Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, renderizaremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
A fertilidade das aves depende da súa capacidade para almacenar suficiente esperma viable durante un período de tempo prolongado nos túbulos de almacenamento de esperma (TSE). O mecanismo exacto polo que os espermatozoides entran, residen e saen do TSE segue sendo controvertido. O esperma das galiñas sharkasi mostrou unha alta tendencia á aglutinación, formando feixes filamentosos móbiles que conteñen moitas células. Debido á dificultade de observar a motilidade e o comportamento dos espermatozoides nunha trompa de Falopio opaca, empregamos un dispositivo microfluídico cunha sección transversal de microcanal similar á dos espermatozoides para estudar a aglutinación e a motilidade dos espermatozoides. Este estudo analiza como se forman os feixes de espermatozoides, como se moven e o seu posible papel na prolongación da residencia do esperma no TSE. Investigamos a velocidade do esperma e o comportamento reolóxico cando se xeraba fluxo de fluído dentro dun canal microfluídico mediante presión hidrostática (caudal = 33 µm/s). Os espermatozoides tenden a nadar contra a corrente (reoloxía positiva) e a velocidade do feixe de espermatozoides redúcese significativamente en comparación co espermatozoide individual. Observouse que os feixes de espermatozoides se moven en espiral e aumentan de lonxitude e grosor a medida que se recrutan máis espermatozoides individuais. Observáronse feixes de espermatozoides achegándose e adheríndose ás paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar ser varridos cunha velocidade de fluxo de fluído > 33 µm/s. Observáronse feixes de espermatozoides achegándose e adheríndose ás paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar ser varridos cunha velocidade de fluxo de fluído > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются e прилипают к боковым стенюрам стенкам стенкам каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Observouse que os feixes de espermatozoides se achegan e adhírense ás paredes laterais dos canais microfluídicos para evitar ser arrastrados a taxas de fluxo de fluído >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются e прилипают к боковым стендкосом стенгокрам замечено канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Observouse que os feixes de espermatozoides se achegan e adhírense ás paredes laterais do canal microfluídico para evitar ser arrastrados polo fluxo de fluído a >33 µm/s.A microscopía electrónica de varrido e transmisión revelou que os feixes de espermatozoides estaban soportados por abundante material denso. Os datos obtidos demostran a mobilidade única dos espermatozoides de galiña Sharkazi, así como a capacidade dos espermatozoides para aglutinarse e formar feixes móbiles, o que contribúe a unha mellor comprensión do almacenamento a longo prazo dos espermatozoides na SMT.
Para lograr a fecundación nos humanos e na maioría dos animais, o esperma e os óvulos deben chegar ao lugar da fecundación no momento adecuado. Polo tanto, o apareamento debe producirse antes ou no momento da ovulación. Por outra banda, algúns mamíferos, como os cans, así como especies non mamíferas, como insectos, peixes, réptiles e aves, almacenan esperma nos seus órganos reprodutores durante un período de tempo prolongado ata que os seus óvulos estean listos para a fecundación (fecundación asíncrona 1 ). As aves son capaces de manter a viabilidade dos espermatozoides capaces de fecundar os óvulos durante 2-10 semanas 2 .
Esta é unha característica única que distingue as aves doutros animais, xa que proporciona unha alta probabilidade de fecundación despois dunha única inseminación durante varias semanas sen apareamento e ovulación simultáneos. O principal órgano de almacenamento de esperma, chamado túbulo de almacenamento de esperma (TSE), está situado nos pregamentos da mucosa interna na unión uterovaxinal. Ata a data, os mecanismos polos que os espermatozoides entran, residen e saen do banco de esperma non se comprenden completamente. Baseándose en estudos previos, propuxéronse moitas hipóteses, pero ningunha delas foi confirmada.
Forman4 formulou a hipótese de que os espermatozoides manteñen a súa residencia na cavidade da SST mediante un movemento oscilatorio continuo en contra da dirección do fluxo de fluído a través dos canais proteicos situados nas células epiteliais da SST (reoloxía). O ATP esgótase debido á constante actividade flaxelar necesaria para manter os espermatozoides no lumen da SST e a motilidade finalmente diminúe ata que os espermatozoides son transportados fóra do banco de esperma polo fluxo de fluído e comezan unha nova viaxe pola trompa de Falopio ascendente para fertilizar os espermatozoides. Óvulo (Forman4). Este modelo de almacenamento de esperma está respaldado pola detección por inmunocitoquímica das acuaporinas 2, 3 e 9 presentes nas células epiteliais da SST. Ata a data, faltan estudos sobre a reoloxía do seme de galiña e o seu papel no almacenamento de SST, a selección vaxinal de espermatozoides e a competencia entre espermatozoides. Nas galiñas, os espermatozoides entran na vaxina despois do apareamento natural, pero máis do 80 % dos espermatozoides son expulsados ​​da vaxina pouco despois do apareamento. Isto suxire que a vaxina é o lugar principal para a selección de espermatozoides nas aves. Ademais, informouse de que menos do 1 % dos espermatozoides fecundados na vaxina acaban en tubérculos subxacentes (TSM)2. Na inseminación artificial de polos na vaxina, o número de espermatozoides que alcanzan a TSM tende a aumentar 24 horas despois da inseminación. Ata o de agora, o mecanismo de selección dos espermatozoides durante este proceso non está claro, e a motilidade dos espermatozoides pode desempeñar un papel importante na captación de espermatozoides mediante TSM. Debido ás paredes grosas e opacas das trompas de Falopio, é difícil monitorizar directamente a motilidade dos espermatozoides nas trompas de Falopio das aves. Polo tanto, carecemos de coñecementos básicos sobre como os espermatozoides fan a transición á TSM despois da fecundación.
Recentemente, recoñeceuse a reoloxía como un factor importante que controla o transporte de espermatozoides nos xenitais dos mamíferos. Baseándose na capacidade dos espermatozoides móbiles para migrar en contracorrente, Zaferani et al.8 empregaron un sistema microfluídico corra para illar pasivamente espermatozoides móbiles de mostras de seme en corrais. Este tipo de clasificación do seme é esencial para o tratamento da infertilidade médica e a investigación clínica, e prefírese aos métodos tradicionais que requiren moito tempo e traballo e poden comprometer a morfoloxía e a integridade estrutural do esperma. Non obstante, ata a data, non se realizaron estudos sobre o efecto das secrecións dos órganos xenitais das galiñas na motilidade do esperma.
Independentemente do mecanismo que mantén o esperma almacenado na tubaxe de superficie da superficie (TSM), moitos investigadores observaron que os espermatozoides residentes aglutinanse cabeza con cabeza na TSM de polos 9 e 10, codornices 2 e pavos 11 para formar feixes de espermatozoides aglutinados. Os autores suxiren que existe unha relación entre esta aglutinación e o almacenamento a longo prazo de espermatozoides na TSM.
Tingari e Lake12 informaron dunha forte asociación entre os espermatozoides na glándula receptora de esperma da galiña e cuestionaron se os espermatozoides aviarios aglutinan do mesmo xeito que os espermatozoides mamíferos. Cren que as conexións profundas entre os espermatozoides no conduto deferente poden deberse ao estrés causado pola presenza dun gran número de espermatozoides nun espazo pequeno.
Ao avaliar o comportamento dos espermatozoides en láminas de vidro colgantes frescas, pódense observar signos transitorios de aglutinación, especialmente nos bordos das pingas de seme. Non obstante, a aglutinación adoitaba verse alterada pola acción rotacional asociada ao movemento continuo, o que explica a natureza transitoria deste fenómeno. Os investigadores tamén observaron que, cando se engadía o diluínte ao seme, aparecían agregados celulares alongados "en forma de fíos".
Os primeiros intentos de imitar un espermatozoide realizáronse retirando un arame fino dunha pinga colgante, o que resultou nunha vesícula alongada semellante a un espermatozoide que sobresaía da pinga de seme. Os espermatozoides aliñáronse inmediatamente de forma paralela dentro da vesícula, pero a unidade completa desapareceu rapidamente debido á limitación 3D. Polo tanto, para estudar a aglutinación dos espermatozoides, é necesario observar a súa motilidade e o seu comportamento directamente nos túbulos de almacenamento de esperma illados, o cal é difícil de conseguir. Por conseguinte, é necesario desenvolver un instrumento que imite os espermatozoides para apoiar os estudos da motilidade e o comportamento de aglutinación dos espermatozoides. Brillard et al13 informaron de que a lonxitude media dos túbulos de almacenamento de espermatozoides en polos adultos é de 400 a 600 µm, pero algúns túbulos de superficie do corpo poden chegar aos 2000 µm. Mero e Ogasawara14 dividiron as glándulas seminíferas en túbulos de almacenamento de esperma agrandados e non agrandados, ambos os cales tiñan a mesma lonxitude (~500 µm) e anchura do colo (~38 µm), pero o diámetro medio do lume dos túbulos era de 56,6 e 56,6 µm. . , respectivamente 11,2 μm, respectivamente. No presente estudo, empregamos un dispositivo microfluídico cun tamaño de canal de 200 µm × 20 µm (L × A), cuxa sección transversal é algo próxima á do SST amplificado. Ademais, examinamos a motilidade dos espermatozoides e o comportamento de aglutinación no fluído que flúe, o que é consistente coa hipótese de Foreman de que o fluído producido polas células epiteliais do SST mantén os espermatozoides no lume nunha dirección contracorrente (reolóxica).
O obxectivo deste estudo foi superar os problemas de observar a mobilidade dos espermatozoides nas trompas de Falopio e evitar as dificultades de estudar a reoloxía e o comportamento dos espermatozoides nun ambiente dinámico. Empregouse un dispositivo microfluídico que crea presión hidrostática para simular a mobilidade dos espermatozoides nos xenitais dunha galiña.
Cando se cargaba unha pinga dunha mostra de esperma diluída (1:40) no dispositivo de microcanles, podíanse identificar dous tipos de motilidade espermática (espermatozoides illados e espermatozoides unidos). Ademais, os espermatozoides tendían a nadar contracorrente (reoloxía positiva; vídeo 1, 2). Aínda que os feixes de espermatozoides tiñan unha velocidade menor que a dos espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron a porcentaxe de espermatozoides que mostraron reotaxe positiva (p < 0,001; Táboa 2). Aínda que os feixes de espermatozoides tiñan unha velocidade menor que a dos espermatozoides solitarios (p < 0,001), aumentaron a porcentaxe de espermatozoides que mostraron reotaxe positiva (p < 0,001; Táboa 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматочных сперматозо1 (), < 0, низкую скорость увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; цтал 2). Aínda que os feixes de espermatozoides tiveron unha velocidade menor que a dos espermatozoides individuais (p < 0,001), aumentaron a porcentaxe de espermatozoides que mostraron reotaxe positiva (p < 0,001; Táboa 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显礏 昳座 昳怏百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Aínda que a velocidade dos feixes de espermatozoides foi menor que a dos espermatozoides individuais (p < 0,001), aumentaron a porcentaxe de espermatozoides con reoloxía positiva (p < 0,001; Táboa 2).Estímase que a reoloxía positiva para espermatozoides individuais e mechóns é de aproximadamente o 53 % e o 85 %, respectivamente.
Observouse que os espermatozoides das galiñas sharkasis inmediatamente despois da exaculación forman feixes lineares, que constan de ducias de individuos. Estes mechóns aumentan en lonxitude e grosor co tempo e poden permanecer in vitro durante varias horas antes de disiparse (vídeo 3). Estes feixes filamentosos teñen forma de espermatozoides de equidna que se forman ao final do epidídimo. Descubriuse que o seme de galiña sharkasis ten unha alta tendencia a aglutinarse e formar un feixe reticulado en menos dun minuto despois da recollida. Estes feixes son dinámicos e capaces de adherirse a calquera parede ou obxecto estático próximo. Aínda que os feixes de espermatozoides reducen a velocidade das células espermáticas, está claro que macroscopicamente aumentan a súa linealidade. A lonxitude dos feixes varía dependendo do número de espermatozoides recollidos nos feixes. Illáronse dúas partes do feixe: a parte inicial, que inclúe a cabeza libre do espermatozoide aglutinado, e a parte terminal, que inclúe a cola e todo o extremo distal do espermatozoide. Usando unha cámara de alta velocidade (950 fps), observáronse cabezas libres de espermatozoides aglutinados na parte inicial do feixe, responsables do movemento do feixe debido ao seu movemento oscilatorio, arrastrando os restantes ao interior do feixe cun movemento helicoidal (Vídeo 4). Non obstante, en mechóns longos, observouse que algunhas cabezas de espermatozoides libres adheridas ao corpo e a porción terminal do mechón actúa como aspas para axudar a propulsar o mechón.
Mentres que se atopan nun fluxo lento de fluído, os feixes de espermatozoides móvense paralelos entre si; porén, comezan a solaparse e a pegarse a todo o que está quieto, para non ser arrastrados polo fluxo de corrente a medida que a velocidade do fluxo aumenta. Os feixes fórmanse cando un puñado de espermatozoides se achegan entre si, comezan a moverse en sincronía e a envolverse uns aos outros, e logo adhírense a unha substancia pegañenta. As figuras 1 e 2 mostran como os espermatozoides se achegan entre si, formando unha unión a medida que as colas se enrolan unhas arredor das outras.
Os investigadores aplicaron presión hidrostática para crear fluxo de fluído nun microcanal para estudar a reoloxía do esperma. Empregouse un microcanal cun tamaño de 200 µm × 20 µm (ancho × alto) e unha lonxitude de 3,6 µm. Utilizáronse microcanais entre os recipientes con xiringas colocadas nos extremos. Utilizouse colorante alimentario para facer os canais máis visibles.
Ate os cables de interconexión e os accesorios á parede. O vídeo foi gravado cun microscopio de contraste de fase. Con cada imaxe, preséntanse imaxes de microscopía de contraste de fase e mapeo. (A) A conexión entre dúas correntes resiste o fluxo debido ao movemento helicoidal (frecha vermella). (B) A conexión entre o feixe de tubos e a parede do canal (frechas vermellas), ao mesmo tempo que están conectados a outros dous feixes (frechas amarelas). (C) Os feixes de espermatozoides no canal microfluídico comezan a conectarse entre si (frechas vermellas), formando unha malla de feixes de espermatozoides. (D) Formación dunha rede de feixes de espermatozoides.
Cando se cargaba unha pinga de esperma diluído no dispositivo microfluídico e se creaba un fluxo, observouse que o feixe de esperma se movía en contra da dirección do fluxo. Os feixes axústanse perfectamente ás paredes dos microcanais e as cabezas libres da parte inicial dos feixes axústanse perfectamente a eles (vídeo 5). Tamén se adhiren a calquera partícula estacionaria no seu camiño, como os residuos, para evitar ser arrastrados pola corrente. Co tempo, estes mechóns convértense en longos filamentos que atrapan outros espermatozoides individuais e mechóns máis curtos (vídeo 6). A medida que o fluxo comeza a diminuír, longas liñas de espermatozoides comezan a formar unha rede de liñas espermáticas (vídeo 7; figura 2).
A alta velocidade de fluxo (V > 33 µm/s), os movementos en espiral dos fíos increméntanse nun intento de atrapar moitos espermatozoides individuais formando feixes para resistir mellor a forza de deriva do fluxo. A alta velocidade de fluxo (V > 33 µm/s), os movementos en espiral dos fíos increméntanse nun intento de atrapar moitos espermatozoides individuais formando feixes para resistir mellor a forza de deriva do fluxo. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, постоньькпы поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше перматозоидов силе потока. A taxas de fluxo elevadas (V > 33 µm/s), os movementos helicoidais das febras aumentan a medida que tentan atrapar moitos espermatozoides individuais formando feixes que son máis capaces de resistir a forza de deriva do fluxo.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 形成 束 形 束 动 增加 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в потьватка множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивлше сопротивлятьа маспротивлять пучки. A taxas de fluxo elevadas (V > 33 µm/s), o movemento helicoidal dos filamentos aumenta nun intento de capturar moitos espermatozoides individuais formando feixes para resistir mellor as forzas de deriva do fluxo.Tamén intentaron unir microcanais ás paredes laterais.
Os feixes de espermatozoides identificáronse como grupos de cabezas de espermatozoides e colas enroladas mediante microscopía óptica (LM). Os feixes de espermatozoides con varios agregados tamén se identificaron como cabezas retorcidas e agregados flaxelares, múltiples colas de espermatozoides fusionadas, cabezas de espermatozoides unidas a unha cola e cabezas de espermatozoides con núcleos curvados como múltiples núcleos fusionados. microscopía electrónica de transmisión (TEM). A microscopía electrónica de varrido (SEM) mostrou que os feixes de espermatozoides eran agregados envaiñados de cabezas de espermatozoides e os agregados de espermatozoides mostraban unha rede unida de colas envoltas.
A morfoloxía e a ultraestrutura dos espermatozoides, a formación de feixes de espermatozoides foron estudadas mediante microscopía óptica (media sección), microscopía electrónica de varrido (SEM) e microscopía electrónica de transmisión (TEM), os frotis de esperma foron tinguidos con laranxa de acridina e examinados mediante microscopía de epifluorescencia.
A tinción de esperma con laranxa de acridina (Fig. 3B) mostrou que as cabezas dos espermatozoides estaban pegadas e cubertas de material secretor, o que levou á formación de grandes mechóns (Fig. 3D). Os feixes de espermatozoides consistían en agregados de espermatozoides cunha rede de colas unidas (Fig. 4A-C). Os feixes de espermatozoides están compostos polas colas de moitos espermatozoides pegadas (Fig. 4D). Os segredos (Fig. 4E, F) cubrían as cabezas dos feixes de espermatozoides.
Formación do feixe de espermatozoides. Usando microscopía de contraste de fase e frotis de esperma tinguidos con laranxa de acridina, observouse que as cabezas dos espermatozoides se pegan entre si. (A) A formación temperá dos mechóns de espermatozoides comeza cun espermatozoide (círculo branco) e tres espermatozoides (círculo amarelo), coa espiral comezando na cola e rematando na cabeza. (B) Microfotografía dun frotis de esperma tinguido con laranxa de acridina que mostra as cabezas de espermatozoides adherentes (frechas). A descarga cobre a(s) cabeza(s). Aumento × 1000. (C) Desenvolvemento dun gran feixe transportado por fluxo nun canal microfluídico (usando unha cámara de alta velocidade a 950 fps). (D) Micrografía dun frotis de esperma tinguido con laranxa de acridina que mostra grandes mechóns (frechas). Aumento: ×200.
Micrografía electrónica de varrido dun feixe de espermatozoides e un frotis de espermatozoides tinguido con laranxa de acridina. (A, B, D, E) son micrografías dixitais en cor de espermatozoides, e C e F son micrografías de frotis de espermatozoides tinguidos con laranxa de acridina que mostran a unión de varios espermatozoides que envolven a rede caudal. (AC) Os agregados de espermatozoides móstranse como unha rede de colas unidas (frechas). (D) Adhesión de varios espermatozoides (con substancia adhesiva, contorno rosa, frecha) que envolven a cola. (E e F) Agregados da cabeza do espermatozoide (punteiros) cubertos con material adhesivo (punteiros). Os espermatozoides formaron feixes con varias estruturas semellantes a vórtices (F). (C) Aumentos de ×400 e (F) ×200.
Usando microscopía electrónica de transmisión, descubrimos que os feixes de espermatozoides tiñan colas unidas (Fig. 6A, C), cabezas unidas a colas (Fig. 6B) ou cabezas unidas a colas (Fig. 6D). As cabezas dos espermatozoides no feixe son curvas, presentando na sección dúas rexións nucleares (Fig. 6D). No feixe de incisión, os espermatozoides tiñan unha cabeza retorcida con dúas rexións nucleares e múltiples rexións flaxelares (Fig. 5A).
Micrografía electrónica dixital en cor que mostra as colas de conexión no feixe de espermatozoides e o material aglutinante que conecta as cabezas dos espermatozoides. (A) Cola unida dun gran número de espermatozoides. Observe o aspecto da cola tanto nas proxeccións vertical (frecha) como horizontal (frecha). (B) A cabeza (frecha) do espermatozoide está conectada á cola (frecha). (C) Varias colas de espermatozoides (frechas) están unidas. (D) O material de aglutinación (AS, azul) conecta catro cabezas de espermatozoides (violeta).
Utilizouse microscopía electrónica de varrido para detectar cabezas de espermatozoides en feixes de espermatozoides cubertos de secrecións ou membranas (Figura 6B), o que indica que os feixes de espermatozoides estaban ancorados por material extracelular. O material aglutinado concentrouse na cabeza do espermatozoide (conxunto en forma de cabeza de medusa; Fig. 5B) e expandiuse distalmente, dando un aspecto amarelo brillante baixo microscopía de fluorescencia cando se tinguía con laranxa de acridina (Fig. 6C). Esta substancia é claramente visible baixo un microscopio de varrido e considérase un aglutinante. As seccións semifinas (Fig. 5C) e os frotis de espermatozoides tinguidos con laranxa de acridina mostraron feixes de espermatozoides que contiñan cabezas densamente empaquetadas e colas enroladas (Fig. 5D).
Varias microfotografías que mostran a agregación de cabezas de espermatozoides e colas pregadas empregando varios métodos. (A) Micrografía electrónica de transmisión dixital en cor en sección transversal dun feixe de espermatozoides que mostra unha cabeza de espermatozoide enrolada cun núcleo de dúas partes (azul) e varias partes flaxelares (verde). (B) Micrografía electrónica de varrido dixital en cor que mostra un grupo de cabezas de espermatozoides semellantes a medusas (frechas) que parecen estar cubertas. (C) Sección semifina que mostra cabezas de espermatozoides agregadas (frechas) e colas enroladas (frechas). (D) Micrografía dun frotis de esperma tinguido con laranxa de acridina que mostra agregados de cabezas de espermatozoides (frechas) e colas adherentes enroladas (frechas). Obsérvese que unha substancia pegañenta (S) cobre a cabeza do espermatozoide. (D) Aumento de × 1000.
Usando microscopía electrónica de transmisión (Fig. 7A), tamén se observou que as cabezas dos espermatozoides estaban retorcidas e os núcleos tiñan forma de espiral, como confirmaron os frotis de esperma tinguidos con laranxa de acridina e examinados mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 7B).
(A) Micrografía electrónica de transmisión dixital en cor e (B) Frotis de esperma tinguido con laranxa de acridina que mostra as cabezas enroladas e a unión das cabezas e colas dos espermatozoides (frechas). (B) Aumento de × 1000.
Un achado interesante é que os espermatozoides de Sharkazi agréganse para formar feixes filamentosos móbiles. As propiedades destes feixes permítennos comprender o seu posible papel na absorción e almacenamento de espermatozoides na tubaxe de superficie do corpo.
Despois do apareamento, os espermatozoides entran na vaxina e sofren un intenso proceso de selección, o que resulta en que só un número limitado de espermatozoides entren na TSM15,16. Ata a data, os mecanismos polos que os espermatozoides entran e saen da TSM non están claros. Nas aves de curral, os espermatozoides almacénanse na TSM durante un período prolongado de 2 a 10 semanas, dependendo da especie6. Continúa a controversia sobre o estado do seme durante o almacenamento na TSM. Están en movemento ou en repouso? Noutras palabras, como manteñen as células espermáticas a súa posición na TSM durante tanto tempo?
Forman4 suxeriu que a residencia e a exección do tubo digestivo superior (TSM) poderían explicarse en termos da motilidade dos espermatozoides. Os autores formulan a hipótese de que os espermatozoides manteñen a súa posición nadando en contra do fluxo de fluído creado polo epitelio da TSM e que os espermatozoides son exectados da TSM cando a súa velocidade cae por debaixo do punto no que comezan a moverse cara atrás debido á falta de enerxía. Zaniboni5 confirmou a presenza de acuaporinas 2, 3 e 9 na porción apical das células epiteliais da TSM, o que pode apoiar indirectamente o modelo de almacenamento de esperma de Foreman. No presente estudo, descubrimos que case a metade dos espermatozoides de Sharkashi mostran unha reoloxía positiva no fluído que flúe, e que os feixes de espermatozoides aglutinados aumentan o número de espermatozoides que mostran unha reoloxía positiva, aínda que a aglutinación os ralentiza. Non se comprende completamente como os espermatozoides viaxan pola trompa de Falopio da ave ata o lugar da fecundación. Nos mamíferos, o fluído folicular quimioatrae os espermatozoides. Non obstante, crese que os quimioatractores dirixen os espermatozoides para que se acheguen a longas distancias7. Polo tanto, outros mecanismos son responsables do transporte de espermatozoides. Informouse de que a capacidade dos espermatozoides para orientarse e fluír contra o líquido das trompas de Falopio liberado despois do apareamento é un factor importante para dirixir os espermatozoides en ratos. Parker 17 suxeriu que os espermatozoides cruzan os ovidutos nadando contra a corrente ciliar en aves e réptiles. Aínda que non se demostrou experimentalmente en aves, Adolphi 18 foi o primeiro en descubrir que o esperma aviario dá resultados positivos cando se crea unha fina capa de líquido entre un cubreobxectivos e un portaobxectivos cunha tira de papel de filtro. Reoloxía. Hino e Yanagimachi [19] colocaron un complexo ovario-tubaro-uterino de rato nun anel de perfusión e inxectaron 1 µl de tinta no istmo para visualizar o fluxo de fluído nas trompas de Falopio. Observaron un movemento moi activo de contracción e relaxación na trompa de Falopio, no que todas as bólas de tinta se movían constantemente cara á ampolla da trompa de Falopio. Os autores salientan a importancia do fluxo de líquido tubárico desde as trompas de Falopio inferiores ás superiores para a elevación e fertilización dos espermatozoides. Brillard20 informou de que, nas galiñas e nos pavos, os espermatozoides migran mediante movemento activo desde a entrada vaxinal, onde se almacenan, ata a unión uterovaxinal, onde se almacenan. Non obstante, este movemento non é necesario entre a unión uterovaxinal e o infundíbulo porque os espermatozoides son transportados por desprazamento pasivo. Coñecendo estas recomendacións previas e os resultados obtidos no presente estudo, pódese asumir que a capacidade dos espermatozoides para moverse río arriba (reoloxía) é unha das propiedades nas que se basea o proceso de selección. Isto determina o paso dos espermatozoides a través da vaxina e a súa entrada no CCT para o seu almacenamento. Como suxeriu Forman4, isto tamén pode facilitar o proceso de entrada dos espermatozoides no SST e no seu hábitat durante un período de tempo e logo a súa saída cando a súa velocidade comeza a diminuír.
Por outra banda, Matsuzaki e Sasanami [21] suxeriron que os espermatozoides aviarios sofren cambios na motilidade desde a latencia á motilidade nos tractos reprodutivos masculinos e femininos. Propúxose que a inhibición da motilidade dos espermatozoides residentes na SST explique o longo tempo de almacenamento dos espermatozoides e o posterior rexuvenecemento despois de abandonar a SST. En condicións hipóxicas, Matsuzaki et al. [1] informaron dunha alta produción e liberación de lactato na SST, o que pode levar á inhibición da motilidade dos espermatozoides residentes. Neste caso, a importancia da reoloxía dos espermatozoides reflíctese na selección e absorción de espermatozoides, e non no seu almacenamento.
O patrón de aglutinación de espermatozoides considérase unha explicación plausible para o longo período de almacenamento de espermatozoides no SST, xa que este é un patrón común de retención de espermatozoides nas aves de curral2,22,23. Bakst et al. 2 observaron que a maioría dos espermatozoides se adherían entre si, formando agregados fasciculares, e que raramente se atopaban espermatozoides individuais no CCM de paspallás. Por outra banda, Wen et al. 24 observaron espermatozoides máis dispersos e menos mechóns de espermatozoides no lumen do SST nas galiñas. Baseándose nestas observacións, pódese asumir que a propensión á aglutinación de espermatozoides difire entre aves e entre espermatozoides no mesmo exaculado. Ademais, Van Krey et al. 9 suxeriron que a disociación aleatoria dos espermatozoides aglutinados é responsable da penetración gradual dos espermatozoides no lumen da trompa de Falopio. Segundo esta hipótese, os espermatozoides con menor capacidade de aglutinación deberían ser expulsados ​​primeiro do SST. Neste contexto, a capacidade dos espermatozoides para aglutinarse pode ser un factor que inflúe no resultado da competencia espermática en aves sucias. Ademais, canto máis tempo se disocie o esperma aglutinado, máis tempo se mantén a fertilidade.
Aínda que se observou a agregación de espermatozoides e a súa agregación en feixes en varios estudos2,22,24, non se describiron en detalle debido á complexidade da súa observación cinemática dentro do SST. Fixéronse varios intentos para estudar a aglutinación de espermatozoides in vitro. Observouse unha agregación extensa pero transitoria cando se retirou o arame fino da pinga de semente colgante. Isto leva ao feito de que unha burbulla alongada sobresae da pinga, imitando a glándula seminal. Debido ás limitacións 3D e aos curtos tempos de secado por goteo, todo o bloque deteriorouse rapidamente9. No presente estudo, utilizando polos Sharkashi e chips microfluídicos, puidemos describir como se forman estes mechóns e como se moven. Os feixes de espermatozoides formáronse inmediatamente despois da recollida do seme e descubriuse que se movían en espiral, mostrando unha reoloxía positiva cando estaban presentes no fluxo. Ademais, cando se observan macroscopicamente, observouse que os feixes de espermatozoides aumentan a linealidade da motilidade en comparación cos espermatozoides illados. Isto suxire que a aglutinación do esperma pode ocorrer antes da penetración do sitio de almacenamento (SST) e que a produción de esperma non se limita a unha pequena área debido ao estrés como se suxeriu anteriormente (Tingari e Lake12). Durante a formación dos mechóns, os espermatozoides nadan en sincronía ata que forman unha unión, entón as súas colas enrólanse unha arredor da outra e a cabeza do espermatozoide permanece libre, pero a cola e a parte distal do espermatozoide péganse cunha substancia pegañenta. Polo tanto, a cabeza libre do ligamento é a responsable do movemento, arrastrando o resto do ligamento. A microscopía electrónica de varrido dos feixes de espermatozoides mostrou cabezas de espermatozoides adheridas cubertas con moito material pegañento, o que suxire que as cabezas de espermatozoides estaban unidas en feixes de repouso, o que puido ocorrer despois de chegar ao sitio de almacenamento (SST).
Cando se tingui un frotis de esperma con laranxa de acridina, pódese observar cun microscopio fluorescente o material adhesivo extracelular que rodea as células espermáticas. Esta substancia permite que os feixes de espermatozoides se adhiran e se aferren a calquera superficie ou partícula circundante para que non se despracen co fluxo circundante. Polo tanto, as nosas observacións mostran o papel da adhesión dos espermatozoides en forma de feixes móbiles. A súa capacidade para nadar contracorrente e adherirse ás superficies próximas permite que os espermatozoides permanezan máis tempo na superficie do corpo.
Rothschild25 empregou unha cámara de hemocitometría para estudar a distribución flotante do seme bovino nunha pinga de suspensión, tomando microfotografías a través dunha cámara con eixe óptico tanto vertical como horizontal do microscopio. Os resultados mostraron que os espermatozoides eran atraídos pola superficie da cámara. Os autores suxiren que pode haber interaccións hidrodinámicas entre o esperma e a superficie. Tendo isto en conta, xunto coa capacidade do seme de polo Sharkashi para formar mechóns pegañentos, pode aumentar a probabilidade de que o seme se adhira á parede do tubo de esperma sobre o corpo e se almacene durante longos períodos de tempo.
Bccetti e Afzeliu26 informaron de que o glicocálix do esperma é necesario para o recoñecemento e a aglutinación dos gametos. Forman10 observou que a hidrólise das unións α-glicosídicas nos recubrimentos de glicoproteínas-glicolípidos ao tratar o seme aviario con neuraminidase provocou unha redución da fertilidade sen afectar a motilidade dos espermatozoides. Os autores suxiren que o efecto da neuraminidase no glicocálix prexudica o secuestro de espermatozoides na unión útero-vaxinal, o que reduce a fertilidade. As súas observacións non poden ignorar a posibilidade de que o tratamento con neuraminidase poida reducir o recoñecemento de espermatozoides e ovocitos. Forman e Engel10 descubriron que a fertilidade reducíase cando as galiñas eran inseminadas intravaxinalmente con seme tratado con neuraminidase. Non obstante, a FIV con esperma tratado con neuraminidase non afectou a fertilidade en comparación coas galiñas de control. Os autores concluíron que os cambios no revestimento de glicoproteínas-glicolípidos arredor da membrana do esperma reduciron a capacidade dos espermatozoides para fertilizar ao afectar o secuestro de espermatozoides na unión útero-vaxinal, o que á súa vez aumentou a perda de espermatozoides debido á velocidade da unión útero-vaxinal, pero non afectou o recoñecemento dos espermatozoides e dos óvulos.
En pavos, Bakst e Bauchan 11 atoparon pequenas vesículas e fragmentos de membrana no lumen do tubo subxacente do corpo (SST) e observaron que algúns destes gránulos se fusionaran coa membrana do esperma. Os autores suxiren que estas relacións poden contribuír ao almacenamento a longo prazo de espermatozoides no SST. Non obstante, os investigadores non especificaron a fonte destas partículas, se son segregadas por células epiteliais CCT, producidas e segregadas polo sistema reprodutor masculino ou producidas polo propio esperma. Ademais, estas partículas son responsables da aglutinación. Grützner et al27 informaron de que as células epiteliais epididimarias producen e segregan unha proteína específica que se require para a formación de tractos seminais dun só poro. Os autores tamén informan de que a dispersión destes feixes depende da interacción das proteínas epididimarias. Nixon et al28 descubriron que os anexos segregan unha proteína, a osteonectina ácida rica en cisteína; SPARC está implicado na formación de penachos de espermatozoides en equidnas e ornitorrincos de peteiro curto. A dispersión destes feixes está asociada coa perda desta proteína.
No presente estudo, a análise ultraestrutural mediante microscopía electrónica mostrou que os espermatozoides adheríronse a unha gran cantidade de material denso. Crese que estas substancias son as responsables da aglutinación que se condensa entre e arredor das cabezas adherentes, pero en concentracións máis baixas na rexión da cola. Supoñemos que esta substancia aglutinante é excretada do sistema reprodutor masculino (epidídimo ou conduto deferente) xunto co seme, xa que a miúdo observamos como o seme se separa da linfa e do plasma seminal durante a exaculación. Informouse de que a medida que os espermatozoides aviarios pasan polo epidídimo e o conduto deferente, sofren cambios relacionados coa maduración que apoian a súa capacidade para unirse a proteínas e adquirir glicoproteínas asociadas á lema plasmática. A persistencia destas proteínas nas membranas espermáticas residentes no tubo suprarrenal suxire que estas proteínas poden influír na adquisición da estabilidade da membrana espermática 30 e determinar a súa fertilidade 31. Ahammad et al32 informaron de que os espermatozoides obtidos de varias partes do sistema reprodutor masculino (desde os testículos ata o conduto deferente distal) mostraron un aumento progresivo da viabilidade en condicións de almacenamento líquido, independentemente da temperatura de almacenamento, e a viabilidade nas galiñas tamén aumenta nas trompas de Falopio despois da inseminación artificial.
Os mechóns de esperma das galiñas sharkashi teñen características e funcións diferentes ás doutras especies como os equidnas, os ornitorrincos, os ratos de madeira, as ratas cervo e os cobaias. Nas galiñas sharkasi, a formación de feixes de espermatozoides reduciu a súa velocidade de natación en comparación cos espermatozoides individuais. Non obstante, estes feixes aumentaron a porcentaxe de espermatozoides reoloxicamente positivos e aumentaron a capacidade dos espermatozoides para estabilizarse nun ambiente dinámico. Polo tanto, os nosos resultados confirman a suxestión anterior de que a aglutinación de espermatozoides na SST está asociada ao almacenamento de esperma a longo prazo. Tamén formulamos a hipótese de que a propensión dos espermatozoides a formar mechóns pode controlar a taxa de perda de espermatozoides na SST, o que pode alterar o resultado da competencia entre espermatozoides. Segundo esta suposición, os espermatozoides con baixa capacidade de aglutinación liberan primeiro a SST, mentres que os espermatozoides con alta capacidade de aglutinación producen a maior parte da descendencia. A formación de feixes de espermatozoides dun só poro é beneficiosa e afecta á proporción pai-fillo, pero utiliza un mecanismo diferente. Nos equidnas e nos ornitorrincos, os espermatozoides están dispostos paralelamente entre si para aumentar a velocidade de avance do feixe. Os feixes de equidnas móvense unhas tres veces máis rápido que os espermatozoides individuais. Crese que a formación destes mechóns de esperma nos equidnas é unha adaptación evolutiva para manter a dominancia, xa que as femias son promiscuas e adoitan aparearse con varios machos. Polo tanto, os espermatozoides de diferentes exaculados compiten ferozmente pola fertilización do óvulo.
Os espermatozoides aglutinados das galiñas sharkasi son fáciles de visualizar mediante microscopía de contraste de fase, o que se considera vantaxoso porque permite un estudo sinxelo do comportamento dos espermatozoides in vitro. O mecanismo polo cal a formación de mechóns de esperma promove a reprodución nas galiñas sharkasi tamén é diferente do observado nalgúns mamíferos placentarios que representan o comportamento cooperativo dos espermatozoides, como os ratos de madeira, onde algúns espermatozoides chegan aos óvulos, axudando a outros individuos relacionados a alcanzar e danar os seus óvulos. para demostrar o teu valor. comportamento altruísta. autofecundación 34. Outro exemplo de comportamento cooperativo nos espermatozoides atopouse en ratos cervos, onde os espermatozoides foron capaces de identificar e combinar cos espermatozoides máis relacionados xeneticamente e formar grupos cooperativos para aumentar a súa velocidade en comparación cos espermatozoides non relacionados 35.
Os resultados obtidos neste estudo non contradín a teoría de Foman sobre o almacenamento a longo prazo de espermatozoides no SWS. Os investigadores informan de que as células espermáticas continúan movéndose no fluxo de células epiteliais que revisten o SST durante un período de tempo prolongado e, despois dun certo período de tempo, as reservas de enerxía das células espermáticas esgótanse, o que resulta nunha diminución da velocidade, o que permite a expulsión de substancias de baixo peso molecular. enerxía dos espermatozoides co fluxo de fluído desde o lumen do SST A cavidade da trompa de Falopio. No presente estudo, observamos que a metade dos espermatozoides individuais mostraron a capacidade de nadar contra os fluídos que flúen, e a súa adhesión no feixe aumentou a súa capacidade de mostrar reoloxía positiva. Ademais, os nosos datos son consistentes cos de Matsuzaki et al. 1 que informaron de que o aumento da secreción de lactato no SST pode inhibir a motilidade dos espermatozoides residentes. Non obstante, os nosos resultados describen a formación de ligamentos móbiles dos espermatozoides e o seu comportamento reolóxico en presenza dun ambiente dinámico dentro dun microcanal nun intento de dilucidar o seu comportamento no SST. As investigacións futuras poderían centrarse en determinar a composición química e a orixe do axente aglutinante, o que sen dúbida axudará aos investigadores a desenvolver novas formas de almacenar seme líquido e aumentar a duración da fertilidade.
No estudo seleccionáronse quince sharkasis machos de pescozo espido de 30 semanas de idade (homocigotos dominantes; Na Na). As aves criáronse na Granxa Avícola de Investigación da Facultade de Agricultura da Universidade de Ashit, na gobernación de Ashit, Exipto. As aves aloxáronse en gaiolas individuais (30 x 40 x 40 cm), sometéronse a un programa de luz (16 horas de luz e 8 horas de escuridade) e alimentáronse cunha dieta que contiña 160 g de proteína bruta, 2800 kcal de enerxía metabolizable e 35 g de calcio cada unha. 5 gramos de fósforo dispoñible por quilogramo de dieta.
Segundo os datos 36 e 37, o seme recolleuse de machos mediante masaxe abdominal. Recolléronse un total de 45 mostras de seme de 15 homes durante 3 días. O seme (n = 15/día) diluíuse inmediatamente 1:1 (v:v) con Belsville Poultry Semen Diluent, que contén difosfato de potasio (1,27 g), glutamato monosódico monohidratado (0,867 g), frutosa (0,5 d), acetato de sodio anhidro (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometano (0,195 g), citrato de potasio monohidratado (0,064 g), monofosfato de potasio (0,065 g), cloruro de magnesio (0,034 g) e H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolaridade 333 mOsm/kg38. As mostras de seme diluídas examináronse primeiro cun microscopio óptico para garantir a boa calidade do seme (humidade) e despois almacenáronse nun baño de auga a 37 °C ata o seu uso dentro da media hora despois da recollida.
A cinemática e a reoloxía dos espermatozoides descríbense empregando un sistema de dispositivos microfluídicos. As mostras de seme diluíronse aínda máis a 1:40 en diluínte de seme aviario de Beltsville, cargáronse nun dispositivo microfluídico (véxase máis abaixo) e os parámetros cinéticos determináronse empregando un sistema de análise computerizada de seme (CASA) desenvolvido previamente para a caracterización microfluídica. sobre a mobilidade dos espermatozoides en medios líquidos (Departamento de Enxeñaría Mecánica, Facultade de Enxeñaría, Universidade de Assiut, Exipto). O complemento pódese descargar en: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Medíronse a velocidade da curva (VCL, μm/s), a velocidade lineal (VSL, μm/s) e a velocidade media da traxectoria (VAP, μm/s). Tomáronse vídeos de espermatozoides empregando un microscopio de contraste de fase invertido Optika XDS-3 (con obxectivo de 40x) conectado a unha cámara Tucson ISH1000 a 30 fps durante 3 s. Emprega o software CASA para estudar polo menos tres áreas e 500 traxectorias de espermatozoides por mostra. O vídeo gravado procesouse cun CASA caseiro. A definición de motilidade no complemento CASA baséase na velocidade de natación do esperma en comparación co caudal e non inclúe outros parámetros como o movemento lateral, xa que se descubriu que isto é máis fiable no fluxo de fluídos. O movemento reolóxico descríbese como o movemento das células espermáticas en contra da dirección do fluxo de fluído. Os espermatozoides con propiedades reolóxicas dividíronse polo número de espermatozoides móbiles; os espermatozoides que estaban en repouso e os que se movían por convección excluíronse da conta.
Todos os produtos químicos empregados obtivéronse de Elgomhoria Pharmaceuticals (O Cairo, Exipto) a menos que se indique o contrario. O dispositivo fabricouse segundo o descrito por El-sherry et al. 40 con algunhas modificacións. Os materiais empregados para fabricar os microcanais incluían placas de vidro (Howard Glass, Worcester, MA), resina negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcohol diacetónico (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemaña) e poliacetona. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Os microcanais fabrícanse mediante litografía branda. Primeiro, imprimiuse unha máscara facial protectora transparente co deseño de microcanal desexado nunha impresora de alta resolución (Prismatic, O Cairo, Exipto e Pacific Arts and Design, Markham, ON). Os másteres realizáronse utilizando placas de vidro como substratos. As placas limpáronse en acetona, isopropanol e auga desionizada e logo revistironse cunha capa de 20 µm de SU8-25 mediante centrifugación (3000 rpm, 1 min). As capas de SU-8 secáronse suavemente (65 °C, 2 min e 95 °C, 10 min) e expuxéronse a radiación UV durante 50 s. Cocáronse tras a exposición a 65 °C e 95 °C durante 1 min e 4 min para reticular as capas de SU-8 expostas, seguido de revelado en alcohol diacetónico durante 6,5 min. Cocáronse os gofres en forno forte (200 °C durante 15 min) para solidificar aínda máis a capa de SU-8.
O PDMS preparouse mesturando o monómero e o endurecedor nunha proporción en peso de 10:1, despois desgasificouse nun desecador de baleiro e verteuse sobre o marco principal do SU-8. O PDMS curou nun forno (120 °C, 30 min), logo cortáronse os canais, separáronse do mestre e perforáronse para permitir que se fixasen tubos na entrada e saída do microcanal. Finalmente, os microcanais de PDMS fixáronse permanentemente a portaobxectos de microscopio usando un procesador corona portátil (Electro-Technic Products, Chicago, IL) como se describe noutro lugar. O microcanal empregado neste estudo mide 200 µm × 20 µm (ancho × alto) e ten 3,6 cm de longo.
O fluxo de fluído inducido pola presión hidrostática dentro do microcanal conséguese mantendo o nivel de fluído no depósito de entrada por riba da diferenza de altura Δh39 no depósito de saída (Fig. 1).
onde f é o coeficiente de fricción, definido como f = C/Re para o fluxo laminar nun canal rectangular, onde C é unha constante que depende da relación de aspecto do canal, L é a lonxitude do microcanal, Vav é a velocidade media dentro do microcanal, Dh é o diámetro hidráulico do canal e g é a aceleración da gravidade. Usando esta ecuación, a velocidade media do canal pódese calcular coa seguinte ecuación: