Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
A evolución dos parasitos microbianos implica unha contraposición entre a selección natural, que fai que os parasitos melloren, e a deriva xenética, que fai que os parasitos perdan xenes e acumulen mutacións nocivas.Aquí, para comprender como se produce esta contraposición a escala dunha única macromolécula, describimos a estrutura crio-EM do ribosoma de Encephalitozoon cuniculi, un organismo eucariota cun dos xenomas máis pequenos da natureza.A redución extrema do ARNr nos ribosomas de E. cuniculi vai acompañada de cambios estruturais sen precedentes, como a evolución de enlazadores de ARNr fusionados ata agora descoñecidos e de ARNr sen protuberancias.Ademais, o ribosoma de E. cuniculi sobreviviu á perda de fragmentos de ARNr e proteínas ao desenvolver a capacidade de usar moléculas pequenas como imitadores estruturais de fragmentos e proteínas de ARNr degradados.En xeral, mostramos que as estruturas moleculares que durante moito tempo se pensaban que estaban reducidas, dexeneradas e suxeitas a mutacións debilitantes teñen unha serie de mecanismos compensatorios que as manteñen activas a pesar das contraccións moleculares extremas.
Dado que a maioría dos grupos de parasitos microbianos teñen ferramentas moleculares únicas para explotar os seus hóspedes, moitas veces temos que desenvolver diferentes terapias para diferentes grupos de parasitos1,2.Non obstante, novas evidencias suxiren que algúns aspectos da evolución dos parasitos son converxentes e en gran medida previsibles, o que indica unha base potencial para intervencións terapéuticas amplas en parasitos microbianos3,4,5,6,7,8,9.
Traballos previos identificaron unha tendencia evolutiva común en parasitos microbianos chamada redución do xenoma ou decadencia do xenoma10,11,12,13.A investigación actual mostra que cando os microorganismos abandonan o seu estilo de vida libre e se converten en parasitos intracelulares (ou endosimbiontes), os seus xenomas sofren metamorfoses lentas pero sorprendentes ao longo de millóns de anos9,11.Nun proceso coñecido como decadencia do xenoma, os parasitos microbianos acumulan mutacións deletéreas que converten moitos xenes antes importantes en pseudoxenes, o que leva á perda xenética gradual e ao colapso mutacional14,15.Este colapso pode destruír ata o 95% dos xenes dos organismos intracelulares máis antigos en comparación con especies de vida libre moi relacionadas.Así, a evolución dos parasitos intracelulares é un tira e afloxa entre dúas forzas opostas: a selección natural darwiniana, que leva á mellora dos parasitos, e o colapso do xenoma, botando os parasitos ao esquecemento.Non está claro como o parasito conseguiu saír deste tira e afloxa e manter a actividade da súa estrutura molecular.
Aínda que o mecanismo da descomposición do xenoma non se comprende completamente, parece que ocorre principalmente debido á frecuente deriva xenética.Debido a que os parasitos viven en poboacións pequenas, asexuadas e xeneticamente limitadas, non poden eliminar eficazmente as mutacións deletéreas que ás veces ocorren durante a replicación do ADN.Isto leva á acumulación irreversible de mutacións nocivas e á redución do xenoma do parasito.Como resultado, o parasito non só perde xenes que xa non son necesarios para a súa supervivencia no medio intracelular.É a incapacidade das poboacións de parasitos para eliminar eficazmente as mutacións deletéreas esporádicas a que fai que estas mutacións se acumulen por todo o xenoma, incluídos os seus xenes máis importantes.
Gran parte da nosa comprensión actual da redución do xenoma baséase unicamente en comparacións de secuencias do xenoma, con menos atención aos cambios nas moléculas reais que realizan funcións de mantemento e serven como dianas potenciais de medicamentos.Estudos comparativos demostraron que a carga de mutacións microbianas intracelulares deletéreas parece predispoñer proteínas e ácidos nucleicos a mal pregarse e agregarse, facéndoos máis dependentes da chaperona e hipersensibles á calor19,20,21,22,23.Ademais, varios parasitos —evolución independente ás veces separada por ata 2.500 millóns de anos— experimentaron unha perda similar de centros de control de calidade na súa síntese de proteínas5,6 e nos mecanismos de reparación do ADN24.Non obstante, sábese pouco sobre o impacto do estilo de vida intracelular en todas as outras propiedades das macromoléculas celulares, incluída a adaptación molecular a unha carga crecente de mutacións nocivas.
Neste traballo, para coñecer mellor a evolución das proteínas e dos ácidos nucleicos dos microorganismos intracelulares, determinouse a estrutura dos ribosomas do parasito intracelular Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi é un organismo parecido a un fungo pertencente a un grupo de microsporidios parasitos que teñen xenomas eucariotas inusualmente pequenos e, polo tanto, úsanse como organismos modelo para estudar a descomposición do xenoma25,26,27,28,29,30.Recentemente, determinouse a estrutura do ribosoma crio-EM para xenomas moderadamente reducidos de Microsporidia, Paranosema locustae e Vairimorpha necatrix31,32 (xenoma de ~3,2 Mb).Estas estruturas suxiren que certa perda de amplificación do ARNr vese compensada polo desenvolvemento de novos contactos entre proteínas ribosómicas veciñas ou a adquisición de novas proteínas ribosómicas msL131,32.Especies Encephalitozoon (xenoma ~ 2,5 millóns de pb), xunto co seu parente máis próximo Ordospora, demostran o grao final de redución do xenoma nos eucariotas: teñen menos de 2000 xenes codificantes de proteínas, e espérase que os seus ribosomas non só estean desprovistas de fragmentos de expansión de ARNr (ARNr de fragmentos de proteína eucaryomal) que distinguen tamén catro ribosomas de fragmentos de proteínas ribosomáticas. s debido á súa falta de homólogos no xenoma de E. cuniculi26,27,28.Polo tanto, chegamos á conclusión de que o ribosoma de E. cuniculi pode revelar estratexias descoñecidas para a adaptación molecular á desintegración do xenoma.
A nosa estrutura crio-EM representa o ribosoma citoplasmático eucariota máis pequeno que se debe caracterizar e proporciona información sobre como o grao final de redución do xenoma afecta a estrutura, a ensamblaxe e a evolución da maquinaria molecular que é parte integrante da célula.Descubrimos que o ribosoma de E. cuniculi viola moitos dos principios amplamente conservados do pregamento do ARN e da ensamblaxe dos ribosomas, e descubrimos unha nova proteína ribosómica previamente descoñecida.De forma bastante inesperada, mostramos que os ribosomas de microsporidios desenvolveron a capacidade de unirse a moléculas pequenas, e hipotetizamos que os truncamentos no ARNr e nas proteínas desencadean innovacións evolutivas que, en última instancia, poden conferir calidades útiles ao ribosoma.
Para mellorar a nosa comprensión da evolución das proteínas e dos ácidos nucleicos en organismos intracelulares, decidimos illar as esporas de E. cuniculi de cultivos de células de mamíferos infectadas para purificar os seus ribosomas e determinar a estrutura destes ribosomas.É difícil obter un gran número de microsporidios parasitarios porque os microsporidios non se poden cultivar nun medio nutritivo.En cambio, crecen e reprodúcense só dentro da célula hóspede.Polo tanto, para obter biomasa de E. cuniculi para a purificación de ribosomas, infectamos a liña celular de ril de mamífero RK13 con esporas de E. cuniculi e cultivamos estas células infectadas durante varias semanas para permitir que E. cuniculi crecese e se multiplicase.Usando unha monocapa de células infectadas de aproximadamente medio metro cadrado, puidemos purificar uns 300 mg de esporas de Microsporidia e utilizalas para illar ribosomas.Despois interrompemos as esporas purificadas con perlas de vidro e illamos os ribosomas brutos mediante o fraccionamento gradual de polietilenglicol dos lisados.Isto permitiunos obter aproximadamente 300 µg de ribosomas crus de E. cuniculi para análise estrutural.
Despois recollemos imaxes crio-EM usando as mostras de ribosomas resultantes e procesamos estas imaxes usando máscaras correspondentes á subunidade ribosómica grande, á cabeza da subunidade pequena e á subunidade pequena.Durante este proceso, recollemos imaxes dunhas 108.000 partículas ribosómicas e calculamos imaxes crio-EM cunha resolución de 2,7 Å (Figuras complementarias 1-3).Despois utilizamos imaxes cryoEM para modelar o ARNr, a proteína ribosómica e o factor de hibernación Mdf1 asociado aos ribosomas de E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estrutura do ribosoma de E. cuniculi en complexo co factor de hibernación Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mapa do factor de hibernación Mdf1 asociado ao ribosoma de E. cuniculi.c Mapa de estrutura secundaria que compara o ARNr recuperado en especies de microsporidios con estruturas ribosómicas coñecidas.Os paneis mostran a localización dos fragmentos de ARNr amplificados (ES) e dos sitios activos dos ribosomas, incluíndo o sitio de decodificación (DC), o bucle de sarcinicina (SRL) e o centro da peptidil transferase (PTC).d A densidade electrónica correspondente ao centro da peptidil transferase do ribosoma de E. cuniculi suxire que este sitio catalítico ten a mesma estrutura no parasito de E. cuniculi e os seus hóspedes, incluído H. sapiens.e, f A correspondente densidade electrónica do centro de decodificación (e) e a estrutura esquemática do centro de decodificación (f) indican que E. cuniculi ten residuos U1491 en lugar de A1491 (numeración de E. coli) en moitos outros eucariotas.Este cambio suxire que E. cuniculi pode ser sensible aos antibióticos que teñen como obxectivo este sitio activo.
En contraste coas estruturas previamente establecidas dos ribosomas de V. necatrix e P. locustae (ambas estruturas representan a mesma familia de microsporidios Nosematidae e son moi semellantes entre si), 31,32 os ribosomas de E. cuniculi sofren numerosos procesos de fragmentación de ARNr e proteínas.Máis desnaturalización (figuras complementarias 4-6).No ARNr, os cambios máis sorprendentes incluíron a perda completa do fragmento de ARNr 25S amplificado ES12L e a dexeneración parcial das hélices h39, h41 e H18 (figura 1c, figura complementaria 4).Entre as proteínas ribosómicas, os cambios máis rechamantes incluíron a perda completa da proteína eS30 e o acurtamento das proteínas eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 e eS7 (figuras complementarias 4, 5).
Así, a redución extrema dos xenomas das especies de Encephalotozoon/Ordospora reflíctese na súa estrutura de ribosomas: os ribosomas de E. cuniculi experimentan a perda máis dramática de contido proteico nos ribosomas citoplasmáticos eucariotas suxeitos a caracterización estrutural, e nin sequera teñen eses fragmentos de ARNr e proteínas que non só están amplamente conservados nos dominios dos eukaryotes, senón que tamén se conservan amplamente no dominio dos eucaryotes.A estrutura do ribosoma de E. cuniculi proporciona o primeiro modelo molecular destes cambios e revela eventos evolutivos que foron ignorados tanto pola xenómica comparativa como polos estudos da estrutura biomolecular intracelular (figura complementaria 7).A continuación, describimos cada un destes eventos xunto coas súas probables orixes evolutivas e o seu impacto potencial na función dos ribosomas.
Despois descubrimos que, ademais dos grandes truncamentos de ARNr, os ribosomas de E. cuniculi teñen variacións de ARNr nun dos seus sitios activos.Aínda que o centro da peptidil transferase do ribosoma de E. cuniculi ten a mesma estrutura que outros ribosomas eucariotas (Fig. 1d), o centro de decodificación difire debido á variación da secuencia no nucleótido 1491 (numeración de E. coli, Fig. 1e, f).Esta observación é importante porque o sitio de decodificación dos ribosomas eucariotas contén normalmente os residuos G1408 e A1491 en comparación cos residuos de tipo bacteriano A1408 e G1491.Esta variación subxace na diferente sensibilidade dos ribosomas bacterianos e eucariotas á familia dos aminoglucósidos dos antibióticos ribosómicos e outras moléculas pequenas que teñen como obxectivo o sitio de decodificación.No sitio de decodificación do ribosoma de E. cuniculi, o residuo A1491 foi substituído por U1491, creando potencialmente unha interface de unión única para pequenas moléculas dirixidas a este sitio activo.A mesma variante A14901 tamén está presente noutros microsporidios como P. locustae e V. necatrix, o que suxire que está moi estendida entre as especies de microsporidios (Fig. 1f).
Debido a que as nosas mostras de ribosoma de E. cuniculi foron illadas de esporas metabólicamente inactivas, probamos o mapa crio-EM de E. cuniculi para a unión de ribosoma anteriormente descrita en condicións de estrés ou fame.Factores de hibernación 31,32,36,37, 38. Comparamos a estrutura previamente establecida do ribosoma hibernante co mapa crio-EM do ribosoma de E. cuniculi.Para o acoplamento utilizáronse ribosomas de S. cerevisiae en complexo co factor de hibernación Stm138, ribosomas de langosta en complexo co factor Lso232 e ribosomas de V. necatrix en complexo con factores Mdf1 e Mdf231.Ao mesmo tempo, atopamos a densidade crio-EM correspondente ao factor de descanso Mdf1.Do mesmo xeito que o Mdf1 que se une ao ribosoma de V. necatrix, Mdf1 tamén se une ao ribosoma de E. cuniculi, onde bloquea o sitio E do ribosoma, posiblemente contribuíndo a que os ribosomas estean dispoñibles cando as esporas do parasito se volven metabólicamente inactivas tras a inactivación do corpo (Figura 2).).
Mdf1 bloquea o sitio E do ribosoma, o que parece axudar a inactivar o ribosoma cando as esporas do parasito se fan metabólicamente inactivas.Na estrutura do ribosoma de E. cuniculi, descubrimos que Mdf1 forma un contacto previamente descoñecido co talo do ribosoma L1, a parte do ribosoma que facilita a liberación do ARNt desacilado do ribosoma durante a síntese de proteínas.Estes contactos suxiren que Mdf1 se disocia do ribosoma usando o mesmo mecanismo que o ARNt desacetilado, proporcionando unha posible explicación de como o ribosoma elimina Mdf1 para reactivar a síntese de proteínas.
Non obstante, a nosa estrutura revelou un contacto descoñecido entre Mdf1 e a pata do ribosoma L1 (a parte do ribosoma que axuda a liberar o ARNt desacilado do ribosoma durante a síntese de proteínas).En particular, Mdf1 usa os mesmos contactos que o segmento do cóbado da molécula de ARNt desacilado (Fig. 2).Este modelado molecular previamente descoñecido mostrou que Mdf1 se disocia do ribosoma usando o mesmo mecanismo que o ARNt desacetilado, o que explica como o ribosoma elimina este factor de hibernación para reactivar a síntese de proteínas.
Ao construír o modelo de ARNr, descubrimos que o ribosoma de E. cuniculi ten fragmentos de ARNr pregados anormalmente, aos que chamamos ARNr fusionado (Fig. 3).Nos ribosomas que abarcan os tres dominios da vida, o ARNr prágase en estruturas nas que a maioría das bases de ARNr se emparejan e se pregan entre si ou interactúan coas proteínas ribosómicas38,39,40.Porén, nos ribosomas de E. cuniculi, os ARNr parecen violar este principio de pregamento ao converter algunhas das súas hélices en rexións de ARNr despregadas.
Estrutura da hélice de ARNr H18 25S en S. cerevisiae, V. necatrix e E. cuniculi.Normalmente, nos ribosomas que abarcan os tres dominios vitais, este enlazador enrólase nunha hélice de ARN que contén de 24 a 34 residuos.En Microsporidia, pola contra, este enlazador de ARNr redúcese gradualmente a dous enlazadores ricos en uridina monocatenario que conteñen só 12 residuos.A maioría destes residuos están expostos a disolventes.A figura mostra que os microsporidios parasitarios parecen violar os principios xerais do pregamento do ARNr, onde as bases de ARNr adoitan estar acopladas a outras bases ou están implicadas en interaccións ARNr-proteína.Nos microsporidios, algúns fragmentos de ARNr adquiren un pregamento desfavorable, no que a antiga hélice de ARNr convértese nun fragmento monocatenario alongado case en liña recta.A presenza destas rexións pouco habituais permite que o ARNr de microsporidios se una a fragmentos de ARNr distantes utilizando un número mínimo de bases de ARN.
O exemplo máis rechamante desta transición evolutiva pódese observar na hélice de ARNr H18 25S (Fig. 3).Nas especies desde E. coli ata humanos, as bases desta hélice de ARNr conteñen 24-32 nucleótidos, formando unha hélice lixeiramente irregular.Nas estruturas ribosómicas previamente identificadas de V. necatrix e P. locustae,31,32 as bases da hélice H18 están parcialmente desenroladas, pero consérvase o emparellamento de bases de nucleótidos.Porén, en E. cuniculi este fragmento de ARNr convértese nos ligadores máis curtos 228UUUUUU232 e 301UUUUUUUU307.A diferenza dos fragmentos típicos de ARNr, estes enlazadores ricos en uridina non se enroscan nin fan contacto extensivo coas proteínas ribosómicas.Pola contra, adoptan estruturas abertas ao disolvente e totalmente despregadas nas que as cadeas de ARNr se estenden case rectas.Esta conformación estirada explica como E. cuniculi usa só 12 bases de ARN para encher o oco de 33 Å entre as hélices de ARNr H16 e H18, mentres que outras especies requiren polo menos o dobre de bases de ARNr para cubrir o oco.
Así, podemos demostrar que, mediante un pregamento enerxeticamente desfavorable, os microsporidios parasitarios desenvolveron unha estratexia para contraer incluso aqueles segmentos de ARNr que permanecen amplamente conservados entre as especies dos tres dominios da vida.Ao parecer, ao acumular mutacións que transforman as hélices de ARNr en enlaces poli-U curtos, E. cuniculi pode formar fragmentos de ARNr pouco habituais que conteñan o menor número posible de nucleótidos para a ligación de fragmentos distais de ARNr.Isto axuda a explicar como os microsporidios lograron unha redución dramática da súa estrutura molecular básica sen perder a súa integridade estrutural e funcional.
Outra característica inusual do ARNr de E. cuniculi é a aparición de ARNr sen engrosamentos (Fig. 4).As protuberancias son nucleótidos sen pares de bases que se retorcen fóra da hélice de ARN en lugar de esconderse nela.A maioría das protuberancias de ARNr actúan como adhesivos moleculares, axudando a unir proteínas ribosómicas adxacentes ou outros fragmentos de ARNr.Algunhas protuberancias actúan como bisagras, permitindo que a hélice de ARNr se flexione e se dobra de forma óptima para a síntese produtiva de proteínas 41 .
a Unha protrusión de ARNr (numeración de S. cerevisiae) está ausente na estrutura do ribosoma de E. cuniculi, pero está presente na maioría dos outros eucariotas b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens e E. cuniculi ribosomas internos.Os parasitos carecen de moitas das protuberancias antigas e moi conservadas de ARNr.Estes engrosamentos estabilizan a estrutura do ribosoma;polo tanto, a súa ausencia nos microsporidios indica unha reducida estabilidade do pregamento do ARNr nos parasitos de microsporidios.A comparación cos talos P (taos L7/L12 en bacterias) mostra que a perda de protuberancias de ARNr ás veces coincide coa aparición de novas protuberancias xunto ás protuberancias perdidas.A hélice H42 do ARNr 23S/28S ten unha protuberancia antiga (U1206 en Saccharomyces cerevisiae) que se estima que ten polo menos 3.500 millóns de anos debido á súa protección en tres dominios da vida.Nos microsporidios, este bulto elimínase.Porén, apareceu unha nova protuberancia xunto á perdida (A1306 en E. cuniculi).
Sorprendentemente, descubrimos que os ribosomas de E. cuniculi carecen da maioría das protuberancias de ARNr que se atopan noutras especies, incluíndo máis de 30 protuberancias conservadas noutros eucariotas (Fig. 4a).Esta perda elimina moitos contactos entre as subunidades ribosómicas e as hélices de ARNr adxacentes, ás veces creando grandes baleiros ocos dentro do ribosoma, facendo que o ribosoma de E. cuniculi sexa máis poroso en comparación cos ribosomas máis tradicionais (Fig. 4b).En particular, descubrimos que a maioría destas protuberancias tamén se perderon nas estruturas dos ribosomas de V. necatrix e P. locustae previamente identificadas, que foron ignoradas por análises estruturais anteriores31,32.
Ás veces, a perda de protuberancias de ARNr vai acompañada do desenvolvemento de novas protuberancias xunto á protuberancia perdida.Por exemplo, o talo P ribosómico contén unha protuberancia U1208 (en Saccharomyces cerevisiae) que sobreviviu de E. coli aos humanos e, polo tanto, estímase que ten 3.500 millóns de anos.Durante a síntese de proteínas, este bulto axuda ao talo P a moverse entre conformacións abertas e pechadas para que o ribosoma poida recrutar factores de tradución e entregalos ao sitio activo.Nos ribosomas de E. cuniculi, este engrosamento está ausente;porén, un novo engrosamento (G883) situado só en tres pares de bases pode contribuír á restauración da flexibilidade óptima do talo P (Fig. 4c).
Os nosos datos sobre ARNr sen protuberancias suxiren que a minimización do ARNr non se limita á perda de elementos de ARNr na superficie do ribosoma, senón que tamén pode implicar o núcleo do ribosoma, creando un defecto molecular específico do parasito que non se describiu nas células de vida libre.obsérvanse especies vivas.
Despois de modelar as proteínas ribosómicas canónicas e o ARNr, descubrimos que os compoñentes ribosómicos convencionais non poden explicar as tres partes da imaxe crio-EM.Dous destes fragmentos son moléculas de tamaño pequeno (fig. 5, figura complementaria 8).O primeiro segmento está encaixado entre as proteínas ribosómicas uL15 e eL18 nunha posición que normalmente ocupa o extremo C-terminal de eL18, que se acurta en E. cuniculi.Aínda que non podemos determinar a identidade desta molécula, o tamaño e a forma desta illa de densidade explícanse ben pola presenza de moléculas de espermidina.A súa unión ao ribosoma está estabilizada por mutacións específicas de microsporidios nas proteínas uL15 (Asp51 e Arg56), que parecen aumentar a afinidade do ribosoma por esta pequena molécula, xa que permiten que uL15 envolva a pequena molécula nunha estrutura ribosómica.Figura complementaria 2).8, datos adicionais 1, 2).
Imaxe crio-EM que mostra a presenza de nucleótidos fóra da ribosa unidos ao ribosoma de E. cuniculi.No ribosoma de E. cuniculi, este nucleótido ocupa o mesmo lugar que o nucleótido 25S ARNr A3186 (numeración Saccharomyces cerevisiae) na maioría dos outros ribosomas eucariotas.b Na estrutura ribosómica de E. cuniculi, este nucleótido sitúase entre as proteínas ribosómicas uL9 e eL20, estabilizando así o contacto entre as dúas proteínas.Análise de conservación de secuencias cd eL20 entre especies de microsporidios.A árbore filoxenética das especies de Microsporidia (c) e o aliñamento de secuencias múltiples da proteína eL20 (d) mostran que os residuos de unión de nucleótidos F170 e K172 consérvanse na maioría dos Microsporidia típicos, coa excepción de S. lophii, coa excepción dos Microsporidia de ramificación precoz, que mantiveron a extensión do ARN ES39.e Esta figura mostra que os residuos de unión de nucleótidos F170 e K172 só están presentes en eL20 do xenoma moi reducido de microsporidios, pero non noutros eucariotas.En xeral, estes datos suxiren que os ribosomas de microsporidios desenvolveron un sitio de unión de nucleótidos que parece unirse ás moléculas de AMP e usalas para estabilizar as interaccións proteína-proteína na estrutura do ribosoma.A alta conservación deste sitio de unión en Microsporidia e a súa ausencia noutros eucariotas suxire que este sitio pode proporcionar unha vantaxe de supervivencia selectiva para Microsporidia.Así, o peto de unión de nucleótidos no ribosoma de microsporidia non parece ser unha característica dexenerada ou unha forma final da degradación do ARNr como se describiu anteriormente, senón unha innovación evolutiva útil que permite que o ribosoma dos microsporidios se una directamente a pequenas moléculas, usándoas como bloques de construción moleculares.bloques de construción para ribosomas.Este descubrimento fai que o ribosoma de microsporidios sexa o único ribosoma coñecido que usa un só nucleótido como bloque estrutural.f Vía evolutiva hipotética derivada da unión de nucleótidos.
A segunda densidade de baixo peso molecular sitúase na interface entre as proteínas ribosómicas uL9 e eL30 (Fig. 5a).Esta interface foi previamente descrita na estrutura do ribosoma Saccharomyces cerevisiae como un sitio de unión para o nucleótido 25S do ARNr A3186 (parte da extensión de ARNr ES39L)38.Demostrouse que nos ribosomas ES39L dexenerados de P. locustae, esta interface únese a un único nucleótido 31 descoñecido, e suponse que este nucleótido é unha forma final reducida de ARNr, na que a lonxitude do ARNr é de ~130-230 bases.ES39L redúcese a un só nucleótido 32,43.As nosas imaxes crio-EM apoian a idea de que a densidade pode ser explicada polos nucleótidos.Non obstante, a maior resolución da nosa estrutura mostrou que este nucleótido é unha molécula extraribosomal, posiblemente AMP (Fig. 5a, b).
Despois preguntamos se o sitio de unión dos nucleótidos apareceu no ribosoma de E. cuniculi ou se existía anteriormente.Dado que a unión de nucleótidos está mediada principalmente polos residuos Phe170 e Lys172 na proteína ribosómica eL30, avaliamos a conservación destes residuos en 4396 eucariotas representativos.Como no caso de uL15 anterior, descubrimos que os residuos Phe170 e Lys172 están altamente conservados só nos Microsporidia típicos, pero ausentes noutros eucariotas, incluídos os Microsporidia Mitosporidium e Amphiamblys atípicos, nos que o fragmento de ARNr ES39L non se reduce 44, 45.-e).
En conxunto, estes datos apoian a idea de que E. cuniculi e posiblemente outros microsporidios canónicos desenvolveron a capacidade de capturar de forma eficiente un gran número de pequenos metabolitos na estrutura do ribosoma para compensar o descenso dos niveis de ARNr e proteínas.Ao facelo, desenvolveron unha capacidade única para unirse a nucleótidos fóra do ribosoma, mostrando que as estruturas moleculares parasitarias compensan capturando pequenos metabolitos abundantes e usándoos como imitadores estruturais de fragmentos de ARN e proteínas degradados..
A terceira parte non simulada do noso mapa crio-EM, atopada na subunidade ribosómica grande.A resolución relativamente alta (2,6 Å) do noso mapa suxire que esta densidade pertence a proteínas con combinacións únicas de residuos de cadeas laterales grandes, o que nos permitiu identificar esta densidade como unha proteína ribosómica previamente descoñecida que identificamos como msL2 (proteína específica de Microsporidia L2) (métodos, figura 6).A nosa busca de homoloxía mostrou que o msL2 consérvase no clado Microsporidia do xénero Encephaliter e Orosporidium, pero ausente noutras especies, incluíndo outros Microsporidia.Na estrutura ribosómica, o msL2 ocupa un oco formado pola perda do ARNr ES31L estendido.Neste baleiro, msL2 axuda a estabilizar o pregamento do ARNr e pode compensar a perda de ES31L (Figura 6).
a Densidade electrónica e modelo da proteína ribosómica específica de Microsporidia msL2 que se atopa nos ribosomas de E. cuniculi.b A maioría dos ribosomas eucariotas, incluído o ribosoma 80S de Saccharomyces cerevisiae, teñen a amplificación do ARNr de ES19L perdida na maioría das especies de microsporidios.A estrutura previamente establecida do ribosoma de microsporidia de V. necatrix suxire que a perda de ES19L nestes parasitos está compensada pola evolución da nova proteína ribosómica msL1.Neste estudo, descubrimos que o ribosoma de E. cuniculi tamén desenvolveu unha proteína adicional que imita o ARN ribosómico como unha aparente compensación pola perda de ES19L.Non obstante, a msL2 (actualmente anotada como a hipotética proteína ECU06_1135) e a msL1 teñen orixes estruturais e evolutivas diferentes.c Este descubrimento da xeración de proteínas ribosómicas msL1 e msL2 non relacionadas evolutivamente suxire que se os ribosomas acumulan mutacións prexudiciais no seu ARNr, poden acadar niveis de diversidade compositiva sen precedentes incluso nun pequeno subconxunto de especies estreitamente relacionadas.Este descubrimento podería axudar a aclarar a orixe e evolución do ribosoma mitocondrial, que é coñecido polo seu ARNr moi reducido e pola súa variabilidade anormal na composición das proteínas entre as especies.
Despois comparamos a proteína msL2 coa proteína msL1 descrita anteriormente, a única proteína ribosómica específica de microsporidios coñecida que se atopa no ribosoma de V. necatrix.Queriamos probar se msL1 e msL2 están relacionados evolutivamente.A nosa análise mostrou que msL1 e msL2 ocupan a mesma cavidade na estrutura ribosómica, pero teñen diferentes estruturas primarias e terciarias, o que indica a súa orixe evolutiva independente (Fig. 6).Así, o noso descubrimento de msL2 proporciona evidencia de que grupos de especies eucariotas compactas poden evolucionar de forma independente proteínas ribosómicas estruturalmente distintas para compensar a perda de fragmentos de ARNr.Este achado é notable porque a maioría dos ribosomas eucariotas citoplasmáticos conteñen unha proteína invariante, incluíndo a mesma familia de 81 proteínas ribosómicas.A aparición de msL1 e msL2 en varios clados de microsporidios en resposta á perda de segmentos de ARNr estendidos suxire que a degradación da arquitectura molecular do parasito fai que os parasitos busquen mutacións compensatorias, que poden eventualmente levar á súa adquisición en diferentes poboacións de parasitos.estruturas.
Finalmente, cando se completou o noso modelo, comparamos a composición do ribosoma de E. cuniculi coa predita a partir da secuencia do xenoma.Anteriormente pensábase que varias proteínas ribosómicas, incluíndo eL14, eL38, eL41 e eS30, faltaban no xenoma de E. cuniculi debido á aparente ausencia dos seus homólogos no xenoma de E. cuniculi.Tamén se prevé a perda de moitas proteínas ribosómicas na maioría dos outros parasitos intracelulares e endosimbiontes moi reducidos.Por exemplo, aínda que a maioría das bacterias de vida libre conteñen a mesma familia de 54 proteínas ribosómicas, só 11 destas familias de proteínas teñen homólogos detectables en cada xenoma analizado de bacterias restrinxidas ao hóspede.En apoio a esta noción, observouse experimentalmente unha perda de proteínas ribosómicas nos microsporidios de V. necatrix e P. locustae, que carecen das proteínas eL38 e eL4131,32.
Non obstante, as nosas estruturas mostran que só eL38, eL41 e eS30 se perden realmente no ribosoma de E. cuniculi.A proteína eL14 conservouse e a nosa estrutura mostrou por que esta proteína non se puido atopar na busca de homoloxía (Fig. 7).Nos ribosomas de E. cuniculi, a maior parte do sitio de unión de eL14 pérdese debido á degradación do ES39L amplificado con ARNr.En ausencia de ES39L, eL14 perdeu a maior parte da súa estrutura secundaria, e só o 18% da secuencia eL14 era idéntica en E. cuniculi e S. cerevisiae.Esta mala conservación da secuencia é notable porque ata Saccharomyces cerevisiae e Homo sapiens -organismos que evolucionaron con 1.500 millóns de anos de diferenza- comparten máis do 51% dos mesmos residuos en eL14.Esta perda anómala de conservación explica por que E. cuniculi eL14 está actualmente anotada como a proteína M970_061160 putativa e non como a proteína ribosómica eL1427.
e O ribosoma Microsporidia perdeu a extensión de ARNr ES39L, que eliminou parcialmente o sitio de unión á proteína ribosómica eL14.En ausencia de ES39L, a proteína de microsporas eL14 sofre unha perda de estrutura secundaria, na que a antiga hélice α de unión ao ARNr dexenera nun bucle de lonxitude mínima.b O aliñamento de secuencias múltiples mostra que a proteína eL14 está moi conservada nas especies eucariotas (identidade de secuencia do 57 % entre lévedos e homólogos humanos), pero mal conservada e diverxente nos microsporidios (nos que non máis do 24 % dos residuos son idénticos ao homólogo eL14).de S. cerevisiae ou H. sapiens).Esta mala conservación de secuencias e a variabilidade da estrutura secundaria explica por que nunca se atopou o homólogo eL14 en E. cuniculi e por que se pensa que esta proteína se perdeu en E. cuniculi.Pola contra, E. cuniculi eL14 anotouse previamente como unha proteína suposta M970_061160.Esta observación suxire que a diversidade do xenoma dos microsporidios está actualmente sobreestimada: algúns xenes que actualmente se pensa que se perderon nos microsporidios consérvanse de feito, aínda que en formas moi diferenciadas;en cambio, pénsase que algúns codifican xenes de microsporidios para proteínas específicas de vermes (por exemplo, a hipotética proteína M970_061160) en realidade codifican as moi diversas proteínas que se atopan noutros eucariotas.
Este achado suxire que a desnaturalización do ARNr pode levar a unha perda dramática da conservación da secuencia nas proteínas ribosómicas adxacentes, facendo que estas proteínas sexan indetectables para as buscas de homoloxía.Así, podemos sobreestimar o grao real de degradación molecular en pequenos organismos do xenoma, xa que algunhas proteínas que se pensa que se perderon en realidade persisten, aínda que en formas moi alteradas.
Como poden os parasitos reter a función das súas máquinas moleculares en condicións de redución do xenoma extrema?O noso estudo responde a esta pregunta describindo a complexa estrutura molecular (ribosoma) de E. cuniculi, un organismo cun dos xenomas eucariotas máis pequenos.
Desde hai case dúas décadas sábese que as moléculas de proteínas e ARN dos parasitos microbianos a miúdo difiren das súas moléculas homólogas nas especies de vida libre porque carecen de centros de control de calidade, redúcense ao 50% do seu tamaño nos microbios de vida libre, etc.moitas mutacións debilitantes que prexudican o pregamento e a función.Por exemplo, espérase que os ribosomas de pequenos organismos de xenoma, incluídos moitos parasitos intracelulares e endosimbiontes, carezan de varias proteínas ribosómicas e de ata un terzo de nucleótidos de ARNr en comparación coas especies de vida libre 27, 29, 30, 49. Non obstante, a forma en que estas moléculas funcionan no parasito segue sendo principalmente un gran parasito.
O noso estudo mostra que a estrutura das macromoléculas pode revelar moitos aspectos da evolución que son difíciles de extraer dos estudos xenómicos comparativos tradicionais de parasitos intracelulares e outros organismos restrinxidos polo hóspede (figura complementaria 7).Por exemplo, o exemplo da proteína eL14 mostra que podemos sobreestimar o grao real de degradación do aparello molecular en especies parasitarias.Agora crese que os parasitos encefalíticas teñen centos de xenes específicos de microsporidios.Non obstante, os nosos resultados mostran que algúns destes xenes aparentemente específicos son en realidade só variantes moi diferentes de xenes que son comúns noutros eucariotas.Ademais, o exemplo da proteína msL2 mostra como pasamos por alto as novas proteínas ribosómicas e subestimamos o contido das máquinas moleculares parasitarias.O exemplo das pequenas moléculas mostra como podemos pasar por alto as innovacións máis enxeñosas nas estruturas moleculares parasitarias que poden darlles nova actividade biolóxica.
En conxunto, estes resultados melloran a nosa comprensión das diferenzas entre as estruturas moleculares dos organismos con restrición de hóspede e os seus homólogos en organismos de vida libre.Amosamos que as máquinas moleculares, pensadas durante moito tempo como reducidas, dexeneradas e suxeitas a varias mutacións debilitantes, teñen un conxunto de características estruturais pouco habituais sistemáticamente ignoradas.
Por outra banda, os fragmentos non voluminosos de ARNr e os fragmentos fusionados que atopamos nos ribosomas de E. cuniculi suxiren que a redución do xenoma pode cambiar incluso aquelas partes da maquinaria molecular básica que se conservan nos tres dominios da vida, despois de case 3.500 millóns de anos.evolución independente das especies.
Os fragmentos de ARNr fusionados e libres de protuberancias nos ribosomas de E. cuniculi son de particular interese á luz de estudos previos de moléculas de ARN en bacterias endosimbióticas.Por exemplo, no endosimbionte de pulgón Buchnera aphidicola, as moléculas de ARNr e ARNt demostraron que teñen estruturas sensibles á temperatura debido ao sesgo da composición A+T e a unha alta proporción de pares de bases non canónicas20,50.Estes cambios no ARN, así como os cambios nas moléculas de proteínas, agora pénsase que son os responsables da excesiva dependencia dos endosimbiontes dos compañeiros e da incapacidade dos endosimbiontes para transferir calor 21, 23 .Aínda que o ARNr de microsporidios parasitos ten cambios estruturalmente distintos, a natureza destes cambios suxire que a reducida estabilidade térmica e unha maior dependencia das proteínas chaperonas poden ser características comúns das moléculas de ARN en organismos con xenomas reducidos.
Por outra banda, as nosas estruturas mostran que os microsporidios do parasito desenvolveron unha capacidade única para resistir fragmentos de ARNr e proteínas amplamente conservados, desenvolvendo a capacidade de utilizar metabolitos pequenos abundantes e facilmente dispoñibles como imitadores estruturais de fragmentos de ARNr e proteínas dexenerados.Degradación da estrutura molecular..Esta opinión está apoiada polo feito de que pequenas moléculas que compensan a perda de fragmentos de proteína no ARNr e ribosomas de E. cuniculi únense a residuos específicos de microsporidios nas proteínas uL15 e eL30.Isto suxire que a unión de moléculas pequenas aos ribosomas pode ser un produto da selección positiva, na que se seleccionaron mutacións específicas de Microsporidia en proteínas ribosómicas pola súa capacidade de aumentar a afinidade dos ribosomas por moléculas pequenas, o que pode levar a organismos ribosómicos máis eficientes.O descubrimento revela unha innovación intelixente na estrutura molecular dos parasitos microbianos e dános unha mellor comprensión de como as estruturas moleculares dos parasitos manteñen a súa función a pesar da evolución redutiva.
Na actualidade, a identificación destas pequenas moléculas segue sen estar clara.Non está claro por que a aparición destas pequenas moléculas na estrutura ribosomal difire entre as especies de microsporidios.En particular, non está claro por que se observa a unión de nucleótidos nos ribosomas de E. cuniculi e P. locustae, e non nos ribosomas de V. necatrix, a pesar da presenza do residuo F170 nas proteínas eL20 e K172 de V. necatrix.Esta deleción pode ser causada polo residuo 43 uL6 (situado xunto ao peto de unión de nucleótidos), que é a tirosina en V. necatrix e non a treonina en E. cuniculi e P. locustae.A voluminosa cadea lateral aromática de Tyr43 pode interferir coa unión de nucleótidos debido á superposición estérica.Alternativamente, a deleción de nucleótidos aparente pode deberse á baixa resolución da imaxe crio-EM, que dificulta a modelización dos fragmentos ribosómicos de V. necatrix.
Por outra banda, o noso traballo suxire que o proceso de desintegración do xenoma pode ser unha forza inventiva.En particular, a estrutura do ribosoma de E. cuniculi suxire que a perda de fragmentos de ARNr e proteínas no ribosoma de microsporidios crea unha presión evolutiva que promove cambios na estrutura do ribosoma.Estas variantes prodúcense lonxe do sitio activo do ribosoma e parecen axudar a manter (ou restaurar) o ensamblaxe óptimo dos ribosomas que, doutro xeito, se vería interrompido pola redución do ARNr.Isto suxire que unha gran innovación do ribosoma de microsporidios parece ter evolucionado cara á necesidade de amortiguar a deriva xenética.
Quizais isto se ilustre mellor coa unión de nucleótidos, que nunca se observou noutros organismos ata agora.O feito de que os residuos de unión de nucleótidos estean presentes nos microsporidios típicos, pero non noutros eucariotas, suxire que os sitios de unión de nucleótidos non son só reliquias que agardan a desaparecer, ou o sitio final para que o ARNr se restaure a forma de nucleótidos individuais.Pola contra, este sitio parece unha función útil que podería ter evolucionado ao longo de varias roldas de selección positiva.Os sitios de unión de nucleótidos poden ser un subproduto da selección natural: unha vez que ES39L é degradado, os microsporidios vense obrigados a buscar compensación para restaurar a bioxénese óptima dos ribosomas en ausencia de ES39L.Dado que este nucleótido pode imitar os contactos moleculares do nucleótido A3186 en ES39L, a molécula de nucleótido convértese nun bloque de construción do ribosoma, cuxa unión mellora aínda máis pola mutación da secuencia eL30.
No que se refire á evolución molecular dos parasitos intracelulares, o noso estudo mostra que as forzas da selección natural darwiniana e a deriva xenética da decadencia do xenoma non operan en paralelo, senón que oscilan.En primeiro lugar, a deriva xenética elimina características importantes das biomoléculas, polo que a compensación é moi necesaria.Só cando os parasitos satisfagan esta necesidade mediante a selección natural darwiniana, as súas macromoléculas terán a oportunidade de desenvolver os seus trazos máis impresionantes e innovadores.É importante destacar que a evolución dos sitios de unión de nucleótidos no ribosoma de E. cuniculi suxire que este patrón de perda por ganancia da evolución molecular non só amortiza mutacións deletéreas, senón que ás veces confire funcións totalmente novas ás macromoléculas parasitarias.
Esta idea é consistente coa teoría do equilibrio móbil de Sewell Wright, que afirma que un sistema estrito de selección natural limita a capacidade dos organismos para innovar51,52,53.Non obstante, se a deriva xenética perturba a selección natural, estas derivas poden producir cambios que non son por si mesmos adaptativos (ou mesmo prexudiciais) pero que conducen a novos cambios que proporcionan unha maior aptitude ou actividade biolóxica nova.O noso marco apoia esta idea ilustrando que o mesmo tipo de mutación que reduce o pregamento e a función dunha biomolécula parece ser o principal detonante da súa mellora.En consonancia co modelo evolutivo gaña-gañou, o noso estudo mostra que a desintegración do xenoma, tradicionalmente vista como un proceso dexenerativo, é tamén un motor importante da innovación, que ás veces e quizais ata moitas veces permite que as macromoléculas adquiran novas actividades parasitarias.pode usalos.