Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
A biopsia líquida (LB) é un concepto que está a gañar rapidamente popularidade no campo biomédico.O concepto baséase principalmente na detección de fragmentos de ADN extracelular circulante (ccfDNA), que se liberan principalmente como pequenos fragmentos despois da morte celular en varios tecidos.Unha pequena proporción destes fragmentos orixínanse de tecidos ou organismos estranxeiros (estraños).No traballo actual aplicamos este concepto ao mexillón, unha especie sentinela coñecida pola súa alta capacidade de filtración da auga do mar.Usamos a capacidade dos mexillóns para actuar como filtros naturais para capturar fragmentos de ADN ambientais de diversas fontes para proporcionar información sobre a biodiversidade dos ecosistemas costeiros mariños.Os nosos resultados mostran que a hemolinfa de mexillón contén fragmentos de ADN que varían moito en tamaño, de 1 a 5 kb.A secuenciación con escopeta mostrou que un gran número de fragmentos de ADN son de orixe microbiana estraña.Entre eles, atopamos fragmentos de ADN de bacterias, arqueas e virus, incluídos virus que se sabe que infectan unha variedade de hóspedes que se atopan habitualmente nos ecosistemas mariños costeiros.En conclusión, o noso estudo demostra que o concepto de LB aplicado ao mexillón representa unha fonte rica pero aínda inexplorada de coñecemento sobre a diversidade microbiana nos ecosistemas costeiros mariños.
O impacto do cambio climático (CC) na biodiversidade dos ecosistemas mariños é unha área de investigación en rápido crecemento.O quecemento global non só causa importantes tensións fisiolóxicas, senón que tamén empurra os límites evolutivos da estabilidade térmica dos organismos mariños, afectando o hábitat de varias especies, o que induce a buscar condicións máis favorables [1, 2].Ademais de afectar á biodiversidade dos metazoos, o CC perturba o delicado equilibrio das interaccións hóspede-microbianos.Esta disbacteriose microbiana supón unha seria ameaza para os ecosistemas mariños xa que fai que os organismos mariños sexan máis susceptibles aos patóxenos infecciosos [3, 4].Crese que o SS xoga un papel importante nas mortes masivas, o que supón un grave problema para a xestión dos ecosistemas mariños globais [5, 6].Esta é unha cuestión importante dados os impactos económicos, ecolóxicos e nutricionais de moitas especies mariñas.Isto é especialmente certo para os bivalvos que viven nas rexións polares, onde os efectos da CK son máis inmediatos e graves [6, 7].De feito, bivalvos como Mytilus spp.úsanse amplamente para controlar os efectos do CC nos ecosistemas mariños.Non é sorprendente que se desenvolveu un número relativamente grande de biomarcadores para controlar a súa saúde, a miúdo utilizando un enfoque de dous niveis que inclúe biomarcadores funcionais baseados na actividade enzimática ou funcións celulares como a viabilidade celular e a actividade fagocítica [8].Estes métodos tamén inclúen a medición da concentración de indicadores de presión específicos que se acumulan nos tecidos brandos despois da absorción de grandes cantidades de auga do mar.Non obstante, a alta capacidade de filtración e o sistema circulatorio semiaberto dos bivalvos ofrecen unha oportunidade para desenvolver novos biomarcadores de hemolinfa utilizando o concepto de biopsia líquida (LB), un enfoque sinxelo e minimamente invasivo para o manexo do paciente.mostras de sangue [9, 10].Aínda que se poden atopar varios tipos de moléculas circulantes no LB humano, este concepto baséase principalmente na análise de secuenciación de ADN de fragmentos de ADN extracelular circulante (ccfDNA) no plasma.De feito, a presenza de ADN circulante no plasma humano coñécese desde mediados do século XX [11], pero só nos últimos anos a aparición de métodos de secuenciación de alto rendemento levou a un diagnóstico clínico baseado no ADN ccf.A presenza destes fragmentos de ADN circulantes débese en parte á liberación pasiva de ADN xenómico (nuclear e mitocondrial) despois da morte celular. En individuos sans, a concentración de ccfDNA adoita ser baixa (<10 ng/ml) pero pódese aumentar entre 5 e 10 veces en pacientes que sofren diversas patoloxías ou están sometidos a estrés, o que provoca danos tisulares. En individuos sans, a concentración de ccfDNA adoita ser baixa (<10 ng/ml) pero pódese aumentar entre 5 e 10 veces en pacientes que sofren diversas patoloxías ou están sometidos a estrés, o que provoca danos tisulares. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. En persoas sans, a concentración de cccDNA é normalmente baixa (<10 ng/ml), pero pode aumentar entre 5 e 10 veces en pacientes con diversas patoloxías ou con estrés que provoca danos tisulares.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理有各种病理或病理或承常较低（加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 病理 或 扯 濣 或 扏增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелича ны 10 увелича ны с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. As concentracións de ccfDNA adoitan ser baixas (<10 ng/ml) en individuos sans, pero poden aumentarse entre 5 e 10 veces en pacientes con diversas patoloxías ou estrés, o que provoca danos tisulares.O tamaño dos fragmentos de ccfDNA varía moito, pero normalmente oscila entre 150 e 200 pb.[12].A análise do ccfDNA autoderivado, é dicir, ccfDNA de células hóspedes normais ou transformadas, pódese usar para detectar cambios xenéticos e epixenéticos presentes no xenoma nuclear e/ou mitocondrial, axudando así aos médicos a seleccionar terapias específicas dirixidas a moleculares [13] .Non obstante, o ccfDNA pódese obter de fontes estrañas como o ccfDNA de células fetais durante o embarazo ou de órganos transplantados [14,15,16,17].O ccfDNA tamén é unha importante fonte de información para detectar a presenza de ácidos nucleicos dun axente infeccioso (estraño), o que permite a detección non invasiva de infeccións xeneralizadas non identificadas por hemocultivos, evitando a biopsia invasiva do tecido infectado [18].Estudos recentes demostraron de feito que o sangue humano contén unha rica fonte de información que se pode usar para identificar patóxenos virais e bacterianos, e que preto do 1% do ccfDNA atopado no plasma humano é de orixe estranxeira [19].Estes estudos demostran que a biodiversidade do microbioma circulante dun organismo pódese avaliar mediante a análise de ccfDNA.Non obstante, ata hai pouco, este concepto utilizábase exclusivamente en humanos e, en menor medida, noutros vertebrados [20, 21].
No presente traballo, utilizamos o potencial de LB para analizar o ADNccf de Aulacomya atra, unha especie do sur que se atopa habitualmente nas illas Kerguelen subantárticas, un grupo de illas no alto dunha gran meseta que se formou hai 35 millóns de anos.erupción volcánica.Usando un sistema experimental in vitro, descubrimos que os fragmentos de ADN na auga do mar son rapidamente absorbidos polos mexillóns e entran no compartimento da hemolinfa.A secuenciación de escopetas demostrou que o ccfDNA da hemolinfa do mexillón contén fragmentos de ADN de orixe propia e non propia, incluíndo bacterias simbióticas e fragmentos de ADN de biomas típicos dos ecosistemas costeiros mariños volcánicos fríos.A hemolinfa ccfDNA tamén contén secuencias virais derivadas de virus con diferentes intervalos de hóspede.Tamén atopamos fragmentos de ADN de animais pluricelulares como peixes óseos, anémonas mariñas, algas e insectos.En conclusión, o noso estudo demostra que o concepto LB pode aplicarse con éxito aos invertebrados mariños para xerar un rico repertorio xenómico nos ecosistemas mariños.
Os adultos (55-70 mm de lonxitude) Mytilus platensis (M. platensis) e Aulacomya atra (A. atra) foron recollidos das costas rochosas intermareais de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Illas Kerguelen en decembro de 2018. Outros mexillóns azuis adultos (Mytilus spp.) obtivéronse dun provedor comercial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canadá) e colocáronse nun tanque aireado a temperatura controlada (4 °C) que contiña 10–20 L de salmoira artificial a 32‰.(Cristal de arrecife de sal de mar artificial, Instant Ocean, Virginia, EUA).Para cada experimento, mediuse a lonxitude e o peso das cunchas individuais.
Un protocolo de acceso aberto gratuíto para este programa está dispoñible en liña (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Brevemente, a hemolinfa LB foi recollida dos músculos abdutores como se describe [22].A hemolinfa clarificouse por centrifugación a 1200 × g durante 3 minutos, o sobrenadante conxelouse (-20 ° C) ata o seu uso.Para o illamento e a purificación do ADNc, as mostras (1,5-2,0 ml) desconxeláronse e procesáronse utilizando o kit de ADNc NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) segundo as instrucións do fabricante.O ccfDNA almacenouse a -80 °C ata unha posterior análise.Nalgúns experimentos, o ccfDNA illouse e purificouse mediante o QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canadá).O ADN purificado cuantificouse mediante un ensaio estándar PicoGreen.A distribución de fragmentos do ccfDNA illado analizouse mediante electroforese capilar utilizando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) utilizando un kit de ADN de alta sensibilidade.O ensaio realizouse usando 1 µl da mostra de ccfDNA segundo as instrucións do fabricante.
Para a secuenciación de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadá) preparou bibliotecas de escopetas utilizando o kit Illumina DNA Mix do kit Illumina MiSeq PE75.Utilizouse un adaptador estándar (BioO).Os ficheiros de datos en bruto están dispoñibles no Arquivo de lectura de secuencias NCBI (SRR8924808 e SRR8924809).A calidade de lectura básica avaliouse mediante FastQC [23].Trimmomatic [24] utilizouse para adaptadores de recorte e lecturas de mala calidade.As lecturas de escopeta con extremos pareados fusionáronse FLASH en lecturas individuais máis longas cunha superposición mínima de 20 pb para evitar desajustes [25]. As lecturas fusionadas anotáronse con BLASTN mediante unha base de datos de taxonomía NCBI bivalva (valor e <1e-3 e homoloxía do 90%) e realizouse o enmascaramento de secuencias de baixa complexidade mediante DUST [26]. As lecturas fusionadas anotáronse con BLASTN mediante unha base de datos de taxonomía NCBI bivalva (valor e <1e-3 e homoloxía do 90%) e realizouse o enmascaramento de secuencias de baixa complexidade mediante DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы оллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой низкой сло но сложной слологии пользованием PO [26]. As lecturas agrupadas anotáronse con BLASTN usando a base de datos de taxonomía de bivalvos NCBI (valor e <1e-3 e homoloxía do 90%) e realizouse o enmascaramento de secuencias de baixa complexidade mediante DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌数数诌数诌数性）用BLASTN [D6]低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90 % 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 （并 读数 Ａ 追 追 蛽 蛹 ） ）复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичесанкой дсономичесанкой сдованием тых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей нислови ностей нислогии с использованием PO [26]. As lecturas agrupadas anotáronse con BLASTN usando a base de datos taxonómica de bivalvos NCBI (valor e <1e-3 e homoloxía do 90%) e realizouse o enmascaramento de secuencias de baixa complexidade usando DUST [26].As lecturas dividíronse en dous grupos: relacionadas con secuencias bivalvas (aquí chamadas autolecturas) e non relacionadas (non autolecturas).Dous grupos foron ensamblados por separado usando MEGAHIT para xerar contigs [27].Mentres tanto, a distribución taxonómica das lecturas do microbioma alieníxena clasificouse mediante Kraken2 [28] e representouse graficamente mediante un gráfico circular de Krona en Galaxy [29, 30].A partir dos nosos experimentos preliminares determinouse que os kmers óptimos eran os kmers-59. Os propios contigs foron entón identificados mediante o aliñamento con BLASTN (base de datos NCBI de bivalvos, valor e < 1e-10 e 60% de homoloxía) para unha anotación final. Os propios contigs foron entón identificados mediante o aliñamento con BLASTN (base de datos NCBI de bivalvos, valor e < 1e-10 e 60% de homoloxía) para unha anotación final. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN BI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Os autocontigs foron entón identificados mediante a comparación con BLASTN (base de datos de bivalvos NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homoloxía) para a anotación final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）对齐来识对齐来臍廿褛识廫过与BLASTN最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтвенные контиги для окончательной аннотации путем сонтиги х NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). A continuación identificáronse os autocontigs para a súa anotación final mediante a comparación con BLASTN (base de datos de bivalvos NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homoloxía). Paralelamente, os contigs de grupos non propios foron anotados con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e < 1e-10 e 60% de homoloxía). Paralelamente, os contigs de grupos non propios foron anotados con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e < 1e-10 e 60% de homoloxía). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база даннтиги база даннных e-10 60%). Paralelamente, os contigs de grupos estranxeiros foron anotados con BLASTN (base de datos NT NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homoloxía).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。羾组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью на BLASBINT ачение e <1e-10 и гомология 60%). Paralelamente, os contigs do grupo non propio foron anotados con BLASTN (base de datos nt NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homoloxía). BLASTX tamén se realizou en contigs non propios usando as bases de datos NCBI de proteínas nr e RefSeq (valor e < 1e-10 e 60% de homoloxía). BLASTX tamén se realizou en contigs non propios usando as bases de datos NCBI de proteínas nr e RefSeq (valor e < 1e-10 e 60% de homoloxía). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeq nr белека на 10 e гомология 60%). BLASTX tamén se realizou en contigs non propios utilizando as bases de datos de proteínas nr e RefSeq NCBI (valor e < 1e-10 e 60% de homoloxía).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０ 性 60 %。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０ 性 60 %。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безных безнка NC ч 1 (Ref. 60%). BLASTX tamén se realizou en contigs non propios utilizando as bases de datos de proteínas nr e RefSeq NCBI (valor e <1e-10 e 60% de homoloxía).Os conxuntos BLASTN e BLASTX de contigs non propios representan os contigs finais (consulte o ficheiro complementario).
Os cebadores utilizados para a PCR están listados na táboa S1.Utilizouse a ADN polimerase Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) para amplificar os xenes diana do ccfDNA.Utilizáronse as seguintes condicións de reacción: desnaturalización a 95 °C durante 3 minutos, 95 °C durante 1 minuto, temperatura de recocido establecida durante 1 minuto, alongamento a 72 °C durante 1 minuto, 35 ciclos e, finalmente, 72 °C en 10 minutos..Os produtos de PCR separáronse mediante electroforese en xeles de agarosa (1,5%) que conteñen SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) a 95 V.
Os mexillóns (Mytilus spp.) foron aclimatados en 500 ml de auga de mar osixenada (32 PSU) durante 24 horas a 4 °C.Engadiuse ao vial ADN plasmídico que contén un inserto que codifica a secuencia de ADNc da galectina-7 humana (número de acceso NCBI L07769) a unha concentración final de 190 μg/μl.Os mexillóns incubados nas mesmas condicións sen adición de ADN foron o control.O terceiro tanque de control contiña ADN sen mexillóns.Para controlar a calidade do ADN na auga do mar, tomáronse mostras de auga de mar (20 μl; tres repeticións) de cada tanque á hora indicada.Para a trazabilidade do ADN plasmídico, recolléronse mexillóns LB nos momentos indicados e analizáronse mediante qPCR e ddPCR.Debido ao alto contido de sal da auga de mar, alícuotas foron diluídas en auga de calidade PCR (1:10) antes de todos os ensaios de PCR.
Realizouse a PCR dixital en gotas (ddPCR) mediante o protocolo BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canadá).Use o perfil de temperatura para determinar a temperatura óptima (táboa S1).As pingas foron xeradas mediante un xerador de gotas QX200 (BioRad).A ddPCR realizouse do seguinte xeito: 95 °C durante 5 min, 50 ciclos de 95 °C durante 30 s e unha temperatura de recocido determinada durante 1 min e 72 °C durante 30 s, 4 °C durante 5 min e 90 °C en 5 minutos.O número de gotas e as reaccións positivas (número de copias/µl) foron medidos mediante un lector de gotas QX200 (BioRad).Rexeitáronse mostras con menos de 10.000 gotas.O control de patróns non se realizou cada vez que se executou ddPCR.
A qPCR realizouse utilizando cebadores específicos Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) e LGALS7.Todas as PCR cuantitativas realizáronse en 20 µl usando o kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).A qPCR iniciouse cunha incubación de 15 minutos a 95 °C seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 10 segundos e a 60 °C durante 60 segundos cunha recollida de datos.As curvas de fusión foron xeradas mediante medicións sucesivas a 95 °C durante 5 s, 65 °C durante 60 s e 97 °C ao final da qPCR.Cada qPCR realizouse por triplicado, agás as mostras de control.
Dado que os mexillóns son coñecidos pola súa alta taxa de filtración, primeiro investigamos se podían filtrar e reter fragmentos de ADN presentes na auga do mar.Tamén nos interesou saber se estes fragmentos se acumulan no seu sistema linfático semiaberto.Resolvemos este problema experimentalmente rastrexando o destino dos fragmentos de ADN solubles engadidos aos tanques de mexillón azuis.Para facilitar o seguimento dos fragmentos de ADN, utilizamos ADN plasmídico estraño (non propio) que contén o xene humano da galectina-7.ddPCR rastrexa fragmentos de ADN plasmídico en auga de mar e mexillóns.Os nosos resultados mostran que se a cantidade de fragmentos de ADN na auga do mar permaneceu relativamente constante ao longo do tempo (ata 7 días) en ausencia de mexillóns, entón en presenza de mexillóns este nivel desapareceu case por completo en 8 horas (Fig. 1a, b).Os fragmentos de ADN exóxeno detectáronse facilmente en 15 minutos no líquido intravalvular e na hemolinfa (Fig. 1c).Estes fragmentos aínda poderían detectarse ata 4 horas despois da exposición.Esta actividade de filtrado con respecto aos fragmentos de ADN é comparable á actividade de filtrado de bacterias e algas [31].Estes resultados suxiren que os mexillóns poden filtrar e acumular ADN estraño nos seus compartimentos fluídos.
Concentracións relativas de ADN plasmídico na auga de mar en presenza (A) ou ausencia (B) de mexillón, medidas mediante ddPCR.En A, os resultados exprésanse en porcentaxes, representando os bordos das caixas os percentiles 75 e 25.A curva logarítmica axustada móstrase en vermello e a área sombreada en gris representa o intervalo de confianza do 95%.En B, a liña vermella representa a media e a azul o intervalo de confianza do 95 % para a concentración.C Acumulación de ADN plasmídico na hemolinfa e fluído valvular dos mexillóns en diferentes momentos despois da adición de ADN plasmídico.Os resultados preséntanse como copias absolutas detectadas/ml (±SE).
A continuación, investigamos a orixe do ccfDNA nos mexillóns recollidos dos bancos de mexillón das illas Kerguelen, un grupo remoto de illas cunha influencia antropoxénica limitada.Para este fin, illouse e purificouse o cccDNA das hemolinfas de mexillón mediante métodos comúnmente utilizados para purificar o cccDNA humano [32, 33].Descubrimos que as concentracións medias de ccfDNA de hemolinfa nos mexillóns están no rango de microgramos por ml de hemolinfa (consulte a táboa S2, información complementaria).Este rango de concentracións é moito maior que en persoas sans (baixos nanogramos por mililitro), pero en casos raros, en pacientes con cancro, o nivel de ccfDNA pode alcanzar varios microgramos por mililitro [34, 35].Unha análise da distribución do tamaño do ccfDNA da hemolinfa mostrou que estes fragmentos varían moito en tamaño, oscilando entre 1000 pb e 1000 pb.ata 5000 pb (Fig. 2).Obtivéronse resultados similares usando o QIAamp Investigator Kit baseado en sílice, un método usado habitualmente na ciencia forense para illar e purificar rapidamente o ADN xenómico a partir de mostras de ADN de baixa concentración, incluíndo ccfDNA [36].
Electroforegrama ccfDNA representativo da hemolinfa de mexillón.Extraído con NucleoSnap Plasma Kit (arriba) e QIAamp DNA Investigator Kit.B Gráfico de violín que mostra a distribución das concentracións de ccfDNA da hemolinfa (±SE) nos mexillóns.As liñas negras e vermellas representan a mediana e o primeiro e o terceiro cuartiles, respectivamente.
Aproximadamente o 1% do ccfDNA en humanos e primates ten unha fonte estraña [21, 37].Dado o sistema circulatorio semiaberto dos bivalvos, a auga de mar rica en microbios e a distribución do tamaño do ccfDNA dos mexillóns, plantexamos a hipótese de que o ccfDNA da hemolinfa dos mexillóns pode conter un conxunto rico e diverso de ADN microbiano.Para probar esta hipótese, secuenciamos o ccfDNA da hemolinfa de mostras de Aulacomya atra recollidas das illas Kerguelen, obtendo máis de 10 millóns de lecturas, o 97,6% das cales pasaron por control de calidade.Despois clasificáronse as lecturas segundo fontes propias e non propias utilizando as bases de datos de bivalvos BLASTN e NCBI (Fig. S1, Información complementaria).
Nos humanos, tanto o ADN nuclear como o mitocondrial pódense liberar ao torrente sanguíneo [38].Non obstante, no presente estudo non foi posible describir en detalle o ADN xenómico nuclear do mexillón, dado que o xenoma de A. atra non foi secuenciado nin descrito.Non obstante, puidemos identificar unha serie de fragmentos de ccfDNA da nosa propia orixe mediante a biblioteca de bivalvos (Fig. S2, Información complementaria).Tamén confirmamos a presenza de fragmentos de ADN da nosa propia orixe mediante amplificación por PCR dirixida daqueles xenes de A. atra que foron secuenciados (Fig. 3).Do mesmo xeito, dado que o xenoma mitocondrial de A. atra está dispoñible nas bases de datos públicas, pódese atopar evidencia da presenza de fragmentos de ccfDNA mitocondrial na hemolinfa de A. atra.A presenza de fragmentos de ADN mitocondrial foi confirmada mediante amplificación por PCR (Fig. 3).
Varios xenes mitocondriais estaban presentes na hemolinfa de A. atra (puntos vermellos - número de stock: SRX5705969) e M. platensis (puntos azuis - número de stock: SRX5705968) amplificados por PCR.Figura adaptada de Breton et al., 2011 B Amplificación do sobrenadante de hemolinfa de A. atra Almacenado en papel FTA.Use un punzón de 3 mm para engadir directamente ao tubo de PCR que contén a mestura de PCR.
Dado o abundante contido microbiano na auga do mar, inicialmente centrámonos na caracterización de secuencias de ADN microbiano na hemolinfa.Para iso utilizamos dúas estratexias diferentes.A primeira estratexia utilizou Kraken2, un programa de clasificación de secuencias baseado en algoritmos que pode identificar secuencias microbianas cunha precisión comparable a BLAST e outras ferramentas [28].Determinouse que máis de 6719 lecturas eran de orixe bacteriana, mentres que 124 e 64 eran de arqueas e virus, respectivamente (Fig. 4).Os fragmentos de ADN bacteriano máis abundantes foron Firmicutes (46%), Proteobacterias (27%) e Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Esta distribución é consistente cos estudos previos sobre o microbioma do mexillón azul mariño [39, 40].As gammaproteobacterias foron a principal clase de proteobacterias (44%), incluíndo moitas Vibronales (Fig. 4b).O método ddPCR confirmou a presenza de fragmentos de ADN de Vibrio no ccfDNA da hemolinfa de A. atra (Fig. 4c) [41].Para obter máis información sobre a orixe bacteriana do ccfDNA, adoptouse un enfoque adicional (Fig. S2, Información complementaria). Neste caso, as lecturas que se solapaban ensamblaron como lecturas pareadas e clasificáronse como de orixe propia (bivalvos) ou non propia usando BLASTN e un valor e de 1e−3 e un corte con > 90 % de homoloxía. Neste caso, as lecturas que se solapaban ensamblaron como lecturas pareadas e clasificáronse como de orixe propia (bivalvos) ou non propia usando BLASTN e un valor e de 1e−3 e un corte con > 90 % de homoloxía. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как чтения с парными концами и были собраны обственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN e и 1e-3син и 1 ждению с гомологией> 90%. Neste caso, as lecturas superpostas recolléronse como lecturas pareadas e clasificáronse como nativas (bivalvas) ou non orixinais usando BLASTN e o valor e de 1e-3 e o corte con > 90 % de homoloxía.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 倢 倢 倢 末端读数，并使用BLASTN值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 用 用 用 的 3 explosión和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и концами и классиЄи классибраны енные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием несобственные по происхождению с использованием зованием зованием зованием знач знач зна1 по происхождению мологии> 90%. Neste caso, as lecturas superpostas recolléronse como lecturas pareadas e clasificáronse como propias (bivalvos) ou non orixinais utilizando valores e BLASTN e 1e-3 e un limiar de homoloxía > 90%.Dado que o xenoma de A. atra aínda non foi secuenciado, utilizamos a estratexia de ensamblaxe de novo do ensamblador MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Un total de 147.188 contigs foron identificados como dependentes (bivalvos) de orixe.Estes contigs foron entón explotados con valores e de 1e-10 usando BLASTN e BLASTX.Esta estratexia permitiunos identificar 482 fragmentos non bivalvos presentes no ccfDNA de A. atra.Máis da metade (57%) destes fragmentos de ADN obtivéronse de bacterias, principalmente de simbiontes branquiais, incluídos os simbiontes sulfotróficos, e de simbiontes branquiais Solemya velum (Fig. 5).
Abundancia relativa a nivel de tipo.B Diversidade microbiana de dous filos principais (Firmicutes e Proteobacterias).Amplificación representativa de ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmentos do xene do ARNr 16S (azul) en tres hemolinfas atra.
Analizáronse un total de 482 contigs recollidos.Perfil xeral da distribución taxonómica das anotacións contig metaxenómicas (procariotas e eucariotas).B Distribución detallada dos fragmentos de ADN bacteriano identificados por BLASTN e BLASTX.
A análise de Kraken2 tamén mostrou que o ccfDNA de mexillón contiña fragmentos de ADN arqueo, incluíndo fragmentos de ADN de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) e Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).A presenza de fragmentos de ADN derivados de Euryarchaeota e Crenarchaeota, atopados anteriormente na comunidade microbiana do mexillón de California, non debería ser unha sorpresa [42].Aínda que Euryarchaeota adoita asociarse con condicións extremas, agora recoñécese que tanto Euryarchaeota como Crenarcheota están entre os procariotas máis comúns no ambiente crioxénico mariño [43, 44].A presenza de microorganismos metanoxénicos nos mexillóns non é sorprendente, tendo en conta os informes recentes de fugas extensas de metano procedentes de fugas no fondo da meseta de Kerguelen [45] e a posible produción microbiana de metano observada nas costas das illas Kerguelen [46].
A nosa atención cambiou entón ás lecturas dos virus de ADN.Segundo o que sabemos, este é o primeiro estudo fóra do obxectivo do contido en virus dos mexillóns.Como era de esperar, atopamos fragmentos de ADN de bacteriófagos (Caudovirales) (Fig. 6b).Non obstante, o ADN viral máis común provén dun filum de nucleocitovirus, tamén coñecido como virus do ADN citoplásmico nuclear grande (NCLDV), que posúe o xenoma máis grande de todos os virus.Dentro deste filo, a maioría das secuencias de ADN pertencen ás familias Mimimidoviridae (58%) e Poxviridae (21%), cuxos hóspedes naturais inclúen vertebrados e artrópodos, mentres que unha pequena proporción destas secuencias de ADN pertencen a algas virolóxicas coñecidas.Infecta algas eucariotas mariñas.As secuencias tamén se obtiveron do virus Pandora, o virus xigante co maior tamaño do xenoma de todos os xéneros virales coñecidos.Curiosamente, o rango de hóspedes que se sabe que están infectados co virus, determinado pola secuenciación do ccfDNA da hemolinfa, foi relativamente grande (Figura S3, Información complementaria).Inclúe virus que infectan insectos como Baculoviridae e Iridoviridae, así como virus que infectan ameba, algas e vertebrados.Tamén atopamos secuencias coincidentes co xenoma de Pithovirus sibericum.Os pitovirus (tamén coñecidos como "virus zombies") foron illados por primeira vez do permafrost de 30.000 anos en Siberia [47].Así, os nosos resultados son consistentes cos informes anteriores que mostran que non todas as especies modernas destes virus están extinguidas [48] e que estes virus poden estar presentes en ecosistemas mariños subárticos remotos.
Finalmente, probamos para ver se podíamos atopar fragmentos de ADN doutros animais pluricelulares.BLASTN e BLASTX identificaron un total de 482 contigs estranxeiros con bibliotecas nt, nr e RefSeq (xenómicas e proteicas).Os nosos resultados mostran que entre os fragmentos estranxeiros de ccfDNA de animais pluricelulares predomina o ADN dos ósos óseos (Fig. 5).Tamén se atoparon fragmentos de ADN de insectos e outras especies.Non se identificou unha parte relativamente grande dos fragmentos de ADN, posiblemente debido á subrepresentación dun gran número de especies mariñas nas bases de datos xenómicas en comparación coas especies terrestres [49].
No presente traballo, aplicamos o concepto LB aos mexillóns, argumentando que a secuenciación de inyección de ccfDNA hemolinfa pode proporcionar información sobre a composición dos ecosistemas costeiros mariños.En particular, descubrimos que 1) a hemolinfa de mexillón contén concentracións relativamente altas (niveis de microgramos) de fragmentos de ADN circulantes relativamente grandes (~1-5 kb);2) estes fragmentos de ADN son independentes e non independentes 3) Entre as fontes estrañas destes fragmentos de ADN, atopamos ADN bacteriano, arqueo e viral, así como ADN doutros animais pluricelulares;4) A acumulación destes fragmentos estranxeiros de ccfDNA na hemolinfa prodúcese rapidamente e contribúe á actividade de filtrado interno dos mexillóns.En conclusión, o noso estudo demostra que o concepto de LB, que ata agora se aplicaba principalmente no campo da biomedicina, codifica unha fonte de coñecemento rica pero inexplorada que se pode utilizar para comprender mellor a interacción entre as especies sentinelas e o seu medio.
Ademais dos primates, informouse de illamento de ccfDNA en mamíferos, incluídos ratos, cans, gatos e cabalos [50, 51, 52].Non obstante, que sabemos, o noso estudo é o primeiro en informar da detección e secuenciación de ccfDNA en especies mariñas cun sistema de circulación aberto.Esta característica anatómica e a capacidade de filtrado dos mexillóns poden explicar, polo menos en parte, as diferentes características de tamaño dos fragmentos de ADN circulantes en comparación con outras especies.Nos humanos, a maioría dos fragmentos de ADN que circulan no sangue son pequenos fragmentos de tamaños comprendidos entre 150 e 200 pb.cun pico máximo de 167 pb [34, 53].Unha pequena pero importante porción dos fragmentos de ADN ten un tamaño de entre 300 e 500 pb, e preto do 5% ten máis de 900 pb.[54].A razón desta distribución de tamaño é que a principal fonte de ccfDNA no plasma ocorre como resultado da morte celular, ben pola morte celular ou pola necrose das células hematopoyéticas circulantes en individuos sans ou pola apoptose das células tumorais en pacientes con cancro (coñecida como ADN circulante do tumor)., ADNc).A distribución do tamaño do ccfDNA da hemolinfa que atopamos nos mexillóns variou entre 1000 e 5000 pb, o que suxire que o ccfDNA dos mexillóns ten unha orixe diferente.Esta é unha hipótese lóxica, xa que os mexillóns teñen un sistema vascular semiaberto e viven en ambientes acuáticos mariños que conteñen altas concentracións de ADN xenómico microbiano.De feito, os nosos experimentos de laboratorio utilizando ADN esóxeno demostraron que os mexillóns acumulan fragmentos de ADN na auga do mar, polo menos despois dunhas horas degrádanse despois da captación celular e/ou liberados e/ou almacenados en diversas organizacións.Dada a rareza das células (tanto procariotas como eucariotas), o uso de compartimentos intravalvulares reducirá a cantidade de ccfDNA de fontes propias, así como de fontes estranxeiras.Tendo en conta a importancia da inmunidade innata dos bivalvos e o gran número de fagocitos circulantes, tamén formulamos a hipótese de que mesmo o ccfDNA estraño está enriquecido en fagocitos circulantes que acumulan ADN estraño tras a inxestión de microorganismos e/ou restos celulares.En conxunto, os nosos resultados mostran que o ccfDNA da hemolinfa bivalva é un depósito único de información molecular e reforza a súa condición de especie sentinela.
Os nosos datos indican que a secuenciación e análise de fragmentos de ccfDNA hemolinfa derivados de bacterias poden proporcionar información clave sobre a flora bacteriana hóspede e as bacterias presentes no ecosistema mariño circundante.As técnicas de secuenciación de inyeccións revelaron secuencias da bacteria comensal A. atra branquia que se perderían se se utilizaran os métodos convencionais de identificación de ARNr 16S, debido en parte a un sesgo da biblioteca de referencia.De feito, o noso uso de datos de LB recollidos de M. platensis na mesma capa de mexillón en Kerguelen mostrou que a composición dos simbiontes bacterianos asociados ás branquias era a mesma para ambas as especies de mexillón (Fig. S4, Información complementaria).Esta semellanza de dous mexillóns xeneticamente diferentes pode reflectir a composición das comunidades bacterianas nos depósitos fríos, sulfurosos e volcánicos de Kerguelen [55, 56, 57, 58].Os niveis máis altos de microorganismos reductores de xofre foron ben descritos ao coller mexillóns de zonas costeiras bioturbadas [59], como a costa de Port-au-France.Outra posibilidade é que a flora do mexillón comensal poida verse afectada pola transmisión horizontal [60, 61].Necesítanse máis investigacións para determinar a correlación entre o medio mariño, a superficie do fondo mariño e a composición das bacterias simbióticas dos mexillóns.Estes estudos están actualmente en curso.
A lonxitude e concentración do ccfDNA da hemolinfa, a súa facilidade de purificación e a súa alta calidade para permitir a secuenciación rápida de escopetas son algunhas das moitas vantaxes do uso do ccfDNA de mexillón para avaliar a biodiversidade nos ecosistemas costeiros mariños.Este enfoque é especialmente eficaz para caracterizar comunidades virais (viromes) nun ecosistema determinado [62, 63].A diferenza das bacterias, das arqueas e dos eucariotas, os xenomas virais non conteñen xenes conservados filoxenéticamente como as secuencias 16S.Os nosos resultados indican que as biopsias líquidas de especies indicadoras como o mexillón poden usarse para identificar un número relativamente grande de fragmentos de virus ccfDNA que se sabe que infectan hóspedes que habitan normalmente nos ecosistemas mariños costeiros.Isto inclúe virus que se sabe que infectan protozoos, artrópodos, insectos, plantas e virus bacterianos (por exemplo, bacteriófagos).Atopouse unha distribución similar cando examinamos o viroma ccfDNA da hemolinfa de mexillóns azuis (M. platensis) recollido na mesma capa de mexillón en Kerguelen (táboa S2, información complementaria).A secuenciación de escopeta do ccfDNA é de feito un novo enfoque que está a gañar impulso no estudo do viroma de humanos ou doutras especies [21, 37, 64].Este enfoque é particularmente útil para estudar virus de ADN de dobre cadea, xa que non se conserva ningún xene único entre todos os virus de ADN de dobre cadea, o que representa a clase de virus máis diversa e ampla de Baltimore [65].Aínda que a maioría destes virus seguen sen clasificarse e poden incluír virus dunha parte completamente descoñecida do mundo viral [66], descubrimos que os viromas e os rangos de hóspedes dos mexillóns A. atra e M. platensis están entre as dúas especies.do mesmo xeito (ver figura S3, información adicional).Esta semellanza non é sorprendente, xa que pode reflectir unha falta de selectividade na captación do ADN presente no medio ambiente.Actualmente necesítanse estudos futuros que utilicen ARN purificado para caracterizar o viroma de ARN.
No noso estudo, utilizamos unha canalización moi rigorosa adaptada do traballo de Kowarski e colegas [37], que utilizaron unha eliminación en dous pasos de lecturas e contigs agrupadas antes e despois da montaxe do ccfDNA nativo, o que resultou nunha alta proporción de lecturas non mapeadas.Polo tanto, non podemos descartar que algunhas destas lecturas non mapeadas aínda poidan ter a súa propia orixe, principalmente porque non temos un xenoma de referencia para esta especie de mexillón.Tamén usamos esta canalización porque nos preocupaban as quimeras entre as lecturas propias e non propias e as lonxitudes de lectura xeradas polo Illumina MiSeq PE75.Outra razón para a maioría das lecturas inexploradas é que gran parte dos microbios mariños, especialmente en áreas remotas como Kerguelen, non foron anotados.Usamos Illumina MiSeq PE75, asumindo lonxitudes de fragmentos de ccfDNA similares ao ccfDNA humano.Para estudos futuros, dado que os nosos resultados mostran que o ccfDNA da hemolinfa ten lecturas máis longas que os humanos e/ou os mamíferos, recomendamos utilizar unha plataforma de secuenciación máis adecuada para fragmentos de ccfDNA máis longos.Esta práctica facilitará moito a identificación de máis indicacións para unha análise máis profunda.A obtención da secuencia do xenoma nuclear completa de A. atra non dispoñible actualmente tamén facilitaría moito a discriminación do ccfDNA de fontes propias e non propias.Dado que a nosa investigación centrouse na posibilidade de aplicar o concepto de biopsia líquida ao mexillón, agardamos que a medida que este concepto se utilice en futuras investigacións, se desenvolvan novas ferramentas e canalizacións para aumentar o potencial deste método para estudar a diversidade microbiana do mexillón.ecosistema mariño.
Como biomarcador clínico non invasivo, os niveis plasmáticos elevados de ccfDNA están asociados con varias enfermidades, danos nos tecidos e condicións de estrés [67,68,69].Este aumento está asociado á liberación de fragmentos de ADN da súa propia orixe despois do dano tisular.Abordamos este problema mediante o estrés térmico agudo, no que os mexillóns foron brevemente expostos a unha temperatura de 30 °C.Realizamos esta análise en tres tipos diferentes de mexillón en tres experimentos independentes.Non obstante, non atopamos ningún cambio nos niveis de ccfDNA despois do estrés térmico agudo (ver Figura S5, información adicional).Este descubrimento pode explicar, polo menos en parte, o feito de que os mexillóns teñan un sistema circulatorio semiaberto e acumulen grandes cantidades de ADN estraño debido á súa alta actividade filtrante.Por outra banda, os mexillóns, como moitos invertebrados, poden ser máis resistentes ao dano tecido inducido polo estrés, limitando así a liberación de ccfDNA na súa hemolinfa [70, 71].
Ata a data, a análise do ADN da biodiversidade nos ecosistemas acuáticos centrouse principalmente na metabarcodificación do ADN ambiental (eDNA).Non obstante, este método adoita estar limitado na análise da biodiversidade cando se usan cebadores.O uso da secuenciación de escopeta elude as limitacións da PCR e a selección sesgada de conxuntos de cebadores.Así, en certo sentido, o noso método achégase máis ao método de secuenciación Shotgun eDNA de alto rendemento usado recentemente, que é capaz de secuenciar directamente o ADN fragmentado e analizar case todos os organismos [72, 73].Non obstante, hai unha serie de cuestións fundamentais que distinguen a LB dos métodos estándar de eDNA.Por suposto, a principal diferenza entre eDNA e LB é o uso de filtros naturais.Informeuse do uso de especies mariñas como esponxas e bivalvos (Dresseina spp.) como filtro natural para estudar o eDNA [74, 75].Non obstante, o estudo de Dreissena utilizou biopsias de tecidos das que se extraeu ADN.A análise do ccfDNA de LB non require biopsia de tecidos, equipos especializados e ás veces caros e loxística asociada con eDNA ou biopsia de tecidos.De feito, recentemente informamos de que o ccfDNA de LB pode almacenarse e analizarse co apoio da FTA sen manter unha cadea de frío, o que supón un gran desafío para a investigación en áreas remotas [76].A extracción de ccfDNA a partir de biopsias líquidas tamén é sinxela e proporciona ADN de alta calidade para a secuenciación de escopetas e a análise por PCR.Esta é unha gran vantaxe dadas algunhas das limitacións técnicas asociadas á análise de eDNA [77].A sinxeleza e o baixo custo do método de mostraxe tamén son especialmente axeitados para programas de seguimento a longo prazo.Ademais da súa alta capacidade de filtrado, outra característica coñecida dos bivalvos é a composición química de mucopolisacáridos do seu moco, que promove a absorción de virus [78, 79].Isto fai dos bivalvos un filtro natural ideal para caracterizar a biodiversidade e o impacto do cambio climático nun ecosistema acuático determinado.Aínda que a presenza de fragmentos de ADN derivados do hóspede pode verse como unha limitación do método en comparación co eDNA, o custo asociado a ter un ccfDNA tan nativo en comparación co eDNA é comprensible á vez pola gran cantidade de información dispoñible para estudos de saúde.anfitrión compensado.Isto inclúe a presenza de secuencias virais integradas no xenoma do hóspede hóspede.Isto é especialmente importante para os mexillóns, dada a presenza de retrovirus leucémicos transmitidos horizontalmente nos bivalvos [80, 81].Outra vantaxe do LB fronte ao eDNA é que aproveita a actividade fagocítica das células sanguíneas circulantes na hemolinfa, que engulle os microorganismos (e os seus xenomas).A fagocitose é a función principal das células sanguíneas nos bivalvos [82].Por último, o método aproveita a alta capacidade de filtración do mexillón (1,5 l/h de media de auga de mar) e a circulación de dous días, que aumentan a mestura de diferentes capas de auga do mar, permitindo a captura de eDNA heterólogo.[83, 84].Así, a análise do ccfDNA do mexillón é unha vía interesante dados os impactos nutricionais, económicos e ambientais do mexillón.Similar á análise do LB recollido en humanos, este método tamén abre a posibilidade de medir os cambios xenéticos e epixenéticos no ADN do hóspede en resposta a substancias esóxenas.Por exemplo, pódense contemplar tecnoloxías de secuenciación de terceira xeración para realizar análises de metilación de todo o xenoma no ccfDNA nativo mediante a secuenciación de nanoporos.Este proceso debería verse facilitado polo feito de que a lonxitude dos fragmentos de ccfDNA do mexillón é idealmente compatible con plataformas de secuenciación de lectura longa que permiten a análise da metilación do ADN en todo o xenoma a partir dunha única secuencia de secuenciación sen necesidade de transformacións químicas.85,86] Esta é unha posibilidade interesante, xa que se demostrou que os patróns de metilación do ADN reflicten unha resposta ao estrés ambiental de moitas xeracións.Polo tanto, pode proporcionar información valiosa sobre os mecanismos subxacentes que rexen a resposta despois da exposición ao cambio climático ou aos contaminantes [87].Non obstante, o uso de LB non está exento de limitacións.Nin que dicir ten que para iso esixe a presenza de especies indicadoras no ecosistema.Como se mencionou anteriormente, o uso de LB para avaliar a biodiversidade dun ecosistema determinado tamén require unha canalización bioinformática rigorosa que teña en conta a presenza de fragmentos de ADN da orixe.Outro problema importante é a dispoñibilidade de xenomas de referencia para as especies mariñas.Espérase que iniciativas como o Proxecto Xenomas de Mamíferos Mariños e o proxecto Fish10k recentemente establecido [88] faciliten esa análise no futuro.A aplicación do concepto LB aos organismos mariños que se alimentan por filtración tamén é compatible cos últimos avances na tecnoloxía de secuenciación, polo que é moi adecuado para o desenvolvemento de biomarcadores multi-ohmios para proporcionar información importante sobre a saúde dos hábitats mariños en resposta ao estrés ambiental.
Os datos de secuenciación do xenoma foron depositados no NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 baixo Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impacto do cambio climático na vida e os ecosistemas mariños.Cole Bioloxía.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Considere os impactos combinados do cambio climático e doutros estresores locais sobre o medio mariño.ambiente científico xeral.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Ciencia do primeiro de marzo.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. A tolerancia á calor reducida en condicións de estrés térmico repetitivo explica a alta mortalidade estival dos mexillóns azuis.Informe científico 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Cambios recentes na frecuencia, causas e extensión das mortes de animais.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Múltiples patóxenos non específicos dunha especie poden causar a mortalidade masiva de Pinna nobilis.A vida.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Impacto potencial do cambio climático nas enfermidades zoonóticas do Ártico.Int J Saúde circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Mexillón azul (Mytilus edulis spp.) como organismos sinal no seguimento da contaminación costeira: unha revisión.Mar Environ Res 2017;130: 338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integración da biopsia líquida no tratamento do cancro.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Maduración da biopsia líquida: Permite a circulación do ADN tumoral.Nat Rev Cancro.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Ácidos nucleicos no plasma humano.Actas da reunión das filiais de Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un novo papel para o ADN libre de células como marcador molecular para o tratamento do cancro.Cuantificación da análise biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS A biopsia líquida entra na clínica: problemas de implementación e desafíos futuros.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW e outros.O ADN fetal está presente no plasma materno e no soro.Lanceta.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Estudo do curso do embarazo e as súas complicacións utilizando ARN extracelular circulante no sangue das mulleres durante o embarazo.Dopediatría.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsia líquida: o ADN libre de células doadores utilízase para detectar lesións aloxénicas nun enxerto renal.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovacións no diagnóstico prenatal: secuenciación do xenoma do plasma materno.Ana MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Detección rápida de patóxenos con secuenciación metaxenómica de próxima xeración de fluídos corporais infectados.Nat Medicina.2021;27:115-24.