Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
A fertilidade das aves depende da súa capacidade para almacenar suficiente esperma viable durante un período prolongado de tempo nos túbulos de almacenamento de esperma (SST).O mecanismo exacto polo cal os espermatozoides entran, residen e abandonan o SST segue sendo controvertido.O esperma das galiñas sharkasi mostrou unha alta tendencia á aglutinación, formando feixes filamentosos móbiles que conteñen moitas células.Debido á dificultade de observar a motilidade e o comportamento dos espermatozoides nunha trompa de Falopio opaca, utilizamos un dispositivo microfluídico cunha sección transversal de microcanle semellante á dos espermatozoides para estudar a aglutinación e a motilidade dos espermatozoides.Este estudo analiza como se forman os paquetes de espermatozoides, como se moven e o seu posible papel na extensión da residencia dos espermatozoides no SST.Investigamos a velocidade dos espermatozoides e o comportamento reolóxico cando o fluxo de fluído se xerou dentro dunha canle microfluídica por presión hidrostática (taxa de fluxo = 33 µm/s).Os espermatozoides tenden a nadar contra corrente (reoloxía positiva) e a velocidade do feixe de espermatozoides redúcese significativamente en comparación cos espermatozoides únicos.Observouse que os paquetes de espermatozoides se moven en espiral e aumentan en lonxitude e grosor a medida que se recrutan máis espermatozoides. Observáronse feixes de esperma aproximándose e adheríndose ás paredes laterais das canles microfluídicas para evitar ser varridos cunha velocidade de fluxo de fluído > 33 µm/s. Observáronse feixes de esperma aproximándose e adheríndose ás paredes laterais das canles microfluídicas para evitar ser varridos cunha velocidade de fluxo de fluído > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенюкам стенюкам стенхкам стенчено чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Observouse que os feixes de esperma se achegan e se adhiren ás paredes laterais das canles microfluídicas para evitar ser arrastrados a velocidades de fluxo de fluído >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются e прилипают к боковым стендком стендком стендков приближаются чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Observouse que os feixes de esperma se achegan e se adhiren ás paredes laterais da canle microfluídica para evitar ser arrastrados polo fluxo de fluído a >33 µm/s.A microscopía electrónica de varrido e transmisión revelou que os feixes de esperma estaban soportados por abundante material denso.Os datos obtidos demostran a mobilidade única dos espermatozoides de polo Sharkazi, así como a capacidade dos espermatozoides para aglutinarse e formar feixes móbiles, o que contribúe a comprender mellor o almacenamento a longo prazo dos espermatozoides en SMT.
Para conseguir a fecundación en humanos e na maioría dos animais, os espermatozoides e os óvulos deben chegar ao lugar da fecundación no momento adecuado.Polo tanto, o apareamento debe producirse antes ou no momento da ovulación.Por outra banda, algúns mamíferos, como os cans, así como as especies non mamíferas, como insectos, peixes, réptiles e aves, almacenan esperma nos seus órganos reprodutores durante un período prolongado de tempo ata que os seus ovos están listos para a fecundación (fertilización asíncrona 1 ).As aves son capaces de manter a viabilidade dos espermatozoides capaces de fertilizar ovos durante 2-10 semanas2.
Esta é unha característica única que distingue as aves doutros animais, xa que proporciona unha alta probabilidade de fecundación despois dunha única inseminación durante varias semanas sen apareamento e ovulación simultáneas.O principal órgano de almacenamento de espermatozoides, chamado túbulo de almacenamento de espermatozoides (SST), está situado nos pregamentos internos da mucosa na unión uterovaxinal.Ata a data, os mecanismos polos que os espermatozoides entran, residen e saen do banco de esperma non se comprenden completamente.A partir de estudos anteriores expuxéronse moitas hipóteses, pero ningunha delas foi confirmada.
Forman4 hipotetizou que os espermatozoides manteñen a súa residencia na cavidade SST mediante un movemento oscilatorio continuo contra a dirección do fluxo de fluídos a través das canles de proteínas situadas nas células epiteliais SST (reoloxía).O ATP esgotase debido á actividade flaxelar constante necesaria para manter o esperma no lumen SST e a motilidade finalmente diminúe ata que os espermatozoides son sacados do banco de esperma mediante o fluxo de fluído e comezan unha nova viaxe pola trompa de Falopio ascendente para fertilizar o esperma.Ovo (Forman4).Este modelo de almacenamento de esperma está apoiado pola detección por inmunocitoquímica das acuaporinas 2, 3 e 9 presentes nas células epiteliais SST.Ata a data, faltan estudos sobre a reoloxía do seme de polo e o seu papel no almacenamento de SST, a selección de esperma vaxinal e a competencia dos espermatozoides.Nas galiñas, o esperma entra na vaxina despois do apareamento natural, pero máis do 80% dos espermatozoides son expulsados ​​da vaxina pouco despois do apareamento.Isto suxire que a vaxina é o lugar principal para a selección de esperma nas aves.Ademais, informouse de que menos do 1% dos espermatozoides fecundados na vaxina acaban en SST2.Na inseminación artificial de pitos na vaxina, o número de espermatozoides que alcanzan a SST tende a aumentar 24 horas despois da inseminación.Ata o momento, o mecanismo de selección dos espermatozoides durante este proceso non está claro, e a motilidade dos espermatozoides pode desempeñar un papel importante na captación de espermatozoides SST.Debido ás paredes grosas e opacas das trompas de Falopio, é difícil controlar directamente a motilidade dos espermatozoides nas trompas de Falopio das aves.Polo tanto, carecemos de coñecementos básicos sobre como os espermatozoides pasan a SST despois da fecundación.
Recentemente recoñeceuse a reoloxía como un factor importante que controla o transporte de espermatozoides nos xenitais dos mamíferos.Baseándose na capacidade dos espermatozoides móbiles para migrar en contracorrente, Zaferani et al8 utilizaron un sistema microfluídico de corra para illar pasivamente os espermatozoides móbiles de mostras de seme encerrada.Este tipo de clasificación do seme é esencial para o tratamento médico da infertilidade e a investigación clínica, e é preferible aos métodos tradicionais que requiren moito tempo e traballo e poden comprometer a morfoloxía e a integridade estrutural do esperma.Non obstante, ata a data non se realizaron estudos sobre o efecto das secrecións dos órganos xenitais das galiñas sobre a motilidade dos espermatozoides.
Independentemente do mecanismo que mantén os espermatozoides almacenados no SST, moitos investigadores observaron que os espermatozoides residentes aglutinan cara a cabeza no SST das galiñas 9, 10, codornices 2 e pavos 11 para formar paquetes de esperma aglutinados.Os autores suxiren que existe unha conexión entre esta aglutinación e o almacenamento a longo prazo de espermatozoides no SST.
Tingari e Lake12 informaron dunha forte asociación entre os espermatozoides na glándula receptora de esperma da galiña e cuestionaron se os espermatozoides aviares aglutinan do mesmo xeito que os espermatozoides de mamíferos.Cren que as conexións profundas entre os espermatozoides nos conductos deferentes poden deberse ao estrés causado pola presenza dun gran número de espermatozoides nun espazo reducido.
Ao avaliar o comportamento dos espermatozoides en láminas de vidro colgadas frescas, pódense ver signos transitorios de aglutinación, especialmente nos bordos das gotas de seme.Non obstante, a aglutinación adoitaba perturbarse pola acción rotacional asociada ao movemento continuo, o que explica a natureza transitoria deste fenómeno.Os investigadores tamén notaron que cando se engadía o diluyente ao seme, aparecían agregados celulares alongados "en forma de fíos".
Os primeiros intentos de imitar un espermatozoide fixéronse eliminando un fío fino dunha gota colgante, o que deu lugar a unha vesícula alongada semellante ao esperma que sobresaía da gota de seme.Os espermatozoides aliñáronse inmediatamente de forma paralela dentro da vesícula, pero toda a unidade desapareceu rapidamente debido á limitación 3D.Polo tanto, para estudar a aglutinación dos espermatozoides, é necesario observar a motilidade e o comportamento dos espermatozoides directamente en túbulos illados de almacenamento de espermatozoides, o que é difícil de conseguir.Polo tanto, é necesario desenvolver un instrumento que imite aos espermatozoides para apoiar os estudos sobre a motilidade dos espermatozoides e o comportamento da aglutinación.Brillard et al13 informaron de que a lonxitude media dos túbulos de almacenamento de esperma nos pitos adultos é de 400-600 µm, pero algúns SST poden chegar a 2000 µm.Mero e Ogasawara14 dividiron as glándulas seminíferas en túbulos de almacenamento de esperma agrandados e non agrandados, ambos os mesmos en lonxitude (~500 µm) e ancho do pescozo (~38 µm), pero o diámetro medio da luz dos túbulos era de 56,6 e 56,6 µm.., respectivamente 11,2 μm, respectivamente.No estudo actual, utilizamos un dispositivo microfluídico cun tamaño de canle de 200 µm × 20 µm (W × H), cuxa sección transversal é algo próxima á do SST amplificado.Ademais, examinamos a motilidade dos espermatozoides e o comportamento da aglutinación no fluído fluído, o que é consistente coa hipótese de Foreman de que o fluído producido polas células epiteliais SST mantén os espermatozoides no lumen nunha dirección contracorrente (reolóxica).
O obxectivo deste estudo foi superar os problemas de observación da motilidade dos espermatozoides na trompa de Falopio e evitar as dificultades de estudar a reoloxía e o comportamento dos espermatozoides nun ambiente dinámico.Utilizouse un dispositivo microfluídico que crea presión hidrostática para simular a motilidade dos espermatozoides nos xenitais dunha galiña.
Cando se cargaba unha gota dunha mostra de esperma diluída (1:40) no dispositivo de microcanle, podíanse identificar dous tipos de motilidade do esperma (esperma illado e esperma unido).Ademais, os espermatozoides tendían a nadar contra corrente (reoloxía positiva; vídeo 1, 2). Aínda que os feixes de esperma tiñan unha velocidade menor que a dos espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron a porcentaxe de espermatozoides que mostraban reotaxis positiva (p < 0.001; Táboa 2). Aínda que os feixes de esperma tiñan unha velocidade menor que a dos espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron a porcentaxe de espermatozoides que mostraban reotaxis positiva (p < 0.001; Táboa 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоих сперматозои в 0, ни зои в 0, ни ли процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Aínda que os feixes de espermatozoides tiñan unha velocidade menor que a dos espermatozoides únicos (p < 0,001), aumentaron a porcentaxe de espermatozoides que mostraban reotaxis positiva (p < 0,001; Táboa 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示浾显示阁显示阁显的速度分比（p <0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显礏 昳怏 昳怏 昳怏分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), нт сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Aínda que a velocidade dos espermatozoides foi menor que a dos espermatozoides únicos (p < 0,001), aumentaron a porcentaxe de espermatozoides con reoloxía positiva (p < 0,001; Táboa 2).Estímase que a reoloxía positiva para espermatozoides únicos e mechas é de aproximadamente un 53% e un 85%, respectivamente.
Observouse que os espermatozoides das galiñas sharkasi inmediatamente despois da exaculación forman feixes lineais, formados por decenas de individuos.Estes mechones aumentan de lonxitude e grosor co paso do tempo e poden permanecer in vitro durante varias horas antes de disiparse (vídeo 3).Estes feixes filamentosos teñen forma de espermatozoides de equidna que se forman ao final do epidídimo.Descubriuse que o seme de galiña Sharkashi ten unha alta tendencia a aglutinarse e formar un feixe reticulado en menos dun minuto despois da recollida.Estas vigas son dinámicas e poden pegarse a calquera parede próxima ou obxectos estáticos.Aínda que os feixes de esperma reducen a velocidade dos espermatozoides, está claro que macroscópicamente aumentan a súa linealidade.A lonxitude dos feixes varía dependendo do número de espermatozoides recollidos en feixes.Illáronse dúas partes do feixe: a parte inicial, incluíndo a cabeza libre do espermatozoide aglutinado, e a parte terminal, incluíndo a cola e todo o extremo distal do espermatozoide.Mediante unha cámara de alta velocidade (950 fps) observáronse cabezas libres de espermatozoides aglutinados na parte inicial do feixe, responsables do movemento do feixe polo seu movemento oscilatorio, arrastrando os restantes ao feixe cun movemento helicoidal (Vídeo 4).Porén, en mechas longas, observouse que algunhas cabezas de esperma libres adheridas ao corpo e a parte terminal do mechón actúan como aspas para axudar a impulsar o mechón.
Mentres que nun fluxo lento de fluído, os feixes de esperma móvense paralelos entre si, con todo, comezan a solaparse e adherirse a todo o que está quieto, para non ser arrastrados polo fluxo de corrente a medida que aumenta a velocidade do fluxo.Os feixes fórmanse cando un puñado de espermatozoides se achegan entre si, comezan a moverse en sincronía e se envolven uns arredor dos outros, e despois adhírense a unha substancia pegajosa.As figuras 1 e 2 mostran como os espermatozoides se achegan entre si, formando unha unión mentres as colas se envolven entre si.
Os investigadores aplicaron presión hidrostática para crear un fluxo de fluído nunha microcanle para estudar a reoloxía do esperma.Utilizouse unha microcanle cun tamaño de 200 µm × 20 µm (W × H) e unha lonxitude de 3,6 µm.Use microcanles entre recipientes con xiringas colocadas nos extremos.Utilizáronse colorantes alimentarios para facer máis visibles as canles.
Ate os cables de interconexión e os accesorios á parede.O vídeo foi tomado cun microscopio de contraste de fase.Con cada imaxe preséntase microscopía de contraste de fase e imaxes de cartografía.(A) A conexión entre dúas correntes resiste o fluxo debido ao movemento helicoidal (frecha vermella).(B) A conexión entre o feixe de tubos e a parede da canle (frechas vermellas), ao mesmo tempo que están conectados a outros dous feixes (frechas amarelas).(C) Os feixes de esperma na canle microfluídica comezan a conectarse entre si (frechas vermellas), formando unha malla de feixes de esperma.(D) Formación dunha rede de feixes de espermatozoides.
Cando se cargou unha gota de esperma diluído no dispositivo microfluídico e se creou un fluxo, observouse que o feixe de esperma se movía en contra da dirección do fluxo.Os paquetes encaixan perfectamente contra as paredes das microcanles e as cabezas libres da parte inicial dos paquetes encaixan perfectamente contra elas (vídeo 5).Tamén se adhiren ás partículas estacionarias ao seu paso, como os restos, para resistir a ser arrastradas pola corrente.Co paso do tempo, estes mechones convértense en filamentos longos que atrapan outros espermatozoides únicos e mechas máis curtas (Vídeo 6).Cando o fluxo comeza a ralentizarse, longas liñas de espermatozoides comezan a formar unha rede de liñas de esperma (Vídeo 7; Figura 2).
A alta velocidade de fluxo (V > 33 µm/s), os movementos en espiral dos fíos increméntanse como un intento de atrapar moitos espermatozoides individuais que forman feixes de resistir mellor á forza de deriva do fluxo. A alta velocidade de fluxo (V > 33 µm/s), os movementos en espiral dos fíos increméntanse como un intento de atrapar moitos espermatozoides individuais que forman feixes de resistir mellor á forza de deriva do fluxo. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, постонь мольпы ножество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дротивостоят дротивостоят дрелщих пучки. A altas taxas de fluxo (V > 33 µm/s), os movementos helicoidais das cadeas aumentan a medida que intentan atrapar moitos espermatozoides individuais formando feixes que son máis capaces de resistir a forza de deriva do fluxo.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束纹的螺旋运动增加地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 形成 束 形 束 动 增加更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в постопхтем в пожение отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейтока. A altas taxas de fluxo (V > 33 µm/s), o movemento helicoidal dos filamentos aumenta nun intento de capturar moitos espermatozoides individuais formando feixes para resistir mellor as forzas de deriva do fluxo.Tamén tentaron unir microcanles ás paredes laterais.
Os feixes de esperma foron identificados como grupos de cabezas de espermatozoides e colas enroscadas mediante microscopía óptica (LM).Tamén se identificaron paquetes de espermatozoides con varios agregados como cabezas retorcidas e agregados flaxelares, múltiples colas de espermatozoides fusionadas, cabezas de espermatozoides unidas a unha cola e cabezas de espermatozoides con núcleos dobrados como múltiples núcleos fusionados.microscopía electrónica de transmisión (TEM).A microscopía electrónica de varrido (SEM) mostrou que os paquetes de espermatozoides eran agregados revestidos de cabezas de espermatozoides e os agregados de espermatozoides mostraban unha rede unida de colas envoltas.
A morfoloxía e a ultraestrutura dos espermatozoides, a formación de feixes de espermatozoides foron estudados mediante microscopía óptica (media sección), microscopía electrónica de varrido (SEM) e microscopía electrónica de transmisión (TEM), os frotis de espermatozoides tinguironse con laranxa de acridina e examináronse mediante microscopía de epifluorescencia.
A tinción de frotis de espermatozoides con laranxa de acridina (Fig. 3B) mostrou que as cabezas dos espermatozoides estaban pegadas e cubertas de material secretor, o que levou á formación de grandes mechas (Fig. 3D).Os feixes de esperma consistían en agregados de esperma cunha rede de colas unidas (Fig. 4A-C).Os feixes de espermatozoides están compostos polas colas de moitos espermatozoides unidos (Fig. 4D).Os segredos (Fig. 4E,F) cubrían as cabezas dos feixes de espermatozoides.
Formación do feixe de espermatozoides Usando microscopía de contraste de fase e frotis de esperma tinguidos con laranxa de acridina, demostrou que as cabezas dos espermatozoides se unían.(A) A formación inicial do mechón de espermatozoides comeza cun esperma (círculo branco) e tres espermatozoides (círculo amarelo), coa espiral que comeza na cola e remata na cabeza.(B) Fotomicrografía dun frotis de esperma tinguido con laranxa de acridina que mostra cabezas de esperma adheridas (frechas).A descarga cobre a(s) cabeza(s).Ampliación × 1000. (C) Desenvolvemento dun gran feixe transportado por fluxo nunha canle microfluídica (usando unha cámara de alta velocidade a 950 fps).(D) Micrografía dun frotis de esperma tinguido con laranxa de acridina que mostra grandes mechas (frechas).Aumento: × 200.
Micrografía electrónica de varrido dun feixe de esperma e un frotis de esperma tinguidos con laranxa de acridina.(A, B, D, E) son micrografías electrónicas dixitalizadas en cor de espermatozoides, e C e F son micrografías de frotis de espermatozoides tinguidos de laranxa acridina que mostran a adhesión de múltiples espermatozoides que envolven a rede caudal.(AC) Os agregados de esperma móstranse como unha rede de colas unidas (frechas).(D) Adhesión de varios espermatozoides (con substancia adhesiva, contorno rosa, frecha) que se envolven arredor da cola.(E e F) Agregados da cabeza de esperma (punteiros) cubertos con material adhesivo (punteiros).Os espermatozoides formaron feixes con varias estruturas tipo vórtice (F).(C) ×400 e (F) ×200 aumentos.
Usando a microscopía electrónica de transmisión, descubrimos que os paquetes de espermatozoides tiñan colas unidas (Fig. 6A, C), cabezas unidas ás colas (Fig. 6B) ou cabezas unidas ás colas (Fig. 6D).As cabezas dos espermatozoides do feixe son curvas, presentando en sección dúas rexións nucleares (Fig. 6D).No feixe da incisión, os espermatozoides tiñan unha cabeza torcida con dúas rexións nucleares e varias rexións flaxelares (Fig. 5A).
Micrografía electrónica de cor dixital que mostra as colas de conexión no feixe de esperma e o material aglutinante que conecta as cabezas de esperma.(A) Cola unida dun gran número de espermatozoides.Observe como se ve a cola tanto nas proxeccións vertical (frecha) como na paisaxe (frecha).(B) A cabeza (frecha) do esperma está conectada á cola (frecha).(C) Varias colas de espermatozoides (frechas) están unidas.(D) O material de aglutinación (AS, azul) conecta catro cabezas de espermatozoides (violeta).
Utilizouse a microscopía electrónica de varrido para detectar cabezas de espermatozoides en paquetes de espermatozoides cubertos de secrecións ou membranas (Figura 6B), o que indica que os feixes de espermatozoides estaban ancorados por material extracelular.O material aglutinado concentrouse na cabeza do esperma (conxunto similar á cabeza de medusa; Fig. 5B) e expandiuse distalmente, dando un aspecto amarelo brillante ao microscopio de fluorescencia cando se tinguiu con laranxa de acridina (Fig. 6C).Esta substancia é claramente visible baixo un microscopio de varrido e considérase un aglutinante.Seccións semi-finas (Fig. 5C) e frotis de esperma tinguidos con laranxa de acridina mostraron paquetes de espermatozoides que conteñen cabezas densamente empaquetadas e colas enroscadas (Fig. 5D).
Varias microfotografías que amosan a agregación de cabezas de espermatozoides e colas dobradas mediante diversos métodos.(A) Micrografía electrónica de transmisión de cor dixital en sección transversal dun feixe de espermatozoides que mostra unha cabeza de esperma enrollada cun núcleo de dúas partes (azul) e varias partes flaxelares (verde).(B) Micrografía dixital de dixitalización en cor que mostra un grupo de cabezas de espermatozoides (frechas) semellantes a medusas que parecen estar cubertas.(C) Sección semifina que mostra cabezas de espermatozoides agregadas (frechas) e colas enroscadas (frechas).(D) Micrografía dun frotis de esperma tinguido con laranxa de acridina que mostra agregados de cabezas de espermatozoides (frechas) e colas adheridas enroscadas (frechas).Teña en conta que unha substancia pegajosa (S) cobre a cabeza do espermatozoide.(D) x 1000 aumentos.
Usando a microscopía electrónica de transmisión (Fig. 7A), tamén se observou que as cabezas dos espermatozoides estaban torcidas e os núcleos tiñan forma de espiral, como confirmaron os frotis de espermatozoides tinguidos con laranxa de acridina e examinados mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 7B).
(A) Micrografía electrónica de transmisión de cores dixital e (B) Frotis de esperma tinguido de laranxa acridina que mostra cabezas enroladas e unión de cabezas e colas de espermatozoides (frechas).(B) x 1000 aumentos.
Un descubrimento interesante é que os espermatozoides de Sharkazi se agregan para formar feixes filamentosos móbiles.As propiedades destes feixes permítennos comprender o seu posible papel na absorción e almacenamento de espermatozoides no SST.
Despois do apareamento, os espermatozoides entran na vaxina e son sometidos a un intenso proceso de selección, polo que só un número limitado de espermatozoides entra no SST15,16.Ata a data, os mecanismos polos que os espermatozoides entran e saen do SST non están claros.Nas aves de curral, os espermatozoides almacénanse no SST durante un período prolongado de 2 a 10 semanas, dependendo da especie6.Persiste a controversia sobre o estado do seme durante o almacenamento no SST.Están en movemento ou en repouso?Noutras palabras, como manteñen os espermatozoides a súa posición no SST durante tanto tempo?
Forman4 suxeriu que a residencia e expulsión de SST poderían explicarse en termos de motilidade do esperma.Os autores formulan a hipótese de que os espermatozoides manteñen a súa posición nadando contra o fluxo de fluído creado polo epitelio SST e que os espermatozoides son expulsados ​​do SST cando a súa velocidade cae por debaixo do punto no que comezan a moverse cara atrás por falta de enerxía.Zaniboni5 confirmou a presenza das acuaporinas 2, 3 e 9 na porción apical das células epiteliais SST, que poden apoiar indirectamente o modelo de almacenamento de esperma de Foreman.No estudo actual, descubrimos que case a metade dos espermatozoides de Sharkashi mostran reoloxía positiva no fluído que flúe, e que os feixes de esperma aglutinados aumentan o número de espermatozoides que mostran reoloxía positiva, aínda que a aglutinación os ralentiza.Non se entende completamente como os espermatozoides viaxan pola trompa de Falopio do paxaro ata o lugar da fecundación.Nos mamíferos, o fluído folicular atrae aos espermatozoides.Non obstante, crese que os quimioatrayentes dirixen aos espermatozoides a achegarse a longas distancias7.Polo tanto, outros mecanismos son os responsables do transporte do esperma.A capacidade dos espermatozoides para orientarse e fluír contra o fluído das trompas de Falopio liberado despois do apareamento foi un factor importante para dirixirse aos espermatozoides dos ratos.Parker 17 suxeriu que os espermatozoides cruzan os ovidutos nadando contra a corrente ciliar en aves e réptiles.Aínda que non se demostrou experimentalmente en aves, Adolphi18 foi o primeiro en descubrir que o esperma aviar dá resultados positivos cando se crea unha fina capa de líquido entre un cubreobjetos e un portaobjetos cunha tira de papel de filtro.Reoloxía.Hino e Yanagimachi [19] colocaron un complexo ovario-tubular-uterino de rato nun anel de perfusión e inxectaron 1 µl de tinta no istmo para visualizar o fluxo de fluído nas trompas de Falopio.Observaron un movemento moi activo de contracción e relaxación na trompa de Falopio, no que todas as bólas de tinta se movían constantemente cara á ampolla da trompa de Falopio.Os autores subliñan a importancia do fluxo de fluído tubárico desde as trompas de Falopio inferiores ás superiores para a elevación e fertilización dos espermatozoides.Brillard20 informou de que en galiñas e pavos, os espermatozoides migran por movemento activo desde a entrada vaxinal, onde se almacenan, ata a unión útero-vaxinal, onde se almacenan.Non obstante, este movemento non é necesario entre a unión uterovaxinal e o infundíbulo porque os espermatozoides son transportados por desprazamento pasivo.Coñecendo estas recomendacións anteriores e os resultados obtidos no presente estudo, pódese supoñer que a capacidade dos espermatozoides para moverse río arriba (reoloxía) é unha das propiedades nas que se basea o proceso de selección.Isto determina o paso dos espermatozoides pola vaxina e a súa entrada no CCT para o seu almacenamento.Como suxeriu Forman4, isto tamén pode facilitar o proceso de que os espermatozoides entren no SST e no seu hábitat durante un período de tempo e despois saian cando a súa velocidade comeza a diminuír.
Por outra banda, Matsuzaki e Sasanami 21 suxeriron que os espermatozoides aviares sofren cambios de motilidade desde a latencia ata a motilidade nos aparellos reprodutores masculinos e femininos.Propúxose a inhibición da motilidade dos espermatozoides residentes no SST para explicar o longo tempo de almacenamento do esperma e despois o rexuvenecemento despois de abandonar o SST.En condicións hipóxicas, Matsuzaki et al.1 informou de alta produción e liberación de lactato no SST, o que pode levar á inhibición da motilidade dos espermatozoides residentes.Neste caso, a importancia da reoloxía espermática reflíctese na selección e absorción dos espermatozoides, e non no seu almacenamento.
O patrón de aglutinación do esperma considérase unha explicación plausible para o longo período de almacenamento do esperma no SST, xa que este é un patrón común de retención de esperma nas aves de curral2,22,23.Bakst et al.2 observou que a maioría dos espermatozoides se unían entre si, formando agregados fasciculares, e raramente se atopaban espermatozoides únicos no CCM de paspallás.Por outra banda, Wen et al.24 observaron máis espermatozoides dispersos e menos mechones de espermatozoides no lume SST en polos.En base a estas observacións, pódese supoñer que a propensión á aglutinación dos espermatozoides difire entre as aves e entre os espermatozoides do mesmo exaculado.Ademais, Van Krey et al.9 suxeriu que a disociación aleatoria dos espermatozoides aglutinados é responsable da penetración gradual dos espermatozoides na luz da trompa de Falopio.Segundo esta hipótese, primeiro deberían ser expulsados ​​do SST os espermatozoides con menor capacidade de aglutinación.Neste contexto, a capacidade de aglutinación dos espermatozoides pode ser un factor que inflúa no resultado da competencia dos espermatozoides nas aves sucias.Ademais, canto máis tempo se disocie o esperma aglutinado, máis tempo se mantén a fertilidade.
Aínda que en varios estudos se observou a agregación e a agregación en feixes de espermatozoides2,22,24, non foron descritos en detalle debido á complexidade da súa observación cinemática dentro do SST.Realizáronse varios intentos para estudar a aglutinación dos espermatozoides in vitro.Observouse unha agregación extensa pero transitoria cando se retirou o fío fino da gota de semente colgante.Isto leva ao feito de que unha burbulla alongada sobresae da gota, imitando a glándula seminal.Debido ás limitacións en 3D e aos curtos tempos de secado por goteo, todo o bloque caeu rapidamente en mal estado9.No estudo actual, utilizando galiñas Sharkashi e chips microfluídicos, puidemos describir como se forman estes penachos e como se moven.Os feixes de esperma formáronse inmediatamente despois da recollida de seme e descubriuse que se movían en espiral, mostrando reoloxía positiva cando estaban presentes no fluxo.Ademais, observados macroscópicamente, os feixes de esperma aumentan a linealidade da motilidade en comparación cos espermatozoides illados.Isto suxire que a aglutinación dos espermatozoides pode ocorrer antes da penetración da SST e que a produción de esperma non se limita a unha pequena área debido ao estrés como se suxeriu anteriormente (Tingari e Lake12).Durante a formación do mechón, os espermatozoides nadan en sincronía ata que forman unha unión, despois as súas colas envólvense entre si e a cabeza do espermatozoide permanece libre, pero a cola e a parte distal do espermatozoide únense cunha substancia pegajosa.Polo tanto, a cabeza libre do ligamento é responsable do movemento, arrastrando o resto do ligamento.A microscopía electrónica de varrido dos paquetes de espermatozoides mostrou cabezas de esperma adheridas cubertas de moito material pegajoso, o que suxire que as cabezas de esperma estaban unidas en paquetes en repouso, o que puido ocorrer despois de chegar ao lugar de almacenamento (SST).
Cando se tinxe un frotis de espermatozoides con laranxa de acridina, pódese ver material adhesivo extracelular ao redor dos espermatozoides baixo un microscopio fluorescente.Esta substancia permite que os espermatozoides se adhiran e se adhiran a calquera superficie ou partícula circundante para que non se despracen co fluxo circundante.Así, as nosas observacións mostran o papel da adhesión dos espermatozoides en forma de feixes móbiles.A súa capacidade de nadar contra a corrente e unirse ás superficies próximas permite que os espermatozoides permanezan máis tempo no SST.
Rothschild25 utilizou unha cámara de hemocitometría para estudar a distribución flotante do seme bovino nunha gota de suspensión, tomando microfotografías a través dunha cámara con eixe óptico vertical e horizontal do microscopio.Os resultados mostraron que os espermatozoides foron atraídos pola superficie da cámara.Os autores suxiren que pode haber interaccións hidrodinámicas entre o esperma e a superficie.Tendo en conta isto, xunto coa capacidade do seme dos pitos Sharkashi para formar mechas pegajosas, pode aumentar a probabilidade de que o seme se adhira á parede de SST e se almacene durante longos períodos de tempo.
Bccetti e Afzeliu26 informaron de que o glicocálix do esperma é necesario para o recoñecemento e a aglutinación dos gametos.Forman10 observou que a hidrólise dos enlaces α-glicosídicos nos recubrimentos de glicoproteína-glicolípidos ao tratar o seme de aves con neuraminidase produciu unha fertilidade reducida sen afectar a motilidade dos espermatozoides.Os autores suxiren que o efecto da neuraminidase sobre o glicocálix prexudica o secuestro de esperma na unión útero-vaxinal, reducindo así a fertilidade.As súas observacións non poden ignorar a posibilidade de que o tratamento con neuraminidase poida reducir o recoñecemento de espermatozoides e ovocitos.Forman e Engel10 descubriron que a fertilidade reduciuse cando as galiñas foron inseminadas por vía intravaxinal con seme tratado con neuraminidase.Non obstante, a FIV con esperma tratado con neuraminidase non afectou a fertilidade en comparación coas galiñas control.Os autores concluíron que os cambios no recubrimento de glicoproteína-glicolípido ao redor da membrana do esperma reduciron a capacidade dos espermatozoides para fertilizar ao deteriorar o secuestro de esperma na unión útero-vaxinal, o que á súa vez aumentou a perda de esperma debido á velocidade da unión útero-vaxinal, pero non afecta o recoñecemento dos espermatozoides e dos óvulos.
En pavos, Bakst e Bauchan 11 atoparon pequenas vesículas e fragmentos de membrana na luz do SST e observaron que algúns destes gránulos se fusionaron coa membrana do esperma.Os autores suxiren que estas relacións poden contribuír ao almacenamento a longo prazo de espermatozoides en SST.Non obstante, os investigadores non especificaron a orixe destas partículas, se son secretadas polas células epiteliais CCT, producidas e segregadas polo sistema reprodutor masculino ou producidas polo propio esperma.Ademais, estas partículas son as responsables da aglutinación.Grützner et al27 informaron de que as células epiteliais do epidídimo producen e segregan unha proteína específica que é necesaria para a formación de tractos seminais de poro único.Os autores tamén informan de que a dispersión destes feixes depende da interacción das proteínas do epidídimo.Nixon et al28 descubriron que os anexos segregan unha proteína, a osteonectina ácida rica en cisteína;SPARC participa na formación de mechas de esperma en equidnas e ornitorrincos de pico curto.A dispersión destes feixes está asociada á perda desta proteína.
No estudo actual, a análise ultraestrutural mediante microscopía electrónica mostrou que os espermatozoides se adhirían a unha gran cantidade de material denso.Pénsase que estas substancias son as responsables da aglutinación que se condensa entre e ao redor das cabezas adheridas, pero en concentracións máis baixas na rexión da cola.Supoñemos que esta substancia aglutinante é excretada do sistema reprodutor masculino (epidídimo ou conducto deferente) xunto co seme, xa que a miúdo observamos que o seme se separa da linfa e do plasma seminal durante a exaculación.Informeuse de que a medida que os espermatozoides aviares pasan polo epidídimo e os conductos deferentes, sofren cambios relacionados coa maduración que apoian a súa capacidade de unir proteínas e adquirir glicoproteínas asociadas ao lema plasmático.A persistencia destas proteínas nas membranas espermáticas residentes no SST suxire que estas proteínas poden influír na adquisición da estabilidade da membrana espermática 30 e determinar a súa fertilidade 31 .Ahammad et al32 informaron de que os espermatozoides obtidos de varias partes do sistema reprodutor masculino (desde os testículos ata o conducto deferente distal) mostraron un aumento progresivo da viabilidade en condicións de almacenamento de líquidos, independentemente da temperatura de almacenamento, e a viabilidade nas galiñas tamén aumenta nas trompas de Falopio despois da inseminación artificial.
Os mechones de esperma de galiña Sharkashi teñen características e funcións diferentes que outras especies como equidnas, ornitorrincos, ratos de madeira, ratas de cervo e cobaias.Nas galiñas sharkasi, a formación de paquetes de espermatozoides reduciu a súa velocidade de natación en comparación cos espermatozoides únicos.Non obstante, estes feixes aumentaron a porcentaxe de espermatozoides reoloxicamente positivos e aumentaron a capacidade dos espermatozoides para estabilizarse nun ambiente dinámico.Así, os nosos resultados confirman a suxestión anterior de que a aglutinación do esperma en SST está asociada co almacenamento de esperma a longo prazo.Tamén formulamos a hipótese de que a propensión dos espermatozoides a formar mechones pode controlar a taxa de perda de esperma en SST, o que pode alterar o resultado da competencia dos espermatozoides.Segundo esta suposición, os espermatozoides con baixa capacidade de aglutinación liberan primeiro SST, mentres que os espermatozoides con alta capacidade de aglutinación producen a maior parte da descendencia.A formación de feixes de esperma dun só poro é beneficiosa e afecta a proporción entre pais e fillos, pero usa un mecanismo diferente.En equidnas e ornitorrincos, os espermatozoides están dispostos paralelos entre si para aumentar a velocidade de avance do feixe.Os feixes de equidnas móvense unhas tres veces máis rápido que os espermatozoides únicos.Crese que a formación deste tipo de espermatozoides nos equidnas é unha adaptación evolutiva para manter o dominio, xa que as femias son promiscuas e adoitan aparearse con varios machos.Polo tanto, os espermatozoides de diferentes exaculados compiten ferozmente pola fertilización do óvulo.
Os espermatozoides aglutinados das galiñas sharkasi son fáciles de visualizar mediante o microscopio de contraste de fase, o que se considera vantaxoso porque permite un estudo sinxelo do comportamento dos espermatozoides in vitro.O mecanismo polo cal a formación de espermatozoides promove a reprodución nas galiñas sharkasi tamén é diferente do observado nalgúns mamíferos placentarios que representan o comportamento cooperativo dos espermatozoides, como os ratos de madeira, onde algúns espermatozoides chegan aos ovos, axudando a outros individuos relacionados a alcanzar e danar os seus ovos.para probarte.comportamento altruísta.Autofecundación 34. Outro exemplo de comportamento cooperativo en espermatozoides atopouse en ratos cervos, onde os espermatozoides foron capaces de identificarse e combinarse cos espermatozoides máis relacionados xeneticamente e formar grupos cooperativos para aumentar a súa velocidade en comparación cos espermatozoides non relacionados35.
Os resultados obtidos neste estudo non contradín a teoría de Foman do almacenamento a longo prazo de espermatozoides en SWS.Os investigadores informan de que os espermatozoides seguen movéndose no fluxo de células epiteliais que recubren o SST durante un período prolongado de tempo e, despois dun determinado período de tempo, as reservas de enerxía dos espermatozoides esgótanse, o que resulta nunha diminución da velocidade, o que permite a expulsión de substancias de pequeno peso molecular.enerxía dos espermatozoides co fluxo de fluído desde a luz do SST A cavidade da trompa de Falopio.No estudo actual, observamos que a metade dos espermatozoides únicos mostraba a capacidade de nadar contra os fluídos que fluían, e a súa adhesión ao feixe aumentou a súa capacidade de mostrar reoloxía positiva.Ademais, os nosos datos son consistentes cos de Matsuzaki et al.1 que informou de que o aumento da secreción de lactato na SST pode inhibir a motilidade dos espermatozoides residentes.Non obstante, os nosos resultados describen a formación de ligamentos móbiles dos espermatozoides e o seu comportamento reolóxico en presenza dun ambiente dinámico dentro dunha microcanle nun intento de dilucidar o seu comportamento en SST.As investigacións futuras poden centrarse en determinar a composición química e a orixe do axente aglutinante, o que sen dúbida axudará aos investigadores a desenvolver novas formas de almacenar o seme líquido e aumentar a duración da fertilidade.
Seleccionáronse como doadores de esperma no estudo quince sharkasi machos de pescozo espido de 30 semanas de idade (dominante homocigoto; Na Na).Os paxaros foron criados na Granxa Avícola de Investigación da Facultade de Agricultura da Universidade de Ashit, Gobernación de Ashit, Exipto.As aves foron aloxadas en gaiolas individuais (30 x 40 x 40 cm), sometidas a un programa de luz (16 horas de luz e 8 horas de escuridade) e alimentáronse cunha dieta que contiña 160 g de proteína bruta, 2800 kcal de enerxía metabolizable, 35 g de calcio cada unha.5 gramos de fósforo dispoñible por quilo de dieta.
Segundo os datos 36, ​​37, o seme foi recollido dos machos mediante masaxe abdominal.Recolléronse un total de 45 mostras de seme de 15 homes durante 3 días.O seme (n = 15/día) diluíuse inmediatamente 1:1 (v:v) con Belsville Poultry Semen Diluent, que contén difosfato de potasio (1,27 g), glutamato monosódico monohidrato (0,867 g), frutosa (0,5 d) de sodio anhidro.acetato (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometano (0,195 g), citrato de potasio monohidrato (0,064 g), monofosfato de potasio (0,065 g), cloruro de magnesio (0,034 g) e H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaridade m333Om3/kg.As mostras de seme diluído examináronse primeiro baixo un microscopio óptico para garantir unha boa calidade do seme (humidade) e despois almacenáronse nun baño de auga a 37 °C ata o seu uso dentro de media hora despois da recollida.
A cinemática e a reoloxía dos espermatozoides descríbense mediante un sistema de dispositivos microfluídicos.As mostras de seme diluíronse aínda máis a 1:40 en Beltsville Avian Semen Diluent, cargáronse nun dispositivo microfluídico (ver máis abaixo) e determináronse os parámetros cinéticos mediante un sistema de análise de seme computarizado (CASA) desenvolvido previamente para a caracterización de microfluídicos.sobre a mobilidade dos espermatozoides en medios líquidos (Departamento de Enxeñaría Mecánica, Facultade de Enxeñaría, Universidade de Assiut, Exipto).O complemento pódese descargar en: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Medíronse a velocidade da curva (VCL, μm/s), a velocidade lineal (VSL, μm/s) e a velocidade media da traxectoria (VAP, μm/s).Os vídeos de espermatozoides foron tomados mediante un microscopio de contraste de fase Optika XDS-3 invertido (con obxectivo de 40x) conectado a unha cámara Tucson ISH1000 a 30 fps durante 3 s.Use o software CASA para estudar polo menos tres áreas e 500 traxectorias de esperma por mostra.O vídeo gravado foi procesado mediante unha CASA caseira.A definición de motilidade no complemento CASA baséase na velocidade de natación dos espermatozoides en comparación coa taxa de fluxo, e non inclúe outros parámetros como o movemento de lado a lado, xa que se comprobou que este é máis fiable no fluxo de fluídos.O movemento reolóxico descríbese como o movemento dos espermatozoides en contra da dirección do fluxo do fluído.Os espermatozoides con propiedades reolóxicas dividíronse polo número de espermatozoides móbiles;Excluíronse do reconto os espermatozoides que estaban en repouso e os espermatozoides en movemento convectivo.
Todos os produtos químicos utilizados obtivéronse de Elgomhoria Pharmaceuticals (O Cairo, Exipto) a non ser que se indique o contrario.O dispositivo foi fabricado segundo o descrito por El-sherry et al.40 con algunhas modificacións.Os materiais utilizados para fabricar as microcanles incluíron placas de vidro (Howard Glass, Worcester, MA), resist negativo SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcohol de diacetona (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemaña) e poliacetona.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Os microcanles son fabricados mediante litografía suave.En primeiro lugar, unha máscara protectora transparente co deseño de microcanle desexado foi impresa nunha impresora de alta resolución (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON).Os mestres realizáronse utilizando placas de vidro como substratos.As placas limpáronse en acetona, isopropanol e auga desionizada e despois recubrironse cunha capa de 20 µm de SU8-25 mediante revestimento por centrifugación (3000 rpm, 1 min).A continuación, as capas de SU-8 secáronse suavemente (65 °C, 2 min e 95 °C, 10 min) e expuxéronse á radiación UV durante 50 s.Cocer a postexposición a 65 °C e 95 °C durante 1 min e 4 min para reticular as capas de SU-8 expostas, seguido do desenvolvemento en alcohol de diacetona durante 6,5 min.Cocer os waffles duros (200 °C durante 15 min) para solidificar aínda máis a capa SU-8.
O PDMS preparouse mesturando o monómero e o endurecedor nunha proporción de peso de 10:1, despois desgasificouse nun desecador ao baleiro e vertiuse no marco principal do SU-8.O PDMS foi curado nun forno (120 ° C, 30 min), despois as canles foron cortadas, separadas do mestre e perforadas para permitir que os tubos se unisen na entrada e saída da microcanle.Finalmente, as microcanles PDMS uníronse permanentemente a portas de microscopio mediante un procesador corona portátil (Electro-Technic Products, Chicago, IL) como se describe noutro lugar.A microcanle utilizada neste estudo mide 200 µm × 20 µm (W × H) e mide 3,6 cm de lonxitude.
O fluxo de fluído inducido pola presión hidrostática no interior da microcanle conséguese mantendo o nivel de fluído no depósito de entrada por riba da diferenza de altura Δh39 no depósito de saída (Fig. 1).
onde f é o coeficiente de rozamento, definido como f = C/Re para o fluxo laminar nunha canle rectangular, onde C é unha constante dependendo da relación de aspecto da canle, L é a lonxitude da microcanle, Vav é a velocidade media dentro da microcanle, Dh é o diámetro hidráulico da canle, g - aceleración da gravidade.Usando esta ecuación, a velocidade media da canle pódese calcular usando a seguinte ecuación: