Morfoxénese 3D in vitro de epitelio intestinal humano en intestino en chip ou híbrido en chip con insercións de cultivo celular

Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada para CSS. Para obter unha mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, mostraremos o sitio sen estilos e JavaScript.
A morfoxénese do intestino humano establece as características de criptas e vellosidades da microarquitectura epitelial 3D e da organización espacial. Esta estrutura única é necesaria para manter a homeostase intestinal protexendo o nicho de células nai na cripta basal dos antíxenos microbianos esóxenos e os seus metabolitos. As estruturas epiteliais D son cruciales para a construción de modelos de intestino in vitro. En particular, o intestino mimético orgánico nun chip pode inducir a morfoxénese 3D espontánea do epitelio intestinal con funcións fisiolóxicas e biomecánicas melloradas. Aquí, fornecemos un protocolo reproducible para inducir de forma robusta a morfoxénese intestinal no chip intestino. , cultivo de Caco-2 ou células epiteliais organoides intestinais en escenarios convencionais, así como nunha plataforma microfluídica, indución da morfoxénese 3D e caracterización de epitelios 3D establecidos usando múltiples modalidades de imaxe. requiren enxeñería ou manipulación celular complexa, que poden superar outras técnicas existentes. Prevemos que o noso protocolo proposto podería ter amplas implicacións para a comunidade de investigación biomédica, proporcionando un método para rexenerar capas epiteliais intestinais 3D in vitro para aplicacións biomédicas, clínicas e farmacéuticas.
Os experimentos demostran que as células epiteliais intestinais Caco-2 cultivadas en dispositivos de microfluídicos de intestino en chip1,2,3,4,5 ou de bicapa6,7 poden sufrir morfoxénese 3D espontánea in vitro sen unha comprensión clara do mecanismo subxacente. No noso estudo recente, descubrimos que a eliminación do cultivo basolateral do dispositivo segregado epimorfogénico é necesaria e suficiente para producir un epimorfoxeno. morfoxénese in vitro, que foi demostrada por Caco-2 e organoides intestinais derivados do paciente.As células epiteliais foron validadas. Neste estudo, centrámonos especificamente na produción celular e na distribución da concentración dun potente antagonista de Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), en dispositivos microfluídicos de intestino nun chip e modificados que conteñen insercións Transwell, denominados "Chip híbrido". -proteína relacionada 1, ou Soggy-1) para o intestino no chip inhibe a morfoxénese ou interrompe a capa epitelial 3D preestruturada, o que suxire que o estrés antagónico durante o cultivo é responsable da morfoxénese intestinal in vitro. Polo tanto, un enfoque práctico para lograr unha morfoxénese robusta no epitelismo é manter o nivel mínimo de contraste activo da interface epitelial mediante a eliminación do flushing ou o nivel mínimo de influencia lateral. (por exemplo, en plataformas de intestino en chip ou híbrido en chip) ou de difusión. Medios basolaterais (por exemplo, desde insercións de Transwell en grandes depósitos basolaterais en pozos).
Neste protocolo, fornecemos un método detallado para fabricar microdispositivos gut-on-a-chip e chips híbridos transwell-inseribles (pasos 1-5) para cultivar células epiteliais intestinais en membranas porosas baseadas en polidimetilsiloxano (PDMS) (pasos 6A, 7A, 8, 9) ou membranas de poliéster inducidas por membranas Transwell, 38, 7B e 6B inducidas. morfoxénese in vitro (paso 10). Tamén identificamos características celulares e moleculares indicativas da histoxénese específica do tecido e da diferenciación celular dependente da liñaxe mediante a aplicación de múltiples modalidades de imaxe (pasos 11-24). do microambiente biomecánico.in vitro.Para inducir a morfoxénese 3D a partir de monocapas epiteliais 2D, eliminamos os antagonistas do morfoxeno en ambas as formas cultivadas facendo fluír o medio ao compartimento basolateral do cultivo. Finalmente, ofrecemos unha representación da utilidade dun modelo 3D rexenerable de crecemento epitelial rexenerable que pode utilizarse un modelo de crecemento epitelial co-dependente do hóspede comorfomico lonxitudinal. -cultivos, infección por patóxenos, lesións inflamatorias, disfunción da barreira epitelial e terapias baseadas en probióticos Exemplo.influencias.
O noso protocolo pode ser útil para unha ampla gama de científicos en investigación básica (por exemplo, bioloxía da mucosa intestinal, bioloxía de células nai e bioloxía do desenvolvemento) e aplicada (por exemplo, probas preclínicas de fármacos, modelado de enfermidades, enxeñaría de tecidos e gastroenteroloxía). s estudando a dinámica da sinalización celular durante o desenvolvemento intestinal, a rexeneración ou a homeostase. Ademais, o noso protocolo é útil para interrogar a infección baixo diversos axentes infecciosos como Norovirus 8, Síndrome Respiratorio Agudo Grave Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ou Vibrio cholerae.Tamén son útiles as audiencias da patoloxía e a patoxénese da enfermidade. O uso dun sistema de microfisioloxía intestinal no chip pode permitir o co-cultivo lonxitudinal 10 e a posterior avaliación da defensa do hóspede, as respostas inmunes e a reparación de lesións relacionadas con patóxenos no tracto gastrointestinal (GI) 11 .Outros trastornos GI asociados a enfermidades do intestino permeable, enfermidades intestinais permeables, síndromes de colquitis, enfermidades de croquitis, enfermidades do intestino permeable ou síndrome do intestino irritable pódese simular cando se preparan capas epiteliais intestinais 3D usando as capas epiteliais intestinais 3D do paciente, estas enfermidades inclúen atrofia das vellosidades, acurtamento das criptas, danos nas mucosas ou deterioración da barreira epitelial. tipos, como células mononucleares de sangue periférico do paciente (PBMC), a modelos que conteñen microarquitecturas 3D de vellosidades intestinales-criptas.células inmunitarias específicas do tecido, 5.
Dado que a microestrutura epitelial en 3D pódese fixar e visualizar sen o proceso de seccionamento, os espectadores que traballan en transcriptómica espacial e imaxes de alta resolución ou superresolución poden estar interesados ​​na nosa cartografía da dinámica espazo-temporal de xenes e proteínas nos nichos epiteliais.Interesado na tecnoloxía. Resposta a estímulos microbianos ou inmunes. Ademais, a diafonía lonxitudinal hóspede-microbioma 10, 14 que coordina a homeostase intestinal pódese establecer na capa 3D da mucosa intestinal co cultivo de diversas especies microbianas, comunidades microbianas ou microbiota fecal, especialmente no gut-on-a-chip.Este enfoque resulta especialmente atractivo para o público que estuda a inmunoloxía das mucosas, a gastroenteroloxía, o microbioma humano, a culturómica e a microbioloxía clínica que buscan cultivar microbiota intestinal previamente sen cultivar no laboratorio. o protocolo tamén se pode difundir a aqueles que desenvolven plataformas de selección ou validación farmacéuticas, biomédicas ou de alto rendemento para a industria alimentaria.Como proba de principio, recentemente demostramos a viabilidade dun sistema de morfoxénese múltiple de alto rendemento escalable a un formato de placa de 24 pozos. O método de morfoxénese pode ser acelerado e potencialmente adoptado por moitos laboratorios de investigación, industrias ou gobernos e axencias reguladoras para comprender a reprogramación celular da morfoxénese intestinal in vitro a nivel transcriptómico para probar fármacos ou bioterapéuticos.
Utilizáronse un número limitado de modelos experimentais de relevancia humana para estudar a morfoxénese do epitelio intestinal, principalmente debido á falta de protocolos implementables para inducir a morfoxénese 3D in vitro. Estes modelos tamén son moi limitados na súa capacidade para ser probados de xeito escalable de varias maneiras. Polo tanto, o noso protocolo para rexenerar estruturas de tecidos 3D in vitro supera os modelos animais in vivo, así como outros modelos tradicionais de cultivo celular estático 2D. Como se describiu anteriormente, a utilización de estruturas epiteliais 3D permitiunos examinar as respostas diferenciadas das células espaciais na localización de varias criptografías. estímulos mucosas ou inmunes. As capas epiteliais 3D poden proporcionar un espazo para estudar como as células microbianas compiten para formar nichos espaciais e a evolución ecolóxica en resposta aos factores do hóspede (por exemplo, capas de moco internas fronte a externas, secreción de IgA e péptidos antimicrobianos). por exemplo, ácidos graxos de cadea curta) que configuran a organización celular e os nichos de células nai nas criptas basais. Estas características só se poden demostrar cando se establecen capas epiteliais 3D in vitro.
Ademais do noso método de creación de estruturas epiteliais intestinais en 3D, hai varios métodos in vitro. O cultivo de organoides intestinales é unha técnica de enxeñería de tecidos de última xeración baseada no cultivo de células nai intestinais en condicións específicas de morfoxeno23,24,25. Non obstante, o uso de modelos de organoides en 3D para análise de transporte ou microcultivo de hospedaxe adoita estar dentro do microbioide do lumen intestinal. polo tanto, a introdución de compoñentes luminais como células microbianas ou antíxenos esóxenos é limitada.O acceso aos lúmenes organoides pódese mellorar mediante un microinxector26,27, pero este método é invasivo e esixe un coñecemento especializado para realizar.
Outros enfoques empregados por varios grupos de investigación utilizan estadas de hidroxel 3D preestruturadas para imitar a estrutura epitelial do intestino cultivando células intestinais humanas illadas na superficie do xel. Fabricar estadas de hidroxel usando moldes impresos en 3D, microfresados ​​ou litográficamente. Con todo, a natureza das armazóns preestruturadas pode impedir a visualización do propio proceso morfoxenético espontáneo. Estes modelos tampouco proporcionan un fluxo luminal ou intersticial dinámico, xa que carece do estrés de cizallamento fluído que necesitan as células intestinais para estudar a función hidroxélica. unha plataforma microfluídica e estruturas epiteliais intestinais modeladas mediante técnicas de gravado con láser. Os organoides intestinais do rato seguen patróns gravados para formar estruturas tubulares intestinais, e o fluxo de fluído intraluminal pode recapitularse mediante un módulo de microfluídica. Non obstante, este modelo non presenta procesos morfoxenéticos espontáneos nin inclúe movementos mecanobiolóxicos do intestino que crean movementos mecanobiolóxicos do mesmo grupo intestino a partir do mesmo grupo de intestinos. A pesar da complexa fabricación de diferentes segmentos intestinais dentro do tubo, este modelo tamén carece de fluxo de fluído luminal e de deformación mecánica. Ademais, a operatividade do modelo pode verse limitada, especialmente despois de que se complete o proceso de bioimpresión, perturbando as condicións experimentais ou as interaccións célula a célula. Pola contra, o noso protocolo proposto ofrece morfoxénese intestinal espontánea, estrés intestino independente, accesibilidade fisiolóxica e biomecánica independente do estrés motar independente da biomecánica. Polo tanto, o noso protocolo de morfoxénese 3D in vitro pode proporcionar un enfoque complementario para superar os desafíos dos métodos existentes.
O noso protocolo está totalmente enfocado na morfoxénese epitelial 3D, con só células epiteliais en cultivo e sen outro tipo de células circundantes, como células mesenquimales, células endoteliais e células inmunes. Como se describiu anteriormente, o núcleo do noso protocolo é a indución da morfoxénese epitelial eliminando os inhibidores do morfoxeno laterais do noso medio intestino robusto. on-a-chip e hybrid-on-a-chip permítenos recrear a capa epitelial 3D ondulada, complexidades biolóxicas adicionais como as interaccións epitelial-mesenquimales33,34, a deposición de matriz extracelular (ECM) 35 e, no noso modelo, as características cripto-vellosidades que transmiten as células nai que transmiten os nichos de células nai que se consideran fibroblastos mesénquimales. o quimo xoga un papel fundamental na produción de proteínas ECM e na regulación da morfoxénese intestinal in vivo35,37,38.A adición de células mesenquimales ao noso modelo mellorou o proceso morfoxenético e a eficiencia da unión celular.A capa endotelial (é dicir, capilares ou linfáticos) xoga un papel importante na regulación do transporte molecular39 e os compoñentes do microinmunidade do vagón e do microambiente. poden conectarse entre modelos de tecidos son un requisito previo cando os modelos de tecidos están deseñados para demostrar interaccións multiorgánicas. Polo tanto, é posible que teñan que incluír células endoteliais para modelar características fisiolóxicas máis precisas con resolución a nivel de órganos. enfermidade.
O uso de chips híbridos é máis sinxelo que gut-on-a-chip porque a configuración do dispositivo é máis sinxela e o uso de insercións Transwell permite un cultivo escalable do epitelio intestinal. Non obstante, as insercións Transwell dispoñibles comercialmente con membranas de poliéster non son elásticas e non poden simular movementos de tipo peristáltico. En realidade, as propiedades estáticas do compartimento apical raramente permiten o co-cultivo bacteriano a longo prazo en chips híbridos. Aínda que podemos inducir de xeito robusto a morfoxénese 3D nas insercións Transwell cando se usan chips híbridos, a escaseza de biomecánica fisioloxicamente relevante e o fluxo de fluído apical pode limitar a viabilidade das plataformas de chips híbridos para aplicacións potenciais.
Non se estableceron completamente reconstrucións a gran escala do eixe cripta-vellosidade humana en cultivos intestino en chip e híbrido en chip. Dado que a morfoxénese comeza a partir dunha monocapa epitelial, as microarquitecturas 3D non proporcionan necesariamente semellanza morfolóxica coas criptas in vivo. a cripta e as rexións vellosas non estaban claramente demarcadas. Aínda que as canles superiores máis altas do chip conducen a un aumento da altura do epitelio de microenxeñería, a altura máxima aínda está limitada a ~300-400 µm. A profundidade real das criptas intestinais humanas no intestino delgado e groso é de ~135 µm e ~400 µm e a altura do intestino delgado é de ~400 µm e ~400 µm, respectivamente.
Desde o punto de vista da imaxe, a imaxe de super-resolución in situ de microarquitecturas 3D pode limitarse ao intestino nun chip, xa que a distancia de traballo necesaria desde a lente obxectivo ata a capa epitelial é da orde duns milímetros. Para superar este problema, pode ser necesario un obxectivo distante. A microfabricación do intestino nun chip implica a adhesión permanente entre cada capa, é moi difícil abrir ou eliminar a capa superior para examinar a estrutura superficial da capa epitelial. Por exemplo, usando un microscopio electrónico de varrido (SEM).
A hidrofobicidade do PDMS foi un factor limitante nos estudos baseados en microfluídicos que tratan de pequenas moléculas hidrofóbicas, xa que o PDMS pode adsorber de forma inespecífica tales moléculas hidrófobas. As alternativas ao PDMS pódense considerar con outros materiais poliméricos. Alternativamente, a modificación da superficie do PDMS (por exemplo, o revestimento con materiais lipófilos para minimizar o glicol ou o polietileno) moléculas fóbicas.
Finalmente, o noso método non se caracterizou ben en termos de proporcionar un cribado de alto rendemento ou unha plataforma experimental amigable para todos os usuarios. O protocolo actual require unha bomba de xiringa por microdispositivo, que ocupa espazo nunha incubadora de CO2 e impide experimentos a gran escala. Esta limitación pódese mellorar significativamente coa escalabilidade de formatos de cultivo innovadores que permiten a reposición e eliminación continuas dos medios basolaterais).
Para inducir a morfoxénese 3D do epitelio intestinal humano in vitro, utilizamos un dispositivo intestinal con chip microfluídico que contén dúas microcanles paralelas e unha membrana porosa elástica no medio para crear unha interface lumen-capilar. As células epiteliais pódense demostrar aplicando a manipulación direccional do fluxo para eliminar os antagonistas do morfoxeno do compartimento basolateral. Todo o procedemento experimental (Figura 1) consta de cinco partes: (i) microfabricación do chip intestinal ou chip híbrido insertable Transwell (pasos 1-5; Caixa 1), (ii) preparación de células organoides intestinais epiteliais ou intestinais humanas.caixas 2-5), (iii) cultivo de células epiteliais intestinais en chips intestinais ou chips híbridos (pasos 6-9), (iv) indución da morfoxénese 3D in vitro (paso 10) e (v)) para caracterizar a microestrutura epitelial 3D (pasos 11-24). morfoxénese telial a controis espaciais, temporais, condicionais ou procedimentais.
Usamos dúas plataformas de cultivo diferentes: gut-on-a-chip con canles rectos ou canles contorneados non lineais, ou chips híbridos que conteñen insercións Transwell (TW) nun dispositivo microfluídico, fabricado como se describe no cadro 1, e o paso 1-5 "Device Fabrication" mostra os pasos principais para facer un só chip ou un chip híbrido. ) e o procedemento de cultivo utilizado neste protocolo "Morfoxénese in vitro" mostra os pasos xerais nos que se cultivan células epiteliais derivadas de Caco-2 ou organoides nun chip intestinal ou en insercións Transwell dun chip híbrido, seguido da indución da morfoxénese 3D e da formación dunha estrutura epitelial caracterizada. en caracterización da diferenciación celular, estudos de fisioloxía intestinal, establecemento de ecosistemas de microbiomas hóspede e modelado de enfermidades. Imaxes de inmunofluorescencia en "Diferenciación celular" que mostran núcleos, actina F e MUC2 expresados ​​na capa epitelial 3D de Caco-2 xerada no chip intestinal. A fisioloxía mostra o moco producido pola tinción de residuos de ácido siálico e N-acetilglucosamina usando aglutinina fluorescente de xerme de trigo. As dúas imaxes superpostas en "Co-culturas de microorganismos hospedador" mostran co-cultivos representativos do microbioma hospedador no intestino nun chip. O panel esquerdo mostra o co-cultivo de proteína E. O panel dereito mostra a localización de GFP E. coli co-cultivadas con células epiteliais 3D Caco-2, seguida da tinción de inmunofluorescencia con actina F (vermello) e núcleos (azul). células (por exemplo, PBMC;verde).Cultiváronse células Caco-2 para establecer unha capa epitelial 3D.Barra de escala, 50 µm.Imaxes na fila inferior: “Diferenciación de células” adaptada con permiso da referencia.2.Oxford University Press;Reproducido con permiso da Ref.5.NAS;“Co-Cultura Host-Microbio” adaptado con permiso da ref.3.NAS;"Modelado de enfermidades" adaptado con permiso da referencia.5.NAS.
Tanto os chips gut-on-chip como os híbridos foron fabricados usando réplicas de PDMS que foron desmoldeadas a partir de moldes de silicio mediante litografía suave1,44 e modeladas con SU-8. , evolucionou nun complexo gut-on-a-chip (datos estendidos Fig. 1b) que inclúe un par de microcanles curvas para inducir un aumento do tempo de residencia de fluídos, patróns de fluxo non lineais e deformación multiaxial das células cultivadas (Fig. 2a-f) 12.Cando intestino máis complexo necesitamos recrear biomecánica intestino complexo. o Gut-Chip voluted tamén induce fortemente a morfoxénese 3D nun período de tempo similar cun grao similar de crecemento epitelial en comparación co Gut-Chip orixinal, independentemente do tipo de célula cultivada. Polo tanto, para inducir a morfoxénese 3D, os deseños lineais e complexos de intestino no chip son intercambiables.2a).Para fabricar o intestino nun chip, a capa superior de PDMS preparada uniuse secuencialmente a unha película de PDMS porosa e despois aliñada coa capa inferior de PDMS mediante unión irreversible mediante un tratador de coroa (Fig. 2b-f). Datos ampliados Fig. 2). O proceso de unión realízase tratando as superficies da réplica do PDMS e do vidro con plasma de osíxeno ou tratamento de coroa. Despois da esterilización do dispositivo microfabricado unido ao tubo de silicona, a configuración do dispositivo estaba lista para realizar a morfoxénese 3D do epitelio intestinal (Figura 2g).
a, Ilustración esquemática da preparación de pezas de PDMS a partir de moldes de silicio con estampado SU-8. A solución de PDMS sen curar vertiuse nun molde de silicio (esquerda), curada a 60 °C (centro) e desmoldeada (dereita). O PDMS desmoldeado foi cortado en anacos e limpouse para o seu posterior uso.b, Fotografía do molde de silicio utilizado para preparar a capa de silicio. d, Unha serie de fotografías dos compoñentes do PDMS superior e inferior e do dispositivo intestinal montado no chip.e, Esquema do aliñamento dos compoñentes do PDMS superior, de membrana e inferior. Cada capa está unida de forma irreversible mediante tratamento con plasma ou coroa. O intestino fabricado nun chip ensamblado cun tubo de silicona e unha xiringa colocouse nun cubreobjetos. O dispositivo de chip colocouse na tapa dunha placa de Petri de 150 mm para procesar.O aglutinante úsase para pechar o tubo de silicona. incorporado ao chip híbrido para inducir a morfoxénese 3D intestinal.O medio é perfundido a través de microcanles debaixo da capa celular establecida no inserto Transwell.Barra de escala, 1 cm.h Reimpreso co permiso da referencia.4.Elsevier.
Neste protocolo, a liña celular Caco-2 e os organoides intestinais usáronse como fontes epiteliais (Fig. 3a). Ambos tipos de células cultiváronse de forma independente (Cadro 2 e Cadro 5) e usáronse para sementar as microcanles recubertas de ECM de intestino no chip ou insercións Transwell. 50) en frascos en T recóllense para preparar suspensións celulares disociadas mediante fluído de tripsinización (cadro 2). Os organoides intestinais humanos de biopsias intestinais ou reseccións cirúrxicas cultiváronse en cúpulas de andamio Matrigel en placas de 24 pozos para soportar o microambiente estrutural. Complementouse cada dous días ata que os organoides creceron ata ~500 µm de diámetro. Os organoides totalmente cultivados recóllense e disocian en células individuais para sementar no intestino ou insercións de Transwell nun chip (Cadro 5). Como xa informamos anteriormente, pódese diferenciar segundo o tipo de enfermidade12,13 (p. lesión versus área non lesionada) e localización gastrointestinal no tracto (por exemplo, duodeno, xexuno, íleon, ceco, colon ou recto). Ofrecemos un protocolo optimizado no cadro 5 para o cultivo de organoides colónicos (coloides) que normalmente requiren concentracións máis altas de morfoxenos que os organoides do intestino delgado.
a, Fluxo de traballo para a indución da morfoxénese intestinal no chip intestinal. O epitelio intestinal humano e os organoides intestinais Caco-2 úsanse neste protocolo para demostrar a morfoxénese 3D. As células epiteliais illadas sementáronse no dispositivo preparado de intestino nun chip (preparación de chip). O fluxo ical (AP) iníciase e mantense durante os primeiros 2 días (fluxo, AP, D0-D2). O fluxo basolateral (BL) tamén se inicia xunto cos movementos de estiramento cíclicos (estiramento, fluxo, AP e BL) cando se forma unha monocapa completa 2D. cada paso experimental ou punto temporal (gráfico de barras, 100 µm). Catro diagramas esquemáticos que ilustran as cascadas correspondentes da morfoxénese intestinal (arriba á dereita). As frechas discontinuas do esquema representan a dirección do fluxo do fluído. Capa (dereita).c, Vista frontal horizontal do establecido Caco-2 3D, claudina (ZO-1, vermello) e membranas de borde en pincel continuo etiquetadas como F-actina (verde) e núcleos (azul) Visualización confocal de inmunofluorescencia de células epiteliais en chips intestinais. d nun chip obtido por microscopía de contraste de fase os días 3, 7, 9, 11 e 13. O recuadro (arriba á dereita) mostra o alto aumento da imaxe proporcionada.magenta), células caliciformes (MUC2; verde), actina F (gris) e núcleos (cian) cultivados en chips do intestino durante 3 días, respectivamente (esquerda) e organoides de 13 días (medio) na capa epitelial.Véxase tamén a Figura 3 de datos estendidos, que destaca a sinalización LGR5 sen que as imaxes de sinalización da microfluorescencia de MUC2 mostran a microfluorescencia da microfluorescencia. id epitelio establecido no intestino nun chip tinguindo a membrana plasmática con colorante CellMask (dereita) o día 13 de cultivo.A barra de escala é de 50 μm a non ser que se indique o contrario.b Reimpreso con permiso da referencia.2.Oxford University Press;c Adaptado con permiso de Reference.2.Oxford University Press;e e f adaptados con permiso por referencia.12 Baixo a licenza Creative Commons CC BY 4.0.
No intestino nun chip, é necesario modificar a superficie hidrófoba da membrana porosa PDMS para un revestimento ECM exitoso. Neste protocolo, aplicamos dous métodos diferentes para modificar a hidrofobicidade das membranas PDMS. Para o cultivo de células Caco-2, a activación superficial só mediante o tratamento con UV/ozono foi suficiente para reducir a hidrofobicidade da superficie PDMS e unir a membrana PDMS e microflúe á membrana PDMS. O cultivo ídico do epitelio organoide require unha funcionalización da superficie baseada en produtos químicos para conseguir unha deposición eficiente das proteínas ECM aplicando secuencialmente polietilenimina (PEI) e glutaraldehido ás microcanles de PDMS. Despois da modificación da superficie, as proteínas ECM foron depositadas para cubrir a superficie funcionalizada do PDMS e, a continuación, introducíronse na superficie de PDMS funcionalizada e, a continuación, introducíronse na célula illada. o medio na microcanle superior ata que as células forman unha monocapa completa, mentres que a microcanle inferior mantén condicións estáticas. Este método optimizado para a activación superficial e o revestimento de ECM permite a unión do epitelio organoide para inducir a morfoxénese 3D na superficie do PDMS.
Os cultivos Transwell tamén requiren revestimento de ECM antes da sementeira celular;non obstante, os cultivos Transwell non requiren complexos pasos de pretratamento para activar a superficie das insercións porosas. Para o cultivo de células Caco-2 en insercións Transwell, o revestimento de ECM nos insertos porosos acelera a unión de células Caco-2 disociadas (<1 hora) e a formación de barreiras de unión estreita (<1-2 días). superficie da membrana (<3 h) e mantense ata que os organoides forman unha monocapa completa con integridade de barreira. Os cultivos transwell realízanse en placas de 24 pocillos sen o uso de chips híbridos.
A morfoxénese 3D in vitro pódese iniciar aplicando o fluxo de fluído ao aspecto basolateral dunha capa epitelial establecida. No intestino nun chip, a morfoxénese epitelial comezou cando o medio foi perfundido nas microcanles superiores e inferiores (Fig. 3a). nutrientes e soro ás células unidas a membranas porosas e xeran tensión de cizallamento luminal, normalmente aplicamos un fluxo dual no intestino nun chip.Nos chips híbridos, insercións Transwell que conteñen monocapas epiteliais foron inseridas nos chips híbridos. Despois, o medio aplicouse baixo o lado basolateral do inserto poroso Transwell a través da microcanle.
As características morfolóxicas das capas epiteliais 3D de microenxeñería pódense analizar aplicando varias modalidades de imaxe, incluíndo microscopía de contraste de fase, microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC), microscopía SEM ou microscopía confocal de inmunofluorescencia (Figuras 3 e 4). Para a transparencia óptica das películas de PDMS e poliéster, tanto as plataformas de intestino nun chip como as plataformas de chip híbrido poden proporcionar imaxes in situ en tempo real sen necesidade de seccionar ou desmontar o dispositivo. Cando se realizan imaxes de inmunofluorescencia (Figuras 1, 3c, f e 4b, c), as células adoitan estar fixadas por triciclo con 4% de triángulos. -100 e 2% (wt/vol) ) de albúmina de soro bovino (BSA), por orde. Dependendo do tipo de célula, pódense utilizar diferentes fixadores, permeabilizadores e axentes bloqueadores. Os anticorpos primarios dirixidos a marcadores de rexións ou células dependentes da liñaxe úsanse para resaltar as células inmobilizadas in situ no chip, seguidos de anticorpos secundarios (núcleo de midi, midi, 4, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 4, 5, 5 ou 6, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8 8 8 8 7 8 7 -fenileno) indol, DAPI) ou F-actina (por exemplo, faloidina marcada con fluorescencia). Tamén se poden realizar imaxes en directo baseadas en fluorescencia in situ para detectar a produción de moco (Fig.1, "Diferenciación celular" e "Fisioloxía do intestino"), a colonización aleatoria de células microbianas (Fig. 1, "Cocultivo de microorganismos hóspedes"), o recrutamento de células inmunitarias (Fig. 1, "Modelado de enfermidades") ou os contornos da morfoloxía epitelial 3D (Fig. 3c, 3c, 3c, 3c, 3d e 3d). capa inferior de microcanle, como se describe na ref. Como se mostra na Fig. 2, a morfoloxía epitelial 3D, así como as microvellosidades no bordo do pincel apical pódense visualizar mediante SEM (Fig. 3b). A expresión dos marcadores de diferenciación pódese avaliar realizando PCR5 cuantitativa ou secuenciación de ARN unicelular. Neste caso, as células híbridas crecen en chips de capas epitelial ou híbridas. obtido pola tripsinización e despois usado para análise molecular ou xenética.
a, Fluxo de traballo para a indución da morfoxénese intestinal nun chip híbrido. Neste protocolo utilízanse caco-2 e organoides intestinais para demostrar a morfoxénese 3D nunha plataforma de chip híbrido. As células epiteliais disociadas sementáronse en insercións Transwell preparadas (preparación de TW; ver a figura a continuación). Despois de 7 días, integrouse nun chip híbrido un único inserto Transwell que contiña unha monocapa 2D de células epiteliais para introducir un fluxo basolateral (Flow, BL), o que finalmente levou á xeración dunha capa epitelial 3D (morfoxénese). .Os esquemas das capas superiores ilustran a configuración experimental para cada paso.b, Os chips híbridos (esquemáticos da esquerda) poden levar á morfoxénese 3D de células epiteliais organoides con vistas de microscopía confocal de arriba abaixo tomadas en diferentes posicións Z (superior, medio e inferior;ver o esquema da dereita e as liñas de puntos correspondentes).mostrou características morfolóxicas obvias. F-actina (cian), núcleo (gris).c, Micrografías confocales de fluorescencia (visión en ángulo 3D) de células epiteliais derivadas de organoides cultivadas en Transwell estático (TW; incrustado dentro dunha caixa discontinua branca) versus chip híbrido (maior plano completo) comparando o par 2D e 3D en corte vertical, respectivamente. esquina superior dereita; "XZ") tamén mostra características 2D e 3D.Barra de escala, 100 µm.c Reimpreso co permiso da referencia.4.Elsevier.
Os controis pódense preparar cultivando as mesmas células (Caco-2 ou células epiteliais organoides intestinais) en monocapas bidimensionais en condicións de cultivo estáticos convencionais. En particular, pode producirse un esgotamento de nutrientes debido á capacidade de volume limitada das microcanles (é dicir, ~4 µL na canle superior no deseño orixinal do chip intestinal).
O proceso de litografía suave debe realizarse nunha sala limpa. Para cada capa do chip (capas superiores e inferiores e membranas) e chips híbridos, utilizáronse diferentes fotomáscaras e fabricáronse en obleas de silicio separadas porque as alturas das microcanles eran diferentes. As alturas obxectivo das microcanles superior e inferior do intestino do chip son 500 µm e 20 µm de altura respectivamente. µm.
Coloca unha oblea de silicio de 3 polgadas nun prato con acetona. Axita suavemente a placa durante 30 segundos, despois seca a oblea ao aire. Transfire a oblea a unha placa con IPA, despois xira a placa durante 30 segundos para limpala.
Opcionalmente pódese usar unha solución de piraña (mestura de peróxido de hidróxeno e ácido sulfúrico concentrado, 1:3 (vol/vol)) para maximizar a eliminación de residuos orgánicos da superficie da oblea de silicio.
A solución de piranha é extremadamente corrosiva e xera calor. Son necesarias precaucións de seguridade adicionais. Para a eliminación de residuos, deixe que a solución se arrefríe e transfira a un recipiente de residuos limpo e seco. Use recipientes secundarios e rotule correctamente os contedores de residuos. Siga as directrices de seguridade da instalación para obter procedementos máis detallados.
Deshidratar as obleas colocándoas nunha placa quente a 200 °C durante 10 min. Despois da deshidratación, a oblea axitause cinco veces ao aire para arrefriar.
Despeje ~10 g de fotorresistente SU-8 2100 no centro da oblea de silicio limpa. Use unhas pinzas para espallar o fotorresistente uniformemente na oblea. En ocasións, coloque a oblea nunha placa quente a 65 °C para que a oblea sexa menos pegajosa e sexa máis fácil de estender. Non coloque a oblea directamente na placa quente.
O SU-8 distribuíuse uniformemente na oblea aplicando o revestimento de espín. Programe unha rotación entrante do SU-8 durante 5-10 s para que se propague a 500 rpm cunha aceleración de 100 rpm/s. Estableza o xiro principal para un patrón de espesor de 200 µm a 1.500 rpm ou alcanza unha altura superior a 50 rpm (ver "Pasos críticos" a continuación) establecidos a una aceleración de 300 rpm/s 30 segundos a 1.200 rpm.
A velocidade de xiro principal pódese axustar segundo o grosor obxectivo do patrón SU-8 na oblea de silicio.
Para fabricar patróns SU-8 de 500 µm de altura para a capa superior do intestino no chip, o revestimento por centrifugado e os pasos de cocción suave desta caixa (pasos 7 e 8) repitéronse secuencialmente (ver paso 9) para producir dúas capas de 250 µm. .
Cocer suavemente as obleas recubertas de SU-8 colocando coidadosamente as obleas nunha placa quente a 65 °C durante 5 minutos, despois cambia a configuración a 95 °C e incúbalas durante 40 minutos máis.
Para acadar unha altura de 500 μm do patrón SU-8 na microcanle superior, repita os pasos 7 e 8 para xerar dúas capas SU-8 de 250 μm de espesor.
Usando o aliñador de máscara UV, realiza unha proba da lámpada segundo as instrucións do fabricante para calcular o tempo de exposición da oblea. (tempo de exposición, ms) = (dose de exposición, mJ/cm2)/(potencia da lámpada, mW/cm2).
Despois de determinar o tempo de exposición, coloque a fotomáscara no soporte da máscara do aliñador da máscara UV e coloque a fotomáscara na oblea revestida de SU-8.
Coloque a superficie impresa da fotomáscara directamente no lado revestido de SU-8 da oblea de silicio para minimizar a dispersión UV.
Expón a oblea revestida de SU-8 e a fotomáscara verticalmente a 260 mJ/cm2 de luz UV durante o tempo de exposición predeterminado (consulte o paso 10 deste cadro).
Despois da exposición UV, as obleas de silicio revestidas de SU-8 cociáronse a 65 °C durante 5 min e a 95 °C durante 15 min en cada placa quente para fabricar patróns cunha altura de 200 μm. Amplíe o tempo posterior á cocción de 95 °C a 30 min para fabricar patróns cunha altura de 500 µm.
O desenvolvedor é vertido nun prato de vidro e a oblea cocida colócase no prato. O volume de desenvolvedor SU-8 pode variar segundo o tamaño da placa de vidro. Seguro que empregará o desenvolvedor su-8 suficiente para eliminar completamente SU-8.Por Exemplo, cando se usa un prato de vidro de 150 mm de diámetro con 1 L de distancia.
Enxágüe o molde desenvolvido con ~ 10 ml de revelador fresco seguido de IPA pulverizando a solución cunha pipeta.
Coloque a oblea nun limpador de plasma e expóñase ao plasma de osíxeno (gas atmosférico, presión obxectivo 1 × 10−5 Torr, potencia 125 W) durante 1,5 min.
Coloque a oblea nun desecador ao baleiro cunha lámina de vidro no seu interior.As obleas e as láminas pódense colocar unha ao lado da outra.Se o desecador ao baleiro está dividido en varias capas mediante unha placa, coloque as láminas na cámara inferior e as obleas na cámara superior. Deixa caer 100 μL de tricloro(1H, 2 H, 1 H, 1,2 H, 1,2 H, 1,2 H, 1,2 H, 1,2 H, 1,2 H, 1 H, 1 H, 1 H, 1 H, 1 H, 1 H, 1 H, 1 H, 1 H, 1 H, 1 H) e aplicar baleiro para a silanización.
Descongelar un vial de células Caco-2 conxeladas nun baño de auga a 37 °C, despois transfire as células descongeladas a un matraz T75 que contén 15 ml de medio Caco-2 prequecido a 37 °C.
Para pasar as células Caco-2 a ~90% de confluencia, primeiro quente medio Caco-2, PBS e tripsina 0,25%/1 mM EDTA nun baño de auga a 37 °C.
Aspirar o medio mediante aspiración ao baleiro. Lavar as células dúas veces con 5 ml de PBS quente repetindo a aspiración ao baleiro e engadindo PBS fresco.


Hora de publicación: 16-Xul-2022