Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, renderizaremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Recentemente, desenvolveuse unha plataforma antimicrobiana libre de produtos químicos baseada na nanotecnoloxía que emprega nanoestruturas de auga artificial (EWNS). As EWNS teñen unha carga superficial elevada e están saturadas con especies reactivas de osíxeno (ROS) que poden interactuar con varios microorganismos, incluídos os patóxenos transmitidos polos alimentos, e inactivalos. Aquí demóstrase que as súas propiedades durante a síntese poden axustarse e optimizarse para mellorar aínda máis o seu potencial antibacteriano. A plataforma de laboratorio de EWNS foi deseñada para axustar as propiedades das EWNS modificando os parámetros de síntese. Caracterización das propiedades das EWNS (carga, tamaño e contido de ROS) utilizando métodos analíticos modernos. Ademais, avaliouse o seu potencial de inactivación microbiana contra microorganismos transmitidos polos alimentos como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum e Saccharomyces cerevisiae. Os resultados presentados aquí demostran que as propiedades das EWNS poden axustarse durante a síntese, o que resulta nun aumento exponencial da eficiencia de inactivación. En particular, a carga superficial aumentou por un factor de catro e as especies reactivas de osíxeno aumentaron. A taxa de eliminación microbiana foi dependente dos microbios e oscilou entre 1,0 e 3,8 log despois dunha exposición de 45 minutos a unha dose de aerosol de 40.000 #/cc de EWNS.
A contaminación microbiana é a principal causa de enfermidades transmitidas polos alimentos causadas pola inxestión de patóxenos ou as súas toxinas. Só nos Estados Unidos, as enfermidades transmitidas polos alimentos causan uns 76 millóns de enfermidades, 325 000 ingresos hospitalarios e 5000 mortes cada ano1. Ademais, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estima que o aumento do consumo de produtos frescos é responsable do 48 % de todas as enfermidades transmitidas polos alimentos notificadas nos Estados Unidos2. O custo das enfermidades e mortes causadas por patóxenos transmitidos polos alimentos nos Estados Unidos é moi elevado, estimado polos Centros para o Control e a Prevención de Enfermidades (CDC) en máis de 15 600 millóns de dólares estadounidenses ao ano3.
Actualmente, as intervencións antimicrobianas químicas4, radiativas5 e térmicas6 para garantir a seguridade alimentaria lévanse a cabo principalmente en puntos críticos de control (PCC) limitados ao longo da cadea de produción (xeralmente despois da colleita e/ou durante o envasado) en lugar de de forma continua. Polo tanto, son propensas á contaminación cruzada. 7. Un mellor control das enfermidades transmitidas polos alimentos e a deterioración dos alimentos require intervencións antimicrobianas que poidan aplicarse potencialmente en todo o continuo da granxa á mesa, á vez que reducen o impacto e os custos ambientais.
Recentemente, desenvolveuse unha plataforma antimicrobiana baseada na nanotecnoloxía e libre de produtos químicos que pode inactivar bacterias superficiais e transportadas polo aire mediante nanoestruturas de auga artificiais (EWNS). As EWNS sintetizáronse mediante dous procesos paralelos, electropulverización e ionización de auga (Fig. 1a). Estudos previos demostraron que as EWNS teñen un conxunto único de propiedades físicas e biolóxicas8,9,10. As EWNS teñen unha media de 10 electróns por estrutura e un tamaño medio a nanoescala de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Ademais, a resonancia de espín electrónico (ESR) mostrou que as EWNS conteñen unha gran cantidade de especies reactivas de osíxeno (ROS), principalmente radicais hidroxilo (OH•) e superóxido (O2-) (Fig. 1c)8. As EVNS permanecen no aire durante moito tempo e poden chocar con microorganismos suspendidos no aire e presentes na superficie, entregando a súa carga útil de ROS e causando a inactivación dos microorganismos (Fig. 1d). Estes primeiros estudos tamén demostraron que as EWNS poden interactuar con diversas bacterias gramnegativas e grampositivas, incluídas as micobacterias, e inactivalas en superficies e no aire. A microscopía electrónica de transmisión mostrou que a inactivación estaba causada pola alteración da membrana celular. Ademais, os estudos de inhalación aguda demostraron que as doses altas de EWNS non causan danos nin inflamación pulmonar 8.
(a) A electropulverización prodúcese cando se aplica unha alta voltaxe entre un tubo capilar que contén líquido e un contraelectrodo. (b) A aplicación de alta presión dá lugar a dous fenómenos diferentes: (i) electropulverización de auga e (ii) formación de especies reactivas de osíxeno (ións) atrapadas nos EWNS. (c) A estrutura única dos EWNS. (d) Debido á súa natureza a nanoescala, os EWNS son moi móbiles e poden interactuar con patóxenos transportados polo aire.
Recentemente tamén se demostrou a capacidade da plataforma antimicrobiana EWNS para inactivar microorganismos transmitidos polos alimentos na superficie dos alimentos frescos. Tamén se mostrou que a carga superficial de EWNS en combinación cun campo eléctrico pódese usar para lograr unha administración dirixida. Ademais, os resultados preliminares para tomates orgánicos despois dunha exposición de 90 minutos a un EWNS de aproximadamente 50.000 #/cm3 foron alentadores, observándose varios microorganismos transmitidos polos alimentos como E. coli e Listeria 11. Ademais, as probas organolépticas preliminares non mostraron efectos sensoriais en comparación cos tomates de control. Aínda que estes resultados iniciais de inactivación son alentadores para aplicacións de seguridade alimentaria mesmo con doses moi baixas de EWNS de 50.000 #/cc. ver, está claro que un maior potencial de inactivación sería máis beneficioso para reducir aínda máis o risco de infección e deterioración.
Aquí, centraremos a nosa investigación no desenvolvemento dunha plataforma de xeración de EWNS para permitir o axuste fino dos parámetros de síntese e a optimización das propiedades fisicoquímicas dos EWNS para mellorar o seu potencial antibacteriano. En particular, a optimización centrouse en aumentar a súa carga superficial (para mellorar a administración dirixida) e o contido de ROS (para mellorar a eficiencia de inactivación). Caracterizar propiedades fisicoquímicas optimizadas (tamaño, carga e contido de ROS) utilizando métodos analíticos modernos e usar microorganismos alimentarios comúns como E. .
O EVNS sintetizouse mediante electropulverización e ionización simultáneas de auga de alta pureza (18 MΩ cm–1). O nebulizador eléctrico 12 úsase normalmente para a atomización de líquidos e a síntese de partículas 13 e fibras 14 de polímeros e cerámicas de tamaño controlado.
Como se detalla en publicacións anteriores 8, 9, 10, 11, nun experimento típico, aplicouse unha alta tensión entre un capilar metálico e un contraelectrodo conectado a terra. Durante este proceso, prodúcense dous fenómenos diferentes: i) electropulverización e ii) ionización da auga. Un forte campo eléctrico entre os dous eléctrodos fai que se acumulen cargas negativas na superficie da auga condensada, o que resulta na formación de conos de Taylor. Como resultado, fórmanse pingas de auga altamente cargadas, que continúan a descompoñerse en partículas máis pequenas, como na teoría de Rayleigh16. Ao mesmo tempo, os fortes campos eléctricos fan que algunhas moléculas de auga se dividan e desprendan electróns (ionicen), o que leva á formación dunha gran cantidade de especies reactivas de osíxeno (ROS)17. O ROS18 xerado simultaneamente encapsulouse en EWNS (Fig. 1c).
Na figura 2a móstrase o sistema de xeración de EWNS desenvolvido e empregado na síntese de EWNS neste estudo. A auga purificada almacenada nunha botella pechada introduciuse a través dun tubo de teflón (2 mm de diámetro interior) nunha agulla de aceiro inoxidable de 30G (capilar metálico). O fluxo de auga contrólase mediante a presión do aire dentro da botella, como se mostra na figura 2b. A agulla está montada nunha consola de teflón e pódese axustar manualmente a unha certa distancia do contraelectródo. O contraelectródo é un disco de aluminio pulido cun burato no centro para a mostraxe. Debaixo do contraelectródo hai un funil de mostraxe de aluminio, que está conectado ao resto da configuración experimental a través dun porto de mostraxe (figura 2b). Para evitar a acumulación de carga que podería interromper o funcionamento do mostrador, todos os compoñentes do mostrador están conectados electricamente a terra.
(a) Sistema de xeración de nanoestruturas de auga modificado (EWNS). (b) Sección transversal do mostrador e da electropulverización, que mostra os parámetros máis importantes. (c) Configuración experimental para a inactivación de bacterias.
O sistema de xeración de EWNS descrito anteriormente é capaz de cambiar os parámetros operativos clave para facilitar o axuste fino das propiedades do EWNS. Axuste a tensión aplicada (V), a distancia entre a agulla e o contraelectrodo (L) e o fluxo de auga (φ) a través do capilar para axustar as características do EWNS. Símbolo utilizado para representar diferentes combinacións: [V (kV), L (cm)]. Axuste o fluxo de auga para obter un cono de Taylor estable dun certo conxunto [V, L]. Para os fins deste estudo, o diámetro da abertura do contraelectrodo (D) mantívose en 0,5 polgadas (1,29 cm).
Debido á xeometría limitada e á asimetría, a intensidade do campo eléctrico non se pode calcular a partir de principios básicos. No seu lugar, empregouse o software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 para calcular o campo eléctrico. O campo eléctrico non é uniforme, polo que o valor do campo eléctrico na punta do capilar utilizouse como valor de referencia para varias configuracións.
Durante o estudo, avaliáronse varias combinacións de tensión e distancia entre a agulla e o contraelectródo en termos de formación de conos de Taylor, estabilidade do cono de Taylor, estabilidade da produción de EWNS e reproducibilidade. Na táboa complementaria S1 móstranse varias combinacións.
A saída do sistema de xeración de EWNS conectouse directamente a un Analizador de Tamaño de Partículas de Mobilidade de Varrido (SMPS, Modelo 3936, TSI, Shoreview, MN) para a medición da concentración numérica de partículas, así como a un Electrómetro de Faraday para Aerosoles (TSI, Modelo 3068B, Shoreview, MN). ) para as correntes de aerosois mediuse como se describe na nosa publicación anterior. Tanto o SMPS como o electrómetro de aerosois tomaron mostras a un caudal de 0,5 L/min (caudal total de mostra de 1 L/min). A concentración numérica de partículas e o fluxo de aerosois medíronse durante 120 segundos. A medición repítese 30 veces. En función das medicións de corrente, calcúlase a carga total de aerosois e estímase a carga media de EWNS para un número total determinado de partículas de EWNS seleccionadas. O custo medio de EWNS pódese calcular usando a Ecuación (1):
onde IEl é a corrente medida, NSMPS é a concentración dixital medida co SMPS e φEl é o caudal por electrómetro.
Dado que a humidade relativa (HR) afecta á carga superficial, a temperatura e a (HR) mantivéronse constantes durante o experimento a 21 °C e 45 %, respectivamente.
Empregáronse microscopía de forza atómica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Bárbara, California) e a sonda AC260T (Olympus, Toquio, Xapón) para medir o tamaño e a vida útil do EWNS. A frecuencia de dixitalización AFM foi de 1 Hz, a área de dixitalización foi de 5 μm × 5 μm e as 256 liñas de dixitalización. Todas as imaxes foron sometidas a un aliñamento de imaxes de primeira orde usando o software Asylum (rango de máscara 100 nm, limiar 100 pm).
Retirouse o funil de proba e colocouse a superficie da mica a unha distancia de 2,0 cm do contraelectrodo durante un tempo medio de 120 s para evitar a aglomeración de partículas e a formación de pingas irregulares na superficie da mica. O EWNS pulverizouse directamente sobre a superficie da mica recentemente cortada (Ted Pella, Redding, CA). Imaxe da superficie da mica inmediatamente despois da pulverización AFM. O ángulo de contacto da superficie da mica sen modificar recentemente cortada é próximo a 0°, polo que o EVNS se distribúe na superficie da mica en forma de cúpula. O diámetro (a) e a altura (h) das pingas difusoras medíronse directamente a partir da topografía AFM e utilizáronse para calcular o volume de difusión abovedada do EWNS utilizando o noso método previamente validado. Asumindo que os EWNS integrados teñen o mesmo volume, o diámetro equivalente pódese calcular utilizando a ecuación (2):
Baseándonos no noso método desenvolvido previamente, utilizouse unha trampa de espín por resonancia de espín electrónico (ESR) para detectar a presenza de intermediarios radicais de vida curta en EWNS. Os aerosois burbulláronse a través dun burbullador Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) que contiña unha solución de 235 mM de DEPMPO(5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc.). Portland, Oregón). Todas as medicións de ESR realizáronse cun espectrómetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) e unha cela de panel plano. Utilizouse o software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) para recoller e analizar os datos. A determinación das características dos ROS levouse a cabo só para un conxunto de condicións de funcionamento [-6,5 kV, 4,0 cm]. As concentracións de EWNS medíronse utilizando o SMPS despois de ter en conta as perdas de EWNS no impactador.
Os niveis de ozono monitorizáronse cun monitor de ozono de dobre feixe 205™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Para todas as propiedades de EWNS, o valor medio úsase como valor de medición e a desviación estándar úsase como erro de medición. Realizáronse probas t para comparar os valores dos atributos de EWNS optimizados cos valores correspondentes do EWNS base.
A figura 2c mostra un sistema de "tirada" de precipitación electrostática (EPES) desenvolvido e caracterizado previamente que se pode empregar para a subministración dirixida de EWNS na superficie. O EPES emprega cargas de EVNS que se poden "guiar" directamente á superficie do obxectivo baixo a influencia dun forte campo eléctrico. Os detalles do sistema EPES preséntanse nunha publicación recente de Pyrgiotakis et al. 11 . Así, o EPES consiste nunha cámara de PVC impresa en 3D con extremos cónicos e contén dúas placas metálicas paralelas de aceiro inoxidable (aceiro inoxidable 304, con revestimento especular) no centro, separadas por 15,24 cm. As placas conectáronse a unha fonte externa de alta tensión (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), a placa inferior sempre estivo conectada a unha tensión positiva e a placa superior sempre estivo conectada a terra (terra flotante). As paredes da cámara están cubertas con papel de aluminio, que está conectada electricamente a terra para evitar a perda de partículas. A cámara ten unha porta de carga frontal selada que permite colocar as superficies de proba en soportes de plástico que as elevan por riba da placa metálica inferior para evitar interferencias de alta tensión.
A eficiencia de deposición de EWNS en EPES calculouse segundo un protocolo desenvolvido previamente detallado na Figura Suplementaria S111.
Como cámara de control, conectouse en serie unha segunda cámara de fluxo cilíndrica ao sistema EPES, no que se empregou un filtro HEPA intermedio para eliminar os EWNS. Como se mostra na Figura 2c, o aerosol de EWNS bombeouse a través de dúas cámaras integradas. O filtro entre a sala de control e o EPES elimina calquera EWNS restante, o que resulta nos mesmos niveis de temperatura (T), humidade relativa (HR) e ozono.
Descubriuse que importantes microorganismos transmitidos polos alimentos contaminan alimentos frescos como a *E. coli* (ATCC #27325), indicador fecal, a *Salmonella enterica* (ATCC #53647), patóxeno transmitido polos alimentos, a *Listeria harmful* (ATCC #33090), substituto da *Listeria monocytogenes* patóxena, derivada da *Saccharomyces cerevisiae* (ATCC #4098) da ATCC (Manassas, VA), un substituto do lévedo de deterioración, e unha bacteria inactivada máis resistente, a *Mycobacterium paralucky* (ATCC #19686).
Compra caixas aleatorias de tomates de uva ecolóxicos no teu mercado local e refrixera a 4 °C ata o seu uso (ata 3 días). Os tomates experimentais tiñan todos o mesmo tamaño, aproximadamente 1,25 cm de diámetro.
Os protocolos de cultivo, inoculación, exposición e reconto de colonias detállanse na nosa publicación anterior e nos datos suplementarios. A eficacia do EWNS avaliouse expondo tomates inoculados a 40.000 #/cm3 durante 45 minutos. En resumo, utilizáronse tres tomates para avaliar os microorganismos superviventes no tempo t = 0 min. Tres tomates colocáronse en EPES e expuxéronse a EWNS a 40.000 #/cc (tomates expostos a EWNS) e os tres restantes colocáronse na cámara de control (tomates de control). Non se levou a cabo un procesamento adicional dos tomates en ambos os grupos. Os tomates expostos a EWNS e os tomates de control retiráronse despois de 45 minutos para avaliar o efecto do EWNS.
Cada experimento realizouse por triplicado. A análise de datos realizouse segundo o protocolo descrito nos datos suplementarios.
Os mecanismos de inactivación avaliáronse mediante a sedimentación de mostras de EWNS expostas (45 min a unha concentración de aerosol de EWNS de 40.000 #/cm3) e mostras non irradiadas de bacterias inocuas E. coli, Salmonella enterica e Lactobacillus. As partículas fixáronse en glutaraldehído ao 2,5 %, paraformaldehído ao 1,25 % e ácido pícrico ao 0,03 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) durante 2 horas a temperatura ambiente. Despois do lavado, fixáronse posteriormente con tetróxido de osmio (OsO4) ao 1,5 % e ferrocianuro de potasio (KFeCN6) durante 2 horas, laváronse 3 veces en auga e incubáronse en acetato de uranilo ao 1 % durante 1 hora, laváronse dúas veces en auga e deshidratáronse durante 10 minutos en alcohol ao 50 %, 70 %, 90 % e 100 %. A continuación, as mostras colocáronse en óxido de propileno durante 1 hora e impregnáronse cunha mestura 1:1 de óxido de propileno e TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). As mostras incluíronse en TAAB Epon e polimerizáronse a 60 °C durante 48 horas. A resina granular curada cortouse e visualizouse mediante TEM usando un microscopio electrónico de transmisión convencional JEOL 1200EX (JEOL, Toquio, Xapón) equipado cunha cámara CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, EUA).
Todos os experimentos realizáronse por triplicado. Para cada punto de tempo, sementáronse lavados bacterianos por triplicado, o que resultou nun total de nove puntos de datos por punto, cuxa media se utilizou como a concentración bacteriana para ese microorganismo en particular. A desviación estándar utilizouse como o erro de medición. Todos os puntos contan.
O logaritmo da diminución da concentración de bacterias en comparación con t = 0 min calculouse usando a seguinte fórmula:
onde C0 é a concentración de bacterias na mostra de control no tempo 0 (é dicir, despois de que a superficie seque pero antes de colocala na cámara) e Cn é a concentración de bacterias na superficie despois de n minutos de exposición.
Para ter en conta a degradación natural das bacterias durante a exposición de 45 minutos, a redución logarítmica en comparación co control despois de 45 minutos tamén se calculou do seguinte xeito:
onde Cn é a concentración de bacterias na mostra de control no tempo n e Cn-Control é a concentración de bacterias de control no tempo n. Os datos preséntanse como unha redución logarítmica en comparación co control (sen exposición a EWNS).
Durante o estudo, avaliáronse varias combinacións de tensión e distancia entre a agulla e o contraelectródo en termos de formación de cono de Taylor, estabilidade do cono de Taylor, estabilidade da produción de EWNS e reproducibilidade. Na Táboa Suplementaria S1 móstranse varias combinacións. Seleccionáronse dous casos que mostran propiedades estables e reproducibles (cono de Taylor, xeración de EWNS e estabilidade ao longo do tempo) para un estudo exhaustivo. Na figura 3 móstranse os resultados para a carga, o tamaño e o contido de ROS en ambos os casos. Os resultados tamén se resumen na Táboa 1. Como referencia, tanto a Figura 3 como a Táboa 1 inclúen as propiedades dos EWNS8, 9, 10, 11 (EWNS de referencia) non optimizados sintetizados previamente. Os cálculos de significación estatística mediante unha proba t bilateral publícanse de novo na Táboa Suplementaria S2. Ademais, os datos adicionais inclúen estudos do efecto do diámetro do burato de mostraxe do contraelectródo (D) e a distancia entre o eléctrodo de terra e a punta (L) (Figuras Suplementarias S2 e S3).
(ac) Distribución de tamaño medida por AFM. (df) Característica da carga superficial. (g) Caracterización de ROS do EPR.
Tamén é importante sinalar que, para todas as condicións anteriores, a corrente de ionización medida estaba entre 2 e 6 μA e a tensión entre -3,8 e -6,5 kV, o que resultou nun consumo de enerxía inferior a 50 mW para este único módulo de contacto de xeración de EWNS. Aínda que o EWNS se sintetizou a alta presión, os niveis de ozono foron moi baixos, sen superar nunca os 60 ppb.
A Figura suplementaria S4 mostra os campos eléctricos simulados para os escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para os escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], os cálculos do campo son 2 × 10⁵ V/m e 4,7 × 10⁵ V/m, respectivamente. Isto é o esperado, xa que no segundo caso a relación tensión-distancia é moito maior.
Na figura 3a e b móstrase o diámetro do EWNS medido co AFM8. Os diámetros medios calculados dos EWNS foron de 27 nm e 19 nm para os esquemas [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para os escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], as desviacións estándar xeométricas das distribucións son 1,41 e 1,45, respectivamente, o que indica unha distribución de tamaño estreita. Tanto o tamaño medio como a desviación estándar xeométrica están moi preto do EWNS de referencia, a 25 nm e 1,41, respectivamente. Na figura 3c móstrase a distribución de tamaño do EWNS de referencia medido usando o mesmo método nas mesmas condicións.
Na figura 3d, e móstranse os resultados da caracterización da carga. Os datos son medicións medias de 30 medicións simultáneas de concentración (#/cm3) e corrente (I). A análise mostra que a carga media no EWNS é de 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- para [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Teñen cargas superficiais significativamente máis altas en comparación co EWNS de referencia (10 ± 2 e-), dúas veces maiores que o escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] e catro veces maiores que o [-3,8 kV, 0,5 cm]. A figura 3f mostra os datos de carga para o EWNS de referencia.
A partir dos mapas de concentración do número EWNS (Figuras suplementarias S5 e S6), pódese observar que o escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] ten significativamente máis partículas que o escenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Tamén cómpre sinalar que a concentración do número EWNS se monitorizou ata 4 horas (Figuras suplementarias S5 e S6), onde a estabilidade da xeración de EWNS mostrou os mesmos niveis de concentración do número de partículas en ambos os casos.
Na figura 3g móstrase o espectro de EPR despois da subtracción do control EWNS optimizado (fondo) a [-6,5 kV, 4,0 cm]. Os espectros de ROS tamén se compararon co escenario de liña base de EWNS nun traballo publicado previamente. O número de EWNS que reaccionaban con trampas de espín calculouse en 7,5 × 104 EWNS/s, o que é similar ao escenario de liña base de EWNS8 publicado previamente. Os espectros de EPR mostraron claramente a presenza de dous tipos de ROS, sendo o O2- a especie predominante e o OH• menos abundante. Ademais, unha comparación directa das intensidades dos picos mostrou que os EWNS optimizados tiñan un contido de ROS significativamente maior en comparación cos EWNS de liña base.
Na figura 4 móstrase a eficiencia de deposición de EWNS en EPES. Os datos tamén se resumen na táboa I e compáranse cos datos orixinais de EWNS. Para ambos os casos de EUNS, a deposición é próxima ao 100 % mesmo a unha baixa tensión de 3,0 kV. Normalmente, 3,0 kV son suficientes para unha deposición do 100 %, independentemente do cambio de carga superficial. Nas mesmas condicións, a eficiencia de deposición de Baseline-EWNS foi só do 56 % debido á súa menor carga (media de 10 electróns por EWNS).
Na figura 5 e na táboa 2 resúmese o valor de inactivación dos microorganismos inoculados na superficie dos tomates despois da exposición a uns 40 000 #/cm3 de EWNS durante 45 minutos no modo óptimo [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli e Lactobacillus innocuous inoculados mostraron unha redución significativa de 3,8 log durante os 45 minutos de exposición. Nas mesmas condicións, S. enterica tivo unha diminución de 2,2 log, mentres que S. cerevisiae e M. parafortutum tiveron unha diminución de 1,0 log.
As micrografías electrónicas (Figura 6) representan os cambios físicos inducidos polas EWNS en células inofensivas de Escherichia coli, Streptococcus e Lactobacillus, o que leva á súa inactivación. As bacterias de control tiñan membranas celulares intactas, mentres que as bacterias expostas tiñan membranas externas danadas.
A obtención de imaxes por microscopía electrónica das bacterias de control e expostas revelou danos na membrana.
Os datos sobre as propiedades fisicoquímicas dos EWNS optimizados mostran conxuntamente que as propiedades (carga superficial e contido de ROS) dos EWNS melloraron significativamente en comparación cos datos de referencia de EWNS publicados previamente8,9,10,11. Por outra banda, o seu tamaño mantívose no rango nanométrico, moi similar aos resultados presentados anteriormente, o que lles permite permanecer no aire durante longos períodos de tempo. A polidispersión observada pódese explicar polos cambios na carga superficial que determinan o tamaño dos EWNS, a aleatoriedade do efecto Rayleigh e a posible coalescencia. Non obstante, como detallaron Nielsen et al.22, unha carga superficial elevada reduce a evaporación ao aumentar eficazmente a enerxía/tensión superficial da pinga de auga. Na nosa publicación anterior8, esta teoría confirmouse experimentalmente para microgotas22 e EWNS. A perda de carga durante o tempo extra tamén pode afectar o tamaño e contribuír á distribución de tamaño observada.
Ademais, a carga por estrutura é duns 22-44 e-, dependendo da situación, o que é significativamente maior en comparación co EWNS básico, que ten unha carga media de 10 ± 2 electróns por estrutura. Non obstante, cómpre sinalar que esta é a carga media do EWNS. Seto et al. Demostrouse que a carga non é homoxénea e segue unha distribución log-normal21. En comparación co noso traballo anterior, duplicar a carga superficial duplica a eficiencia de deposición no sistema EPES a case o 100 %11.