Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, mostraremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
A morfoxénese intestinal humana establece características criptóvilosas da microarquitectura epitelial 3D e da organización espacial. Esta estrutura única é necesaria para manter a homeostase intestinal ao protexer o nicho de células nai na cripta basal dos antíxenos microbianos exóxenos e os seus metabolitos. Ademais, as vellosidades intestinais e o moco secretor presentan células epiteliais funcionalmente diferenciadas cunha barreira protectora na superficie da mucosa intestinal. Polo tanto, a recreación de estruturas epiteliais 3D é crucial para a construción de modelos intestinais in vitro. En particular, o intestino nun chip mimético orgánico pode inducir a morfoxénese 3D espontánea do epitelio intestinal con funcións fisiolóxicas e biomecánica melloradas. Aquí, proporcionamos un protocolo reproducible para inducir de forma robusta a morfoxénese intestinal no intestino nun chip microfluídico, así como nun chip híbrido integrado en Transwell. Describimos métodos detallados para a fabricación de dispositivos, o cultivo de células epiteliais organoides ou Caco-2 intestinais en entornos convencionais, así como nunha plataforma microfluídica, a indución da morfoxénese 3D e a caracterización de epitelios 3D establecidos. empregando múltiples modalidades de imaxe. Este protocolo consegue a rexeneración da microarquitectura intestinal funcional controlando o fluxo de fluído basolateral durante 5 días. O noso método de morfoxénese in vitro emprega tensión de cizallamento fisioloxicamente relevante e movemento mecánico e non require enxeñaría ou manipulación celular complexa, o que pode superar outras técnicas existentes. Imaxinamos que o noso protocolo proposto podería ter amplas implicacións para a comunidade de investigación biomédica, proporcionando un método para rexenerar capas epiteliais intestinais 3D in vitro para aplicacións biomédicas, clínicas e farmacéuticas.
Os experimentos demostran que as células epiteliais intestinais Caco-2 cultivadas en dispositivos microfluídicos bicapa ou intestino nun chip1,2,3,4,5 poden sufrir morfoxénese 3D espontánea in vitro sen unha comprensión clara do mecanismo subxacente. No noso estudo recente, descubrimos que a eliminación dos antagonistas de morfóxenos segregados basolateralmente dos dispositivos de cultivo é necesaria e suficiente para inducir a morfoxénese epitelial 3D in vitro, o que foi demostrado por Caco-2 e organoides intestinais derivados de pacientes. Validáronse células epiteliais. Neste estudo, centrámonos especificamente na produción celular e na distribución da concentración dun potente antagonista de Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), en dispositivos microfluídicos modificados e de intestino nun chip que conteñen insercións Transwell, denominados "chip híbrido". Demostramos que a adición de antagonistas exóxenos de Wnt (como DKK-1, represor de Wnt 1, proteína relacionada co frizzled secretada 1 ou Soggy-1) ao intestino no chip inhibe a morfoxénese ou interrompe a capa epitelial 3D preestruturada, o que suxire que o estrés antagonista durante o cultivo é responsable da morfoxénese intestinal in vitro. Polo tanto, unha estratexia práctica para lograr unha morfoxénese robusta na interface epitelial é eliminar ou manter minimamente os niveis de antagonistas de Wnt no compartimento basolateral mediante un lavado activo (por exemplo, en plataformas de intestino nun chip ou híbridas nun chip) ou difusión en medios basolaterais (por exemplo, de insercións Transwell a grandes reservorios basolaterais en pozos).
Neste protocolo, proporcionamos un método detallado para fabricar microdispositivos intestino-en-un-chip e chips híbridos inseribles con Transwell (pasos 1-5) para cultivar células epiteliais intestinais en membranas porosas baseadas en polidimetilsiloxano (PDMS) (pasos 6A, 7A, 8, 9) ou membranas de poliéster de insercións Transwell (pasos 6B, 7B, 8, 9) e inducir a morfoxénese 3D in vitro (paso 10). Tamén identificamos características celulares e moleculares indicativas de histoxénese específica de tecido e diferenciación celular dependente de liñaxe aplicando múltiples modalidades de imaxe (pasos 11-24). Inducimos a morfoxénese utilizando células epiteliais intestinais humanas, como Caco-2 ou organoides intestinais, en dous formatos de cultivo con detalles técnicos que inclúen a modificación da superficie de membranas porosas, a creación de monocapas 2D e a bioquímica intestinal e a reprodución do microambiente biomecánico in vitro. Para inducir a morfoxénese 3D a partir de monocapas epiteliais 2D, eliminamos antagonistas de morfóxenos en ambos os cultivos. fórmase ao facer fluír o medio cara ao compartimento basolateral do cultivo. Finalmente, proporcionamos unha representación da utilidade dunha capa epitelial 3D rexenerable que se pode usar para modelar o crecemento epitelial dependente de morfoxenos, cocultivos lonxitudinais hóspede-microbioma, infección por patóxenos, lesións inflamatorias, disfunción da barreira epitelial e terapias baseadas en probióticos. Exemplo de influencias.
O noso protocolo pode ser útil para unha ampla gama de científicos en investigación básica (por exemplo, bioloxía da mucosa intestinal, bioloxía das células nai e bioloxía do desenvolvemento) e aplicada (por exemplo, probas preclínicas de fármacos, modelaxe de enfermidades, enxeñaría de tecidos e gastroenteroloxía) de amplo impacto. Debido á reproducibilidade e robustez do noso protocolo para inducir a morfoxénese 3D do epitelio intestinal in vitro, prevemos que a nosa estratexia técnica poida difundirse a audiencias que estudan a dinámica da sinalización celular durante o desenvolvemento intestinal, a rexeneración ou a homeostase. Ademais, o noso protocolo é útil para interrogar a infección baixo varios axentes infecciosos como o norovirus 8, o coronavirus da síndrome respiratoria aguda grave 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ou Vibrio cholerae. Tamén son útiles os públicos especializados en patoloxía e patoxénese de enfermidades. O uso dun sistema de microfisioloxía intestinal en chip pode permitir o cocultivo lonxitudinal 10 e a posterior avaliación da defensa do hóspede, as respostas inmunitarias e a reparación de lesións relacionadas con patóxenos no tracto gastrointestinal (GI) 11. Outros trastornos GI asociados coa síndrome do intestino permeable, a enfermidade celíaca, a enfermidade de Crohn, a colite ulcerosa, a pouquite ou a síndrome do intestino irritable pódense simular cando se preparan capas epiteliais intestinais en 3D utilizando as capas epiteliais intestinais en 3D do paciente, estas enfermidades inclúen atrofia das vellosidades, acurtamento das criptas, dano da mucosa ou barreira epitelial deteriorada. Biopsia ou organoides intestinais derivados de células nai 12,13. Para modelar mellor a maior complexidade do ambiente da enfermidade, os lectores poden considerar engadir tipos de células relevantes para a enfermidade, como as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) do paciente, a modelos que conteñen microarquitecturas 3D de vellosidades-criptas intestinais. células inmunitarias específicas de tecido, 5.
Dado que a microestrutura epitelial 3D pódese fixar e visualizar sen o proceso de seccionamento, os observadores que traballan en transcriptómica espacial e imaxes de alta ou superresolución poden estar interesados ​​no noso mapeo da dinámica espaciotemporal de xenes e proteínas en nichos epiteliais. Interesado na tecnoloxía. Resposta a estímulos microbianos ou inmunitarios. Ademais, a interferencia lonxitudinal entre o hóspede e o microbioma 10, 14 que coordina a homeostase intestinal pódese establecer na capa mucosa intestinal 3D mediante o cocultivo de varias especies microbianas, comunidades microbianas ou microbiota fecal, especialmente no intestino nun chip. na plataforma. Esta abordaxe é particularmente atractiva para o público que estuda inmunoloxía mucosa, gastroenteroloxía, microbioma humano, culturómica e microbioloxía clínica que busca cultivar microbiota intestinal previamente non cultivada no laboratorio. Se o noso protocolo de morfoxénese in vitro pode adaptarse a formatos de cultivo escalables, como insercións multipozo en placas de 24, 96 ou 384 pozos que reabastecen continuamente os compartimentos basolaterais, o protocolo tamén pode difundirse a aqueles que desenvolven plataformas farmacéuticas, biomédicas ou de cribado ou validación de alto rendemento para a industria alimentaria. Como proba de principio, recentemente demostramos a viabilidade dun sistema de morfoxénese multiplex de alto rendemento escalable a un formato de placa de 24 pozos. Ademais, comercializáronse varios produtos de órgano nun chip16,17,18. Polo tanto, a validación do noso método de morfoxénese in vitro pode ser acelerada e potencialmente adoptada por moitos laboratorios de investigación, industria ou axencias gobernamentais e reguladoras para comprender a reprogramación celular da morfoxénese intestinal in vitro a nivel transcriptómico para probar fármacos ou Bioterapéuticas A absorción e o transporte de candidatos a fármacos avaliáronse empregando substitutos intestinais en 3D ou modelos de órganos nun chip personalizados ou comerciais para avaliar a reproducibilidade do proceso de morfoxénese intestinal.
Empregouse un número limitado de modelos experimentais relevantes para os humanos para estudar a morfoxénese epitelial intestinal, principalmente debido á falta de protocolos implementables para inducir a morfoxénese 3D in vitro. De feito, gran parte do coñecemento actual sobre a morfoxénese intestinal baséase en estudos con animais (por exemplo, peixe cebra20, ratos21 ou polos22). Non obstante, requiren moito traballo e custo, poden ser eticamente cuestionables e, o máis importante, non determinan con precisión os procesos de desenvolvemento humano. Estes modelos tamén son moi limitados na súa capacidade para ser probados dun xeito escalable de varias vías. Polo tanto, o noso protocolo para rexenerar estruturas de tecidos 3D in vitro supera os modelos animais in vivo, así como outros modelos tradicionais de cultivo celular 2D estáticos. Como se describiu anteriormente, a utilización de estruturas epiteliais 3D permitiunos examinar a localización espacial das células diferenciadas no eixe cripta-vilosidade en resposta a diversos estímulos mucosos ou inmunitarios. As capas epiteliais 3D poden proporcionar un espazo para estudar como as células microbianas compiten para formar nichos espaciais e a evolución ecolóxica en resposta a factores do hóspede (por exemplo, capas de moco internas fronte a externas, secreción de IgA e péptidos antimicrobianos). Ademais, a morfoloxía epitelial 3D pode permitirnos comprender como a microbiota intestinal estrutura as súas comunidades e produce sinerxicamente metabolitos microbianos (por exemplo, ácidos graxos de cadea curta) que configuran a organización celular e os nichos de células nai nas criptas basais. Estas características só se poden demostrar cando se establecen capas epiteliais 3D in vitro.
Ademais do noso método para crear estruturas epiteliais intestinais en 3D, existen varios métodos in vitro. O cultivo de organoides intestinal é unha técnica de enxeñaría de tecidos de última xeración baseada no cultivo de células nai intestinais en condicións morfoxénicas específicas23,24,25. Non obstante, o uso de modelos de organoides en 3D para a análise do transporte ou os cocultivos hóspede-microbioma adoita ser un reto porque o lumen intestinal está encerrado dentro do organoide e, polo tanto, a introdución de compoñentes luminais como células microbianas ou antíxenos exóxenos é limitada. O acceso aos lumens de organoides pódese mellorar mediante un microinxector,26,27 pero este método é invasivo e laborioso e require coñecementos especializados para a súa realización. Ademais, os cultivos de organoides tradicionais mantidos en andamios de hidrogel en condicións estáticas non reflicten con precisión a biomecánica activa in vivo.
Outros enfoques empregados por varios grupos de investigación utilizan andamios de hidrogel 3D preestruturados para imitar a estrutura do epitelio intestinal cultivando células intestinais humanas illadas na superficie do xel. Fabricar andamios de hidrogel usando moldes impresos en 3D, microfresados ​​ou fabricados litograficamente. Este método mostra a disposición autoorganizada de células epiteliais illadas in vitro con gradientes de morfoxeno fisioloxicamente relevantes, establecendo unha estrutura epitelial de alta relación de aspecto e interferencia estroma-epitelio ao incluír células estromais no andamios. Non obstante, a natureza dos andamios preestruturados pode impedir a visualización do propio proceso morfoxenético espontáneo. Estes modelos tampouco proporcionan fluxo luminal ou intersticial dinámico, carecendo da tensión de cizallamento do fluído que as células intestinais necesitan para sufrir morfoxénese e obter función fisiolóxica. Outro estudo recente utilizou andamios de hidrogel nunha plataforma microfluídica e estruturas epiteliais intestinais modeladas usando técnicas de gravado láser. Os organoides intestinais de rato seguen patróns gravados para formar estruturas tubulares intestinais, e o fluxo de fluído intraluminal pódese recapitular usando un módulo de microfluídica. Non obstante, este modelo nin... exhibe procesos morfoxenéticos espontáneos nin inclúe movementos mecanobiolóxicos intestinais. As técnicas de impresión 3D do mesmo grupo puideron crear tubos intestinais en miniatura con procesos morfoxenéticos espontáneos. A pesar da complexa fabricación de diferentes segmentos intestinais dentro do tubo, este modelo tamén carece de fluxo de fluído luminal e deformación mecánica. Ademais, a operabilidade do modelo pode ser limitada, especialmente despois de que se complete o proceso de bioimpresión, perturbando as condicións experimentais ou as interaccións célula a célula. En cambio, o noso protocolo proposto proporciona morfoxénese intestinal espontánea, tensión de cizallamento fisioloxicamente relevante, biomecánica que imita a motilidade intestinal, accesibilidade a compartimentos apicais e basolaterais independentes e recreación de microambientes biolóxicos complexos de modularidade. Polo tanto, o noso protocolo de morfoxénese 3D in vitro pode proporcionar unha abordaxe complementaria para superar os desafíos dos métodos existentes.
O noso protocolo céntrase integramente na morfoxénese epitelial 3D, só con células epiteliais en cultivo e sen outros tipos de células circundantes, como células mesenquimais, células endoteliais e células inmunitarias. Como se describiu anteriormente, o núcleo do noso protocolo é a indución da morfoxénese epitelial mediante a eliminación dos inhibidores de morfóxenos segregados no lado basolateral do medio introducido. Aínda que a robusta modularidade do noso intestino nun chip e híbrido nun chip nos permite recrear a capa epitelial 3D ondulante, aínda hai que ter en conta complexidades biolóxicas adicionais, como as interaccións epitelio-mesenquimais33,34, a deposición da matriz extracelular (MEC)35 e, no noso modelo, as características das criptas e vellosidades que transmiten nichos de células nai nas criptas basais. As células estromais (por exemplo, os fibroblastos) do mesénquima desempeñan un papel fundamental na produción de proteínas da MEC e na regulación da morfoxénese intestinal in vivo35,37,38. A adición de células mesenquimais ao noso modelo mellorou o proceso morfoxenético. e a eficiencia da adhesión celular. A capa endotelial (é dicir, capilares ou linfáticos) xoga un papel importante na regulación do transporte molecular39 e no recrutamento de células inmunitarias40 no microambiente intestinal. Ademais, os compoñentes vasculares que se poden conectar entre modelos de tecidos son un requisito previo cando se deseñan modelos de tecidos para demostrar interaccións multiorgánicas. Polo tanto, pode ser necesario incluír células endoteliais para modelar características fisiolóxicas máis precisas con resolución a nivel de órgano. As células inmunitarias derivadas de pacientes tamén son esenciais para mostrar respostas inmunitarias innatas, presentación de antíxenos, interferencia inmunitaria adaptativa innata e inmunidade específica de tecidos no contexto da imitación de enfermidades intestinais.
O uso de chips híbridos é máis sinxelo que o de intestino nun chip porque a configuración do dispositivo é máis sinxela e o uso de insercións Transwell permite un cultivo escalable do epitelio intestinal. Non obstante, as insercións Transwell dispoñibles comercialmente con membranas de poliéster non son elásticas e non poden simular movementos peristálticos. Ademais, o compartimento apical da inserción Transwell colocada no chip híbrido permaneceu estacionario sen tensión de cizallamento no lado apical. Claramente, as propiedades estáticas no compartimento apical raramente permiten o cocultivo bacteriano a longo prazo en chips híbridos. Aínda que podemos inducir de forma robusta a morfoxénese 3D en insercións Transwell cando usamos chips híbridos, a escaseza de biomecánica fisioloxicamente relevante e fluxo de fluído apical pode limitar a viabilidade das plataformas de chips híbridos para aplicacións potenciais.
As reconstrucións a escala completa do eixe cripta-vilosidade humana en cultivos intestino-chip e híbrido-chip non se estableceron completamente. Dado que a morfoxénese comeza a partir dunha monocapa epitelial, as microarquitecturas 3D non proporcionan necesariamente semellanza morfolóxica coas criptas in vivo. Aínda que caracterizamos a poboación celular proliferante preto do dominio das criptas basais no epitelio 3D microenxeñado, as rexións das criptas e das vilosidades non estaban claramente demarcadas. Aínda que os canais superiores máis altos no chip provocan un aumento da altura do epitelio microenxeñado, a altura máxima aínda está limitada a ~300–400 µm. A profundidade real das criptas intestinais humanas no intestino delgado e groso é de ~135 µm e ~400 µm, respectivamente, e a altura das vilosidades do intestino delgado é de ~600 µm41.
Desde o punto de vista da imaxe, a obtención de imaxes de superresolución in situ de microarquitecturas 3D pode estar limitada ao intestino nun chip, xa que a distancia de traballo requirida desde a lente do obxectivo ata a capa epitelial é da orde duns poucos milímetros. Para superar este problema, pode ser necesario un obxectivo distante. Ademais, a realización de seccións finas para a preparación de mostras para obter imaxes é un reto debido á alta elasticidade do PDMS. Ademais, dado que a microfabricación capa por capa do intestino nun chip implica unha adhesión permanente entre cada capa, é extremadamente difícil abrir ou retirar a capa superior para examinar a estrutura superficial da capa epitelial. Por exemplo, mediante o uso dun microscopio electrónico de varrido (SEM).
A hidrofobicidade do PDMS foi un factor limitante nos estudos baseados en microfluídica que tratan con pequenas moléculas hidrofóbicas, xa que o PDMS pode adsorber de forma non específica ditas moléculas hidrofóbicas. Pódense considerar alternativas ao PDMS con outros materiais poliméricos. Alternativamente, pódese considerar a modificación da superficie do PDMS (por exemplo, revestimento con materiais lipofílicos 42 ou poli(etilenglicol) 43) para minimizar a adsorción de moléculas hidrofóbicas.
Finalmente, o noso método non se caracterizou ben en termos de proporcionar unha plataforma experimental de cribado de alto rendemento ou "talla única" fácil de usar. O protocolo actual require unha bomba de xiringa por microdispositivo, o que ocupa espazo nunha incubadora de CO2 e impide experimentos a grande escala. Esta limitación pódese mellorar significativamente mediante a escalabilidade de formatos de cultivo innovadores (por exemplo, insercións porosas de 24, 96 ou 384 pozos que permiten a reposición e eliminación continuas de medios basolaterais).
Para inducir a morfoxénese 3D do epitelio intestinal humano in vitro, empregamos un dispositivo intestinal con chip microfluídico que contén dous microcanais paralelos e unha membrana porosa elástica entre eles para crear unha interface lumen-capilar. Tamén demostramos o uso dun dispositivo microfluídico dun só canal (un chip híbrido) que proporciona fluxo basolateral continuo debaixo de capas epiteliais polarizadas cultivadas en insercións Transwell. En ambas as plataformas, pódese demostrar a morfoxénese de varias células epiteliais intestinais humanas aplicando a manipulación direccional do fluxo para eliminar os antagonistas do morfóxeno do compartimento basolateral. Todo o procedemento experimental (Figura 1) consta de cinco partes: (i) microfabricación do chip intestinal ou do chip híbrido inserible Transwell (pasos 1-5; Cadro 1), (ii) preparación de células epiteliais intestinais (células Caco-2) ou organoides intestinais humanos; caixas 2-5), (iii) cultivo de células epiteliais intestinais en chips intestinais ou chips híbridos (pasos 6-9), (iv) indución da morfoxénese 3D in vitro (paso 10) e (v)) para caracterizar a microestrutura epitelial 3D (pasos 11-24). Finalmente, deseñouse un grupo de control axeitado (que se analiza con máis detalle máis adiante) para validar a eficacia da morfoxénese in vitro comparando a morfoxénese epitelial con controis espaciais, temporais, condicionais ou procedimentais.
Empregamos dúas plataformas de cultivo diferentes: intestino nun chip con canles rectas ou canles contorsionadas non lineais, ou chips híbridos que conteñen insercións Transwell (TW) nun dispositivo microfluídico, fabricado como se describe no cadro 1, e os pasos 1-5. "Fabricación de dispositivos" mostra os pasos principais para fabricar un só chip ou un chip híbrido. "Cultivo de células epiteliais intestinais humanas" explica a fonte celular (Caco-2 ou organoides intestinais humanos) e o procedemento de cultivo empregado neste protocolo. "Morfoxénese in vitro" mostra os pasos xerais nos que as células epiteliais derivadas de Caco-2 ou organoides se cultivan nun chip intestinal ou en insercións Transwell dun chip híbrido, seguido da indución da morfoxénese 3D e a formación dunha estrutura epitelial caracterizada. O número de paso do programa ou o número de cadro móstrase debaixo de cada frecha. A aplicación proporciona exemplos de como se poden usar as capas epiteliais intestinais establecidas, por exemplo, na caracterización da diferenciación celular, estudos de fisioloxía intestinal, establecemento de ecosistemas hóspede-microbioma e modelado de enfermidades. Imaxes de inmunofluorescencia en "Cell "Diferenciación" que mostra núcleos, actina F e MUC2 expresados ​​na capa epitelial 3D de Caco-2 xerada no chip intestinal. A sinalización MUC2 está presente nas células caliciformes e no moco segregado polas superficies mucosas. As imaxes fluorescentes en Fisioloxía Intestinal mostran moco producido por tinguidura de ácido siálico e residuos de N-acetilglicosamina usando aglutinina fluorescente de xerme de trigo. As dúas imaxes superpostas en "Cocultivos hóspede-microbio" mostran cocultivos representativos de microbioma hóspede no intestino nun chip. O panel esquerdo mostra o cocultivo de E. coli que expresa proteína verde fluorescente (GFP) con células epiteliais 3D de Caco-2 microenxeñería. O panel dereito mostra a localización da GFP de E. coli cocultivada con células epiteliais 3D de Caco-2, seguida de tinguidura de inmunofluorescencia con actina F (vermello) e núcleos (azul). A modelización de enfermidades ilustra o intestino san fronte ao permeable en chips de inflamación intestinal baixo desafío fisiolóxico con antíxenos bacterianos (por exemplo, lipopolisacárido, LPS) e células inmunitarias (por exemplo, PBMC; verde). Cultiváronse células Caco-2 para establecer unha capa epitelial 3D. Barra de escala, 50 µm. Imaxes na fila inferior: "Diferenciación de células" adaptada con permiso da referencia. 2. Oxford University Press; Reproducido con permiso da Ref. 5. NAS; "Cocultivo hospedador-microbio" adaptado con permiso da ref. 3. NAS; "Modelado de enfermidades" adaptado con permiso da referencia. 5. NAS.
Tanto os chips intestino-en-chip como os híbridos fabricáronse utilizando réplicas de PDMS que foron desmoldadas de moldes de silicio mediante litografía branda1,44 e modeladas con SU-8. O deseño dos microcanais en cada chip determínase considerando a hidrodinámica como a tensión de cizallamento e a presión hidrodinámica1,4,12. O deseño orixinal de intestino-en-chip (Datos ampliados Fig. 1a), que consistía en dous microcanais rectos paralelos xustapostos, evolucionou nun complexo intestino-en-chip (Datos ampliados Fig. 1b) que inclúe un par de microcanais curvos para inducir un maior tempo de residencia do fluído, patróns de fluxo non lineais e deformación multiaxial das células cultivadas (Fig. 2a-f)12. Cando é necesario recrear unha biomecánica intestinal máis complexa, pódense elixir intestinos-en-chips complexos. Demostramos que o Gut-Chip enrevesado tamén induce fortemente a morfoxénese 3D nun período de tempo similar cun grao similar de crecemento epitelial en comparación co orixinal. Gut-Chip, independentemente do tipo de célula cultivada. Polo tanto, para inducir a morfoxénese 3D, os deseños de intestinos lineais e complexos no chip son intercambiables. As réplicas de PDMS curadas en moldes de silicona con patróns SU-8 proporcionaron características negativas despois do desmoldeo (Fig. 2a). Para fabricar o intestino nun chip, a capa superior de PDMS preparada uniuse secuencialmente a unha película porosa de PDMS e logo aliñouse coa capa inferior de PDMS mediante unión irreversible usando un tratador corona (Fig. 2b-f). Para fabricar chips híbridos, as réplicas de PDMS curadas uníronse a láminas de vidro para crear dispositivos microfluídicos dun só canal que puidesen acomodar insercións Transwell (Fig. 2h e Datos ampliados Fig. 2). O proceso de unión realízase tratando as superficies da réplica de PDMS e o vidro con plasma de osíxeno ou tratamento corona. Despois da esterilización do dispositivo microfabricado unido ao tubo de silicona, a configuración do dispositivo estaba lista para realizar a morfoxénese 3D do epitelio intestinal (Figura 2g).
a, Ilustración esquemática da preparación de pezas de PDMS a partir de moldes de silicio con patrón SU-8. A solución de PDMS sen curar vertiuse nun molde de silicio (esquerda), curou a 60 °C (centro) e desmoldouse (dereita). O PDMS desmoldouse cortouse en anacos e limpouse para o seu uso posterior. b, Fotografía do molde de silicio utilizado para preparar a capa superior de PDMS. c, Fotografía do molde de silicio utilizado para fabricar a membrana porosa de PDMS. d, Unha serie de fotografías dos compoñentes superior e inferior de PDMS e o dispositivo intestinal no chip ensamblado. e, Esquema da aliñación dos compoñentes superior, da membrana e inferior de PDMS. Cada capa está unida irreversiblemente mediante tratamento con plasma ou corona. f, Esquema do dispositivo intestino nun chip fabricado con microcanles convolutados superpostos e cámaras de baleiro. g, Configuración do intestino nun chip para o cultivo celular microfluídico. O intestino nun chip fabricado ensamblado cun tubo de silicona e unha xiringa colocouse sobre un cubreobxectivos. O dispositivo con chip colocouse na tapa dunha placa de Petri de 150 mm para o seu procesamento. O aglutinante úsase para pechar o tubo de silicona. h, instantáneas visuais da fabricación de chips híbridos e morfoxénese 3D usando chips híbridos. Inseríronse insercións Transwell preparadas de forma independente para cultivar monocapas 2D de células epiteliais intestinais no chip híbrido para inducir a morfoxénese intestinal 3D. O medio perfúdese a través de microcanles debaixo da capa celular establecida na inserción Transwell. Barra de escala, 1 cm. h Reimpreso con permiso da referencia. 4. Elsevier.
Neste protocolo, a liña celular Caco-2 e os organoides intestinais empregáronse como fontes epiteliais (Fig. 3a). Ambos os tipos de células cultiváronse de forma independente (Cadro 2 e Cadro 5) e empregáronse para sementar os microcanais recubertos de ECM de insercións de intestino no chip ou Transwell. Cando as células son confluentes (cobertura >95 % en frascos), as células Caco-2 cultivadas de forma rutineira (entre as pasaxes 10 e 50) en frascos T recóllense para preparar suspensións de células disociadas mediante fluído de tripsinización (cadro 2). Os organoides intestinais humanos procedentes de biopsias intestinais ou reseccións cirúrxicas cultiváronse en cúpulas de andamio de Matrigel en placas de 24 pozos para soportar o microambiente estrutural. O medio que contiña morfóxenos esenciais (como Wnt, R-espondina e Noggin) e factores de crecemento preparados como se describe no Cadro 3 suplementouse cada dous días ata que os organoides creceron ata aproximadamente 500 µm de diámetro. Os organoides completamente desenvolvidos recóllense e disócianse en células individuais para a súa sementación en insercións de intestino ou Transwell nun chip (cadro 5). Como xa informamos anteriormente, pódese diferenciar segundo o tipo de enfermidade12,13 (por exemplo, colite ulcerosa, enfermidade de Crohn, cancro colorrectal ou doante normal), o sitio da lesión (por exemplo, lesión fronte a área non lesionada) e a localización gastrointestinal no tracto (por exemplo, duodeno, xexuno, íleo, cego, colon ou recto). Ofrecemos un protocolo optimizado no cadro 5 para o cultivo de organoides colónicos (coloides) que normalmente requiren concentracións máis altas de morfóxenos que os organoides do intestino delgado.
a, Fluxo de traballo para a indución da morfoxénese intestinal no chip intestinal. Neste protocolo utilízanse epitelio intestinal humano Caco-2 e organoides intestinais para demostrar a morfoxénese 3D. As células epiteliais illadas foron sembradas no dispositivo gut-on-a-chip preparado (preparación do chip). Unha vez que as células son sembradas e adheridas á membrana porosa de PDMS no día 0 (D0), o fluxo apical (PA) iníciase e mantense durante os primeiros 2 días (fluxo, PA, D0-D2). O fluxo basolateral (BL) tamén se inicia xunto con movementos de estiramento cíclicos (estiramento, fluxo, PA e BL) cando se forma unha monocapa 2D completa. A morfoxénese intestinal 3D ocorreu espontaneamente despois de 5 días de cultivo microfluídico (morfoxénese, D5). As imaxes de contraste de fase mostran unha morfoloxía representativa das células Caco-2 en cada paso experimental ou punto temporal (gráfico de barras, 100 µm). Catro diagramas esquemáticos que ilustran as fervenzas correspondentes da morfoxénese intestinal (arriba á dereita). As frechas discontinuas No esquema representan a dirección do fluxo de fluído.b, Imaxe SEM que mostra a topoloxía superficial do epitelio 3D de Caco-2 establecido (esquerda).O recadro que destaca a área ampliada (cadro branco discontinuo) mostra as microvilosidades rexeneradas na capa 3D de Caco-2 (dereita).c, Vista frontal horizontal das membranas de claudina (ZO-1, vermello) e bordo de cepillo continuo de Caco-2 establecidas marcadas con F-actina (verde) e núcleos (azul) Visualización confocal por inmunofluorescencia de células epiteliais en chips intestinais.As frechas que apuntan ao esquema central indican a localización do plano focal para cada vista confocal.d, Curso temporal dos cambios morfolóxicos en organoides cultivados nun chip obtidos por microscopía de contraste de fase nos días 3, 7, 9, 11 e 13.O recadro (arriba á dereita) mostra o alto aumento da imaxe proporcionada.e, Microfotografía DIC do epitelio 3D organoide establecido no intestino nunha sección tomada o día 7.f, Superposto Imaxes de inmunofluorescencia que mostran marcadores para células nai (LGR5; maxenta), células caliciformes (MUC2; verde), actina F (gris) e núcleos (cian) cultivados en chips intestinais durante 3 días, respectivamente (esquerda) e organoides de 13 días (medio) na capa epitelial. Véxase tamén a Figura 3 de datos ampliados, que destaca a sinalización LGR5 sen a sinalización MUC2. Imaxes de fluorescencia que mostran a microestrutura epitelial (dereita) do epitelio organoide 3D establecido no intestino nun chip ao tinguir a membrana plasmática con colorante CellMask (dereita) no día 13 do cultivo. A barra de escala é de 50 μm a menos que se indique o contrario. b Reproducido con permiso da referencia. 2. Oxford University Press; c Adaptado con permiso da referencia. 2. Oxford University Press; e e f adaptados con permiso da referencia. 12 Baixo a licenza Creative Commons CC BY 4.0.
No intestino nun chip, é necesario modificar a superficie hidrofóbica da membrana porosa de PDMS para un revestimento ECM exitoso. Neste protocolo, aplicamos dous métodos diferentes para modificar a hidrofobicidade das membranas de PDMS. Para o cultivo de células Caco-2, a activación superficial mediante tratamento UV/ozono por si soa foi suficiente para reducir a hidrofobicidade da superficie de PDMS, revestir a ECM e unir as células Caco-2 á membrana de PDMS. Non obstante, o cultivo microfluídico do epitelio organoide require unha funcionalización superficial baseada en produtos químicos para lograr unha deposición eficiente de proteínas ECM aplicando secuencialmente polietilenimina (PEI) e glutaraldehído aos microcanais de PDMS. Despois da modificación superficial, depositáronse proteínas ECM para cubrir a superficie de PDMS funcionalizada e logo introducíronse no epitelio organoide illado. Unha vez unidas as células, o cultivo celular microfluídico comeza perfundindo só o medio no microcanal superior ata que as células forman unha monocapa completa, mentres que o microcanal inferior mantén condicións estáticas. Este método optimizado para a activación superficial e o revestimento ECM permite a unión de organoides. epitelio para inducir a morfoxénese 3D na superficie do PDMS.
Os cultivos Transwell tamén requiren un recubrimento de ECM antes da sementeira celular; non obstante, os cultivos Transwell non requiren pasos complexos de pretratamento para activar a superficie dos insertos porosos. Para o cultivo de células Caco-2 en insertos Transwell, o recubrimento de ECM en insertos porosos acelera a unión de células Caco-2 disociadas (<1 hora) e a formación de barreiras de unión estreita (<1-2 días). Para cultivar organoides en insertos Transwell, os organoides illados seméntanse en insertos recubiertos de ECM, únense á superficie da membrana (<3 h) e mantéñense ata que os organoides formen unha monocapa completa con integridade de barreira. Os cultivos Transwell realízanse en placas de 24 pozos sen o uso de chips híbridos.
A morfoxénese 3D in vitro pode iniciarse aplicando fluxo de fluído á cara basolateral dunha capa epitelial establecida. No intestino nun chip, a morfoxénese epitelial comezou cando o medio se perfundiu nos microcanales superior e inferior (Fig. 3a). Como se describiu anteriormente, é fundamental introducir fluxo de fluído no compartimento inferior (basolateral) para a eliminación continua dos inhibidores de morfoxenos segregados direccionais. Para proporcionar nutrientes e soro suficientes ás células unidas ás membranas porosas e xerar tensión de cizallamento luminal, normalmente aplicamos fluxo dual no intestino nun chip. Nos chips híbridos, inseríronse insertos Transwell que conteñen monocapas epiteliais nos chips híbridos. Despois, o medio aplicouse baixo o lado basolateral do inserto poroso Transwell a través do microcanal. A morfoxénese intestinal ocorreu de 3 a 5 días despois do inicio do fluxo basolateral en ambas as plataformas de cultivo.
As características morfolóxicas das capas epiteliais 3D microenxeñeiras pódense analizar aplicando varias modalidades de imaxe, incluíndo microscopía de contraste de fase, microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC), SEM ou microscopía confocal de inmunofluorescencia (Figuras 3 e 4). A imaxe de contraste de fase ou DIC pódese realizar facilmente en calquera momento durante o cultivo para monitorizar a forma e a protrusión das capas epiteliais 3D. Debido á transparencia óptica do PDMS e das películas de poliéster, tanto as plataformas de chip intestino nun chip como as de chip híbrido poden proporcionar imaxes in situ en tempo real sen necesidade de seccionar ou desmontar o dispositivo. Ao realizar imaxes de inmunofluorescencia (Figuras 1, 3c, f e 4b, c), as células adoitan fixarse ​​con paraformaldehído (PFA) ao 4 % (peso/vol), seguido de Triton X-100 e albumina sérica bovina (BSA) ao 2 % (peso/vol), por orde. Dependendo do tipo de célula, pódense usar diferentes fixadores, permeabilizantes e axentes bloqueadores. Primario Os anticorpos dirixidos a marcadores celulares ou rexionais dependentes da liñaxe úsanse para resaltar as células inmobilizadas in situ no chip, seguidos de anticorpos secundarios xunto cun colorante de contraste dirixido ao núcleo (por exemplo, 4′,6-diamidino-2-fenileno) indol, DAPI) ou á F-actina (por exemplo, faloidina marcada con fluorescencia). A imaxe en vivo baseada en fluorescencia tamén se pode realizar in situ para detectar a produción de moco (Fig. 1, "Diferenciación celular" e "Fisioloxía intestinal"), a colonización aleatoria de células microbianas (Fig. 1, "Cocultivo hóspede-microbio"), o recrutamento de células inmunitarias (Fig. 1, "Modelado de enfermidades") ou os contornos da morfoloxía epitelial 3D (Fig. 3c, f e 4b, c). Ao modificar o intestino no chip para separar a capa superior da capa inferior de microcanles, como se describe na referencia. Como se mostra na Fig. 2, a morfoloxía epitelial 3D, así como as microvilosidades no bordo apical en cepillo, pódense visualizar mediante SEM (Fig. 3b). A expresión de marcadores de diferenciación pódese avaliar mediante a realización de PCR5 cuantitativa ou secuenciación de ARN unicelular. Neste caso, as capas 3D de células epiteliais cultivadas en chips intestinais ou chips híbridos recóllense mediante tripsinización e logo utilízanse para análises moleculares ou xenéticas.
a, Fluxo de traballo para a indución da morfoxénese intestinal nun chip híbrido. Neste protocolo utilízanse Caco-2 e organoides intestinais para demostrar a morfoxénese 3D nunha plataforma de chips híbridos. As células epiteliais disociadas sementáronse en insercións Transwell preparadas (preparación TW; ver a figura a continuación). Unha vez sementadas as células e unidas a membranas de poliéster en insercións Transwell, todas as células cultiváronse en condicións estáticas (cultivo TW). Despois de 7 días, integrouse un único inserto Transwell que contiña unha monocapa 2D de células epiteliais nun chip híbrido para introducir un fluxo basolateral (Fluxo, BL), o que finalmente levou á xeración dunha capa epitelial 3D (morfoxénese). Micrografías de contraste de fase que mostran as características morfolóxicas das células epiteliais de órganos humanos derivadas do colon ascendente doante normal (liña C103) en cada paso ou punto temporal experimental. Os esquemas das capas superiores ilustran a configuración experimental para cada paso. b, Os chips híbridos (esquema da esquerda) poden levar á morfoxénese 3D de células epiteliais organoides con vistas de microscopía confocal de arriba abaixo. tomadas en diferentes posicións Z (superior, media e inferior; ver o esquema da dereita e as liñas punteadas correspondentes). mostraron características morfolóxicas obvias. F-actina (cian), núcleo (gris). c, Micrografías confocais de fluorescencia (vista angular 3D) de células epiteliais derivadas de organoides cultivadas en Transwell estático (TW; inserido dentro da caixa branca descontinua) fronte a un chip híbrido (plano completo máis grande) comparando a morfoloxía 2D fronte a 3D, respectivamente. Un par de vistas de corte transversal vertical 2D (inseridas na esquina superior dereita; "XZ") tamén mostran características 2D e 3D. Barra de escala, 100 µm. c Reproducido con permiso da referencia. 4. Elsevier.
Os controis pódense preparar cultivando as mesmas células (Caco-2 ou células epiteliais organoides intestinais) en monocapas bidimensionais en condicións de cultivo estáticas convencionais. En particular, pode producirse un esgotamento de nutrientes debido á capacidade de volume limitada dos microcanais (é dicir, ~4 µL no canal superior no deseño orixinal do chip intestinal). Polo tanto, tamén se pode comparar a morfoloxía epitelial antes e despois da aplicación do fluxo basolateral.
O proceso de litografía branda debe realizarse nunha sala limpa. Para cada capa do chip (capas superior e inferior e membranas) e chips híbridos, usáronse diferentes fotomáscaras que se fabricaron en obleas de silicio separadas porque as alturas dos microcanles eran diferentes. As alturas obxectivo dos microcanles superior e inferior do interior do chip son de 500 µm e 200 µm, respectivamente. A altura obxectivo do canal do chip híbrido é de 200 µm.
Coloque unha oblea de silicio de 3 polgadas nun prato con acetona. Remova suavemente a placa durante 30 segundos e logo seque a oblea ao aire. Transfira a oblea a un prato con IPA e logo xire a placa durante 30 segundos para limpala.
Opcionalmente, pódese usar unha solución de piraña (mestura de peróxido de hidróxeno e ácido sulfúrico concentrado, 1:3 (vol/vol)) para maximizar a eliminación de residuos orgánicos da superficie da oblea de silicio.
A solución de piraña é extremadamente corrosiva e xera calor. Son necesarias precaucións de seguridade adicionais. Para a eliminación de residuos, deixe que a solución arrefríe e transfira a un colector de residuos limpo e seco. Use recipientes secundarios e etiquete correctamente os recipientes de residuos. Siga as directrices de seguridade das instalacións para obter procedementos máis detallados.
Deshidratar as obleas colocándoas nunha placa quente a 200 °C durante 10 minutos. Despois da deshidratación, a oblea axitouse cinco veces ao aire para arrefriala.
Verte ~10 g de fotorresina SU-8 2100 no centro da oblea de silicio limpa. Usa unhas pinzas para estender a fotorresina uniformemente pola oblea. De cando en vez, coloca a oblea nunha placa quente a 65 °C para que a fotorresina sexa menos pegañenta e máis fácil de estender. Non coloques a oblea directamente sobre a placa quente.
O SU-8 distribuíuse uniformemente na oblea mediante o revestimento por rotación. Programe unha rotación entrante do SU-8 durante 5–10 s para propagarse a 500 rpm a unha aceleración de 100 rpm/s. Axuste o xiro principal para un patrón de 200 µm de espesor a 1500 rpm ou consiga un espesor de 250 µm (creando unha altura de 500 µm para a capa superior do interior do chip; consulte "Pasos críticos" a continuación) a unha aceleración de 300 rpm/s e 30 segundos a 1200 rpm.
A velocidade de xiro principal pódese axustar segundo o grosor obxectivo do patrón SU-8 na oblea de silicio.
Para fabricar patróns SU-8 de 500 µm de altura para a capa superior das entrañas do chip, os pasos de revestimento por centrifugación e cocción suave desta caixa (pasos 7 e 8) repetíronse secuencialmente (véxase o paso 9) para producir dúas capas de 250 µm de grosor de SU-8, que se poden superpoñer e unir mediante exposición UV no paso 12 desta caixa, creando unha capa de 500 µm de altura.
Cociña suavemente as obleas revestidas con SU-8 colocándoas coidadosamente nunha placa quente a 65 °C durante 5 minutos, despois cambia a configuración a 95 °C e incuba durante 40 minutos adicionais.
Para conseguir unha altura de 500 μm do patrón SU-8 no microcanal superior, repita os pasos 7 e 8 para xerar dúas capas SU-8 de 250 μm de grosor.
Usando o aliñador de máscaras UV, realice unha proba de lámpada segundo as instrucións do fabricante para calcular o tempo de exposición da oblea. (tempo de exposición, ms) = (dose de exposición, mJ/cm2)/(potencia da lámpada, mW/cm2).
Despois de determinar o tempo de exposición, coloque a fotomáscara no soporte da máscara do aliñador de máscara UV e coloque a fotomáscara na oblea revestida de SU-8.
Coloque a superficie impresa da fotomáscara directamente sobre o lado revestido de SU-8 da oblea de silicio para minimizar a dispersión de UV.
Expón a oblea revestida de SU-8 e a fotomáscara verticalmente a 260 mJ/cm2 de luz UV durante o tempo de exposición predeterminado (véxase o paso 10 deste cadro).
Despois da exposición aos raios UV, as obleas de silicio recubertas con SU-8 cocéronse a 65 °C durante 5 minutos e a 95 °C durante 15 minutos en cada placa quente para fabricar patróns cunha altura de 200 μm. Ampliouse o tempo de poscocción a 95 °C a 30 minutos para fabricar patróns cunha altura de 500 μm.
O revelador vértese nunha placa de vidro e a oblea cocida colócase na placa. O volume de revelador SU-8 pode variar dependendo do tamaño da placa de vidro. Asegúrese de usar suficiente revelador SU-8 para eliminar completamente o SU-8 non exposto. Por exemplo, ao usar unha placa de vidro de 150 mm de diámetro cunha capacidade de 1 L, use ~300 mL de revelador SU-8. Revelar o molde durante 25 minutos con rotación suave ocasional.
Enxágüe o molde desenvolvido con ~10 mL de revelador fresco seguido de IPA pulverizando a solución cunha pipeta.
Coloque a oblea nun limpador de plasma e expoña a plasma de osíxeno (gas atmosférico, presión obxectivo 1 × 10−5 Torr, potencia 125 W) durante 1,5 min.
Coloque a oblea nun desecador ao baleiro cun portaobxectos de vidro no seu interior. As obleas e os portaobxectos pódense colocar un ao lado do outro. Se o desecador ao baleiro está dividido en varias capas por unha placa, coloque os portaobxectos na cámara inferior e as obleas na cámara superior. Deixe caer 100 μL de solución de tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil)silano nun portaobxectos de vidro e aplique baleiro para a silanización.
Desconxelar un vial de células Caco-2 conxeladas nun baño de auga a 37 °C e, a continuación, transferir as células desconxeladas a un matraz T75 que contén 15 mL de medio Caco-2 prequentado a 37 °C.
Para pasar células Caco-2 a ~90 % de confluencia, primeiro quentar o medio Caco-2, PBS e tripsina ao 0,25 %/EDTA 1 mM nun baño de auga a 37 °C.
Aspirar o medio mediante aspiración ao baleiro. Lavar as células dúas veces con 5 mL de PBS morno repetindo a aspiración ao baleiro e engadindo PBS fresco.