Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha taic CSS cuibhrichte aig an dreach brabhsair a tha thu a’ cleachdadh. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brabhsair ùraichte (no gun cuir thu dheth Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). Aig an aon àm, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, nì sinn an làrach-lìn gun stoidhlichean agus JavaScript.
Modhan ùra imdhùnach is speactramaitreach mais airson mion-sgrùdadh iom-fhillte air oligosaccharides maireannach ann an stover arbhair air an ro-làimhseachadh le AFEX. Tha bith-thomas lignocellulosic na roghainn seasmhach an àite connadh fosail agus tha e air a chleachdadh gu farsaing gus bith-theicneòlasan a leasachadh airson cinneasachadh thoraidhean leithid biadh, biadh, connadh agus ceimigean. Is e prìomh amas nan teicneòlasan sin leasachadh phròiseasan farpaiseach a thaobh cosgais airson carbohydrates iom-fhillte a tha an làthair ann am ballachan cealla planntrais a thionndadh gu siùcaran sìmplidh leithid glùcois, xylose agus arabinose. Leis gu bheil bith-thomas lignocellulosic gu math ceann-laidir, feumar a chur fo làimhseachadh teirmeachemiceach (me, exfoliation snàithleach ammonia (AFEX), searbhagan caolaichte (DA), lionntan ianach (IL)) agus làimhseachadh bith-eòlasach (me, hydrolysis enzymatic agus coipeadh microbial) còmhla gus an toradh a tha thu ag iarraidh fhaighinn. . Ach, nuair a thèid enzyman fungach malairteach a chleachdadh sa phròiseas hydrolysis, chan eil ach 75-85% de na siùcaran soluble a chaidh a chruthachadh nan monosaccharides, agus tha an 15-25% a tha air fhàgail nan oligosaccharides soluble, neo-riaghlaidh, nach eil an-còmhnaidh rim faighinn le meanbh-fhàs-bheairtean. Roimhe seo, tha sinn air oligosaccharides stòlda soluble a sgaradh agus a ghlanadh gu soirbheachail le bhith a’ cleachdadh measgachadh de sgaradh gualain is talamh diatomaceous agus cromagrafaidheachd às-dùnadh meud, agus cuideachd air sgrùdadh a dhèanamh air na feartan bacaidh enzyme aca. Tha sinn air faighinn a-mach gu bheil e nas duilghe oligosaccharides anns a bheil ìre nas àirde de phoilimearachadh (DP) de dh’ ionadan searbhag uronic methylated a phròiseasadh le measgachaidhean enzyme malairteach na oligosaccharides DP ìosal agus neodrach. An seo tha sinn ag aithris cleachdadh grunn dhòighean a bharrachd, a’ gabhail a-steach pròifileadh glycan a’ cleachdadh antibodies monoclonal (mAbs) sònraichte do glycans bith-mhais planntrais gus ceanglaichean glycan ann am ballachan cealla planntrais agus hydrolysates enzymatic a chomharrachadh, ianachadh dì-sorption laser le taic maitrís, agus mais-spectrometry ùine-itealaich. . Bidh MALDI-TOF-MS) a’ cleachdadh mullaichean breithneachaidh fiosrachail structar a gheibhear le speactroscopaidh às deidh lobhadh àrd-sgoile de ianan àicheil, cromagrafaidheachd gas agus mais-spectrometry (GC-MS) gus ceanglaichean oligosaccharide a chomharrachadh le agus às aonais derivatization. Air sgàth meud beag oligosaccharides (DP 4–20), tha na moileciuilean sin duilich an cleachdadh airson ceangal agus comharrachadh mAb. Gus faighinn thairis air an duilgheadas seo, chuir sinn an sàs dòigh ùr neo-ghluasadach oligosaccharide stèidhichte air conjugation biotin a chomharraich gu soirbheachail a’ mhòr-chuid de oligosaccharides soluble DP ìosal air uachdar a’ mhicro-phlàta, a chaidh an uairsin a chleachdadh ann an siostam mAb àrd-toraidh airson mion-sgrùdadh ceangail sònraichte. Cuidichidh an dòigh ùr seo le leasachadh dheuchainnean glùcome àrd-toraidh nas adhartaiche san àm ri teachd a dh’ fhaodar a chleachdadh gus oligosaccharides a tha an làthair ann am biomarkers a sgaradh agus a chomharrachadh airson adhbharan breithneachaidh.
Tha bith-thomas lignocellulosic, air a dhèanamh suas de stuthan àiteachais, coilltearachd, feòir is fiodha, na stuth amh a dh’fhaodadh a bhith ann airson cinneasachadh thoraidhean stèidhichte air bith-eòlas, a’ gabhail a-steach biadh, biadh, connadh agus ro-ruithearan ceimigeach gus toraidhean le luach nas àirde a thoirt gu buil1. Tha gualaisg (leithid ceallalòs agus hemicellulos) a tha an làthair ann am ballachan cealla planntrais air an dì-phoileimireachadh gu monosaccharides le giullachd ceimigeach agus bith-chruth-atharrachadh (leithid hydrolysis enzymatic agus coipeadh meanbh-bhitheach). Am measg nan ro-làimhseachadh cumanta tha leudachadh snàithleach ammonia (AFEX), searbhag caolaichte (DA), leaghan ianach (IL), agus spreadhadh smùide (SE), a bhios a’ cleachdadh measgachadh de cheimigean agus teas gus cinneasachadh lignocellulose a lughdachadh le bhith a’ fosgladh ballachan cealla planntrais3,4. ceann-laidir stuth, 5. Tha hydrolysis enzymatic air a dhèanamh aig luchd àrd de sholaidean a’ cleachdadh einsìmean malairteach gnìomhach anns a bheil gualaisg (CAZymes) agus coipeadh meanbh-bhitheach a’ cleachdadh beirm no bacteria transgenic gus connadh agus ceimigean stèidhichte air bith-eòlas a thoirt gu buil6.
Tha CAZymes ann an einnseanan malairteach air an dèanamh suas de mheasgachadh iom-fhillte de einnseanan a bhios a’ sgoltadh ceanglaichean iom-fhillte gualaisg-siùcair gu sineirgisteach gus monosaccharides a chruthachadh2,7. Mar a dh’innis sinn roimhe, tha an lìonra iom-fhillte de phoileimearan cùbhraidh lignin le gualaisg gan dèanamh gu math do-ruigsinneach, a tha a’ leantainn gu tionndadh siùcair neo-iomlan, a’ cruinneachadh 15-25% de oligosaccharides gnè nach eil air an dèanamh rè hydrolysis enzymatic den bhith-thomas ro-làimhsichte. Tha seo na dhuilgheadas cumanta le diofar dhòighean ro-làimhseachaidh bith-thomas. Am measg cuid de na h-adhbharan airson a’ bhacadh seo tha casg enzyme rè hydrolysis, no dìth no ìrean ìosal de einnseanan riatanach riatanach a tha a dhìth gus ceanglaichean siùcair a bhriseadh ann am bith-thomas planntrais. Cuidichidh tuigse air co-dhèanamh agus feartan structarail shiùcairean, leithid na ceanglaichean siùcair ann an oligosaccharides, sinn le bhith a’ leasachadh tionndadh siùcair rè hydrolysis, a’ dèanamh phròiseasan bith-theicneòlais farpaiseach a thaobh cosgais le toraidhean a thig bho pheatroil.
Tha e dùbhlanach structar charbohydrates a dhearbhadh agus feumaidh e measgachadh de dhòighean leithid cromatagrafaidh leaghaidh (LC)11,12, speactroscopaidh ath-shonnrachaidh magnetach niùclasach (NMR)13, electrophoresis capillary (CE)14,15,16 agus speactrometry mais (MS)17. ,ochd-deug. Tha dòighean MS leithid speactrometry mais ùine-itealaich le dì-asbhadh laser agus ianachadh a’ cleachdadh maitrís (MALDI-TOF-MS) nan dòigh ioma-chruthach airson structaran charbohydrate a chomharrachadh. O chionn ghoirid, chaidh MS tandem air a bhrosnachadh le bualadh (CID) de adducts ian sodium a chleachdadh gu farsaing gus lorgan-meòir a chomharrachadh a tha a’ freagairt ri suidheachaidhean ceangail oligosaccharide, rèiteachaidhean anomeric, sreathan, agus suidheachaidhean geugachaidh 20, 21.
’S e inneal sàr-mhath a th’ ann an mion-sgrùdadh glycan airson ceanglaichean gualaisg a chomharrachadh gu domhainn22. Bidh an dòigh seo a’ cleachdadh antibodies monoclonal (mAbs) a tha ag amas air glycan balla cealla planntrais mar phrobairean gus ceanglaichean iom-fhillte gualaisg a thuigsinn. Tha còrr air 250 mAbs rim faighinn air feadh an t-saoghail, air an dealbhadh an aghaidh diofar oligosaccharides loidhneach is meurach a’ cleachdadh diofar saccharides24. Chaidh grunn mAbs a chleachdadh gu farsaing gus structar, co-dhèanamh agus atharrachaidhean balla cealla planntrais a chomharrachadh, leis gu bheil eadar-dhealachaidhean mòra ann a rèir seòrsa cealla planntrais, organ, aois, ìre leasachaidh agus àrainneachd fàis25,26. O chionn ghoirid, chaidh an dòigh seo a chleachdadh gus tuigse fhaighinn air sluagh vesicle ann an siostaman planntrais is bheathaichean agus na dreuchdan fa leth aca ann an còmhdhail glycan mar a chaidh a dhearbhadh le comharran fo-cheallach, ìrean leasachaidh no brosnachaidhean àrainneachdail, agus gus gnìomhachd enzymatic a dhearbhadh. Am measg cuid de na structaran eadar-dhealaichte de ghliceanan agus xylans a chaidh a chomharrachadh tha pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glucans ceangail measgaichte (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), searbhag glucuronic-arabinoxylan (GArbX) agus arabino-galactan (ArbG)29.
Ach, a dh’aindeoin nan oidhirpean rannsachaidh seo uile, chan eil ach beagan sgrùdaidhean air fòcas a chuir air nàdar cruinneachadh oligosaccharide rè hydrolysis luchdan solidan àrd (HSL), a’ gabhail a-steach leigeil ma sgaoil oligosaccharide, atharrachaidhean fad slabhraidh oligomeric rè hydrolysis, diofar phoileimearan DP ìosal, agus na cuairtean aca. cuairteachaidhean 30,31,32. Aig an aon àm, ged a tha mion-sgrùdadh glycan air a bhith na inneal feumail airson mion-sgrùdadh coileanta air structar glycan, tha e duilich oligosaccharides DP ìosal soluble ann an uisge a mheasadh a’ cleachdadh dhòighean antibody. Chan eil oligosaccharides DP nas lugha le cuideam moileciuil nas lugha na 5-10 kDa a’ ceangal ri pleitean ELISA 33, 34 agus thèid an nighe air falbh mus tèid antibody a chur ris.
An seo, airson a’ chiad uair, tha sinn a’ taisbeanadh deuchainn ELISA air pleitean còmhdaichte le avidin a’ cleachdadh antibodies monoclonal, a’ cothlamadh modh-obrach biotinylation aon-cheum airson oligosaccharides teasfhulangach soluble le mion-sgrùdadh glycome. Chaidh an dòigh-obrach againn airson mion-sgrùdadh glycome a dhearbhadh le MALDI-TOF-MS agus mion-sgrùdadh stèidhichte air GC-MS air ceanglaichean oligosaccharide co-phàirteach a’ cleachdadh derivatization trimethylsilyl (TMS) de cho-dhèanamh siùcair hydrolyzed. Faodar an dòigh-obrach ùr-ghnàthach seo a leasachadh mar dhòigh àrd-toraidh san àm ri teachd agus tagradh nas fharsainge fhaighinn ann an rannsachadh bith-mheidigeach35.
Bidh atharrachaidhean iar-eadar-theangachaidh air einnseanan agus antibodies, leithid glycosylation,36 a’ toirt buaidh air an gnìomhachd bhitheòlasach aca. Mar eisimpleir, tha atharrachaidhean ann an glycosylation phròtainean serum a’ cluich pàirt chudromach ann an airtreitis inflammatory, agus thathas a’ cleachdadh atharrachaidhean ann an glycosylation mar chomharran breithneachaidh37. Chaidh aithris anns an litreachas gu bheil diofar glycans a’ nochdadh gu furasta ann an grunn ghalaran, a’ gabhail a-steach galairean inflammatory cronach an t-slighe gastrointestinal agus an grùthan, galairean bhìorasach, aillsean ovarian, broilleach agus prostate38,39,40. Bheir tuigse air structar glycans a’ cleachdadh dhòighean ELISA glycan stèidhichte air antibody barrachd misneachd ann am breithneachadh galair gun a bhith a’ cleachdadh dhòighean MS iom-fhillte.
Sheall an sgrùdadh a rinn sinn roimhe nach robh oligosaccharides stòlda air an hydrolysis an dèidh ro-làimhseachaidh agus hydrolysis einsímeach (Figear 1). Anns an obair a rinn sinn roimhe, leasaich sinn dòigh às-tharraing ìre-chruaidh le gual-fhiodha gnìomhaichte gus oligosaccharides a sgaradh bho hydrolyzate stover corn ro-làimh le AFEX (ACSH)8. Às dèidh an às-tharraing agus an dealachadh tùsail, chaidh na oligosaccharides a roinn tuilleadh le cromagrafaidheachd às-dùnaidh meud (SEC) agus an cruinneachadh a rèir cuideam moileciuil. Chaidh monomers siùcair agus oligomers a chaidh a leigeil ma sgaoil bho dhiofar ro-làimhseachadh a sgrùdadh le mion-sgrùdadh co-dhèanamh siùcair. Nuair a thathar a’ dèanamh coimeas eadar susbaint oligosaccharides siùcair a fhuaireadh le diofar dhòighean ro-làimhseachaidh, tha làthaireachd oligosaccharides stòlda na dhuilgheadas cumanta ann an tionndadh bith-thomas gu monosaccharides agus faodaidh e leantainn gu lùghdachadh ann an toradh siùcair co-dhiù 10-15% agus eadhon suas ri 18%. Na SA. Tha an dòigh seo air a chleachdadh airson tuilleadh cinneasachadh mòr-sgèile de bhloighean oligosaccharide. Chaidh an ACH a thig às agus na bloighean às dèidh sin le cuideaman moileciuil eadar-dhealaichte a chleachdadh mar stuth deuchainneach airson comharrachadh oligosaccharides san obair seo.
Às dèidh ro-làimhseachaidh agus hydrolysis einsímeach, dh’fhan oligosaccharides maireannach gun hydrolysis. An seo (A) tha dòigh dealachaidh oligosaccharide anns a bheil oligosaccharides air an dealachadh bho hydrolysate stover corn ro-làimhseachaidh AFEX (ACSH) a’ cleachdadh leabaidh pacaichte de charbon gnìomhaichte agus talamh diatomaceous; (B) Modh airson dealachadh oligosaccharides. Chaidh na oligosaccharides a sgaradh tuilleadh le cromatagrafaidheachd cuir às do mheud (SEC); (C) Monomers agus oligomers saccharide air an leigeil ma sgaoil bho dhiofar ro-làimhseachadh (searbhag caolaichte: DA, leaghan ianach: IL agus AFEX). Suidheachaidhean hydrolysis einsímeach: luchd àrd de sholaidean de 25% (w/w) (timcheall air 8% de luchdachadh glucan), hydrolysis 96 uair, luchdachadh einsím malairteach 20 mg/g (co-mheas Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) agus (D) Monomers agus oligomers siùcair de ghlùcois, xylose agus arabinose air an leigeil ma sgaoil bho stover corn ro-làimhseachaidh AFEX (ACS).
Tha mion-sgrùdadh glycan air dearbhadh gu bheil e na inneal feumail airson mion-sgrùdadh structarail coileanta air glycans ann an earrannan a chaidh a sgaradh bho fhuigheall bith-thomas cruaidh. Ach, chan eil saccharides soluble ann an uisge air an riochdachadh gu leòr a’ cleachdadh an dòigh thraidiseanta seo41 leis gu bheil e duilich oligosaccharides le cuideam moileciuil ìosal a ghluasad air pleitean ELISA agus thèid an nighe a-mach mus tèid antibody a chur ris. Mar sin, airson ceangal agus comharrachadh antibody, chaidh dòigh biotinylation aon-cheum a chleachdadh gus oligosaccharides soluble, neo-cho-chòrdail a chòmhdach air pleitean ELISA còmhdaichte le avidin. Chaidh an dòigh seo a dhearbhadh a’ cleachdadh an ACSH a chaidh a thoirt a-mach roimhe agus bloigh stèidhichte air a chuideam moileciuil (no ìre polymerization, DP). Chaidh biotinylation aon-cheum a chleachdadh gus dlùth-cheangal oligosaccharide a mheudachadh le bhith a’ cur biotin-LC-hydrazide ris a’ cheann lughdachadh den charbohydrate (Figear 2). Ann am fuasgladh, bidh a’ bhuidheann hemiacetal aig a’ cheann lughdachadh ag ath-fhreagairt leis a’ bhuidheann hydrazide de biotin-LC-hydrazide gus ceangal hydrazone a chruthachadh. Ann an làthair an àidseant lughdachadh NaCNBH3, tha an ceangal hydrazone air a lughdachadh gu toradh deireannach biotinylated seasmhach. Le atharrachadh air a’ cheann lughdachaidh siùcair, dh’fhàs e comasach oligosaccharides le DP ìosal a cheangal ri pleitean ELISA, agus nar sgrùdadh chaidh seo a dhèanamh air pleitean còmhdaichte le avidin a’ cleachdadh mAbs a bha ag amas air glycan.
Sgrìonadh antibodies monoclonal stèidhichte air ELISA airson oligosaccharides biotinylated. An seo (A) biotinylation oligosaccharides agus sgrìonadh ELISA às dèidh sin le mAbs targaidte le glycan air truinnsearan còmhdaichte le NeutrAvidin agus (B) a’ sealltainn modh-obrach aon-cheum airson biotinylation de thoraidhean ath-bhualadh.
Chaidh pleitean còmhdaichte le avidin agus antibodies ceangailte ri oligosaccharide an uair sin a chur ri antibodies bun-sgoile agus àrd-sgoile agus an nighe ann am meadhan mothachail air solas agus ùine. Às deidh ceangal antibody a bhith deiseil, cuir fo-strat TMB ris gus am pleit a ghoir. Chaidh an ath-bhualadh a stad mu dheireadh le searbhag sulfarach. Chaidh na pleitean goir a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh leughadair ELISA gus neart ceangail gach antibody a dhearbhadh gus ceangal-tarsainn sònraichte do antibody a lorg. Airson mion-fhiosrachadh agus paramadairean na deuchainn, faic an earrann co-fhreagarrach “Stuthan agus Modhan”.
Tha sinn a’ sealltainn cho feumail sa tha an dòigh ùr-leasaichte seo airson cleachdaidhean sònraichte le bhith a’ comharrachadh nan oligosaccharides soluble a tha an làthair ann an ACSH a bharrachd air ann am bloighean oligosaccharide amh agus glan air an sgaradh bho hydrolysates lignocellulosic. Mar a chithear ann am Figear 3, is e na xylans epitope-substituted as cumanta a chaidh an comharrachadh ann an ACSH a’ cleachdadh dhòighean deuchainn glycome bioacylated mar as trice arabinogalactans uronic (U) no methyluronic (MeU) agus pectic. Chaidh a’ mhòr-chuid dhiubh a lorg cuideachd anns an sgrùdadh roimhe againn air mion-sgrùdadh glycans de sholaidean neo-hydrolyzed (UHS)43.
Lorg epitopes oligosaccharide ath-sheasmhach le bhith a’ cleachdadh antibody monoclonal a tha air a stiùireadh an aghaidh glycan balla cealla. Is e an co-phàirt “neodrach” an co-phàirt ACN agus is e an co-phàirt FA an co-phàirt “aigéadach”. Tha deargan nas soilleire air a’ mhapa teas a’ comharrachadh susbaint epitope nas àirde, agus tha gorman nas soilleire a’ comharrachadh cùl-raon bàn. Tha luachan dath air an sgèile stèidhichte air luachan OD amh airson foirmlean N=2. Tha na prìomh epitopes a tha air an aithneachadh leis na antibodies air an sealltainn air an taobh cheart.
Cha b’ urrainnear na structaran neo-cheallalòs seo a sgoltadh leis na ceallalasan agus na hemiceallulasan as cumanta anns a’ mheasgachadh einnsein malairteach a chaidh a dhearbhadh, a tha a’ toirt a-steach na h-einnseanan malairteach as cumanta. Mar sin, tha feum air einnseinean taice ùra airson an hydrolysis. Às aonais nan einnseinean taice neo-cheallalòs riatanach, bidh na ceanglaichean neo-cheallalòs seo a’ cur casg air tionndadh iomlan gu monosaccharides, eadhon ged a thèid na poileamairean siùcair pàrant aca a hydrolysis gu mòr ann am pìosan nas giorra agus an sgaoileadh le bhith a’ cleachdadh measgachaidhean einnsein malairteach.
Sheall tuilleadh sgrùdaidh air sgaoileadh chomharran agus a neart ceangail gu robh epitopes ceangail nas ìsle ann am bloighean siùcair àrd DP (A, B, C, DP suas gu 20+) na ann am bloighean ìosal DP (D, E, F, DP) ann an dimers) (Figear 1). Tha bloighean searbhagach nas cumanta ann an epitopes neo-cheallalòs na bloighean neodrach. Tha na h-iomadh rud seo a rèir a’ phàtrain a chaidh fhaicinn san sgrùdadh roimhe againn, far an robh DP àrd agus moieties searbhagach nas seasmhaiche ri hydrolysis enzymatic. Mar sin, faodaidh làthaireachd epitopes glycan neo-cheallalòs agus ath-chur U agus MeU cur gu mòr ri seasmhachd nan oligosaccharides. Bu chòir a thoirt fa-near gum faod èifeachdas ceangail agus lorg a bhith duilich airson oligosaccharides ìosal DP, gu sònraichte ma tha an epitope na oligosaccharide dimeric no trimeric. Faodar seo a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh oligosaccharides malairteach de dhiofar fhaid, gach fear anns nach eil ach aon epitope a cheanglas ri mAb sònraichte.
Mar sin, nochd cleachdadh antibodies sònraichte do structar seòrsachan sònraichte de cheanglaichean ath-sheasmhach. A rèir an seòrsa antibody a chaidh a chleachdadh, am pàtran ceangail iomchaidh, agus neart a’ chomharra a bhios e a’ dèanamh (as pailte agus as lugha pailt), faodar einnseanan ùra a chomharrachadh agus a chur ris a’ mheasgachadh einnsean gu leth-chainnteach airson glycoconversion nas coileanta. A’ gabhail mion-sgrùdadh oligosaccharides ACSH mar eisimpleir, is urrainn dhuinn stòr-dàta de cheanglaichean glycan a chruthachadh airson gach stuth bith-thomas. Bu chòir a thoirt fa-near an seo gum bu chòir beachdachadh air an dàimh eadar-dhealaichte aig antibodies, agus mura h-eil fios air an dàimh aca, cruthaichidh seo duilgheadasan sònraichte nuair a thathar a’ dèanamh coimeas eadar comharran diofar antibodies. A bharrachd air an sin, is dòcha gum bi coimeas eadar ceanglaichean glycan ag obair as fheàrr eadar sampallan airson an aon antibody. Faodar na ceanglaichean ath-sheasmhach sin an uairsin a cheangal ris an stòr-dàta CAZyme, às an urrainn dhuinn einnseanan a chomharrachadh, einnseanan tagraiche a thaghadh agus deuchainn a dhèanamh airson einnseanan briseadh-ceangail, no siostaman meanbh-bhitheach a leasachadh gus na h-einnseanan sin a chuir an cèill airson an cleachdadh ann am biorefineries44.
Gus measadh a dhèanamh air mar a bhios modhan imdhùnach a’ cur ri modhan eile airson oligosaccharides le cuideam moileciuil ìosal a tha an làthair ann an hydrolysates lignocellulosic a chomharrachadh, rinn sinn MALDI (Figear 4, S1-S8) agus mion-sgrùdadh air saccharides a tha stèidhichte air TMS stèidhichte air GC-MS air an aon phannal (Figear 5) den phàirt oligosaccharide. Tha MALDI air a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh a bheil sgaoileadh mais nam moileciuilean oligosaccharide a’ freagairt ris an structar a tha san amharc. Air Figear 4 chithear MS de na co-phàirtean neodrach ACN-A agus ACN-B. Dhearbh mion-sgrùdadh ACN-A raon de shiùcairean pentose bho DP 4–8 (Figear 4) gu DP 22 (Figear S1), aig a bheil cuideaman a’ freagairt ri oligosaccharides MeU-xylan. Dhearbh mion-sgrùdadh ACN-B an t-sreath pentose agus glucoxylan le DP 8-15. Ann an stuth a bharrachd leithid Figear S3, tha mapaichean sgaoilidh mais pàirt searbhagach FA-C a’ sealltainn raon de shiùcairean pentose air an cur nan àite le (Me)U le DP de 8-15 a tha a rèir nan xylans air an cur nan àite a lorgar ann an sgrìonadh mAb stèidhichte air ELISA. Tha na epitopes cunbhalach.
Speactram MALDI-MS de oligosaccharides neo-ghèillidh soluble a tha an làthair ann an ACS. An seo, (A) bloighean raon cuideam ìosal ACN-A anns a bheil searbhag uronic methylated (DP 4-8) air an cur nan àite le oligosaccharides glucuroxylan agus (B) ACN-B xylan agus oligosaccharides searbhag uronic methylated air an cur nan àite le glucuroxylan (DP 8-15).
Mion-sgrùdadh air co-dhèanamh fuigheall glycan oligosaccharides teasfhulangach. An seo (A) Co-dhèanamh saccharide TMS de dhiofar bhloighean oligosaccharide a fhuaireadh a’ cleachdadh mion-sgrùdadh GC-MS. (B) Structaran diofar shiùcairean a tha stèidhichte air TMS a tha an làthair ann an oligosaccharides. ACN – bloigh acetonitrile anns a bheil oligosaccharides neodrach agus FA – bloigh searbhag ferulic anns a bheil oligosaccharides searbhagach.
Chaidh co-dhùnadh inntinneach eile a tharraing bhon mhion-sgrùdadh LC-MS air a’ phàirt oligosaccharide, mar a chithear ann am Figear S9 (chithear na dòighean anns an stuth eileagtronaigeach a bharrachd). Chaidh pìosan de bhuidhnean hexose agus -OAc fhaicinn a-rithist is a-rithist rè ceangal a’ phàirt ACN-B. Chan e a-mhàin gu bheil an lorg seo a’ dearbhadh an sgaradh a chaidh fhaicinn ann am mion-sgrùdadh glycome agus MALDI-TOF, ach tha e cuideachd a’ toirt seachad fiosrachadh ùr mu dheidhinn toraidhean gualaisg a dh’fhaodadh a bhith ann am bith-thomas lignocellulosic ro-làimhsichte.
Rinn sinn mion-sgrùdadh cuideachd air co-dhèanamh glycan de bhloighean oligosaccharide a’ cleachdadh derivatization glycan TMS. A’ cleachdadh GC-MS, dh’ fhaigh sinn a-mach co-dhèanamh shiùcairean neoni (neo-thìreach) agus searbhagach (GluA agus GalA) anns a’ bhloigh oligosaccharide (Figear 5). Lorgar searbhag glucuronic ann an co-phàirtean searbhagach C agus D, agus lorgar searbhag galacturonic ann an co-phàirtean searbhagach A agus B, agus tha an dà chuid nan co-phàirtean DP àrd de shiùcairean searbhagach. Chan e a-mhàin gu bheil na toraidhean seo a’ dearbhadh ar dàta ELISA agus MALDI, ach tha iad cuideachd a rèir ar sgrùdaidhean roimhe air cruinneachadh oligosaccharide. Mar sin, tha sinn den bheachd gu bheil dòighean dìonach ùr-nodha a’ cleachdadh biotinylation de oligosaccharides agus sgrìonadh ELISA às dèidh sin gu leòr airson oligosaccharides soluble recalcitrant a lorg ann an diofar shamhlaichean bith-eòlasach.
Leis gu bheil grunn dhòighean eadar-dhealaichte air dearbhadh gu bheil dòighean sgrìonaidh mAb stèidhichte air ELISA air an dearbhadh, bha sinn airson tuilleadh rannsachaidh a dhèanamh air comas na dòigh-obrach ùir chainníomach seo. Chaidh dà oligosaccharide malairteach, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) agus 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), a cheannach agus a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh dòigh-obrach ùr mAb a tha ag amas air glycan balla cealla. Tha Figear 6 a’ sealltainn co-dhàimh loidhneach eadar an comharra ceangail biotinylated agus dùmhlachd log dùmhlachd oligosaccharide, a’ moladh modail adsorption Langmuir a dh’ fhaodadh a bhith ann. Am measg nan mAbs, bha CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, agus CCRC-M151 co-cheangailte ri XHE, agus bha CCRC-M108, CCRC-M109, agus LM11 co-cheangailte ri A2XX thairis air raon bho 1 nm gu 100 nano. Air sgàth cho beag ‘s a bha antibodies ri fhaighinn rè an deuchainn, chaidh deuchainnean cuibhrichte a dhèanamh le gach dùmhlachd oligosaccharide. Bu chòir a thoirt fa-near an seo gu bheil cuid de na h-antasubstaint ag ath-fhreagairt gu math eadar-dhealaichte ris an aon oligosaccharide mar shubstrait, is dòcha leis gu bheil iad a’ ceangal ri epitopes beagan eadar-dhealaichte agus gum faod ceanglaichean ceangail gu math eadar-dhealaichte a bhith aca. Bidh na dòighean-obrach agus na buaidhean a tha an lùib aithneachadh epitope ceart tòrr nas iom-fhillte nuair a thèid an dòigh-obrach mAb ùr a chur an sàs ann an sampallan fìor.
Chaidh dà oligosaccharide malairteach a chleachdadh gus raon lorg diofar mAbs a tha ag amas air glycan a dhearbhadh. An seo, tha co-dhàimhean loidhneach le dùmhlachd log de dùmhlachd oligosaccharide a’ nochdadh pàtrain adsorption Langmuir airson (A) XHE le mAb agus (B) A2XX le mAb. Tha na epitopes co-fhreagarrach a’ nochdadh structaran nan oligosaccharides malairteach a chaidh a chleachdadh mar shubstratan anns an deuchainn.
Tha cleachdadh antibodies monoclonal targaidte le glycan (mion-sgrùdadh glycocomic no sgrìonadh mAb stèidhichte air ELISA) na inneal cumhachdach airson a’ mhòr-chuid de na prìomh glycans balla cealla a tha a’ dèanamh suas bith-mhais planntrais a chomharrachadh gu domhainn. Ach, chan eil mion-sgrùdadh glycan clasaigeach a’ comharrachadh ach glycans balla cealla nas motha, leis nach eil a’ mhòr-chuid de oligosaccharides air an gluasad gu h-èifeachdach air pleitean ELISA. Anns an sgrùdadh seo, chaidh stover arbhair ro-làimhseachaidh le AFEX a hydrolyzed gu enzymatic aig susbaint àrd de sholaidean. Chaidh mion-sgrùdadh siùcair a chleachdadh gus co-dhèanamh gualaisgean balla cealla ath-sheasmhach a dhearbhadh anns an hydrolyzate. Ach, tha mion-sgrùdadh mAb air oligosaccharides nas lugha ann an hydrolysates air a mheas ro ìosal, agus tha feum air innealan a bharrachd gus oligosaccharides a dhèanamh neo-ghluasadach gu h-èifeachdach air pleitean ELISA.
Tha sinn ag aithris an seo air dòigh ùr is èifeachdach airson oligosaccharides a ghluasad airson sgrìonadh mAb le bhith a’ cothlamadh biotinylation oligosaccharide agus an uairsin sgrìonadh ELISA air pleitean còmhdaichte le NeutrAvidin™. Sheall na oligosaccharides biotinylated neo-ghluasadach dàimh gu leòr airson an antibody gus leigeil le lorg luath is èifeachdach de oligosaccharides ath-sheasmhach. Dhearbh mion-sgrùdadh air co-dhèanamh nan oligosaccharides stòlda seo stèidhichte air mais spectrometry toraidhean an dòigh-obrach ùir seo airson immunoscreation. Mar sin, tha na sgrùdaidhean seo a’ sealltainn gum faodar an cothlamadh de biotinylation oligosaccharide agus sgrìonadh ELISA le antibodies monoclonal targaidte le glycan a chleachdadh gus ceanglaichean-tarsainn a lorg ann an oligosaccharides agus gum faodar a chur an sàs gu farsaing ann an sgrùdaidhean bith-cheimiceach eile a tha a’ comharrachadh structar oligosaccharides.
’S e an dòigh phròifileadh glycan stèidhichte air biotin seo a’ chiad aithisg a tha comasach air sgrùdadh a dhèanamh air na ceanglaichean gualaisg ath-sheasmhach de oligosaccharides soluble ann am bith-thomas planntrais. Cuidichidh seo le bhith a’ tuigsinn carson a tha cuid de phàirtean de bith-thomas cho ceann-laidir nuair a thig e gu cinneasachadh bith-chonnaidh. Tha an dòigh seo a’ lìonadh beàrn cudromach ann an dòighean mion-sgrùdaidh glycome agus a’ leudachadh a cleachdadh gu raon nas fharsainge de shubstratan nas fhaide na oligosaccharides planntrais. San àm ri teachd, is dòcha gun cleachd sinn robotachd airson biotinylation agus gun cleachd sinn an dòigh a leasaich sinn airson mion-sgrùdadh àrd-toraidh de shamhlaichean a’ cleachdadh ELISA.
Chaidh connlach arbhair (CS) a chaidh fhàs bho shìol hibrid Pioneer 33A14 a bhuain ann an 2010 bho Kramer Farms ann an Ray, Colorado. Le cead bhon t-sealbhadair fearainn, faodar am bith-thomas seo a chleachdadh airson rannsachadh. Chaidh na sampallan a stòradh tioram < 6% taiseachd ann am pocannan zip-lock aig teòthachd an t-seòmair. Chaidh na sampallan a stòradh tioram < 6% taiseachd ann am pocannan zip-lock aig teòthachd an t-seòmair. Mar a gheibh thu cuidhteas an t-saighead < 6% anns a 'phacaid agus an àbhaist-mholaidh при комнатнопра темура. Chaidh sampallan a stòradh tioram aig <6% taiseachd ann am pocannan le ziparan aig teòthachd an t-seòmair.样 品 在室温下以干燥<6% 的水分储 存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Gabhail a-steach an t-suaicheantais airson an t-seòmair-beò aig an àm seo < 6%. Tha sampallan air an stòradh ann am pocannan zip aig teòthachd an t-seòmair le taiseachd < 6%.Bha an sgrùdadh a’ gèilleadh ri stiùiridhean ionadail is nàiseanta. Rinneadh mion-sgrùdadh co-dhèanamh a’ cleachdadh protocol NREL. Chaidh a lorg gu robh 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% pròtain agus 13.4% luaithre anns a’ cho-dhèanamh.
’S e measgachadh iom-fhillte de cheallalas, β-glucosidase agus Cellic® HTec2 (157 mg pròtain/ml, baidse VHN00001) bho Novozymes (Franklinton, NC, USA) a th’ ann an Cellic® CTec2 (138 mg pròtain/ml, baidse VHN00001). Chaidh Multifect Pectinase® (72 mg pròtain/mL), measgachadh iom-fhillte de einnseanan a bhios a’ lughdachadh pectin, a thoirt seachad le DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Chaidh dùmhlachd pròtain einnsein a dhearbhadh le bhith a’ measadh susbaint pròtain (agus a’ toirt air falbh tabhartas naitridean neo-phròtain) a’ cleachdadh mion-sgrùdadh naitridean Kjeldahl (dòigh AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Chaidh talamh diatomaceous 545 a cheannach bho EMD Millipore (Billerica, MA). Chaidh gual-fhiodha gnìomhaichte (DARCO, gràinneagan 100 mogaill), Avicel (PH-101), xylan faidhbhile, agus a h-uile ceimigean eile a cheannach bho Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Chaidh ro-làimhseachadh AFEX a dhèanamh aig GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Chaidh an ro-làimhseachadh a dhèanamh aig 140°C airson 15 mionaidean. Ùine-còmhnaidh 46 aig co-mheas 1:1 de ammonia gun uisge ri bith-mhais aig luchdachadh 60% (w/w) ann an reactar baidse benchtop stàilinn gun smal (Parr Instruments Company). Thug e 30 mionaidean. Chaidh an reactar a thoirt gu 140°C agus chaidh an ammonia a leigeil ma sgaoil gu luath, a’ leigeil leis a’ bith-mhais tilleadh gu teòthachd an t-seòmair gu luath. Bha co-dhèanamh stover arbhair ro-làimhsichte AFEX (ACS) coltach ri co-dhèanamh stover arbhair gun làimhseachadh (UT-CS).
Chaidh ACSH 25% (w/w) àrd-shòlaid (timcheall air 8% de luchd dextran) ullachadh mar stuth tòiseachaidh airson cinneasachadh oligosaccharides air sgèile mhòr. Chaidh hiodrolysis einsímach de ACS a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh measgachadh einsímach malairteach a’ toirt a-steach Cellic® Ctec2 10 mg pròtain/g glucan (ann am bith-thomas ro-làimhsichte), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg pròtain/g glucan, agus Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg pròtain/g dextran. Chaidh hiodrolysis einsímach a dhèanamh ann am bioreactor 5-liotair le meud-obrach de 3 liotair, pH 4.8, 50°C agus 250 rpm. Às dèidh hiodrolysis airson 96 uairean, chaidh an hiodrolysate a chruinneachadh le bhith ga shnìomh-chriathradh aig 6000 rpm airson 30 mionaid agus an uairsin aig 14000 rpm airson 30 mionaid gus solidan gun hiodrolysis a thoirt air falbh. Chaidh an hydrolyzate an uair sin a chur fo shìoladh sterile tro bhèicear sìoltachain 0.22 mm. Chaidh an hydrolyzate sìolaichte a stòradh ann am botail sterile aig 4° C. agus an uair sin a roinneadh air carbon.
Mion-sgrùdadh air co-dhèanamh shampaill bith-thomas stèidhichte air earrann a rèir modhan-obrach mion-sgrùdaidh obair-lann NREL: ullachadh shampaill airson mion-sgrùdadh co-dhèanamh (NREL/TP-510-42620) agus dearbhadh charbohydrates structarail agus lignin ann am bith-thomas (NREL/TP-510 – 42618)47.
Rinneadh mion-sgrùdadh oligosaccharide air an t-sruth hydrolyzate air sgèile 2 ml a’ cleachdadh dòigh hydrolysis searbhagach stèidhichte air autoclave. Measgaich an sampall hydrolyzate le 69.7 µl de 72% searbhag sulfarach ann an tiùb cultar le caip sgriubha 10 ml agus goir airson 1 uair a thìde air bòrd-obrach aig 121 °C, fuaraich air deigh agus sìolaich a-steach do fhial cromagrafaidheachd lionn àrd-choileanaidh (HPLC). Chaidh dùmhlachd nan oligosaccharides a dhearbhadh le bhith a’ toirt air falbh dùmhlachd nam monosaccharides anns an sampall neo-hydrolyzed bhon dùmhlachd siùcair iomlan anns an sampall hydrolyzed le searbhag.
Chaidh dùmhlachdan glùcois, xylose, agus arabinose anns a’ bhith-thomas air a h-hydrolysachadh le searbhag a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh siostam HPLC Shimadzu uidheamaichte le samplair fèin-ghluasadach, teasadair colbh, pumpa isocratach, agus lorgaire clàr-amais ath-tharraingeach air colbh Bio-Rad Aminex HPX-87H. Chaidh an colbh a chumail aig 50°C agus a dh’fhuasgladh le 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ann an uisge. sruthadh.
Chaidh an t-supernatant hydrolyzate a lagachadh agus a sgrùdadh airson susbaint monomer agus oligosaccharide. Chaidh siùcaran monomeric a fhuaireadh às dèidh hydrolysis enzymatic a sgrùdadh le HPLC uidheamaichte le colbh Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P agus colbh dìon luaithre. Chaidh teòthachd a’ cholbh a chumail aig 80°C, chaidh uisge a chleachdadh mar an ìre gluasadach le ìre sruthadh de 0.6 ml/min. Chaidh oligosaccharides a dhearbhadh le hydrolysis ann an searbhag caolaichte aig 121°C a rèir nan dòighean a tha air am mìneachadh ann an refs. 41, 48, 49.
Rinneadh mion-sgrùdadh saccharide air fuigheall bith-thomas amh, air a làimhseachadh ro-làimh le AFEX agus air a h-uile fuigheall neo-hydrolysis (a’ gabhail a-steach cinneasachadh earrannan balla cealla sreathach agus an sgrìonadh mAb) a’ cleachdadh modhan-obrach a chaidh a mhìneachadh roimhe 27, 43, 50, 51. Airson mion-sgrùdadh glùcoma, thathar ag ullachadh fuigheall neo-sholubhail ann an deoch-làidir de stuth balla cealla planntrais bho fhuigheall bith-thomas agus gan cur fo às-tharraing sreathach le ath-bheachdan a tha a’ sìor fhàs ionnsaigheach leithid ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM agus 0.5% w/v), CON. (1M agus 4M, an dà chuid le 1% w/v sodium borohydride) agus clorite searbhagach mar a chaidh a mhìneachadh roimhe 52,53. An uairsin chaidh na h-earrannan a chur fo ELISA an aghaidh pannal iom-fhillte de mAb50an a chaidh a stiùireadh chun glycan balla cealla, agus chaidh na h-ath-bheachdan ceangail mAb a thaisbeanadh mar mhapa teas. Chaidh mAbs a bha ag amas air glycan balla cealla planntrais a cheannach bho stocan obair-lann (sreath CCRC, JIM agus MAC).
Bith-thinileachadh aon-cheum de oligosaccharides. Chaidh ceangal charbohydrates le biotin-LC-hydrazide a dhèanamh a’ cleachdadh an dòigh-obrach a leanas. Chaidh biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) a sgaoileadh ann an dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) le bhith ga mheasgachadh gu làidir agus ga theasachadh aig 65° C. airson 1 mionaid. Chaidh searbhag aiseatach reòthte (30 µl) a chur ris agus chaidh am measgachadh a dhòrtadh air sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) agus chaidh a sgaoileadh gu tur às deidh a theasachadh aig 65° C. airson timcheall air 1 mionaid. An uairsin, chaidh bho 5 gu 8 μl den mheasgachadh ath-bhualadh a chur ris an oligosaccharide tioram (1-100 nmol) gus cus molar 10-fhillte no barrachd den leubail fhaighinn thairis air a’ cheann lughdachadh. Chaidh an ath-bhualadh a dhèanamh aig 65°C airson 2 uair a thìde, agus às deidh sin chaidh na sampallan a ghlanadh sa bhad. Cha deach sodium cyanoborohydride a chleachdadh anns na deuchainnean lipéadaidh gun lughdachadh, agus chaidh na sampallan ath-bhualadh aig 65° C. airson 2.5 uair a thìde.
Còmhdach ELISA agus nighe shampaill de oligosaccharides biotinylated. Chaidh 25 μl de shampaill biotinylated (100 μl de gach sampall dùmhail air a lagachadh ann an 5 ml de fhuasgladh bufair Tris 0.1 M (TBS)) a chur ri gach tobar den phlàta còmhdaichte le avidin. Chaidh tobraichean smachd a chòmhdach le 50 μl de biotin aig dùmhlachd de 10 μg/ml ann an 0.1 M TBS. Chaidh uisge dì-ionichte a chleachdadh mar chòmhdach airson tomhais bàn. Chaidh an clàr a ghoir airson 2 uair a thìde aig teòthachd an t-seòmair anns an dorchadas. Nigh am plàta 3 tursan le bainne sgimichte 0.1% ann an 0.1 M TBS a’ cleachdadh prògram àireamh 11 airson Grenier flat 3A.
Cur ris agus nighe nan antibodies bun-sgoile. Cuir 40 µl de antibodie bun-sgoile ri gach tobar. Goir am microphlàta airson 1 uair a thìde aig teòthachd an t-seòmair anns an dorchadas. An uairsin chaidh na pleitean a nighe 3 tursan le 0.1% bainne ann an 0.1M TBS a’ cleachdadh prògram nighe #11 airson Grenier Flat 3A.
Cuir antibody àrd-sgoile ris agus nigh e. Cuir 50 µl de antibody àrd-sgoile luchag/radain (air a lagachadh 1:5000 ann am bainne 0.1% ann an 0.1 M TBS) ri gach tobar. Goir am microphlàta airson 1 uair a thìde aig teòthachd an t-seòmair anns an dorchadas. An uairsin chaidh na microphlàtaichean a nighe 5 tursan le bainne 0.1% ann an 0.1 M TBS a’ cleachdadh prògram nighe phlàta Grenier Flat 5A #12.
A’ cur fo-strat ris. Cuir 50 µl de 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ris an fho-strat bunaiteach (le bhith a’ cur 2 dhiog de bufair, 3 dhiogan de TMB, 2 dhiog de haidridean piorocsaid ri 15 ml de dh’uisge dì-ionichte). Ullaich an fo-strat TMB agus cuir ann am vortex e mus tèid a chleachdadh). Goir am microphlàta aig teòthachd an t-seòmair airson 30 mionaid. Anns an dorchadas.
Crìochnaich an ceum agus leugh an clàr. Cuir 50 µl de 1 N searbhag sulfarach ri gach tobar agus clàraich an absorbance bho 450 gu 655 nm a’ cleachdadh leughadair ELISA.
Ullaich fuasglaidhean 1 mg/ml de na stuthan anailisichte seo ann an uisge dì-ionichte: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, searbhag galacturonic (GalA), searbhag glucuronic (GlcA), mannose, glùcos, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine (glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (inbhe a-staigh). Chaidh dà inbhe ullachadh le bhith a’ cur ris na fuasglaidhean siùcair 1 mg/mL a chithear ann an Clàr 1. Tha na sampallan air an reothadh agus air an liofileachadh aig -80° C. gus an tèid an t-uisge gu lèir a thoirt air falbh (mar as trice timcheall air 12-18 uairean).
Cuir 100–500 µg den shampall ri tiùban le caip sgriubha air cothromachadh anailis. Clàraich an ìre a chaidh a chur ris. ’S fheàrr an sampall a sgaoileadh ann an dùmhlachd sònraichte de fhuasglaiche agus a chur ris an tiùb mar aliquot leaghaidh. Cleachd 20 µl de 1 mg/ml inositol mar inbhe a-staigh airson gach tiùb sampall. Feumaidh an ìre de inbhe a-staigh a thèid a chur ris an sampall a bhith co-ionann ris an ìre de inbhe a-staigh a chaidh a chur ris an tiùb inbhe.
Cuir 8 ml de methanol gun uisge ri fial le caip sgriubha. An uairsin 4 ml de fhuasgladh HCl methanol 3 N, cuir caip air agus crathadh e. Chan eil uisge ga chleachdadh leis a’ phròiseas seo.
Cuir 500 µl de fhuasgladh methanol 1 M HCl ris na sampallan oligosaccharide agus na tiùban TMS àbhaisteach. Chaidh na sampallan a ghoir thar oidhche (168 uair) aig 80° C. ann am bloc teirmeach. Tiormaich an toradh methanolis aig teòthachd an t-seòmair a’ cleachdadh iomadachd tiormachaidh. Cuir 200 µl MeOH ris agus tiormaich a-rithist. Tha am pròiseas seo air ath-aithris dà uair. Cuir 200 µl de methanol, 100 µl de pyridine agus 100 µl de acetic anhydride ris an sampall agus measgaich gu math. Goir na sampallan aig teòthachd an t-seòmair airson 30 mionaid agus tiormaich iad. Cuir 200 µl de methanol ris agus tiormaich a-rithist.
Cuir 200 µl de Tri-Sil ris agus teas an tiùb le caip airson 20 mionaid. 80°C, an uairsin fuaraich gu teòthachd an t-seòmair. Cleachd iomadachd tiormachaidh gus an sampall a thiormachadh tuilleadh gu meud de mu 50 µl. Tha e cudromach a thoirt fa-near nach do leig sinn leis na sampallan tiormachadh gu tur.
Cuir 2 ml de heacsan ris agus measgaich gu math le bhith ga mheasgachadh le vortex. Lìon bàrr phìoban Pasteur (5-8 mm) le pìos clòimhe glainne le bhith ga chur air mullach pìoba le trast-thomhas de 5-3/4 òirleach. Chaidh na sampallan a chuir ann an centrifuge aig 3000 g airson 2 mhionaid. Tha fuigheall sam bith nach gabh a leagail air a dhòrtadh a-mach. Tiormaich an sampall gu 100-150 µl. Chaidh tomhas-lìonaidh de mu 1 μl a stealladh a-steach don GC-MS aig teòthachd tòiseachaidh de 80 °C agus ùine tòiseachaidh de 2.0 mionaidean (Clàr 2).