Algúns temas de resolución de problemas de LC nunca están desactualizados, xa que hai problemas na práctica de LC, aínda que a tecnoloxía do instrumento mellora co paso do tempo. Hai moitas formas en que os problemas poden xurdir nun sistema de LC e acabar en mala forma. Cando xorden problemas relacionados coa forma do pico, unha pequena lista de posibles causas destes resultados axuda a simplificar a nosa experiencia de resolución de problemas.
Foi divertido escribir esta columna "Resolución de problemas de LC" e pensar en temas cada mes, porque algúns temas nunca pasan de moda. Aínda que no campo da investigación de cromatografía certos temas ou ideas quedan obsoletos ao ser substituídos por ideas máis novas e mellores, no campo da resolución de problemas, xa que o primeiro artigo de resolución de problemas apareceu nesta revista (o LC) desde entón, aínda son poucos temas relevantes na Revista LC. Centreime varias seccións de resolución de problemas de LC nas tendencias contemporáneas que afectan á cromatografía líquida (LC) (por exemplo, a comparación relativa da nosa comprensión do efecto da presión sobre a retención [2] Novos avances) A ​​nosa interpretación dos resultados da LC e como solucionar problemas cos instrumentos de LC modernos. Na entrega deste mes, continuou a miña serie de LC que comezou en decembro (3 e 2021). solución de problemas: os elementos que son excelentes para calquera solucionador de problemas son esenciais, sen importar a idade do sistema que esteamos a usar. O tema central desta serie é moi relevante para o famoso gráfico de parede "LC Troubleshooting Guide" do LCGC (4) que se colga en moitos laboratorios. Para a terceira parte desta serie, optei por centrarme nos problemas relacionados coa forma dos picos ou as características dos picos. todos estes problemas en detalle nun artigo, polo que nesta primeira entrega sobre o tema, centrareime nalgúns dos que vexo con máis frecuencia. Espero que os usuarios de LC novos e maiores atopen algúns consellos e recordatorios útiles sobre este importante tema.
Respondo cada vez máis ás preguntas de resolución de problemas con "todo é posible". Esta resposta pode parecer sinxela cando se consideran observacións difíciles de interpretar, pero a miúdo paréceme apropiada. Con moitas posibles causas de mala forma de pico, é importante manter a mente aberta ao considerar cal pode ser o problema e poder priorizar as posibles causas para comezar a resolver os posibles esforzos máis importantes.
Un paso clave en calquera exercicio de resolución de problemas, pero que creo que está infravalorado, é recoñecer que hai un problema que hai que resolver. Recoñecer que hai un problema moitas veces significa recoñecer que o que lle pasa á ferramenta é diferente das nosas expectativas, que están configuradas pola teoría, o coñecemento empírico e a experiencia (5). , esponjoso, bordo de ataque, cola, etc.), pero tamén ao ancho. As nosas expectativas para a forma real do pico son simples. A teoría (6) apoia ben a expectativa do libro de texto de que, na maioría dos casos, os picos cromatográficos deben ser simétricos e axustarse á forma dunha distribución gaussiana, como se mostra na Figura 1a. na Figura 1 móstranse algunhas das outras posibilidades que se poden observar, é dicir, algunhas das formas en que as cousas poden saír mal. No resto desta entrega, dedicaremos tempo a discutir algúns exemplos específicos de situacións que poden levar a estes tipos de formas.
Ás veces, os picos non se observan en absoluto no cromatograma onde se espera que sexan eluídos. O gráfico de parede anterior indica que a ausencia dun pico (supoñendo que a mostra contén realmente o analito obxectivo nunha concentración que debería facer que a resposta do detector sexa suficiente para velo por riba do ruído) adoita estar relacionada con algún problema do instrumento ou con condicións incorrectas da fase móbil (se se observan).picos, xeralmente demasiado "débiles"). Na Táboa I pódese atopar unha pequena lista de problemas e solucións potenciais nesta categoría.
Como se mencionou anteriormente, a cuestión de canto se debe tolerar o ensanchamento do pico antes de prestar atención e tratar de solucionalo é un tema complexo que comentarei nun artigo futuro. A miña experiencia é que o ensanchamento do pico significativo adoita ir acompañado dun cambio significativo na forma do pico, e que o ensanchamento do pico é máis común que o pre-pico ou a división.
Cada un destes problemas foi discutido en detalle en números anteriores de Troubleshooting LC, e os lectores interesados ​​nestes temas poden consultar estes artigos anteriores para obter información sobre as causas raíz e as posibles solucións a estes problemas.Máis detalles.
O peak tailing, a fronting de pico e a división poden ser causados ​​por fenómenos químicos ou físicos, e a lista de posibles solucións a estes problemas varía moito, dependendo de se estamos a tratar cun problema químico ou físico. Moitas veces, comparando os diferentes picos nun cromatograma, podes atopar pistas importantes sobre cal é o culpable. só un ou algúns picos están afectados, pero o resto parece ben, a causa é probablemente química.
As causas químicas do pico de colas son demasiado complexas para discutir brevemente aquí. O lector interesado remítese á recente edición de "LC Troubleshooting" para unha discusión máis profunda (10). Non obstante, unha cousa fácil de tentar é reducir a masa do analito inxectado e ver se a forma do pico mellora. pequenas masas de analito, ou as condicións cromatográficas deben cambiarse para que se poidan obter boas formas de pico mesmo con masas máis grandes inxectadas.
Tamén hai moitas razóns físicas potenciais para o pico de colas. Os lectores interesados ​​nunha discusión detallada das posibilidades remítense a outro número recente de "LC Troubleshooting" (11). Unha das causas físicas máis comúns do pico de colas é unha conexión deficiente nun punto entre o inxector e o detector (12). non usara antes e instalou un bucle de inxección de pequeno volume cunha virola que fora moldeada nun capilar de aceiro inoxidable. Despois dalgúns experimentos iniciais de solución de problemas, decatámonos de que a profundidade do porto no estator da válvula de inxección era moito máis profunda do que estabamos acostumados, o que producía un gran volume morto na parte inferior do porto. o volume morto no fondo do porto.
As frontes de pico como as que se mostran na Figura 1e tamén poden ser causadas por problemas físicos ou químicos. Unha causa física común do bordo de ataque é que o leito de partículas da columna non está ben embalado, ou que as partículas se reorganizaron co paso do tempo. Do mesmo xeito que co pico de colas causado por este fenómeno físico, a mellor forma de solucionar isto é substituír a columna e manter a súa forma. condicións de retención lineais”. En condicións ideais (lineais), a cantidade de analito retida pola fase estacionaria (polo tanto, o factor de retención) está linealmente relacionada coa concentración do analito na columna. Cromatográficamente, isto significa que a medida que aumenta a masa de analito inxectado na columna, o pico faise máis alto, pero non máis ancho. r a medida que se inxecta máis masa. Ademais, as formas non lineais determinan a forma dos picos cromatográficos, o que resulta en bordos de ataque ou de saída. Do mesmo xeito que ocorre coa sobrecarga de masa que provoca un pico de colas (10), o pico de avance causado pola retención non lineal tamén se pode diagnosticar reducindo a masa do analito inxectado. debe cambiarse para minimizar este comportamento.
Ás veces observamos o que parece ser un pico "dividido", como se mostra na Figura 1f. O primeiro paso para resolver este problema é determinar se a forma do pico se debe a unha coelución parcial (é dicir, a presenza de dous compostos distintos pero moi eluíntes). t” os picos están relacionados co físico. O rendemento non ten nada que ver coa propia columna. Moitas veces, a pista máis importante para esta decisión é se todos os picos do cromatograma presentan formas divididas, ou só un ou dous. Se é só un ou dous, probablemente sexa un problema de coelución;se todos os picos están divididos, probablemente sexa un problema físico, probablemente relacionado coa propia columna.
Os picos divididos relacionados coas propiedades físicas da propia columna adoitan deberse a fritas de entrada ou saída parcialmente bloqueadas, ou a reorganización das partículas na columna, o que permite que a fase móbil flúe máis rápido que a fase móbil en certas áreas da formación da canle da columna .noutras rexións (11).A frita parcialmente obstruída ás veces pode ser eliminada invertendo o fluxo a través da columna;porén, na miña experiencia, esta é normalmente unha solución a curto prazo e non a longo prazo. Isto é moitas veces fatal coas columnas modernas se as partículas se recombinan dentro da columna. Neste punto, é mellor substituír a columna e continuar.
O pico da Figura 1g, tamén dunha instancia recente no meu propio laboratorio, adoita indicar que o sinal é tan alto que alcanzou o extremo superior do intervalo de resposta. Para os detectores de absorbancia óptica (UV-vis neste caso), cando a concentración do analito é moi alta, o analito absorbe a maior parte da luz que atravesa a célula de fluxo do detector, deixando moi pouca luz para ser detectada polas distintas fontes eléctricas. de ruído, como a luz perdida e a "corrente escura", facendo que o sinal sexa moi "difuso" en aparencia e independente da concentración do analito.Cando isto ocorre, o problema a miúdo pódese resolver facilmente reducindo o volume de inxección do analito, reducindo o volume de inxección, diluíndo a mostra ou ambos.
Na escola de cromatografía, usamos o sinal do detector (é dicir, o eixe Y no cromatograma) como un indicador da concentración de analito na mostra. Polo que parece estraño ver un cromatograma cun sinal por debaixo de cero, xa que a interpretación sinxela é que isto indica unha concentración de analito negativa, que por suposto non é fisicamente posible.
Neste caso, un pico negativo simplemente significa que as moléculas que eluyen da columna absorben menos luz que a propia fase móbil inmediatamente antes e despois do pico. Isto pode ocorrer, por exemplo, cando se usan lonxitudes de onda de detección relativamente baixas (<230 nm) e aditivos de fase móbil que absorben a maior parte da luz a estas lonxitudes de onda. picos para preparar unha curva de calibración e obter información cuantitativa precisa, polo que non hai ningunha razón fundamental para evitalos per se (este método ás veces denomínase “detección UV indirecta”) (13). Non obstante, se realmente queremos evitar os picos negativos por completo, no caso da detección de absorbancia, a mellor solución é empregar unha lonxitude de onda de detección diferente para que absorba máis a fase móbil que a fase móbil que absorba ou cambie a composición da luz que absorba máis a fase móbil que a fase anal. que os analitos.
Tamén poden aparecer picos negativos cando se utiliza a detección do índice de refracción (RI) cando o índice de refracción de compoñentes distintos do analito na mostra, como a matriz disolvente, é diferente do índice de refracción da fase móbil. Isto tamén ocorre coa detección UV-vis, pero este efecto tende a atenuarse en relación á detección de RI. a fase móbil.
Na terceira parte sobre o tema básico da resolución de problemas de LC, discutín situacións nas que a forma de pico observada difire da forma de pico esperada ou normal. A resolución eficaz de tales problemas comeza co coñecemento das formas de pico esperadas (baseado na teoría ou na experiencia previa con métodos existentes), polo que as desviacións destas expectativas son obvias. os motivos que vexo con máis frecuencia.Coñecer estes detalles proporciona un bo lugar para comezar a solucionar problemas, pero non capta todas as posibilidades.Os lectores interesados ​​nunha lista máis detallada de causas e solucións poden consultar o cadro de parede "LC Troubleshooting Guide" de LCGC.
(4) Gráfico de parede "LC Troubleshooting Guide" de LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, Nova York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF e Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.