Algúns temas de resolución de problemas de LC nunca están desactualizados, xa que existen problemas na práctica de LC, mesmo cando a tecnoloxía dos instrumentos mellora co tempo. Hai moitas maneiras polas que poden xurdir problemas nun sistema LC e acabar nunha mala forma do pico. Cando xorden problemas relacionados coa forma do pico, unha breve lista de posibles causas para estes resultados axuda a simplificar a nosa experiencia de resolución de problemas.
Foi divertido escribir esta columna de "Solución de problemas de LC" e pensar en temas cada mes, porque algúns temas nunca pasan de moda. Mentres que no campo da investigación en cromatografía certos temas ou ideas se volven obsoletos ao ser substituídos por ideas máis novas e mellores, no campo da resolución de problemas, desde que apareceu o primeiro artigo de resolución de problemas nesta revista (o LC Journal naquel momento) xa que algúns temas aínda son relevantes) en 1983 (1). Nos últimos anos, centrei varias seccións de resolución de problemas de LC nas tendencias contemporáneas que afectan á cromatografía líquida (LC) (por exemplo, a comparación relativa da nosa comprensión do efecto da presión na retención [2] Novos avances) A ​​nosa interpretación dos resultados de LC e como solucionar problemas con instrumentos de LC modernos. Na entrega deste mes, continúo a miña serie (3), que comezou en decembro de 2021, que se centrou nalgúns dos temas de "vida ou morte" da resolución de problemas de LC: os elementos que son excelentes para calquera solucionador de problemas son esenciais, independentemente da idade do sistema que esteamos a usar. O tema central desta serie é moi relevante para o famoso gráfico mural "Guía de resolución de problemas de LC" do LCGC (4). colgado en moitos laboratorios. Para a terceira parte desta serie, decidín centrarme en cuestións relacionadas coa forma do pico ou as características do pico. Incriblemente, o gráfico mural enumera 44 posibles causas diferentes dunha mala forma do pico. Non podemos considerar todos estes problemas en detalle nun só artigo, polo que nesta primeira entrega sobre o tema, centrareime nalgunhas das que vexo con máis frecuencia. Espero que os usuarios de LC, tanto novos como maiores, atopen algúns consellos e recordatorios útiles sobre este importante tema.
Cada vez máis respondendo ás preguntas de resolución de problemas con "todo é posible". Esta resposta pode parecer doada cando se consideran observacións difíciles de interpretar, pero a miúdo paréceme apropiada. Con moitas causas posibles dunha mala forma dos picos, é importante manter a mente aberta ao considerar cal podería ser o problema e ser capaz de priorizar as causas potenciais para comezar os nosos esforzos de resolución de problemas, centrándonos nas posibilidades máis comúns; este punto é moi importante.
Un paso clave en calquera exercicio de resolución de problemas, pero que creo que está infravalorado, é recoñecer que hai un problema que precisa ser resolto. Recoñecer que hai un problema a miúdo significa recoñecer que o que lle ocorre á ferramenta é diferente das nosas expectativas, que están moldeadas pola teoría, o coñecemento empírico e a experiencia (5). A "forma do pico" á que se fai referencia aquí en realidade non só se refire á forma do pico (simétrica, asimétrica, suave, esponxosa, de bordo de ataque, de cola, etc.), senón tamén á anchura. As nosas expectativas sobre a forma real do pico son sinxelas. A teoría (6) apoia ben a expectativa do libro de texto de que, na maioría dos casos, os picos cromatográficos deberían ser simétricos e axustarse á forma dunha distribución gaussiana, como se mostra na Figura 1a. O que esperamos das anchuras dos picos é unha cuestión máis complexa e discutiremos este tema nun futuro artigo. As outras formas de pico da Figura 1 mostran algunhas das outras posibilidades que se poderían observar, noutras palabras, algunhas das formas en que as cousas poderían saír mal. No resto desta entrega, dedicaremos tempo a discutir algúns exemplos específicos de situacións que poden levar a estas. tipos de formas.
Ás veces, os picos non se observan en absoluto no cromatograma onde se espera que sexan eluídos. O gráfico mural anterior indica que a ausencia dun pico (supoñendo que a mostra conteña realmente o analito diana a unha concentración que debería facer que a resposta do detector sexa suficiente para velo por riba do ruído) adoita estar relacionada con algún problema do instrumento ou con condicións incorrectas da fase móbil (se se observan). picos, xeralmente demasiado "débiles"). Unha breve lista de posibles problemas e solucións nesta categoría pódese atopar na Táboa I.
Como se mencionou anteriormente, a cuestión de canto ensanche de picos se debe tolerar antes de prestar atención e tentar solucionalo é un tema complexo que abordarei nun artigo futuro. A miña experiencia é que un ensanche significativo de picos adoita ir acompañado dun cambio significativo na forma do pico, e a cola do pico é máis común que o prepico ou a división. Non obstante, os picos nominalmente simétricos tamén se ensanchan, o que pode ser causado por diferentes razóns:
Cada un destes problemas foi tratado en detalle en números anteriores de Troubleshooting LC, e os lectores interesados ​​nestes temas poden consultar estes artigos anteriores para obter información sobre as causas principais e as posibles solucións para estes problemas. Máis detalles.
A formación de cola de picos, a formación de fronte de picos e a división poden estar causadas por fenómenos químicos ou físicos, e a lista de posibles solucións para estes problemas varía moito, dependendo de se se trata dun problema químico ou físico. A miúdo, ao comparar os diferentes picos dun cromatograma, pódense atopar pistas importantes sobre cal é o culpable. Se todos os picos dun cromatograma presentan formas similares, o máis probable é que a causa non sexa física. Se só se ven afectados un ou uns poucos picos, pero o resto parecen estar ben, o máis probable é que a causa sexa química.
As causas químicas da acumulación de picos son demasiado complexas para analizalas brevemente aquí. O lector interesado pode consultar o número recente de “LC Troubleshooting” para unha análise máis detallada (10). Non obstante, unha cousa sinxela que se pode intentar é reducir a masa do analito inxectado e ver se a forma do pico mellora. Se é así, entón esta é unha boa pista de que o problema é a “sobrecarga de masa”. Neste caso, o método debe limitarse a inxectar pequenas masas de analito ou as condicións cromatográficas deben cambiarse para que se poidan obter boas formas de pico mesmo con masas inxectadas máis grandes.
Tamén existen moitas posibles razóns físicas para a aparición de picos de cola. As persoas interesadas nunha discusión detallada das posibilidades poden consultar outro número recente de "LC Troubleshooting" (11). Unha das causas físicas máis comúns da aparición de picos de cola é unha mala conexión nun punto entre o inxector e o detector (12). Un exemplo extremo móstrase na Figura 1d, obtida no meu laboratorio hai unhas semanas. Neste caso, construímos un sistema cunha nova válvula de inxección que non usáramos antes e instalamos un bucle de inxección de pequeno volume cunha férula que fora moldeada nun capilar de aceiro inoxidable. Despois dalgúns experimentos iniciais de resolución de problemas, decatámonos de que a profundidade do porto no estator da válvula de inxección era moito máis profunda do que estabamos afeitos, o que resultaba nun gran volume morto na parte inferior do porto. Este problema resólvese facilmente substituíndo o bucle de inxección por outro tubo; podemos axustar a férula á posición correcta para eliminar o volume morto na parte inferior do porto.
As frontes de pico como as que se mostran na Figura 1e tamén poden estar causadas por problemas físicos ou químicos. Unha causa física común do bordo de ataque é que o leito de partículas da columna non estea ben compactado ou que as partículas se reorganizaron co tempo. Do mesmo xeito que coa formación de cola de pico causada por este fenómeno físico, a mellor maneira de solucionar isto é substituír a columna e seguir adiante. Fundamentalmente, as formas de pico do bordo de ataque con orixe química adoitan xurdir do que chamamos condicións de retención "non lineais". En condicións ideais (lineais), a cantidade de analito retida pola fase estacionaria (polo tanto, o factor de retención) está relacionada linealmente coa concentración do analito na columna. Cromatograficamente, isto significa que a medida que aumenta a masa de analito inxectada na columna, o pico faise máis alto, pero non máis ancho. Esta relación rómpese cando o comportamento de retención non é lineal, e os picos non só se fan máis altos, senón tamén máis anchos a medida que se inxecta máis masa. Ademais, as formas non lineais determinan a forma dos picos cromatográficos, o que resulta en bordos de ataque ou de saída. Do mesmo xeito que coa sobrecarga de masa que causa a formación de cola de pico (10), o pico O bordo de ataque causado pola retención non lineal tamén se pode diagnosticar reducindo a masa de analito inxectada. Se a forma do pico mellora, o método debe modificarse para non superar a calidade da inxección que causa o bordo de ataque ou as condicións cromatográficas deben cambiarse para minimizar este comportamento.
Ás veces observamos o que parece ser un pico "dividido", como se mostra na Figura 1f. O primeiro paso para resolver este problema é determinar se a forma do pico se debe a unha coelución parcial (é dicir, á presenza de dous compostos distintos pero que eluen estreitamente). Se en realidade hai dous analitos diferentes que eluen estreitamente, entón trátase de mellorar a súa resolución (por exemplo, aumentando a selectividade, a retención ou o reconto de placas), e os picos "divididos" aparentes están relacionados coa física. O rendemento non ten nada que ver coa propia columna. A miúdo, a pista máis importante para esta decisión é se todos os picos do cromatograma presentan formas divididas ou só un ou dous. Se é só un ou dous, probablemente sexa un problema de coelución; se todos os picos están divididos, probablemente sexa un problema físico, moi probablemente relacionado coa propia columna.
Os picos divididos relacionados coas propiedades físicas da propia columna adoitan deberse a fritas de entrada ou saída parcialmente bloqueadas ou a unha reorganización das partículas na columna, o que permite que a fase móbil flúa máis rápido que a fase móbil en certas áreas da formación de canles da columna noutras rexións (11). Ás veces, as fritas parcialmente obstruídas poden eliminarse invertendo o fluxo a través da columna; non obstante, na miña experiencia, esta adoita ser unha solución a curto prazo en lugar de a longo prazo. Isto adoita ser fatal nas columnas modernas se as partículas se recombinan dentro da columna. Neste punto, é mellor substituír a columna e continuar.
O pico da Figura 1g, tamén dun caso recente no meu propio laboratorio, adoita indicar que o sinal é tan alto que alcanzou o extremo superior do rango de resposta. Para os detectores de absorbancia óptica (UV-vis neste caso), cando a concentración do analito é moi alta, o analito absorbe a maior parte da luz que pasa a través da cela de fluxo do detector, deixando moi pouca luz para detectar. Nestas condicións, o sinal eléctrico do fotodetector está fortemente influenciado por varias fontes de ruído, como a luz dispersa e a "corrente escura", o que fai que o sinal teña un aspecto moi "difuso" e sexa independente da concentración do analito. Cando isto ocorre, o problema a miúdo pódese resolver facilmente reducindo o volume de inxección do analito: reducindo o volume de inxección, diluíndo a mostra ou ambas as dúas cousas.
Na escola de cromatografía, empregamos o sinal do detector (é dicir, o eixe y no cromatograma) como indicador da concentración do analito na mostra. Polo tanto, parece estraño ver un cromatograma cun sinal por debaixo de cero, xa que a interpretación simple é que isto indica unha concentración negativa de analito, o que, por suposto, non é fisicamente posible. Na miña experiencia, os picos negativos obsérvanse con máis frecuencia cando se usan detectores de absorbancia óptica (por exemplo, UV-vis).
Neste caso, un pico negativo simplemente significa que as moléculas que eluen da columna absorben menos luz que a propia fase móbil inmediatamente antes e despois do pico. Isto pode ocorrer, por exemplo, cando se usan lonxitudes de onda de detección relativamente baixas (<230 nm) e aditivos de fase móbil que absorben a maior parte da luz a estas lonxitudes de onda. Estes aditivos poden ser compoñentes de solvente de fase móbil como metanol ou compoñentes tampón como acetato ou formiato. En realidade, pódense usar picos negativos para preparar unha curva de calibración e obter información cuantitativa precisa, polo que non hai ningunha razón fundamental para evitalos per se (este método ás veces denomínase "detección UV indirecta") (13). Non obstante, se realmente queremos evitar os picos negativos por completo, no caso da detección de absorbancia, a mellor solución é usar unha lonxitude de onda de detección diferente para que o analito absorba máis que a fase móbil, ou cambiar a composición da fase móbil para que absorban menos luz que os analitos.
Tamén poden aparecer picos negativos ao usar a detección por índice de refracción (IR) cando o índice de refracción doutros compoñentes que non sexan o analito na mostra, como a matriz do disolvente, é diferente do índice de refracción da fase móbil. Isto tamén ocorre coa detección UV-vis, pero este efecto tende a atenuarse en relación coa detección por IR. En ambos os casos, os picos negativos pódense minimizar facendo que a composición da matriz da mostra coincida máis coa da fase móbil.
Na terceira parte sobre o tema básico da resolución de problemas de LC, tratei situacións nas que a forma do pico observada difire da forma do pico esperada ou normal. A resolución eficaz destes problemas comeza co coñecemento das formas dos picos esperadas (baseadas na teoría ou na experiencia previa con métodos existentes), polo que as desviacións destas expectativas son obvias. Os problemas de forma do pico teñen moitas causas potenciais diferentes (demasiado ancho, cola, bordo de ataque, etc.). Nesta entrega, analizo en detalle algunhas das razóns que vexo con máis frecuencia. Coñecer estes detalles proporciona un bo punto de partida para a resolución de problemas, pero non recolle todas as posibilidades. Os lectores interesados ​​nunha lista máis detallada de causas e solucións poden consultar o gráfico mural "Guía de resolución de problemas de LC" de LCGC.
(4) Gráfico mural “Guía de resolución de problemas de LC” do LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Análise de datos e procesamento de sinais en cromatografía (Elsevier, Nova York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF e Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.