Grazas por visitar Nature.com. Estás a usar unha versión do navegador con compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir a compatibilidade continua, mostramos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Recentemente, desenvolveuse unha plataforma antimicrobiana libre de produtos químicos baseada na nanotecnoloxía que emprega nanoestruturas de auga artificial (EWNS). As EWNS teñen unha carga superficial elevada e son ricas en especies reactivas de osíxeno (ROS) que poden interactuar con varios microorganismos, incluídos os patóxenos transmitidos polos alimentos, e inactivalos. Aquí demóstrase que as súas propiedades durante a síntese poden axustarse e optimizarse para mellorar aínda máis o seu potencial antibacteriano. A plataforma de laboratorio de EWNS foi deseñada para axustar as propiedades das EWNS modificando os parámetros de síntese. A caracterización das propiedades das EWNS (carga, tamaño e contido de ROS) realizouse utilizando métodos analíticos modernos. Ademais, inoculáronse microorganismos alimentarios como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum e Saccharomyces cerevisiae na superficie de tomates de uva orgánicos para avaliar o seu potencial de inactivación microbiana. Os resultados presentados aquí demostran que as propiedades das EWNS poden axustarse durante a síntese, o que resulta nun aumento exponencial da eficiencia de inactivación. En particular, a carga superficial aumentou por un factor de catro e o contido de ROS aumentou. A taxa de eliminación microbiana dependía dos microbios e oscilaba entre 1,0 e 3,8 log despois de 45 minutos de exposición a unha dose de aerosol de 40.000 #/cm3 EWNS.
A contaminación microbiana é a principal causa de enfermidades transmitidas polos alimentos causadas pola inxestión de patóxenos ou as súas toxinas. As enfermidades transmitidas polos alimentos representan uns 76 millóns de enfermidades, 325 000 hospitalizacións e 5000 mortes cada ano só nos Estados Unidos1. Ademais, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estima que o aumento do consumo de produtos frescos é responsable do 48 % de todas as enfermidades transmitidas polos alimentos notificadas nos Estados Unidos2. O custo das enfermidades e mortes por patóxenos transmitidos polos alimentos nos Estados Unidos é moi elevado, estimado polos Centros para o Control e a Prevención de Enfermidades (CDC) en máis de 15 600 millóns de dólares ao ano3.
Actualmente, as intervencións antimicrobianas químicas4, radiativas5 e térmicas6 para garantir a seguridade alimentaria aplícanse principalmente en puntos críticos de control (PCC) limitados na cadea de produción (xeralmente despois da colleita e/ou durante o envasado) en lugar de implementarse continuamente de tal xeito que os produtos frescos estean suxeitos a contaminación cruzada7. As intervencións antimicrobianas son necesarias para controlar mellor as enfermidades transmitidas polos alimentos e a deterioración dos alimentos e teñen o potencial de aplicarse en todo o continuo da granxa á mesa. Menos impacto e custo.
Recentemente desenvolveuse unha plataforma antimicrobiana libre de produtos químicos baseada na nanotecnoloxía para inactivar bacterias en superficies e no aire utilizando nanoestruturas de auga artificial (EWNS). Para a síntese de EVNS, empregáronse dous procesos paralelos: electropulverización e ionización de auga (Fig. 1a). Anteriormente demostrouse que os EWNS teñen un conxunto único de propiedades físicas e biolóxicas8,9,10. Os EWNS teñen unha media de 10 electróns por estrutura e un tamaño nanométrico medio de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Ademais, a resonancia de espín electrónico (ESR) mostrou que os EWNS conteñen unha gran cantidade de especies reactivas de osíxeno (ROS), principalmente radicais hidroxilo (OH•) e superóxido (O2-) (Fig. 1c)8. Os EWNS permaneceron no aire durante moito tempo e puideron chocar cos microbios suspendidos no aire e presentes nas superficies, entregando a súa carga útil de ROS e causando a inactivación microbiana (Fig. 1d). Estes estudos anteriores tamén demostraron que as EWNS poden interactuar con diversas bacterias gramnegativas e grampositivas de importancia para a saúde pública, incluídas as micobacterias, e inactivalas en superficies e no aire8,9. A microscopía electrónica de transmisión mostrou que a inactivación estaba causada pola alteración da membrana celular. Ademais, os estudos de inhalación aguda demostraron que as doses altas de EWNS non causan danos nin inflamación pulmonar8.
(a) A electropulverización prodúcese cando se aplica unha alta tensión entre un capilar que contén líquido e un contraelectrodo. (b) A aplicación de alta tensión dá lugar a dous fenómenos diferentes: (i) electropulverización de auga e (ii) xeración de especies reactivas de osíxeno (ións) atrapadas nos EWNS. (c) A estrutura única dos EWNS. (d) Os EWNS son moi móbiles debido á súa natureza a nanoescala e poden interactuar con patóxenos transportados polo aire.
Recentemente tamén se demostrou a capacidade da plataforma antimicrobiana EWNS para inactivar microorganismos transmitidos polos alimentos na superficie dos alimentos frescos. Tamén se mostrou que a carga superficial de EWNS pódese usar en combinación cun campo eléctrico para unha administración dirixida. Máis importante aínda, observouse un resultado inicial prometedor de aproximadamente 1,4 log na actividade do tomate orgánico contra varios microorganismos alimentarios como E. coli e Listeria nos 90 minutos posteriores á exposición a EWNS a unha concentración de aproximadamente 50.000#/cm311. Ademais, as probas preliminares de avaliación organoléptica non mostraron ningún efecto organoléptico en comparación co tomate de control. Aínda que estes resultados iniciais de inactivación prometen seguridade alimentaria mesmo con doses moi baixas de EWNS de 50.000#/cc. ver, está claro que un maior potencial de inactivación sería máis beneficioso para reducir aínda máis o risco de infección e deterioración.
Aquí, centraremos a nosa investigación no desenvolvemento dunha plataforma de xeración de EWNS para axustar os parámetros de síntese e optimizar as propiedades fisicoquímicas dos EWNS para mellorar o seu potencial antibacteriano. En particular, a optimización centrouse en aumentar a súa carga superficial (para mellorar a administración dirixida) e o contido de ROS (para mellorar a eficiencia de inactivación). Caracterización de propiedades fisicoquímicas optimizadas (tamaño, carga e contido de ROS) utilizando métodos analíticos modernos e microorganismos alimentarios comúns como E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae e M. parafortuitum.
O EVNS sintetizouse mediante electropulverización e ionización simultáneas de auga de alta pureza (18 MΩ cm–1). O atomizador eléctrico 12 úsase normalmente para atomizar líquidos e partículas 13 e cerámicas de polímeros sintéticos e fibras 14 de tamaño controlado.
Como se detalla en publicacións anteriores 8, 9, 10, 11, nun experimento típico, aplícase unha alta tensión entre un capilar metálico e un contraelectrodo conectado a terra. Durante este proceso, prodúcense dous fenómenos diferentes: 1) electropulverización e 2) ionización da auga. Un forte campo eléctrico entre os dous eléctrodos fai que se acumulen cargas negativas na superficie da auga condensada, o que resulta na formación de conos de Taylor. Como resultado, fórmanse pingas de auga altamente cargadas, que continúan a descompoñerse en partículas máis pequenas, segundo a teoría de Rayleigh16. Ao mesmo tempo, un forte campo eléctrico fai que algunhas das moléculas de auga se dividan e desprendan electróns (ionización), xerando así unha gran cantidade de especies reactivas de osíxeno (ROS)17. Os paquetes ROS18 xerados simultaneamente encapsuláronse en EWNS (Fig. 1c).
Na figura 2a móstrase o sistema de xeración de EWNS desenvolvido e empregado na síntese de EWNS neste estudo. A auga purificada almacenada nunha botella pechada foi alimentada a través dun tubo de teflón (2 mm de diámetro interior) a unha agulla de aceiro inoxidable de 30G (capilar metálico). Como se mostra na figura 2b, o fluxo de auga está controlado pola presión do aire dentro da botella. A agulla está conectada a unha consola de teflón que se pode axustar manualmente a unha certa distancia do contraelectródo. O contraelectródo é un disco de aluminio pulido cun burato no medio para a mostraxe. Debaixo do contraelectródo hai un funil de mostraxe de aluminio, que está conectado ao resto da configuración experimental a través dun porto de mostraxe (figura 2b). Todos os compoñentes do mostrador están conectados electricamente a terra para evitar a acumulación de carga que podería degradar a mostraxe de partículas.
(a) Sistema de xeración de nanoestruturas de auga modificado (EWNS). (b) Sección transversal do mostrador e da unidade de electropulverización que mostra os parámetros máis importantes. (c) Configuración experimental para a inactivación de bacterias.
O sistema de xeración de EWNS descrito anteriormente é capaz de cambiar os parámetros operativos clave para facilitar o axuste fino das propiedades do EWNS. Axuste a tensión aplicada (V), a distancia entre a agulla e o contraelectrodo (L) e o fluxo de auga (φ) a través do capilar para axustar as características do EWNS. Os símbolos [V (kV), L (cm)] úsanse para denotar diferentes combinacións. Axuste o fluxo de auga para obter un cono de Taylor estable dun certo conxunto [V, L]. Para os fins deste estudo, a abertura do contraelectrodo (D) axustouse a 0,5 polgadas (1,29 cm).
Debido á xeometría limitada e á asimetría, a intensidade do campo eléctrico non se pode calcular a partir de principios básicos. No seu lugar, empregouse o software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 para calcular o campo eléctrico. O campo eléctrico non é uniforme, polo que o valor do campo eléctrico na punta do capilar utilizouse como valor de referencia para varias configuracións.
Durante o estudo, avaliáronse varias combinacións de tensión e distancia entre a agulla e o contraelectródo en termos de formación de conos de Taylor, estabilidade do cono de Taylor, estabilidade da produción de EWNS e reproducibilidade. Na táboa complementaria S1 móstranse varias combinacións.
A saída do sistema de xeración de EWNS conectouse directamente a un medidor de partículas de mobilidade de varrido (SMPS, modelo 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) para medir a concentración numérica de partículas e utilizouse cun electrómetro de aerosois de Faraday (TSI, modelo 3068B, Shoreview, EUA). MN) para medir os fluxos de aerosois, como se describe na nosa publicación anterior9. Tanto o SMPS como o electrómetro de aerosois tomaron mostras a un caudal de 0,5 L/min (caudal total de mostra de 1 L/min). As concentracións de partículas e os fluxos de aerosois medíronse durante 120 s. Repita a medición 30 veces. A carga total de aerosol calcúlase a partir das medicións actuais e a carga media de EWNS estímase a partir do número total de partículas de EWNS mostreadas. O custo medio de EWNS pódese calcular usando a ecuación (1):
onde IEl é a corrente medida, NSMPS é a concentración numérica medida co SMPS e φEl é o caudal cara ao electrómetro.
Dado que a humidade relativa (HR) afecta á carga superficial, a temperatura e a (HR) mantivéronse constantes a 21 °C e 45 %, respectivamente, durante o experimento.
Empregáronse microscopía de forza atómica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Bárbara, California) e a sonda AC260T (Olympus, Toquio, Xapón) para medir o tamaño e a vida útil do EWNS. A velocidade de exploración AFM é de 1 Hz e a área de exploración é de 5 µm × 5 µm con 256 liñas de exploración. Todas as imaxes foron sometidas a un aliñamento de imaxes de primeira orde usando o software Asylum (máscara cun rango de 100 nm e un limiar de 100 pm).
Retire o funil de mostraxe e coloque a superficie da mica a unha distancia de 2,0 cm do contraelectrodo durante un tempo medio de 120 s para evitar a coalescencia de partículas e a formación de pingas irregulares na superficie da mica. O EWNS aplicouse directamente ás superficies de mica recentemente cortadas (Ted Pella, Redding, CA). Inmediatamente despois da pulverización catódica, visualizouse a superficie da mica mediante AFM. O ángulo de contacto da superficie da mica sen modificar recentemente cortada é próximo a 0°, polo que o EWNS se propaga sobre a superficie da mica nunha forma abovedada20. O diámetro (a) e a altura (h) das pingas difusoras medíronse directamente a partir da topografía do AFM e utilizáronse para calcular o volume de difusión abovedada EWNS utilizando o noso método previamente validado8. Asumindo que o EVNS integrado ten o mesmo volume, o diámetro equivalente pódese calcular a partir da ecuación (2):
De acordo co noso método desenvolvido previamente, utilizouse unha trampa de espín de resonancia de espín electrónico (ESR) para detectar a presenza de intermediarios radicais de vida curta en EWNS. Os aerosois pasáronse a través dunha solución que contiña 235 mM de DEPMPO (5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc., Portland, Oregón). Todas as medicións de EPR realizáronse cun espectrómetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) e matrices de células planas. Utilizouse o software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) para recoller e analizar os datos. A caracterización dos ROS realizouse só para un conxunto de condicións de funcionamento [-6,5 kV, 4,0 cm]. As concentracións de EWNS medíronse utilizando SMPS despois de ter en conta a perda de EWNS no impactador.
Os niveis de ozono monitorizáronse cun monitor de ozono de dobre feixe 205™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Para todas as propiedades de EWNS, o valor da medición é a media das medicións e o erro de medición é a desviación estándar. Realizouse unha proba t para comparar o valor do atributo EWNS optimizado co valor correspondente do EWNS base.
A figura 2c mostra un sistema de paso por precipitación electrostática (EPES) desenvolvido e caracterizado previamente que se pode empregar para dirixir EWNS11 a superficies. O EPES emprega unha carga de EWNS en combinación cun forte campo eléctrico para "apuntar" directamente á superficie do obxectivo. Os detalles do sistema EPES preséntanse nunha publicación recente de Pyrgiotakis et al.11. Así, o EPES consiste nunha cámara de PVC impresa en 3D con extremos cónicos que conteñen dúas placas metálicas paralelas de aceiro inoxidable (aceiro inoxidable 304, pulido espello) no medio, separadas por 15,24 cm. As placas conectáronse a unha fonte externa de alta tensión (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), a placa inferior sempre foi positiva e a placa superior sempre estivo conectada a terra (flotante). As paredes da cámara están cubertas con papel de aluminio, que está conectada electricamente a terra para evitar a perda de partículas. A cámara ten unha porta de carga frontal selada que permite colocar as superficies de proba en bastidores de plástico, levantándoas da placa metálica inferior para evitar interferencias de alta tensión.
A eficiencia de deposición de EWNS en EPES calculouse segundo un protocolo desenvolvido previamente detallado na Figura Suplementaria S111.
Como cámara de control, o segundo fluxo a través da cámara cilíndrica conéctase en serie co sistema EPES mediante un filtro HEPA intermedio para eliminar os EWNS. Como se mostra na figura 2c, o aerosol de EWNS bombeouse a través de dúas cámaras conectadas en serie. O filtro entre a sala de control e o EPES elimina calquera EWNS restante, o que resulta nos mesmos niveis de temperatura (T), humidade relativa (HR) e ozono.
Descubriuse que importantes microorganismos transmitidos polos alimentos contaminan produtos frescos, como Escherichia coli (ATCC #27325), un indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), un patóxeno transmitido polos alimentos, Listeria innocua (ATCC #33090), unha alternativa á Listeria monocytogenes, unha alternativa á patóxena. Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) como alternativa aos lévedos de deterioración e Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) como bacteria viva máis resistente, adquiriuse a ATCC (Manassas, Virxinia).
Compra ao chou caixas de tomates de uva ecolóxicos no teu mercado local e refrixeraos a 4 °C ata o seu uso (ata 3 días). Selecciona tomates para experimentar cun tamaño, duns 1/2 polgada de diámetro.
Os protocolos para a incubación, a inoculación, a exposición e a contaxe de colonias foron detallados nas nosas publicacións anteriores e explicados en detalle nos Datos suplementarios 11. O rendemento do EWNS avaliouse expoñendo tomates inoculados a 40.000 #/cm3 durante 45 minutos. Brevemente, no tempo t = 0 min, utilizáronse tres tomates para avaliar os microorganismos superviventes. Tres tomates colocáronse en EPES e expuxéronse a EWNS a 40.000 #/cc (tomates expostos a EWNS) e outros tres colocáronse na cámara de control (tomates de control). Ningún dos grupos de tomates foi sometido a un procesamento adicional. Os tomates e os controis expostos a EWNS retiráronse despois de 45 minutos para avaliar o efecto do EWNS.
Cada experimento realizouse por triplicado. A análise de datos realizouse segundo o protocolo descrito nos datos suplementarios.
As mostras bacterianas de *E. coli*, *Enterobacter* e *L. innocua* expostas a EWNS (45 min, concentración de aerosol de EWNS de 40.000 #/cm3) e as non expostas foron pelletadas para avaliar os mecanismos de inactivación. O precipitado fixouse durante 2 horas a temperatura ambiente nunha solución de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) cun fixador de glutaraldehído ao 2,5 %, paraformaldehído ao 1,25 % e ácido pícrico ao 0,03 %. Despois da lavaxe, fixáronse con tetróxido de osmio (OsO4) ao 1 % e ferrocianuro de potasio (KFeCN6) ao 1,5 % durante 2 h, laváronse 3 veces con auga e incubáronse en acetato de uranilo ao 1 % durante 1 h e, a continuación, laváronse dúas veces con auga. Deshidratación posterior de 10 minutos cada unha con alcol ao 50 %, 70 %, 90 % e 100 %. A continuación, as mostras colocáronse en óxido de propileno durante 1 hora e impregnáronse cunha mestura 1:1 de óxido de propileno e TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). As mostras incluíronse en TAAB Epon e polimerizáronse a 60 °C durante 48 horas. A resina granular curada cortouse e visualizouse mediante TEM usando un JEOL 1200EX (JEOL, Toquio, Xapón), un microscopio electrónico de transmisión convencional equipado cunha cámara CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, EUA).
Todos os experimentos realizáronse por triplicado. Para cada punto de tempo, os lavados bacterianos colocáronse en placas por triplicado, o que resultou nun total de nove puntos de datos por punto, cuxa media se utilizou como a concentración bacteriana para ese organismo en particular. A desviación estándar utilizouse como o erro de medición. Todos os puntos contan.
O logaritmo da diminución da concentración de bacterias en comparación con t = 0 min calculouse usando a seguinte fórmula:
onde C0 é a concentración de bacterias na mostra de control no tempo 0 (é dicir, despois de que a superficie seque pero antes de colocala na cámara) e Cn é a concentración de bacterias na superficie despois de n minutos de exposición.
Para ter en conta a degradación natural das bacterias durante o período de exposición de 45 minutos, tamén se calculou a redución logarítmica en comparación co control aos 45 minutos do seguinte xeito:
Onde Cn é a concentración de bacterias na mostra de control no tempo n e Cn-Control é a concentración de bacterias de control no tempo n. Os datos preséntanse como unha redución logarítmica en comparación co control (sen exposición a EWNS).
Durante o estudo, avaliáronse varias combinacións de tensión e distancia entre a agulla e o contraelectródo en termos de formación de cono de Taylor, estabilidade do cono de Taylor, estabilidade da produción de EWNS e reproducibilidade. Na Táboa Suplementaria S1 móstranse varias combinacións. Seleccionáronse dous casos para un estudo completo que mostra propiedades estables e reproducibles (cono de Taylor, produción de EWNS e estabilidade ao longo do tempo). Na Fig. 3 móstranse os resultados sobre a carga, o tamaño e o contido de ROS para dous casos. Os resultados tamén se resumen na Táboa 1. Como referencia, a Figura 3 e a Táboa 1 inclúen as propiedades dos EWNS8, 9, 10, 11 (EWNS de referencia) non optimizados sintetizados previamente. Os cálculos de significación estatística utilizando unha proba t bilateral publícanse de novo na Táboa Suplementaria S2. Ademais, os datos adicionais inclúen estudos sobre o efecto do diámetro do orificio de mostraxe do contraelectródo (D) e a distancia entre o eléctrodo de terra e a punta da agulla (L) (Figuras Suplementarias S2 e S3).
(a–c) Distribución de tamaños do AFM. (d–f) Característica da carga superficial. (g) Caracterización de ROS e ESR.
Tamén é importante sinalar que, para todas as condicións anteriores, as correntes de ionización medidas estiveron no rango de 2-6 µA e as voltaxes no rango de -3,8 a -6,5 kV, o que resultou nun consumo de enerxía para este módulo de xeración de EWNS dun só terminal inferior a 50 mW. Aínda que o EWNS se sintetizou a alta presión, os niveis de ozono foron moi baixos, sen superar nunca os 60 ppb.
A Figura suplementaria S4 mostra os campos eléctricos simulados para os escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Os campos segundo os escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] calcúlanse como 2 × 10⁵ V/m e 4,7 × 10⁵ V/m, respectivamente. Isto é de esperar, xa que a relación entre a tensión e a distancia é moito maior no segundo caso.
Na figura 3a e b móstrase o diámetro do EWNS medido co AFM8. Os diámetros medios dos EWNS para os escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] calculáronse como 27 nm e 19 nm, respectivamente. As desviacións estándar xeométricas das distribucións para os casos [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] son ​​1,41 e 1,45, respectivamente, o que indica unha distribución de tamaño estreita. Tanto o tamaño medio como a desviación estándar xeométrica están moi preto do EWNS de referencia, sendo 25 nm e 1,41, respectivamente. Na figura 3c móstrase a distribución de tamaño do EWNS de referencia medido usando o mesmo método nas mesmas condicións.
Na figura 3d, a figura e móstranse os resultados da caracterización da carga. Os datos son medicións medias de 30 medicións simultáneas de concentración (#/cm3) e corrente (I). A análise mostra que a carga media no EWNS é de 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- para [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. En comparación co EWNS de referencia (10 ± 2 e-), a súa carga superficial é significativamente maior, o dobre que a do escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] e catro veces máis que a do [-3,8 kV, 0,5 cm]. A figura 3f móstranse os datos básicos de pagamento do EWNS.
A partir dos mapas de concentración numérica de EWNS (figuras suplementarias S5 e S6), pódese observar que a escena [-6,5 kV, 4,0 cm] ten un número significativamente maior de partículas que a escena [-3,8 kV, 0,5 cm]. Tamén cómpre sinalar que as concentracións numéricas de EWNS foron monitorizadas durante un máximo de 4 horas (figuras suplementarias S5 e S6), onde a estabilidade da xeración de EWNS mostrou os mesmos niveis de concentracións numéricas de partículas en ambos os casos.
A figura 3g mostra o espectro de EPR despois da subtracción de control (fondo) para EWNS optimizados a [-6,5 kV, 4,0 cm]. O espectro de ROS tamén se compara coa liña base de EWNS nun artigo publicado anteriormente. O número calculado de EWNS que reaccionan coa trampa de espín é de 7,5 × 104 EWNS/s, o que é similar á liña base de EWNS8 publicada anteriormente. Os espectros de EPR indicaron claramente a presenza de dous tipos de ROS, onde predominaba o O2-, mentres que o OH• estaba presente nunha cantidade menor. Ademais, unha comparación directa das intensidades dos picos mostrou que os EWNS optimizados tiñan un contido de ROS significativamente maior en comparación cos EWNS de liña base.
Na figura 4 móstrase a eficiencia de deposición de EWNS en EPES. Os datos tamén se resumen na táboa I e compáranse cos datos orixinais de EWNS. Para ambos os casos de EUNS, a deposición foi próxima ao 100 % mesmo a unha baixa tensión de 3,0 kV. Normalmente, 3,0 kV é suficiente para lograr unha deposición do 100 % independentemente do cambio de carga superficial. Nas mesmas condicións, a eficiencia de deposición do Baseline-EWNS foi só do 56 % debido á menor carga (media de 10 electróns por EWNS).
A Figura 5 e a Táboa 2 resumen o grao de inactivación dos microorganismos inoculados na superficie dos tomates despois da exposición a aproximadamente 40.000 #/cm3 de EWNS durante 45 minutos no escenario óptimo [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli e L. innocua inoculadas mostraron unha redución significativa de 3,8 log despois de 45 minutos de exposición. Nas mesmas condicións, S. enterica mostrou unha redución logarítmica menor de 2,2 log, mentres que S. cerevisiae e M. parafortuitum mostraron unha redución de 1,0 log.
Micrografías electrónicas (Figura 6) que representan os cambios físicos inducidos por EWNS en células de E. coli, Salmonella enterica e L. innocua que levan á inactivación. As bacterias de control mostraron membranas celulares intactas, mentres que as bacterias expostas tiñan membranas externas danadas.
A obtención de imaxes por microscopía electrónica das bacterias de control e expostas revelou danos na membrana.
Os datos sobre as propiedades fisicoquímicas dos EWNS optimizados mostran conxuntamente que as propiedades dos EWNS (carga superficial e contido de ROS) melloraron significativamente en comparación cos datos de referencia de EWNS publicados previamente8,9,10,11. Por outra banda, o seu tamaño mantívose no rango nanométrico, o que é moi similar aos resultados publicados previamente, o que lles permite permanecer no aire durante un longo período de tempo. A polidispersión observada pódese explicar por cambios na carga superficial, que determinan a magnitude do efecto Rayleigh, a aleatoriedade e a posible fusión dos EWNS. Non obstante, como detallaron Nielsen et al.22, unha carga superficial elevada reduce a evaporación ao aumentar eficazmente a enerxía/tensión superficial da pinga de auga. Esta teoría confirmouse experimentalmente para microgotas22 e EWNS na nosa publicación anterior8. A perda de tempo extra tamén pode afectar o tamaño e contribuír á distribución de tamaño observada.
Ademais, a carga por estrutura é duns 22–44 e-, dependendo das circunstancias, o que é significativamente maior en comparación co EWNS básico, que ten unha carga media de 10 ± 2 electróns por estrutura. Non obstante, cómpre sinalar que esta é a carga media do EWNS. Seto et al. Demostrouse que a carga non é uniforme e segue unha distribución log-normal21. En comparación co noso traballo anterior, duplicar a carga superficial duplica a eficiencia de deposición no sistema EPES a case o 100 %11.