Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
O sangrado incontrolado é unha das principais causas de morte.Conseguir unha rápida hemostase garante a supervivencia do suxeito como primeiros auxilios durante os combates, accidentes de tráfico e operacións de redución de mortes.Andamio composto reforzado con fibras nanoporosas (NFRCS) derivado dunha composición formadora de película hemostática simple (HFFC) xa que unha fase continua pode desencadear e mellorar a hemostase.O desenvolvemento do NFRCS baséase no deseño da á da libélula.A estrutura das ás da libélula consta de ás transversais e lonxitudinais, e as membranas das ás están conectadas entre si para manter a integridade da microestrutura.HFFC recubre uniformemente a superficie da fibra cunha película de espesor nanométrico e conecta o grosor do algodón (Ct) (fase dispersa) distribuído aleatoriamente para formar unha estrutura nanoporosa.A combinación de fases continuas e dispersas reduce o custo do produto en dez veces en comparación cos produtos dispoñibles comercialmente.Os NFRCS modificados (tampóns ou pulseiras) pódense usar nunha variedade de aplicacións biomédicas.Estudos in vivo concluíron que o Cp NFRCS desencadea e mellora o proceso de coagulación no lugar de aplicación.O NFRCS pode modular o microambiente e actuar a nivel celular debido á súa estrutura nanoporosa que resulta nunha mellor cicatrización das feridas no modelo de feridas por escisión.
O sangrado incontrolado durante o combate, as situacións intraoperatorias e de emerxencia pode supoñer unha grave ameaza para a vida dos feridos1.Estas condicións levan ademais a un aumento xeral da resistencia vascular periférica, o que leva a choque hemorráxico.As medidas adecuadas para controlar o sangrado durante e despois da cirurxía considéranse potencialmente mortais2,3.O dano a grandes vasos conduce a unha perda masiva de sangue, o que resulta nunha taxa de mortalidade ≤ 50 % en combate e 31 % durante a cirurxía1.A perda masiva de sangue leva a unha diminución do volume corporal, o que reduce o gasto cardíaco.Un aumento da resistencia vascular periférica total e un deterioro progresivo da microcirculación conducen a hipoxia nos órganos de soporte vital.O choque hemorráxico pode ocorrer se a condición continúa sen unha intervención eficaz1,4,5.Outras complicacións inclúen a progresión da hipotermia e a acidose metabólica, así como un trastorno da coagulación que impide o proceso de coagulación.O shock hemorráxico grave asóciase a un maior risco de morte6,7,8.No choque de grao III (progresivo), a transfusión de sangue é esencial para a supervivencia do paciente durante a morbilidade e mortalidade intraoperatoria e posoperatoria.Para superar todas as situacións de perigo de vida anteriores, desenvolvemos un andamio composto reforzado con fibras nanoporosas (NFRCS) que utiliza unha concentración mínima de polímero (0,5%) utilizando unha combinación de polímeros hemostáticos solubles en auga.
Co uso de reforzo de fibra, pódense desenvolver produtos rendibles.As fibras dispostas ao azar semellan a estrutura da á dunha libélula, equilibradas polas franxas horizontais e verticais das ás.As veas transversais e lonxitudinais da á comunícanse coa membrana da á (fig. 1).NFRCS consiste en Ct reforzado como sistema de andamio con mellor resistencia física e mecánica (Figura 1).Debido á accesibilidade e á artesanía, os cirurxiáns prefiren usar medidores de fíos de algodón (Ct) durante as operacións e os apósitos. Polo tanto, tendo en conta os seus múltiples beneficios, incluíndo > 90% de celulosa cristalina (imparte na mellora da actividade hemostática), Ct utilizouse como sistema esquelético de NFRCS9,10. Polo tanto, tendo en conta os seus múltiples beneficios, incluíndo > 90% de celulosa cristalina (imparte na mellora da actividade hemostática), Ct utilizouse como sistema esquelético de NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90 % кристалличесвесклой в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Polo tanto, dados os seus moitos beneficios, incluíndo > 90% de celulosa cristalina (implicada no aumento da actividade hemostática), Ct utilizouse como sistema esquelético NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 % 的结晶纤维素（有助于增强止血滢止血滴止血滴 NF， NF ，，，，，，） ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Polo tanto, dados os seus moitos beneficios, incluíndo máis do 90% de celulosa cristalina (axuda a mellorar a actividade hemostática), Ct utilizouse como armazón para NFRCS9,10.Ct foi recuberto superficialmente (observouse formación de película nano-espesa) e interconectado cunha composición formadora de película hemostática (HFFC).HFFC actúa como un matrixel, mantendo xuntos Ct colocados aleatoriamente.O deseño desenvolvido transmite tensión dentro da fase dispersa (fibras de reforzo).É difícil obter estruturas nanoporosas con boa resistencia mecánica usando concentracións mínimas de polímeros.Ademais, non é doado personalizar diferentes moldes para diferentes aplicacións biomédicas.
A figura mostra un diagrama do deseño NFRCS baseado na estrutura de ás de libélula (A).Esta imaxe mostra unha analoxía comparativa da estrutura da á dunha libélula (as veas que se cruzan e lonxitudinais da á están interconectadas) e unha microfotografía de sección transversal de Cp NFRCS (B).Representación esquemática de NFRCS.
Os NFRC desenvolvéronse utilizando HFFC como unha fase continua para abordar as limitacións anteriores.O HFFC está composto por varios polímeros hemostáticos formadores de película, incluíndo quitosano (como polímero hemostático principal) con metilcelulosa (MC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC 50 cp) e alcohol polivinílico (PVA)) (125 kDa) como polímero de soporte que promove a formación de trombos.formación.A adición de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) mellorou a capacidade de absorción de humidade do NFRCS.Engadiuse polietilenglicol 400 (PEG 400) para mellorar a reticulación dos polímeros nas mesturas de polímeros unidos.Aplicáronse a Ct tres composicións hemostáticas de HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC e Cp HFFC), a saber, quitosano con MC (Cm), quitosano con HPMC (Ch) e quitosano con PVA (Cp).Varios estudos de caracterización in vitro e in vivo confirmaron a actividade hemostática e de cicatrización de feridas do NFRCS.Os materiais compostos ofrecidos por NFRCS pódense usar para personalizar varias formas de andamios para satisfacer necesidades específicas.
Ademais, o NFRCS pódese modificar como vendaxe ou rolo para cubrir toda a área da lesión das extremidades inferiores e outras partes do corpo.Específicamente para as lesións dos membros de combate, o deseño NFRCS deseñado pódese cambiar a medio brazo ou perna completa (Figura complementaria S11).O NFRCS pódese converter nunha pulseira con pegamento para tecidos, que se pode usar para deter o sangramento de lesións suicidas graves no pulso.O noso principal obxectivo é desenvolver un NFRCS co menor polímero posible que poida ser entregado a unha gran poboación (por debaixo do limiar da pobreza) e que se poida colocar nun botiquín de primeiros auxilios.Sinxelo, eficiente e económico no seu deseño, NFRCS beneficia ás comunidades locais e pode ter un impacto global.
Quitosano (peso molecular 80 kDa) e amaranto foron adquiridos de Merck, India.A hidroxipropil metilcelulosa 50 Cp, o polietilenglicol 400 e a metilcelulosa foron adquiridas de Loba Chemie Pvt.LLC, Bombai.O alcohol polivinílico (peso molecular 125 kDa) (87-90 % hidrolizado) foi adquirido de National Chemicals, Gujarat.A polivinilpirrolidina K30 comprouse en Molychem, Bombai, os hisopos estériles foron adquiridos en Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, con auga Milli Q (sistema de purificación de auga Direct-Q3, Merck, India) como transportista.
O NFRCS desenvolveuse mediante un método de liofilización11,12.Todas as composicións de HFFC (táboa 1) preparáronse usando un axitador mecánico.Preparar unha solución de quitosano ao 0,5% usando ácido acético ao 1% en auga axitando continuamente a 800 rpm cun axitador mecánico.O peso exacto do polímero cargado indicado na Táboa 1 engadiuse á solución de quitosano e axitouse ata obter unha solución de polímero transparente.Engadíronse PVP K30 e PEG 400 á mestura resultante nas cantidades indicadas na Táboa 1, e continuou a axitación ata obter unha solución de polímero viscoso transparente.O baño resultante de solución de polímero foi sonicado durante 60 minutos para eliminar as burbullas de aire atrapadas da mestura de polímero.Como se mostra na figura complementaria S1 (b), Ct distribuíuse uniformemente en cada pozo dunha placa de 6 pozos (molde) complementada con 5 ml de HFFC.
A placa de seis pozos foi sonicada durante 60 minutos para lograr a humectación e a distribución uniformes de HFFC na rede Ct.A continuación, conxela a placa de seis pozos a -20 °C durante 8-12 horas.As placas de conxelación foron liofilizadas durante 48 horas para obter varias formulacións de NFRCS.O mesmo procedemento úsase para producir diferentes formas e estruturas, como tampóns ou tampóns cilíndricos, ou calquera outra forma para diferentes aplicacións.
O quitosano pesado con precisión (80 kDa) (3%) disólvese en ácido acético ao 1% usando un axitador magnético.Á solución resultante de quitosano engadiuse 1% de PEG 400 e axitause durante 30 minutos.Verter a solución resultante nun recipiente cadrado ou rectangular e conxelar a -80 °C durante 12 horas.As mostras conxeladas foron liofilizadas durante 48 horas para obter Cs13 poroso.
O NFRCS desenvolvido foi sometido a experimentos mediante espectroscopia infravermella de transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Xapón) para confirmar a compatibilidade química do quitosano con outros polímeros14,15.Os espectros FTIR (ancho do intervalo espectral de 400 a 4000 cm-1) de todas as mostras probadas obtivéronse mediante a realización de 32 exploracións.
A taxa de absorción sanguínea (BAR) para todas as formulacións avaliouse mediante o método descrito por Chen et al.16 con pequenas modificacións.Os NFRK desenvolvidos de todas as composicións secáronse nun forno ao baleiro a 105 °C durante a noite para eliminar o disolvente residual.Colocáronse 30 mg de NFRCS (peso inicial da mostra - W0) e 30 mg de Ct (control positivo) en pratos separados que conteñen unha premestura de citrato de sodio ao 3,8%.A intervalos de tempo predeterminados, é dicir, 5, 10, 20, 30, 40 e 60 segundos, elimináronse os NFRCS e limpáronse as súas superficies do sangue non absorbido colocando as mostras en Ct durante 30 segundos.Considerouse o peso final do sangue absorbido polo NFRCS 16 (W1) en cada momento.Calcula a porcentaxe de BAR usando a seguinte fórmula:
O tempo de coagulación do sangue (BCT) determinouse segundo o informado por Wang et al.17 .O tempo necesario para que o sangue enteiro (sangue de rato premesturado con citrato de sodio 3,8%) coagulase en presenza de NFRCS calculouse como o BCT da mostra da proba.Os distintos compoñentes de NFRCS (30 mg) colocáronse en frascos de tapón de rosca de 10 ml e incubáronse a 37 °C.Engadiuse sangue (0,5 ml) ao frasco e 0,3 ml de CaCl2 0,2 ​​M para activar a coagulación do sangue.Finalmente, inverte o frasco cada 15 segundos (ata 180°) ata que se forme un coágulo firme.O BCT da mostra estímase polo número de flips vails17,18.En base a BCT, seleccionáronse dúas composicións óptimas de NFRCS Cm, Ch e Cp para estudos de caracterización posteriores.
O BCT das composicións Ch NFRCS e Cp NFRCS determinouse implementando o método descrito por Li et al.19 .Coloque 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs (control positivo) en placas de Petri separadas (37 °C).Mesturouse o sangue que contiña citrato de sodio ao 3,8% con CaCl2 0,2 ​​M nunha proporción de volume 10:1 para iniciar o proceso de coagulación do sangue.Aplicáronse 20 µl de mestura de sangue de rata 0,2 M de CaCl2 á superficie da mostra e colocáronse nunha placa de Petri baleira.O control foi o sangue vertido en placas de Petri baleiras sen Ct.A intervalos fixos de 0, 3 e 5 minutos, detén a coagulación engadindo 10 ml de auga desionizada (DI) á mostra que contén o prato sen perturbar o coágulo.Os eritrocitos non coagulados (eritrocitos) sofren hemólise en presenza de auga desionizada e liberan hemoglobina.A hemoglobina en diferentes puntos de tempo (HA(t)) foi medida a 540 nm (λmáx. hemoglobina) usando un espectrofotómetro UV-Vis.Tomouse como patrón de referencia a absorción absoluta de hemoglobina (AH(0)) en 0 min de 20 µl de sangue en 10 ml de auga desionizada.A captación relativa de hemoglobina (RHA) do sangue coagulado calculouse a partir da relación HA(t)/HA(0) usando o mesmo lote de sangue.
Usando un analizador de texturas (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EUA), determináronse as propiedades adhesivas de NFRK ao tecido danado.Preme un prato cilíndrico de fondo aberto contra o interior da pel de porco (sen a capa de graxa).As mostras (Ch NFRCS e Cp NFRCS) aplicáronse mediante cánula en moldes cilíndricos para crear adhesión á pel do porco.Despois dunha incubación de 3 minutos a temperatura ambiente (RT) (25 °C), rexistrouse a forza adhesiva NFRCS a unha velocidade constante de 0,5 mm/seg.
A principal característica dos selantes cirúrxicos é aumentar a coagulación do sangue mentres reduce a perda de sangue.A coagulación sen perdas en NFRCS avaliouse mediante un método publicado previamente con lixeiras modificacións 19 .Fai un tubo de microcentrífuga (2 ml) (diámetro interior 10 mm) cun orificio de 8 × 5 mm2 nun lado do tubo de centrífuga (que representa unha ferida aberta).NFRCS úsase para pechar a abertura e a cinta úsase para selar os bordos exteriores.Engade 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M ao tubo de microcentrífuga que contén a premestura de citrato de sodio ao 3,8%.Despois de 10 minutos, retiráronse os tubos de microcentrífuga dos pratos e determinouse o aumento da masa dos pratos debido á saída de sangue do NFRK (n = 3).Comparáronse as perdas de sangue Ch NFRCS e Cp NFRCS con Cs.
A integridade húmida do NFRCS determinouse a partir do método descrito por Mishra e Chaudhary21 con pequenas modificacións.Coloque o NFRCS nun matraz Erlenmeyer de 100 ml con 50 ml de auga e remueva durante 60 s sen formar parte superior.Inspección visual e priorización das mostras para a integridade física en función da recollida.
A forza de unión do HFFC ao Ct estudouse utilizando métodos publicados previamente con pequenas modificacións.A integridade do revestimento superficial avaliouse expoñendo NFRK a ondas acústicas (estímulo externo) en presenza de auga milliQ (Ct).Os NFRCS Ch NFRCS e Cp NFRCS desenvolvidos colocáronse nun vaso de precipitados cheo de auga e sonicados durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 30 min, respectivamente.Despois do secado, utilizouse a diferenza porcentual entre o peso inicial e final do NFRCS para calcular a porcentaxe de perda de material (HFFC).BCT in vitro apoiou aínda máis a forza de unión ou a perda de materiais de superficie.A eficiencia da unión de HFFC ao Ct proporciona coagulación do sangue e un revestimento elástico na superficie do Ct22.
A homoxeneidade do NFRCS desenvolvido determinouse polo BCT de mostras (30 mg) tomadas de lugares xerais seleccionados aleatoriamente do NFRCS.Siga o procedemento BCT mencionado anteriormente para determinar o cumprimento da NFRCS.A proximidade entre as cinco mostras garante unha cobertura uniforme da superficie e a deposición de HFFC na malla Ct.
A área nominal de contacto con sangue (NBCA) determinouse como se informou anteriormente con algunhas modificacións.Coagula o sangue premendo 20 µl de sangue entre as dúas superficies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs.Despois de 1 hora, as dúas partes do stent separáronse e mediron manualmente a área do coágulo.O valor medio de tres repeticións considerouse NBCA NFRCS19.
Utilizouse a análise de absorción dinámica de vapor (DVS) para avaliar a eficacia do NFRCS para absorber auga do medio externo ou do lugar da lesión responsable de iniciar a coagulación.O DVS avalía ou rexistra a absorción e perda de vapor nunha mostra gravimétricamente utilizando unha balanza ultrasensible cunha resolución de masa de ±0,1 µg.Unha presión de vapor parcial (humidade relativa) é xerada por un controlador electrónico de fluxo de masa ao redor da mostra mesturando gases portadores saturados e secos. Segundo as directrices da Farmacopea Europea, en función da porcentaxe de absorción de humidade polas mostras, as mostras clasificáronse en 4 categorías (0-0,012 % p/p− non higroscópicas, 0,2-2 % p/p lixeiramente higroscópicas, 2-15 % moderadamente higroscópicas) e > 15 % p/p moi higroscópicas e > 15 % p/p. Segundo as directrices da Farmacopea Europea, en función da porcentaxe de absorción de humidade polas mostras, as mostras clasificáronse en 4 categorías (0-0,012 % p/p− non higroscópicas, 0,2-2 % p/p lixeiramente higroscópicas, 2-15 % moderadamente higroscópicas) e > 15 % p/p moi higroscópicas e > 15 % p/p.De acordo coas recomendacións da Farmacopea Europea, dependendo da porcentaxe de absorción de humidade polas mostras, as mostras dividíronse en 4 categorías (0-0,012% p/p - non higroscópico, 0,2-2% p/p lixeiramente higroscópico, 2-15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadamente higroscópico e > 15% moi higroscópico)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/0,012% w/0,012% w/0,012% w/0,012% /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 分为 分为 分 分 0（ 0.00（0.湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。De acordo coas recomendacións da Farmacopea Europea, as mostras divídense en 4 clases dependendo da porcentaxe de humidade absorbida pola mostra (0-0,012% en peso - non higroscópico, 0,2-2% en peso lixeiramente higroscópico, 2-15% en peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderadamente higroscópico, > 15 % moi higroscópico) 23.A eficiencia higroscópica de NFCS X NFCS e TsN NFCS determinouse nun analizador DVS TA TGA Q5000 SA.Durante este proceso, obtivéronse o tempo de execución, a humidade relativa (RH) e o peso da mostra en tempo real a 25 °C24.O contido de humidade calcúlase mediante unha análise de masa NFRCS precisa mediante a seguinte ecuación:
MC é a humidade NFRCS.m1 - peso seco dos AINE.m2 é a masa NFRCS en tempo real a unha determinada RH.
A superficie total estimouse mediante un experimento de adsorción de nitróxeno con nitróxeno líquido despois de baleirar as mostras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). A superficie total estimouse mediante un experimento de adsorción de nitróxeno con nitróxeno líquido despois de baleirar as mostras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азоток по сперимента ожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). A superficie total estimouse mediante un experimento de adsorción de nitróxeno con nitróxeno líquido despois de que as mostras fosen baleiradas a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表靂总表。✨ 25 °C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбцод писорбцод писалась ле опорожнения образцов в течение 10 часов при 25 °C (< 7 × 10-3 торр). A superficie total estimouse mediante experimentos de adsorción de nitróxeno con nitróxeno líquido despois de que as mostras fosen baleiradas durante 10 horas a 25 °C (< 7 x 10-3 torr).A superficie total, o volume de poro e o tamaño dos poros NFRCS determináronse cun Quantachrome de NOVA 1000e, Austria usando o software RS 232.
Prepare un 5% de glóbulos rojos (solución salina como diluyente) a partir de sangue enteiro.A continuación, transfire unha alícuota de HFFC (0,25 ml) a unha placa de 96 pocillos e 5% de masa de glóbulos rojos (0,1 ml).Incubar a mestura a 37 °C durante 40 minutos.Considerouse unha mestura de glóbulos vermellos e soro como control positivo, e unha mestura de solución salina e glóbulos vermellos como control negativo.A hemaglutinación determinouse segundo a escala Stajitzky.As escalas propostas son as seguintes: + + + + agregados granulares densos;+ + + almofadas inferiores lisas con bordos curvos;+ + almofadas inferiores lisas con bordos rasgados;+ aneis vermellos estreitos ao redor dos bordos das almofadas lisas;– (negativo) botón vermello discreto 12 no centro do pozo inferior.
A hemocompatibilidade do NFRCS estudouse segundo o método da Organización Internacional de Normalización (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.O método gravimétrico descrito por Singh et al.Realizáronse pequenas modificacións para avaliar a formación de trombos na presenza ou na superficie de NFRCS.Incubáronse 500 mg de Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 24 horas a 37 °C.Despois de 24 horas, eliminouse o PBS e tratouse NFRCS con 2 ml de sangue que contiña citrato de sodio ao 3,8%.Na superficie do NFRCS, engade 0,04 ml de CaCl2 0,1 M ás mostras incubadas.Despois de 45 minutos, engadíronse 5 ml de auga destilada para deter a coagulación.O sangue coagulado na superficie de NFRK tratouse con solución de formaldehido ao 36-38%.Secáronse e pesáronse os coágulos fixados con formaldehido.A porcentaxe de trombose estimouse calculando o peso do vaso sen sangue e mostra (control negativo) e do vaso con sangue (control positivo).
Como confirmación inicial, as mostras foron visualizadas baixo un microscopio óptico para comprender a capacidade do revestimento superficial de HFFC, Ct interconectado e a rede de Ct para formar poros.Seccións finas de Ch e Cp de NFRCS recortáronse cunha folla de bisturí.A sección resultante colocouse sobre un portaobjetos de vidro, cuberta cun cubreobjetos e fixáronse os bordos con cola.As diapositivas preparadas observáronse ao microscopio óptico e realizáronse fotografías con diferentes aumentos.
A deposición de polímeros en redes Ct visualizouse mediante microscopía de fluorescencia baseada no método descrito por Rice et al.29. A composición de HFFC utilizada para a formulación mesturouse cun colorante fluorescente (amaranto) e preparáronse NFRCS (Ch e Cp) segundo o método mencionado anteriormente. A composición de HFFC utilizada para a formulación mesturouse cun colorante fluorescente (amaranto) e preparáronse NFRCS (Ch e Cp) segundo o método mencionado anteriormente.A composición de HFFC utilizada para a formulación mesturouse cun colorante fluorescente (amaranto) e obtívose NFRCS (Ch e Cp) segundo o método mencionado anteriormente.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜)将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜)A composición de HFFC utilizada na formulación mesturouse cun colorante fluorescente (Amaranto) e recibiu NFRCS (Ch e Cp), como se mencionou anteriormente.Cortáronse seccións finas de NFRK das mostras obtidas, colocáronse sobre portas de vidro e cubríronse con cubreobjetos.Observe as láminas preparadas baixo un microscopio fluorescente utilizando un filtro verde (310-380 nm).Tomáronse imaxes con un aumento de 4x para comprender as relacións Ct e o exceso de deposición de polímeros na rede Ct.
A topografía da superficie de NFRCS Ch e Cp determinouse mediante un microscopio de forza atómica (AFM) cun voladizo TESP ultranítido en modo tapping: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwán.A rugosidade da superficie determinouse mediante a raíz cadrada media (RMS) mediante un software (Scanning Probe Image Processor).Varias localizacións NFRCS foron representadas en imaxes 3D para comprobar a uniformidade da superficie.A desviación estándar da puntuación para unha determinada área defínese como a rugosidade da superficie.Utilizouse a ecuación RMS para cuantificar a rugosidade superficial de NFRCS31.
Realizáronse estudos baseados en FESEM usando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, para comprender a morfoloxía superficial de Ch NFRCS e Cp NFRCS, que mostraron mellor BCT que Cm NFRCS.O estudo FESEM realizouse segundo o método descrito por Zhao et al.32 con pequenas modificacións.NFRCS 20 a 30 mg Ch NFRCS e Cp NFRCS foron mesturados previamente con 20 µl de citrato sódico ao 3,8% premesturado con sangue de rata.Engadíronse 20 μl de CaCl2 0,2 ​​M ás mostras tratadas con sangue para iniciar a coagulación e as mostras incubáronse a temperatura ambiente durante 10 minutos.Ademais, os eritrocitos en exceso foron eliminados da superficie NFRCS mediante aclarado con solución salina.
As mostras posteriores foron tratadas con glutaraldehido ao 0,1% e despois secáronse nun forno de aire quente a 37 °C para eliminar a humidade.As mostras secas foron recubertas e analizadas 32 .Outras imaxes obtidas durante a análise foron a formación de coágulos na superficie de fibras individuais de algodón, a deposición de polímeros entre Ct, a morfoloxía (forma) dos eritrocitos, a integridade do coágulo e a morfoloxía dos eritrocitos en presenza de NFRCS.As áreas NFRCS non tratadas e as áreas NFRCS tratadas con Ch e Cp incubadas con sangue foron escaneadas en busca de ións elementais (sodio, potasio, nitróxeno, calcio, magnesio, cinc, cobre e selenio)33.Compare as porcentaxes de ións elementais entre mostras tratadas e non tratadas para comprender a acumulación de ións elementais durante a formación do coágulo e a homoxeneidade do coágulo.
O espesor do revestimento da superficie de Cp HFFC na superficie de Ct determinouse mediante FESEM.As seccións transversais de Cp NFRCS foron cortadas da armazón e recubertas por pulverización catódica.FESEM observou as mostras de revestimento por pulverización catódica resultantes e mediuse o grosor do revestimento superficial 34 , 35 , 36 .
A micro-TC de raios X proporciona imaxes non destrutivas 3D de alta resolución e permítelle estudar a disposición estrutural interna do NFRK.A micro-TC utiliza un feixe de raios X que atravesa a mostra para rexistrar o coeficiente de atenuación lineal local dos raios X na mostra, o que axuda a obter información morfolóxica.A localización interna de Ct en Cp NFRCS e Cp NFRCS tratada con sangue examinouse mediante micro-TC para comprender a eficacia de absorción e a coagulación do sangue en presenza de NFRCS37,38,39.As estruturas 3D de mostras de Cp NFRCS tratadas con sangue e non tratadas foron reconstruídas mediante micro-TC (V|tome|x S240, Phoenix, Alemaña).Usando a versión 2.2 do software VG STUDIO-MAX, tomáronse varias imaxes de raios X desde diferentes ángulos (idealmente cunha cobertura de 360°) para desenvolver imaxes 3D para NFRCS.Os datos de proxección recollidos reconstruíronse en imaxes volumétricas 3D utilizando o correspondente software 3D ScanIP Academic sinxelo.
Ademais, para comprender a distribución do coágulo, engadíronse ao NFRCS 20 µl de sangue premesturado con citrato e 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M para iniciar a coagulación do sangue.As mostras preparadas déixanse endurecer.A superficie de NFRK tratouse con glutaraldehido ao 0,5% e secouse nun forno de aire quente a 30-40 ° C durante 30 min.O coágulo de sangue formado no NFRCS foi escaneado, reconstruído e visualizouse unha imaxe 3D do coágulo de sangue.
Realizáronse ensaios antibacterianos en Cp NFRCS (mellor en comparación co Ch NFRCS) utilizando o método descrito anteriormente con pequenas modificacións.A actividade antibacteriana de Cp NFRCS e Cp HFFC determinouse mediante tres microorganismos de proba diferentes [S.aureus (bacterias grampositivas), E.coli (bacterias gramnegativas) e Candida branca (C.albicans)] que crecían en agar en placas de Petri nunha incubadora.Inocular uniformemente 50 ml da suspensión de cultivo bacteriano diluído nunha concentración de 105-106 CFU ml-1 sobre o medio de agar.Verte o medio nunha placa de Petri e deixa que se solidifique.Realizáronse pozos na superficie da placa de agar para encher con HFFC (3 pozos para HFFC e 1 para o control negativo).Engade 200 µl de HFFC a 3 pozos e 200 µl de pH 7,4 PBS ao cuarto pozo.No outro lado da placa de Petri, coloque un disco Cp NFRCS de 12 mm sobre o ágar solidificado e humedecelo con PBS (pH 7,4).Os comprimidos de ciprofloxacino, ampicilina e fluconazol considéranse patróns de referencia para Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans.Mida manualmente a zona de inhibición e tome unha imaxe dixital da zona de inhibición.
Despois da aprobación ética institucional, o estudo realizouse no Kasturba Medical College of Education and Research en Manipal, Karnataka, no sur da India.O protocolo experimental TEG in vitro foi revisado e aprobado polo Comité de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Os suxeitos foron recrutados entre doadores de sangue voluntarios (entre 18 e 55 anos) do banco de sangue do hospital.Ademais, conseguiuse un consentimento informado dos voluntarios para a recollida de mostras de sangue.O TEG nativo (N-TEG) ​​foi usado para estudar o efecto da formulación de Cp HFFC sobre sangue enteiro premesturado con citrato de sodio.O N-TEG é amplamente recoñecido polo seu papel na reanimación no punto de atención, o que crea problemas para os médicos debido ao potencial de atraso clínicamente significativo nos resultados (probas de coagulación de rutina).A análise N-TEG realizouse usando sangue enteiro.Obtívose o consentimento informado e a historia clínica detallada de todos os participantes.O estudo non incluíu participantes con complicacións hemostáticas ou trombóticas como o embarazo/posparto ou enfermidades hepáticas.Tamén se excluíron do estudo os suxeitos que tomaban fármacos que afectan á fervenza da coagulación.Realizáronse probas básicas de laboratorio (hemoglobina, tempo de protrombina, tromboplastina activada e reconto de plaquetas) a todos os participantes segundo os procedementos estándar.N-TEG determina a viscoelasticidade do coágulo sanguíneo, a estrutura inicial do coágulo, a interacción das partículas, o fortalecemento do coágulo e a lise do coágulo.A análise N-TEG proporciona datos gráficos e numéricos sobre os efectos colectivos de varios elementos celulares e plasma.A análise N-TEG realizouse en dous volumes diferentes de Cp HFFC (10 µl e 50 µl).Como resultado, engadiuse 1 ml de sangue enteiro con ácido cítrico a 10 μl de Cp HFFC.Engade 1 ml (Cp HFFC + sangue citrato), 340 µl de sangue mesturado a 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M que contén TEG.Despois, cargáronse pratos de TEG en TEG® 5000, US para medir R, K, ángulo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY o 30% das mostras de sangue en presenza de Cp HFFC41.
O protocolo de estudo in vivo foi revisado e aprobado polo Comité Institucional de Ética Animal (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Todos os experimentos con animais realizáronse de acordo coas recomendacións do Comité de Control e Supervisión da Experimentación Animal (CPCSEA).Todos os estudos NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) realizáronse en ratas Wistar femias (con un peso de 200 a 250 g).Todos os animais foron aclimatados a unha temperatura de 24-26 °C, os animais tiñan acceso libre a comida e auga estándar ad libitum.Todos os animais foron divididos aleatoriamente en diferentes grupos, cada grupo estaba formado por tres animais.Todos os estudos realizáronse de acordo con Estudos en animais: Informe de experimentos in vivo 43 .Antes do estudo, os animais foron anestesiados mediante a administración intraperitoneal (ip) dunha mestura de 20-50 mg de ketamina (por 1 kg de peso corporal) e 2-10 mg de xilazina (por 1 kg de peso corporal).Despois do estudo, calculouse o volume de sangrado avaliando a diferenza entre o peso inicial e final das mostras, tomouse como volume de sangrado da mostra o valor medio obtido das tres probas.
Implementouse o modelo de amputación da cola de rata para comprender o potencial do NFRCS para modular o sangrado en traumas, combates ou accidentes de tráfico (modelo de lesións).Cortar o 50% da cola cunha lámina de bisturí e colocar no aire durante 15 s para garantir o sangrado normal.Ademais, colocáronse mostras de proba na cola dunha rata aplicando presión (Ct, Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS).Informes de hemorraxia e PCT para mostras de proba (n = 3)17,45.
A eficacia do control da presión NFRCS en combate investigouse nun modelo da arteria femoral superficial.Exponse a arteria femoral, perforase cun trocar de 24G e sangrárase en 15 segundos.Despois de observar unha hemorraxia incontrolada, a mostra colócase no lugar da punción con presión aplicada.Inmediatamente despois da aplicación da mostra de proba, rexistrouse o tempo de coagulación e observouse a eficacia hemostática durante os seguintes 5 minutos.Repetiuse o mesmo procedemento con Cs e Ct46.
Dowling et al.47 propuxeron un modelo de lesión hepática para avaliar o potencial hemostático dos materiais hemostáticos no contexto da hemorraxia intraoperatoria.BCT rexistrouse para mostras de Ct (control negativo), cadro Cs (control positivo), mostras de Ch NFRCS e Cp NFRCS.A vea cava suprahepática da rata foi exposta mediante a realización dunha laparotomía media.Despois diso, a parte distal do lóbulo esquerdo foi cortada cunhas tesoiras.Fai unha incisión no fígado cunha lámina de bisturí e déixao sangrar uns segundos.Colocáronse mostras de proba de Ch NFRCS e Cp NFRCS pesadas con precisión na superficie danada sen ningunha presión positiva e rexistrouse BCT.A continuación, o grupo control (Ct) aplicou presión seguida de Cs 30 s47 sen romper a lesión.
Realizáronse ensaios de cicatrización de feridas in vivo mediante un modelo de ferida por escisión para avaliar as propiedades de cicatrización das feridas dos NFRCS baseados en polímeros desenvolvidos.Seleccionáronse e realizáronse modelos de feridas por escisión segundo métodos publicados previamente con pequenas modificacións19,32,48.Todos os animais foron anestesiados como se describiu anteriormente.Use un punzón de biopsia (12 mm) para facer unha incisión circular profunda na pel das costas.Os lugares de feridas preparados foron vestidos con Cs (control positivo), Ct (recoñecendo que as almofadas de algodón interfiren coa cicatrización), Ch NFRCS e Cp NFRCS (grupo experimental) e un control negativo sen ningún tratamento.En cada día do estudo, mediuse a área da ferida en todas as ratas.Use unha cámara dixital para facer unha foto da zona da ferida e póñase un apósito novo.A porcentaxe de peche da ferida mediuse coa seguinte fórmula:
En función da porcentaxe de peche da ferida no día 12 do estudo, a pel de rata do mellor grupo foi extirpada ((Cp NFRCS) e o grupo control) e estudouse mediante a tinción H&E e a tinción tricromática de Masson. En función da porcentaxe de peche da ferida no día 12 do estudo, a pel de rata do mellor grupo foi extirpada ((Cp NFRCS) e o grupo control) e estudouse mediante a tinción H&E e a tinción tricromática de Masson.En base á porcentaxe de peche da ferida no día 12 do estudo, a pel das ratas do mellor grupo ((Cp NFRCS) e do grupo control) foi extirpada e examinada por tinción con hematoxilina-eosina e tricromo de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠百分比根据进鼠皌按进E Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皓分比切进鼠皌按进最眳组）As ratas do mellor grupo ((Cp NFRCS) e grupos control) foron extirpadas para a tinción de hematoxilina-eosina e a tinción de tricromo de Masson en función da porcentaxe de peche da ferida o día 12 do estudo.O procedemento de tinción implementado realizouse segundo os métodos descritos anteriormente49,50.Brevemente, tras a fixación en formalina ao 10%, as mostras deshidratáronse mediante unha serie de alcohois graduados.Use un micrótomo para obter seccións finas (5 µm de espesor) do tecido extirpado.Tratáronse seccións serias finas de controis e Cp NFRCS con hematoxilina e eosina para estudar os cambios histopatolóxicos.Utilizouse a tinción tricromática de Masson para detectar a formación de fibrillas de coláxeno.Os resultados obtidos foron estudados a cegas por patólogos.
A estabilidade das mostras de Cp NFRCS estudouse a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C/60% RH ± 5%) durante 12 meses51.Cp NFRCS (decoloración da superficie e crecemento microbiano) inspeccionouse visualmente e probouse a resistencia ao desgaste do pregamento e a BCT segundo os métodos anteriores descritos na sección Materiais e métodos.
A escalabilidade e reproducibilidade de Cp NFRCS examinouse preparando Cp NFRCS cun tamaño de 15 × 15 cm2.Ademais, elimináronse mostras de 30 mg (n = 5) de varias fraccións Cp NFRCS e avaliouse o BCT das mostras estudadas como se describiu anteriormente na sección de Métodos.
Tentamos desenvolver varias formas e estruturas usando composicións de Cp NFRCS para diversas aplicacións biomédicas.Tales formas ou configuracións inclúen hisopos cónicos para hemorraxias nasais, procedementos dentais e hisopos cilíndricos para hemorraxias vaxinais.
Todos os conxuntos de datos exprésanse como media ± desviación estándar e foron analizados mediante ANOVA usando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) seguido da proba de comparacións múltiples de Bonferroni (*p<0.05).
Todos os procedementos realizados en estudos humanos estiveron de acordo cos estándares do Instituto e do National Research Council, así como coa Declaración de Helsinki de 1964 e as súas modificacións posteriores, ou estándares éticos similares.Todos os participantes foron informados sobre as características do estudo e o seu carácter voluntario.Os datos dos participantes permanecen confidenciais unha vez recollidos.O protocolo experimental TEG in vitro foi revisado e aprobado polo Comité de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Os voluntarios asinaron o consentimento informado para recoller mostras de sangue.
Todos os procedementos realizados en estudos con animais realizáronse de acordo coa Facultade de Medicina de Kastuba, Instituto de Educación Superior de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Todos os experimentos con animais deseñados realizáronse de acordo coas directrices do Comité para o Control e Supervisión da Experimentación Animal (CPCSEA).Todos os autores seguen as directrices de ARRIVE.
Analizáronse os espectros FTIR de todos os NFRCS e comparáronse co espectro de quitosano que se mostra na Figura 2A.Picos espectrais característicos de quitosano (rexistrados) a 3437 cm-1 (estiramento de OH e NH, superposición), 2945 e 2897 cm-1 (estiramento de CH), 1660 cm-1 (deformación NH2), 1589 cm-1 (flexión N–H), 1157 cm-1 (estiramento secundario C-10), 1157 cm-10 C-10 yl), 993 cm-1 (estiramento CO, Bo-OH) 52,53,54.A táboa complementaria S1 mostra os valores do espectro de absorción FTIR NFRCS para quitosano (reporte), quitosano puro, Cm, Ch e Cp.Os espectros FTIR de todos os NFRCS (Cm, Ch e Cp) mostraron as mesmas bandas de absorción características que o quitosano puro sen cambios significativos (Fig. 2A).Os resultados do FTIR confirmaron a ausencia de interaccións químicas ou físicas entre os polímeros utilizados para desenvolver o NFRCS, o que indica que os polímeros utilizados son inertes.
Caracterización in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs.(A) representa os espectros FTIR combinados das composicións de quitosano e Cm NFRCS, Ch NFRCS e Cp NFRCS baixo compresión.(B) a) Taxa de absorción de sangue enteiro de NFRCS Cm, Ch, Cp e Cg (n = 3);As mostras de Ct mostraron unha BAR máis alta porque o hisopo de algodón ten unha maior eficiencia de absorción;b) Sangue despois da absorción sanguínea Ilustración da mostra absorbida.Representación gráfica do BCT da mostra de proba C (Cp NFRCS tivo o mellor BCT (15 s, n = 3)). Os datos en C, D, E e G mostráronse como media ± SD, e as barras de erro representan SD, ***p <0,0001. Os datos en C, D, E e G mostráronse como media ± SD, e as barras de erro representan SD, ***p <0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешноставлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей прешностей прешностей прешностей actual, ***p <0,0001. Os datos en C, D, E e G preséntanse como media ± desviación estándar e as barras de erro representan a desviación estándar, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрештносдне погрештносдние е отклонение, ***p <0,0001. Os datos en C, D, E e G móstranse como media ± desviación estándar, as barras de erro representan a desviación estándar, ***p<0,0001.