-sgrùdadh agus comharrachadh phròtainean ann an lionntan bodhaig, figheagan agus ceallan na obair air leth dùbhlanach air sgàth an àireamh mhòr de ghnèithean a dh’ fhaodadh a bhith air an lorg ann an aon sampall. Ged a tha speactramaitreachd mais na inneal èifeachdach airson sreath peptide agus pròtain, ma thèid sampallan mar sin a stealladh a-steach don speactramaitreadair mais ann an aon dol-a-mach, cha bhith an dealachadh air leth freagarrach. Faodar an duilgheadas seo a lughdachadh le bhith a’ cur an gnìomh dealachaidhean cromagrafaidheachd leaghaidh (LC) mus tèid mion-sgrùdadh MS a dhèanamh, a lughdaicheas an àireamh de anailitichean a’ dol a-steach don speactramaitreadair mais aig àm sònraichte4,5,6. A bharrachd air an sin, rè dealachadh ìre leaghaidh, faodar anailitichean a chuimseachadh ann an roinnean cumhang, agus mar sin a’ cruinneachadh nan anailitichean sin agus a’ leasachadh cugallachd lorg MS. Tha cromagrafaidheachd leaghaidh (LC) air adhartas mòr a dhèanamh thar nan deich bliadhna a dh’ fhalbh agus tha e air fàs gu bhith na chuspair mòr-chòrdte. dòigh-obrach ann an mion-sgrùdadh pròtaineòmach7,8,9,10.
Tha cromatagrafaidheachd leaghaidh ìre-aisig (RP-LC) air a chleachdadh gu farsaing airson measgachadh peptide a ghlanadh agus a sgaradh a’ cleachdadh silica octadecyl-modified (ODS) mar an ìre statach11,12,13. Ach, chan eil ìrean statach RP a’ toirt seachad dealachadh riarachail de peptides agus pròtainean air sgàth an structar iom-fhillte agus an nàdar amfaifileach 14,15. Mar sin, tha feum air ìrean statach a chaidh a dhealbhadh gu sònraichte gus peptides agus pròtainean le pàirtean pòlar agus neo-phòlar a sgrùdadh gus eadar-obrachadh leis na h-anailitean sin agus an cumail16. Faodaidh cromatagrafaidheachd modh-measgaichte, a bheir seachad eadar-obrachaidhean ioma-mhodhail, a bhith na roghainn eile an àite RP-LC airson dealachadh peptides, pròtainean, agus measgachaidhean iom-fhillte eile. Chaidh grunn ìrean statach modh-measgaichte ullachadh, agus chaidh colbhan air am pacadh leis na h-ìrean sin a chleachdadh airson dealachadh peptide agus pròtain17,18,19,20,21. Tha ìrean statach modh-measgaichte (WAX / RPLC, HILIC / RPLC, eadar-chur pòlar / RPLC) freagarrach airson dealachadh peptide agus pròtain air sgàth làthaireachd an dà chuid pòlar agus neo-phòlar. buidhnean22,23,24,25,26,27,28. San aon dòigh, tha ìrean statach eadar-fhighte pòlarach le buidhnean pòlarach ceangailte gu covalent a’ sealltainn cumhachd dealachaidh math agus roghnachd gun samhail airson anailitichean pòlarach agus neo-phòlarach, leis gu bheil an dealachadh an urra ris an eadar-obrachadh eadar an anailit agus an ìre statach. Eadar-obrachaidhean ioma-mhodhail29, 30, 31, 32. O chionn ghoirid, dh’ullaich Zhang et al.30 ìre statach polyamine le crìoch dodecyl agus sgar iad gu soirbheachail hydrocarbons, antidepressants, flavonoids, nucleosides, estrogens, agus grunn anailitichean eile.Tha buidhnean pòlarach agus neo-phòlarach aig an eadar-fhighteadair pòlarach, agus mar sin faodar a chleachdadh gus peptides agus pròtainean a sgaradh aig a bheil pàirtean hydrophobic agus hydrophilic.Tha colbhan leabaithe ann am pòlarach (me, colbhan C18 leabaithe ann amide) rim faighinn gu malairteach fon ainm malairt colbhan Ascentis Express RP-Amide, ach chan eil na colbhan seo air an cleachdadh ach airson mion-sgrùdadh amine 33.
Anns an sgrùdadh làithreach, chaidh ìre statach leabaithe ann am pòla (polystyrene leabaithe ann an N-phenylmaleimide) ullachadh agus a mheasadh airson dealachadh peptides agus cnàmhan trypsin de HSA. Chaidh an ìre statach ullachadh a’ cleachdadh an ro-innleachd a leanas. Chaidh gràineanan silica porous ullachadh a rèir a’ mhodh-obrach a chaidh a thoirt seachad san fhoillseachadh roimhe againn le beagan atharrachaidhean air a’ phròtacal ullachaidh. Chaidh an co-mheas de urea, polyethylene glycol (PEG), TMOS, uisge searbhag aiseatach atharrachadh gus gràineanan silica ullachadh le meud mòr pore. San dàrna àite, chaidh ligand ùr, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, a cho-chur agus a chleachdadh gus gràineanan silica a thoirt a-mach gus ìre statach leabaithe ann am pòla ullachadh. Chaidh an ìre statach a thig às a phacadh a-steach do cholbh stàilinn gun smal (100 × 1.8 mm id) a’ cleachdadh an sgeama pacaidh leasaichte. Tha pacadh a’ cholbh air a chuideachadh le crith meacanaigeach gus dèanamh cinnteach gu bheil leabaidh aon-ghnèitheach air a chruthachadh taobh a-staigh a’ cholbh. Dèan measadh air dealachadh colbh pacaichte de mheasgachaidhean peptide anns a bheil còig peptides; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) agus cnàmhadh trypsin de albumin serum daonna (HAS). Chaidh am measgachadh peptide agus cnàmhadh trypsin de HSA fhaicinn a’ dealachadh le deagh rùn-sgaradh agus èifeachdas. Chaidh coileanadh dealachaidh colbh PMP a choimeas ri coileanadh colbh Ascentis Express RP-Amide. Chaidh fhaicinn gu robh an dà chuid peptides agus pròtainean air an rùn-sgaradh gu math agus èifeachdach air colbh PMP, a bha nas èifeachdaiche na colbh Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethylene Glycol), Urea, searbhag aiseatach, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Albumin Serum Daonna (HSA), clòraid ammonium, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), clòraid methacryloyl (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, peroxide benzoyl (BPO), acetonitrile ìre HPLC (ACN), methanol, 2-Propanol, agus acetone. Air a cheannach bho Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Chaidh measgachadh de urea (8 g), polyethylene glycol (8 g), agus 8 mL de 0.01 N searbhag aiseatach a mheasgachadh airson 10 mionaidean, agus an uairsin chaidh 24 mL de TMOS a chur ris fo chumhachan reòthte. Chaidh am measgachadh ath-bhualadh a theasachadh aig 40 ° C airson 6 uairean a thìde agus an uairsin aig 120 ° C airson 8 uairean a thìde ann an autoclave stàilinn gun smal. Chaidh an t-uisge a dhòrtadh dheth agus chaidh an stuth a bha air fhàgail a thiormachadh aig 70 ° C airson 12 uairean a thìde. Chaidh am mais bhog tioram a mhuileann gu rèidh ann an àmhainn agus a losgadh aig 550 ° C airson 12 uairean a thìde. Chaidh trì baidsean ullachadh agus a chomharrachadh gus ath-riochdachadh a sgrùdadh ann am meud gràinean, meud pore agus farsaingeachd uachdar.
Le bhith ag atharrachadh uachdar mìrean silica le ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) a chaidh a cho-chur ro-làimh agus an uair sin le poileimearachadh rèididheach le styrene, chaidh todhar anns a bheil buidheann pòlar ullachadh. Ìre statach airson cruinneachaidhean agus slabhraidhean polystyrene. Tha am pròiseas ullachaidh air a mhìneachadh gu h-ìosal.
Chaidh N-phenylmaleimide (200 mg) agus methyl vinyl isocyanate (100 mg) a sgaoileadh ann an toluene tioram, agus chaidh 0.1 mL de 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) a chur ris a’ fhlasg ath-bhualaidh gus copolymer phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate (PMCP) ullachadh. Chaidh am measgachadh a theasachadh aig 60°C airson 3 uairean a thìde, a shìoladh agus a thiormachadh ann an àmhainn aig 40°C airson 3 uairean a thìde.
Chaidh mìrean silica tioram (2 g) a sgaoileadh ann an toluene tioram (100 mL), a mheasgachadh agus a shònachadh ann am flasg bonn cruinn 500 mL airson 10 mionaidean. Chaidh PMCP (10 mg) a sgaoileadh ann an toluene agus a chur ris a’ fhlasg ath-bhualaidh boinneagan tro thunail boinne. Chaidh am measgachadh a theasachadh aig 100 ° C airson 8 uairean a thìde, a shìoladh agus a nighe le acetone agus a thiormachadh aig 60 ° C airson 3 uairean a thìde. An uairsin, chaidh mìrean silica ceangailte ri PMCP (100 g) a sgaoileadh ann an toluene (200 ml) agus chaidh 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) a chur ris an làthair 100 µL de dibutyltin dilaurate mar chatalaiche. Chaidh am measgachadh a mheasgachadh aig 50 ° C airson 8 uairean a thìde, a shìoladh agus a thiormachadh aig 50 ° C airson 3 uairean a thìde.
Chaidh stìorain (1 mL), beinsoile piorocsaid BPO (0.5 mL), agus mìrean silica ceangailte ri TEMPO-PMCP (1.5 g) a sgaoileadh ann an toluene agus an glanadh le naitridean. Chaidh poileimearachadh stìorain a dhèanamh aig 100°C airson 12 uair a thìde. Chaidh an toradh a thig às a nighe le methanol agus a thiormachadh aig 60°C thar oidhche. Tha an sgeama ath-bhualadh iomlan air a shealltainn ann am Figear 1.
Chaidh na sampallan a dhì-ghasadh aig 393 K airson 1 uair a thìde gus cuideam fuigheallach nas lugha na 10-3 Torr fhaighinn. Chaidh an ìre de N2 a chaidh a shùghadh aig cuideam coimeasach de P/P0 = 0.99 a chleachdadh gus meud iomlan nam pores a dhearbhadh. Chaidh morf-eòlas mìrean silica lom agus ceangailte ri ligand a sgrùdadh le microscopaidh sganaidh dealanach (Hitachi High Technologies, Tokyo, Iapan). Chaidh sampallan tiormaichte (silica lom agus mìrean silica ceangailte ri ligand) a chuir air colbh alùmanum a’ cleachdadh teip charboin steigeach. Chaidh òr a phlàtadh air na sampallan a’ cleachdadh còta sputter Q150T, agus chaidh sreath Au 5 nm a thasgadh air na sampallan. Bidh seo a’ leasachadh èifeachdas a’ phròiseis a’ cleachdadh bholtaids ìosal agus a’ toirt seachad sputtering fuar gràin grinn. Chaidh anailisiche eileamaideach Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 a chleachdadh airson mion-sgrùdadh eileamaideach. Chaidh anailisiche meud mìrean Malvern (Worcestershire, RA) Mastersizer 2000 a chleachdadh gus an sgaoileadh meud mìrean fhaighinn. Mìrean silica rùisgte agus mìrean silica ceangailte ri ligand (5 mg gach fear) air an sgaoileadh ann an 5 mL de isopropanol, air an sonicachadh airson 10 mionaidean, air an cur ann am vortex airson 5 mionaidean, agus air an cur air being optigeach an Mastersizer. Chaidh mion-sgrùdadh teirmeagrafaimeatrach a dhèanamh aig ìre 5 °C gach mionaid thairis air raon teòthachd eadar 30 agus 800 °C.
Chaidh colbhan stàilinn gun smal le lìnigeadh glainne de thomhasan (100 × 1.8 mm id) a phacadh a’ cleachdadh an dòigh pacaidh slurry, a’ cur an gnìomh an aon mhodh-obrach a chaidh a chleachdadh ann an Ref. 31. Chaidh colbh stàilinn gun smal (le lìnigeadh glainne, 100 × 1.8 mm id) le uidheamachadh toraidh anns an robh frit 1 µm a cheangal ri pacair sludaidh (Alltech Deerfield, IL, USA). Ullaich sludaidh ìre statach le bhith a’ crochadh 150 mg de ìre statach ann an 1.2 mL de methanol agus ga chur chun cholbh stòraidh. Chaidh methanol a chleachdadh mar an fhuasglaiche sludaidh a bharrachd air an fhuasglaiche gluasaid. Lìon an colbh gu seicheamhach le bhith a’ cur cuideaman de 100 MP airson 10 mionaidean, 80 MP airson 15 mionaidean, agus 60 MP airson 30 mionaidean. Rè pacadh, chaidh crith meacanaigeach a chuir an sàs le dà chreathadair colbh GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) gus dèanamh cinnteach à pacadh cothromach a’ cholbh. Dùin am pacair sludaidh agus leig às a’ chuideam gu slaodach gus casg a chuir air milleadh sam bith taobh a-staigh a’ cholbh. Dì-cheangail an colbh bhon aonad pacaidh sludaidh agus ceangail uidheamachadh eile ris an t-slighe a-steach agus ris an t-siostam LC gus a choileanadh a sgrùdadh.
Chaidh pumpa LC (10AD Shimadzu, Iapan), in-stealladh (Valco (USA) C14 W.05) le lùb in-stealladh 50nL, inneal-dì-ghasachaidh membran (Shimadzu DGU-14A), uinneag capillary UV-VIS a thogail. Lorgaire inneal µLC sònraichte (UV-2075) agus meanbh-cholbhan le lìnigeadh glainne. Cleachd tiùban ceangail glè chumhang is goirid gus buaidh leudachadh còmhlan colbh a bharrachd a lughdachadh. Às deidh pacadh, chaidh capillaries (50 μm id 365) agus capillaries aonaidh lughdachadh (50 μm) a chuir a-steach aig beul 1/16″ an aonaidh lughdachadh. Chaidh cruinneachadh dàta agus giullachd cromatagrafach a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog Multichro 2000. Sgrùdadh aig 254 nm Chaidh deuchainn a dhèanamh air anailisichean airson gabhail UV. Chaidh dàta cromatagrafach a sgrùdadh le OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin bho serum daonna, pùdar liofilichte, ≥ 96% (electrophoresis gel agarose) 3 mg measgaichte le trypsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 mL), agus 0.2 M ammonium bicarbonate (1 mL). Chaidh am fuasgladh a mheasgachadh airson 10 mionaidean agus a chumail ann an amar-uisge aig 37°C airson 6 uairean a thìde, an uairsin a mhùchadh le 1 mL de 0.1% TFA. Criathraich am fuasgladh agus stòraich fo 4°C.
Chaidh dealachadh measgachaidhean peptide agus cnàmhadh trypsin HSA a mheasadh air leth air colbhan PMP. Thoir sùil air dealachadh measgachadh peptide agus cnàmhadh trypsin HSA leis a’ cholbh PMP agus dèan coimeas eadar na toraidhean agus colbh Ascentis Express RP-Amide. Tha an àireamh plàta teòiridheach air a thomhas mar a leanas:
Tha ìomhaighean SEM de ghràineanan silica lom agus gràinean silica ceangailte ri ligand air an sealltainn ann am FIG. 2. Tha ìomhaighean SEM de ghràineanan silica lom (A, B) a’ sealltainn, an coimeas ris na sgrùdaidhean a bh’ againn roimhe, gu bheil na gràinean sin cruinn agus gu bheil na gràinean air an sìneadh no gu bheil co-chothromachd neo-riaghailteach aca. Tha uachdar nam gràinean silica ceangailte ri ligand (C, D) nas socair na uachdar nam gràinean silica lom, agus is dòcha gu bheil seo mar thoradh air còmhdach slabhraidhean polystyrene air uachdar nam gràinean silica.
Dealbhan miocrosgop dealanach sganaidh de ghràineanan silica lom (A, B) agus gràinean silica ceangailte ri ligand (C, D).
Tha sgaoilidhean meud gràinean mìrean silica lom agus mìrean silica ceangailte ri ligand air an sealltainn ann am Figear 3(A). Sheall lùban sgaoilidh meud gràinean stèidhichte air meud gun do dh’àrdaich meud nam mìrean silica às deidh atharrachadh ceimigeach (Figear 3A). Tha dàta sgaoilidh meud gràinean nam mìrean silica bhon sgrùdadh làithreach agus an sgrùdadh roimhe air an coimeas ann an Clàr 1(A). Tha meud gràinean stèidhichte air meud, d(0.5), de PMP 3.36 μm, an taca ris an sgrùdadh roimhe againn le luach ad(0.5) de 3.05 μm (mìrean silica ceangailte ri polystyrene)34. Bha sgaoileadh meud gràinean nas cumhainge aig a’ bhaidse seo an taca ris an sgrùdadh roimhe againn air sgàth nan co-mheasan eadar-dhealaichte de PEG, urea, TMOS, agus searbhag aiseatach anns a’ mheasgachadh ath-bhualadh. Tha meud gràinean ìre PMP beagan nas motha na meud ìre gràinean silica ceangailte ri polystyrene a rannsaich sinn roimhe. Tha seo a’ ciallachadh nach do chuir gnìomhachd uachdar mìrean silica le styrene ach sreath polystyrene (0.97 µm) air uachdar an t-silica, ach anns an ìre PMP bha tiugh an t-sreath… 1.38 µm.
Sgaoileadh meud mìrean (A) agus sgaoileadh meud nan pores (B) de mhìrean silica lom agus mìrean silica ceangailte ri ligand.
Tha meud nam pores, meud nam pores agus farsaingeachd uachdar nam mìrean silica den sgrùdadh làithreach air an toirt seachad ann an Clàr 1(B). Tha pròifilean PSD nam mìrean silica lom agus nam mìrean silica ceangailte ri ligand air an sealltainn ann am Figear 3(B). Tha na toraidhean co-chosmhail ris an sgrùdadh roimhe againn. Tha meudan nam pores de na mìrean silica lom agus ceangailte ri ligand 310 agus 241, fa leth, a tha a’ nochdadh gu bheil meud nam pores a’ lùghdachadh le 69 às dèidh atharrachadh ceimigeach, mar a chithear ann an Clàr 1(B), agus tha an t-atharrachadh sa lùb air a shealltainn ann am Figear 3(B). San aon dòigh, lùghdaich meud nam pores de na mìrean silica bho 0.67 gu 0.58 cm3/g às dèidh atharrachadh ceimigeach. Tha farsaingeachd uachdar sònraichte nam mìrean silica a chaidh a sgrùdadh an-dràsta 116 m2/g, a tha co-chosmhail ris an sgrùdadh roimhe againn (124 m2/g). Mar a chithear ann an Clàr 1(B), lùghdaich farsaingeachd uachdar (m2/g) nam mìrean silica cuideachd bho 116 m2/g gu 105 m2/g às dèidh atharrachadh ceimigeach. atharrachadh.
Tha toraidhean mion-sgrùdadh eileamaideach na h-ìre statach air an sealltainn ann an Clàr 2. Tha an luchd gualain anns an ìre statach làithreach aig 6.35%, a tha nas ìsle na an luchd gualain anns an sgrùdadh roimhe againn (mìrean silica ceangailte ri polystyrene, 7.93%35 agus 10.21%, fa leth)42. Tha an luchd gualain anns an ìre statach làithreach ìosal, leis gu bheil cuid de ligands pòlar leithid phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) agus 4-hydroxy-TEMPO air an cleachdadh ann an ullachadh an SP làithreach. Tha an ceudad cuideam naitridean den ìre statach làithreach aig 2.21%, an taca ri 0.1735 agus 0.85% a rèir cuideam naitridean ann an sgrùdaidhean roimhe, fa leth. Tha seo a’ ciallachadh gu bheil an % cuideam de naitridean nas àirde anns an ìre statach làithreach air sgàth phenylmaleimide. San aon dòigh, bha luchdan gualain thoraidhean (4) agus (5) 2.7% agus 2.9%, fa leth, agus bha luchdan gualain an toraidh dheireannaich (6) bha e 6.35%, mar a chithear ann an Clàr 2. Chaidh call cuideim a dhearbhadh le ìre statach PMP, agus chithear lùb TGA ann am Figear 4. Tha lùb TGA a’ sealltainn call cuideim de 8.6%, a tha ann an deagh cho-chòrdadh ris an luchdachadh gualain (6.35%) leis gu bheil na ligands a’ gabhail a-steach chan e a-mhàin C ach cuideachd N, O, agus H.
Chaidh an ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate a thaghadh airson atharrachadh uachdar mìrean silica leis gu bheil buidhnean phenylmaleimide polar agus buidhnean vinylisocyanate ann. Faodaidh buidhnean vinyl isocyanate ath-bhualadh a bharrachd le styrene le bhith a’ poileimearachadh radaigeach beò. Is e an dàrna adhbhar buidheann a chuir a-steach aig a bheil eadar-obrachadh meadhanach leis an anailit agus gun eadar-obrachadh electrostatach làidir eadar an anailit agus an ìre statach, leis nach eil cosgais fhìor-dhealbhach aig a’ phàirt phenylmaleimide aig pH àbhaisteach. Faodar smachd a chumail air polarity na h-ìre statach leis an ìre as fheàrr de styrene agus an ùine ath-bhualadh de phoileimearachadh radaigeach saor. Tha an ceum mu dheireadh den ath-bhualadh (poileimearachadh radaigeach saor) deatamach agus faodaidh e polarity na h-ìre statach atharrachadh. Chaidh mion-sgrùdadh eileamaideach a dhèanamh gus sgrùdadh a dhèanamh air luchdachadh gualain nan ìrean statach seo. Chaidh fhaicinn gun do mheudaich àrdachadh na tha de styrene agus an ùine ath-bhualadh luchdachadh gualain na h-ìre statach agus a chaochladh. Tha luchdan gualain eadar-dhealaichte aig SPan air an ullachadh le diofar dùmhlachdan de styrene. A-rithist, luchdaich na h-ìrean statach seo a-steach do cholbhan stàilinn gun staoin agus thoir sùil air an coileanadh cromagrafach aca (roghnachd, rùn, N luach, msaa.). Stèidhichte air na deuchainnean seo, chaidh foirmleachadh leasaichte a thaghadh gus ìre statach PMP ullachadh gus dèanamh cinnteach à polarity fo smachd agus gleidheadh ​​​​​​deagh anailit.
Chaidh còig measgachaidhean peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) a mheasadh cuideachd le bhith a’ cleachdadh colbh PMP a’ cleachdadh ìre gluasadach; 60/40 (v/v) acetonitrile/uisge (0.1% TFA) aig ìre sruthadh de 80 μL/min. Fo chumhachan elution as fheàrr, is e an àireamh phlàta teòiridheach (N) gach colbh (100 × 1.8 mm id) 20,000 ± 100 (200,000 plàta/m²). Tha Clàr 3 a’ toirt seachad na luachan N airson nan trì colbhan PMP agus tha na cromatograman air an sealltainn ann am Figear 5A. Mion-sgrùdadh luath air colbh PMP aig ìre sruthadh àrd (700 μL/min), chaidh còig peptides a elution taobh a-staigh aon mhionaid, bha luachan N glè mhath, 13,500 ± 330 gach colbh (100 × 1.8 mm id), a’ freagairt ri 135,000 plàta/m (Figear 5B). Chaidh trì colbhan den aon mheud (100 × 1.8 mm id) a phacadh le trì baidsean eadar-dhealaichte de ìre stèidhichte PMP gus ath-riochdachadh a dhearbhadh. An Chaidh dùmhlachd anailit airson gach colbh a chlàradh a’ cleachdadh nan suidheachaidhean elution as fheàrr agus an àireamh de phlàtaichean teòiridheach N agus an ùine gleidhidh gus an aon mheasgachadh deuchainn a sgaradh air gach colbh. Tha an dàta ath-riochdachadh airson colbhan PMP air a shealltainn ann an Clàr 4. Tha ath-riochdachadh colbh PMP a’ freagairt gu math ri luachan %RSD glè ìosal, mar a chithear ann an Clàr 3.
Sgaradh measgachadh peptide air colbh PMP (B) agus colbh Ascentis Express RP-Amide (A); ìre gluasadach 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), tomhasan colbh PMP (100 × 1.8 mm id); anailiseach Òrdugh elution nan todhar: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) agus 5 (leucine) searbhag enkephalin)).
Chaidh colbh PMP (100 × 1.8 mm id) a mheasadh airson dealachadh chnàmhan tryptic de albumin serum daonna ann an cromatagrafaidheachd leaghaidh àrd-choileanaidh. Tha an cromatagram ann am Figear 6 a’ sealltainn gu bheil an sampall air a sgaradh gu math agus gu bheil an rùn glè mhath. Chaidh cnàmhan HSA a sgrùdadh a’ cleachdadh ìre sruthadh de 100 µL / min, ìre gluasadach 70/30 acetonitrile / uisge agus 0.1% TFA. Mar a chithear anns a’ chromatagram (Figear 6), chaidh cnàmhadh HSA a roinn ann an 17 stùcan a tha a’ freagairt ri 17 peptides. Chaidh èifeachdas dealachaidh gach stùc anns a’ chnàmhadh HSA obrachadh a-mach agus tha na luachan air an toirt seachad ann an Clàr 5.
Chaidh cnàmhadh tryptic de HSA (100 × 1.8 mm id) a sgaradh air colbh PMP; ìre sruthadh (100 µL/min), ìre gluasadach 60/40 acetonitrile/uisge le 0.1% TFA.
far a bheil L fad a’ cholbh, η slaodachd na h-ìre gluasadach, ΔP cuideam cùil a’ cholbh, agus u astar loidhneach na h-ìre gluasadach. Bha treòiteachd colbh PMP 2.5 × 10-14 m2, bha an ìre sruth 25 μL/min, agus chaidh 60/40 v/v ACN/uisge a chleachdadh. Bha treòiteachd colbh PMP (100 × 1.8 mm id) coltach ris an fhear san sgrùdadh roimhe againn Ref.34. Is e treòiteachd a’ cholbh air a phacadh le mìrean uachdarach porous: 1.7 × 10-15 airson mìrean 1.3 μm, 3.1 × 10-15 airson mìrean 1.7 μm, 5.2 × 10-15 agus 2.5 × 10-14 m2 airson mìrean 2.6 μm Airson mìrean 5 μm 43. Mar sin, tha treòiteachd ìre PMP coltach ri treòiteachd mìrean cridhe-shlige 5 μm.
far a bheil Wx na chuideam den cholbh air a phacadh le clòroform, Wy na chuideam den cholbh air a phacadh le methanol, agus ρ na dùmhlachd den fhuasglaiche. Dùmhlachdan methanol (ρ = 0.7866) agus clòroform (ρ = 1.484). B’ e 0.63 agus 0.55, fa leth, an truailleachd iomlan de cholbhan SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 agus colbhan C18-Urea 31 a rinn sinn sgrùdadh orra roimhe. Tha seo a’ ciallachadh gu bheil làthaireachd ligands urea a’ lughdachadh treòiteachd na h-ìre statach. Air an làimh eile, tha an truailleachd iomlan de cholbh PMP (100 × 1.8 mm id) 0.60. Tha treòiteachd cholbhan PMP nas ìsle na treòiteachd cholbhan air am pacadh le mìrean silica ceangailte ri C18 oir ann an ìrean statach de sheòrsa C18 tha na ligands C18 ceangailte ris na mìrean silica mar shlabhraidhean loidhneach, agus ann an ìrean statach de sheòrsa polystyrene, tha an sreath polymer an ìre mhath tiugh A air a chruthachadh timcheall air. Ann an deuchainn àbhaisteach, thèid porosity a’ cholbh obrachadh a-mach mar:
Tha Figear 7A,B a’ sealltainn colbh PMP (100 × 1.8 mm id) agus colbh Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) a’ cleachdadh nan aon chumhachan elution (ie, 60/40 ACN/H2O agus 0.1% TFA).) den phlota van Deemter. Chaidh measgachaidhean peptide taghte (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ullachadh ann an 20 µL/ Is e 800 µL/min an ìre sruth as ìsle airson an dà cholbh. B’ e 2.6 µm agus 3.9 µm, fa leth, na luachan HETP as ìsle aig an ìre sruth as fheàrr (80 µL/min) airson colbh PMP agus colbh Ascentis Express RP-Amide. Tha na luachan HETP a’ nochdadh gu bheil èifeachdas dealachaidh colbh PMP (100 × 1.8 mm id) mòran nas fheàrr na colbh Ascentis Express RP-Amide a tha ri fhaighinn gu malairteach (100 × 1.8 mm id). Tha plota van Deemter ann am Figear 7(A) a’ sealltainn nach eil an lùghdachadh ann an luach N le sruth a tha a’ sìor fhàs cudromach an taca ris an sgrùdadh roimhe againn. Tha èifeachdas dealachaidh nas àirde colbh PMP (100 × 1.8 mm id) an coimeas ris a’ cholbh Ascentis Express RP-Amide stèidhichte air leasachaidhean ann an cumadh, meud, agus modhan pacaidh iom-fhillte nan gràinean a thathas a’ cleachdadh san obair làithreach34.
(A) plota van Deemter (HETP an aghaidh astar loidhneach ìre gluasadach) air fhaighinn le bhith a’ cleachdadh colbh PMP (100 × 1.8 mm id) ann an 60/40 ACN/H2O le 0.1% TFA. (B) plota van Deemter (HETP an aghaidh astar loidhneach ìre gluasadach) air fhaighinn le bhith a’ cleachdadh colbh Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) ann an 60/40 ACN/H2O le 0.1% TFA.
Chaidh ìre statach polystyrene leabaithe ann am pòla ullachadh agus a mheasadh airson dealachadh measgachaidhean peptide synthetigeach agus cnàmhadh trypsin de albumin serum daonna (HAS) ann an cromagrafaidheachd leaghaidh àrd-choileanaidh. Tha coileanadh cromagrafaidheachd cholbhan PMP airson measgachaidhean peptide sàr-mhath ann an èifeachdas dealachaidh agus rùn. Tha an coileanadh dealachaidh nas fheàrr de cholbhan PMP mar thoradh air grunn adhbharan, leithid meud gràinean agus meud pore nam gràinean silica, co-chur fo smachd na h-ìre statach, agus pacadh colbh iom-fhillte. A bharrachd air èifeachdas dealachaidh àrd, tha cuideam cùil colbh ìosal aig ìrean sruthadh àrd na bhuannachd eile den ìre statach seo. Tha colbhan PMP a’ nochdadh ath-riochdachadh math agus faodar an cleachdadh airson mion-sgrùdadh measgachaidhean peptide agus cnàmhadh trypsin diofar phròtainean. Tha sinn an dùil an colbh seo a chleachdadh airson dealachadh thoraidhean nàdarra, todhar bith-ghnìomhach bho lusan cungaidh-leighis agus earrannan fungach ann an cromagrafaidheachd leaghaidh. San àm ri teachd, thèid colbhan PMP a mheasadh cuideachd airson dealachadh phròtainean agus antibodies monoclonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Rannsachadh air Siostaman Dealachaidh Peptide le Cromatagrafaidheachd Ìre In-aiseig Pàirt I: Leasachadh Pròtacal Comharrachadh Colbh. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peptidean gnìomhach leasaichte air an dealbhadh airson làimhseachadh ghalaran gabhaltach. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidean leigheasach sintéiseach: saidheans agus a’ mhargaidh. lorg dhrogaichean. 15 (1-2) an-diugh, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Cromatagrafaidheachd Leaghach Pròtaineòmach Adhartach. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Leigidh cromatagrafaidheachd leaghaidh adhartach-speictreamachd mais le bhith a’ toirt a-steach metabolomics agus proteomics a tha air an targaideadh gu farsaing. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Dreuchd UHPLC ann an leasachadh dhrogaichean. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Taobhan bunaiteach is practaigeach de chromatagrafaidheachd leaghaidh fo chuideam fìor àrd airson dealachaidhean luath. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Cleachdadh cromatagrafaidheachd leaghaidh àrd-choileanaidh ann an leasachadh dhrogaichean. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Hidreagalan macrophorous monolithach air an ullachadh bho emulsions ìre a-staigh àrd ola-ann-uisge airson glanadh èifeachdach de enteroviruses. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Dreuchd cromatagrafaidheachd leaghaidh ann am pròtain-eòlas. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Gluasadan a tha a’ tighinn am bàrr ann an dealachaidhean cromatagrafaidh leaghaidh ìre-aiseig de pheptidean leigheasach agus pròtainean: teòiridh agus tagraidhean. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Sgaradh dà-thaobhach de pheiptidean a’ cleachdadh siostam RP-RP-HPLC a’ cleachdadh diofar luachan pH anns a’ chiad agus an dàrna tomhas dealachaidh. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Chaidh sgrùdadh a dhèanamh air feartan gluasaid mais agus coileanadh cineatach cholbhan cromagrafach àrd-èifeachdais air am pacadh le mìrean làn-2 μm C18 làn-phorach agus uachdarach.J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Gluasadan o chionn ghoirid agus dùbhlain anailis ann an aonaranachd, comharrachadh agus dearbhadh peptidean bith-ghnìomhach planntrais.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Cruth-tìre pròtaineamaigeach rìoghachd na beatha. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Giullachd sìos-sruth peptidean leigheasach le cromatagrafaidheachd leaghaidh ullachaidh. Molecule (Basel, an Eilbheis) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Cromatagrafaidheachd measgaichte-mhodh agus a cur an sàs ann am bith-phoilimeirean. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligands airson cromatagrafaidheachd pròtain measgaichte-mhodh: prionnsapal, caractarachadh, agus dealbhadh. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).