Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada para CSS. Para obter unha mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, mostraremos o sitio sen estilos e JavaScript.
As partículas de sílice porosa preparáronse mediante un método sol-xel con algunhas modificacións para obter partículas macroporosas. Estas partículas foron derivatizadas mediante polimerización por transferencia de cadea de fragmentación por adición reversible (RAFT) con N-fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PMI) e estireno para preparar a intercalación de N-fenilmaleimida de poliestireno en fase estacionaria de aceiro inoxidable. mm id) foron empaquetados mediante envasado de lodos. Separación en columna de PMP avaliada dunha mestura peptídica formada por cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) condicións cromatográficas óptimas de dixestión e dixestión da HA. ​​O reconto de placas oréticas da mestura de péptidos é de ata 280.000 placas/m². Comparando o rendemento de separación da columna desenvolvida coa columna comercial Ascentis Express RP-Amide, observouse que o rendemento de separación da columna PMP era superior ao da columna comercial en termos de eficacia e resolución de separación.
Nos últimos anos, a industria biofarmacéutica converteuse nun mercado global en expansión cun aumento substancial da cota de mercado. Co crecemento explosivo da industria biofarmacéutica1,2,3, a análise de péptidos e proteínas é moi desexada. Ademais do péptido obxectivo, xéranse varias impurezas durante a síntese de péptidos, polo que requiren a purificación cromatográfica da purificación cromatográfica da proteína de péptidos e a análise do corpo de fluídos de peptídicos e a purificación do corpo desexado de péptidos e a análise do corpo de fluídos. é unha tarefa extremadamente desafiante debido ao gran número de especies potencialmente detectables nunha única mostra. Aínda que a espectrometría de masas é unha ferramenta eficaz para a secuenciación de péptidos e proteínas, se tales mostras se inxectan no espectrómetro de masas nunha única pasada, a separación non será a ideal. 5,6.Ademais, durante a separación da fase líquida, os analitos poden enfocarse en rexións estreitas, concentrando así estes analitos e mellorando a sensibilidade de detección de MS. A cromatografía líquida (LC) avanzou significativamente durante a última década e converteuse nunha técnica popular na análise proteómica7,8,9,10.
A cromatografía líquida en fase inversa (RP-LC) utilízase amplamente para a purificación e separación de mesturas peptídicas usando sílice modificada con octadecil (ODS) como fase estacionaria11,12,13. Non obstante, as fases estacionarias RP non proporcionan unha separación satisfactoria de péptidos e proteínas debido á súa estrutura complexa e á súa estrutura complexa e os péptidos de natureza anfifílica están deseñados de forma especial para analizar os péptidos de natureza anfifílica. a cromatografía de modo mixto, que proporciona interaccións multimodais, pode ser unha alternativa á RP-LC para a separación de péptidos, proteínas e outras mesturas complexas. 21.As fases estacionarias de modo mixto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalación polar/RPLC) son axeitadas para separacións de péptidos e proteínas debido á presenza de grupos polares e non polares22,23,24,25,26,27,28. Do mesmo xeito, as fases polares intercalantes mostran unha separación polar única e unha boa separación polar con potencia de intercalación polar e unha separación polar única e unha boa separación polar con potencia covalente. r analitos, xa que a separación depende da interacción entre o analito e a fase estacionaria.Interaccións multimodais 29, 30, 31, 32. Recentemente, Zhang et al.30 preparou unha fase estacionaria de poliamina terminada en dodecilo e separou con éxito hidrocarburos, antidepresivos, flavonoides, nucleósidos, estróxenos e varios outros analitos. O intercalador polar ten grupos polares e non polares, polo que se pode usar para separar péptidos e proteínas que teñan péptidos e proteínas que teñen tanto péptidos hidrofóbicos como columnas hidrofóbicas e incrustadas en polimidas. 8 columnas) están dispoñibles comercialmente baixo o nome comercial Ascentis Express RP-Amide columns, pero estas columnas úsanse só para a análise da amina 33.
No presente estudo, preparouse unha fase estacionaria polar (poliestireno embebido en N-fenilmaleimida) e avaliouse para a separación de péptidos e dixestos de tripsina de HSA. A fase estacionaria preparouse mediante a seguinte estratexia. Preparáronse partículas de sílice porosa segundo o procedemento indicado na nosa publicación anterior con algunhas modificacións no protocolo de preparación de ácido glicénico, polietil, auga, TMOSG. axustouse para preparar partículas de sílice con gran tamaño de poro. En segundo lugar, sintetizouse un novo ligando, fenilmaleimida-metilvinil isocianato, que utilizouse para derivar partículas de sílice para preparar unha fase estacionaria incrustada polar. A fase estacionaria resultante embalouse nunha columna de aceiro inoxidable (100 × 1,8 mm). d dentro da columna.Avaliar a separación de columnas empaquetadas de mesturas peptídicas formadas por cinco péptidos;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) e Tripsina dixestión de seroalbúmina humana (HAS).A mestura peptídica e a dixestión de tripsina de HSA observouse para separar a columna cunha boa resolución e eficacia da columna de separación. -Columna de amidas. Observouse que tanto os péptidos como as proteínas estaban ben resoltos e eran eficientes na columna PMP, que era máis eficiente que a columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, ácido acético, trimetoxi ortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albúmina sérica humana (HSA), cloruro de amonio, urea, hexano metildisilazano (HMDS), cloruro de metacriloílo (MC), peróxido de metacriloilo (MC-4-TEMP-POLC), (HP-4-POLC, óxido de polietileno) Grao de acetonitrilo (ACN), metanol, 2-propanol e acetona Comprados a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Axitause unha mestura de urea (8 g), polietilenglicol (8 g) e 8 ml de ácido acético 0,01 N durante 10 minutos, e despois engadíronlle 24 ml de TMOS en condicións de xeo. Ed a 70 ° C durante 12 horas. A masa branda seca foi moída suavemente nun forno e calcinouse a 550 ° C durante 12 horas. Preparáronse e caracterizáronse tres lotes para examinar a reproducibilidade no tamaño das partículas, tamaño dos poros e superficie.
Mediante a modificación superficial de partículas de sílice con ligando fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP) pre-sintetizado seguido de polimerización radial con estireno, preparouse un composto que contén grupos polares.Fase estacionaria para áridos e cadeas de poliestireno. A continuación descríbese o proceso de preparación.
Disolvéronse N-fenilmaleimida (200 mg) e isocianato de metilo vinilo (100 mg) en tolueno seco, e engadíronse 0,1 ml de 2,2′-azoisobutironitrilo (AIBN) ao matraz de reacción para preparar fenilmaleimida e isocianato de metilo vinilo. méter no forno a 40 °C durante 3 horas.
As partículas de sílice secas (2 g) dispersáronse en tolueno seco (100 ml), axitáronse e sonicaron nun matraz de fondo redondo de 500 ml durante 10 min. PMCP (10 mg) disolvéronse en tolueno e engadíronse gota a gota ao matraz de reacción mediante un funil de goteo. A continuación, disolvéronse partículas de sílice unidas a PMCP (100 g) en tolueno (200 ml) e engadiuse 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) en presenza de 100 µl de dilaurato de dibutilestaño como catalizador.
Estireno (1 ml), peróxido de benzoilo BPO (0,5 ml) e partículas de sílice unidas a TEMPO-PMCP (1,5 g) dispersáronse en tolueno e purgáronse con nitróxeno.
As mostras foron desgasificadas a 393 K durante 1 hora para obter unha presión residual inferior a 10-3 Torr. A cantidade de N2 adsorbida a unha presión relativa de P/P0 = 0,99 utilizouse para determinar o volume total do poro. Examinouse a morfoloxía das partículas de sílice núas e ligandos con ligando con mostra de microscopía electrónica de varrido, Tokyoitachi e Tecnoloxías altas de ligando (Tokio, Japón). partículas de sílice unidas) colocáronse nunha columna de aluminio usando cinta adhesiva de carbono. Colocouse ouro nas mostras mediante un revestidor de pulverización catódica Q150T, e nas mostras depositouse unha capa de Au de 5 nm. Isto mellora a eficiencia do proceso usando baixas tensións e proporciona gran fino, pulverización catódica en frío. n (Worcestershire, Reino Unido) Utilizouse o analizador de tamaño de partícula Mastersizer 2000 para obter a distribución de tamaño de partícula. As partículas de sílice espidas e as partículas de sílice unidas por ligando (5 mg cada unha) foron dispersadas en 5 ml de isopropanol, sonicadas durante 10 min, vórtexadas durante 5 min e colocáronse no banco óptico Master a unha velocidade de 5 °C. rango de temperatura de 30 a 800 °C.
Empaquetáronse columnas de diámetro estreito de aceiro inoxidable revestidas de vidro de dimensións (100 × 1,8 mm de diámetro interior) mediante o método de empaquetado de puríns, aplicando o mesmo procedemento que se utiliza na Ref.31.Conectouse unha columna de aceiro inoxidable (revestida de vidro, 100 × 1,8 mm de diámetro interior) cun accesorio de saída que contén unha frita de 1 µm a un empacador de lodos (Alltech Deerfield, IL, EUA). o disolvente propulsor.Enche a columna secuencialmente aplicando presións de 100 MP durante 10 minutos, 80 MP durante 15 minutos e 60 MP durante 30 minutos. Durante o envasado, aplicouse a vibración mecánica con dous agitadores de columna GC (Alltech, Deerfield, IL, EUA) para evitar un empaquetado uniforme da columna. desde a unidade de envasado de purín e conectar outro accesorio á entrada e ao sistema LC para comprobar o seu funcionamento.
Construíuse unha bomba LC (10AD Shimadzu, Xapón), inxector (Valco (EUA) C14 W.05) con bucle de inxección de 50 nL, desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), ventá capilar UV-VIS. embalaxe, os capilares (50 μm id 365 e os capilares de unión reductora (50 μm) instaláronse na saída de 1/16″ da unión redutora. A recollida de datos e o procesamento cromatográfico realizáronse mediante o software Multichro 2000. O seguimento a 254 nm Probáronse os analitos para a absorción de datos UV.
Albúmina de soro humano, po liofilizado, ≥ 96% (electroforese en xel de agarosa) 3 mg mesturado con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 ml) e bicarbonato de amonio 0,2 M (1 ml). % TFA.Filtrar a disolución e almacenar por debaixo de 4 °C.
A separación das mesturas peptídicas e as dixestións de tripsina de HSA avaliáronse por separado en columnas PMP. Comprobe a separación da mestura peptídica e da dixestión de tripsina de HSA pola columna PMP e compare os resultados coa columna de Ascentis Express RP-Amide. O número de placas teóricas calcúlase do seguinte xeito:
Na FIG.2 .Imaxes SEM de partículas de sílice núa (A, B) mostran que, en contraste cos nosos estudos anteriores, estas partículas son esféricas nas que as partículas son alongadas ou teñen simetría irregular. A superficie das partículas de sílice unidas a ligandos (C, D) é máis lisa que a das partículas de sílice núa, o que pode deberse ao recubrimento das polisílices na superficie das partículas de sílice.
Imaxes de microscopio electrónico de varrido de partículas de sílice núa (A, B) e partículas de sílice unidas a ligandos (C, D).
As distribucións de tamaño de partículas de sílice espidas e partículas de sílice unidas a ligando móstranse na Figura 3 (A). As curvas de distribución de tamaño de partícula baseadas en volume mostraron que o tamaño das partículas de sílice aumentou despois da modificación química (Fig. 3A). Os datos de distribución de tamaño de partícula das partículas de sílice do estudo actual e do estudo anterior compáranse na Táboa 1 (A.53 μm). , en comparación co noso estudo anterior cun valor ad(0,5) de 3,05 μm (partículas de sílice unidas a poliestireno) 34. Este lote tiña unha distribución de tamaño de partícula máis estreita en comparación co noso estudo anterior debido ás proporcións variables de PEG, urea, TMOS e ácido acético na mestura de reacción. estudado previamente. Isto significa que a funcionalización superficial das partículas de sílice con estireno só depositou unha capa de poliestireno (0,97 µm) na superficie da sílice, mentres que na fase PMP o espesor da capa era de 1,38 µm.
Distribución de tamaño de partícula (A) e distribución de tamaño de poro (B) de partículas de sílice espidas e partículas de sílice unidas a ligandos.
O tamaño dos poros, o volume dos poros e a superficie das partículas de sílice do estudo actual aparecen na táboa 1 (B). Os perfís PSD das partículas de sílice núas e das partículas de sílice unidas a ligando móstranse na figura 3 (B). Os resultados son comparables aos do noso estudo anterior. como se mostra na táboa 1(B), e o cambio da curva móstrase na figura 3(B). Do mesmo xeito, o volume de poros das partículas de sílice diminuíu de 0,67 a 0,58 cm3/g despois da modificación química.A superficie específica das partículas de sílice actualmente estudadas é de 116 m2/g, que é comparable á superficie mostrada na táboa anterior (124 m2/g). /g) das partículas de sílice tamén diminuíu de 116 m2/g a 105 m2/g despois da modificación química.
Os resultados da análise elemental da fase estacionaria móstranse na táboa 2. A carga de carbono da fase estacionaria actual é do 6,35%, o que é menor que a carga de carbono do noso estudo anterior (partículas de sílice unidas con poliestireno, 7,93%35 e 10,21%, respectivamente) Utilizáronse nds como fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP) e 4-hidroxi-TEMPO. A porcentaxe en peso de nitróxeno da fase estacionaria actual é do 2,21 %, fronte ao 0,1735 e o 0,85 % en peso de nitróxeno en estudos anteriores, respectivamente. 4) e (5) foron do 2,7% e do 2,9%, respectivamente, mentres que a carga de carbono do produto final (6) foi do 6,35%, como se mostra na táboa 2. A perda de peso comprobouse coa fase estacionaria de PMP, e a curva TGA móstrase na figura 4. A curva TGA mostra unha perda de peso do 8,6%, que non só contén un ligando de carbono (6%, pero que non só contén a carga de carbono). , O e H.
O ligando fenilmaleimida-metilvinilisocianato escolleuse para a modificación da superficie das partículas de sílice porque ten grupos fenilmaleimida polares e grupos vinilisocianato. Os grupos isocianato de vinilo poden reaccionar aínda máis co estireno mediante a polimerización de radicales vivos. O resto de imida non ten carga virtual a pH normal. A polaridade da fase estacionaria pódese controlar pola cantidade óptima de estireno e o tempo de reacción da polimerización por radicais libres. O último paso da reacción (polimerización por radicais libres) é fundamental e pode cambiar a polaridade da fase estacionaria. Realizouse unha análise elemental para comprobar a carga de carbono destas fases estacionarias. ción da fase estacionaria e viceversa.Os SP preparados con diferentes concentracións de estireno teñen diferentes cargas de carbono.De novo, cargue estas fases estacionarias en columnas de aceiro inoxidable e comprobe o seu rendemento cromatográfico (selectividade, resolución, valor N, etc.).En base a estes experimentos, seleccionouse unha formulación optimizada para preparar a fase estacionaria do PMP para garantir unha boa retención de polaridade analis controlada.
Tamén se avaliaron cinco mesturas de péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) mediante unha columna PMP utilizando unha fase móbil;60/40 (v/v) acetonitrilo/auga (0,1% TFA) a un caudal de 80 μL/min. En condicións de elución óptimas, o número teórico de placas (N) por columna (100 × 1,8 mm id) é de 20.000 ± 100 (200.000 μL/min). Os gramos móstranse na Figura 5A. Análise rápida nunha columna PMP a alto fluxo (700 μL/min), cinco péptidos eluíronse nun minuto, os valores de N foron moi bos, 13.500 ± 330 por columna (100 × 1,8 mm id), Corresponde a 135.000 placas identificadas (fig. 0,8 mm id) empaquetáronse con tres lotes diferentes de fase estacionaria de PMP para comprobar a reproducibilidade. A concentración de analito para cada columna rexistrouse utilizando as condicións de elución óptimas e o número de placas teóricas N e o tempo de retención para separar a mesma mestura de proba en cada columna. Os datos de reproducibilidade das columnas de PMP móstranse na táboa 4. A reproducibilidade das columnas de PMP móstranse na Táboa 4. A reproducibilidade das columnas de PMP móstranse na táboa 4. A reproducibilidade das columnas de PMP con valores de correlación moi baixos, como se amosa na columna PMP do pozo 3 % RSD é moi baixo.
Separación da mestura peptídica na columna PMP (B) e na columna Ascentis Express RP-Amide (A);fase móbil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensións da columna PMP (100 × 1,8 mm id);analítica A orde de elución dos compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (leucina) encefalina ácida)).
Avaliouse unha columna PMP (100 × 1,8 mm id) para a separación de dixestións trípticas de albúmina sérica humana na cromatografía líquida de alto rendemento.O cromatograma da Figura 6 mostra que a mostra está ben separada e a resolución é moi boa.As dixestións de HSA analizáronse utilizando un caudal de 100 µL/min, a fase móbil acetona/30% acetona/itrilo e 70FA/30% de auga. cromatograma (Figura 6), a dixestión de HSA dividiuse en 17 picos correspondentes a 17 péptidos. Calculouse a eficiencia de separación de cada pico na dixestión de HSA e os valores aparecen na Táboa 5.
Separouse unha dixestión tríptica de HSA (100 × 1,8 mm id) nunha columna de PMP;caudal (100 µl/min), fase móbil 60/40 acetonitrilo/auga con 0,1 % de TFA.
onde L é a lonxitude da columna, η é a viscosidade da fase móbil, ΔP é a contrapresión da columna e u é a velocidade lineal da fase móbil. A permeabilidade da columna PMP era de 2,5 × 10-14 m2, o caudal era de 25 μL/min e 60/40 v/v ACN/auga utilizouse a permeabilidade da columna PMP 1 × 8 mm. o noso estudo anterior Ref.34.A permeabilidade da columna chea de partículas superficialmente porosas é: 1,7 × 10-15 para partículas de 1,3 μm, 3,1 × 10-15 para partículas de 1,7 μm, 5,2 × 10-15 e 2,5 × 10-14 para partículas de 1,3 μm. a permeabilidade da fase PMP é similar á das partículas núcleo-copa de 5 μm.
onde Wx é o peso da columna chea con cloroformo, Wy é o peso da columna chea con metanol e ρ é a densidade do disolvente. Densidades de metanol (ρ = 0,7866) e cloroformo (ρ = 1,484). 31 que estudamos anteriormente foron 0,63 e 0,55, respectivamente. Isto significa que a presenza de ligandos de urea reduce a permeabilidade da fase estacionaria. Por outra banda, a porosidade total da columna PMP (100 × 1,8 mm id) é de 0,60. A permeabilidade das columnas PMP enlazadas con partículas C8 estacionarias é máis baixa que a das columnas de PMP enlazadas con partículas C8 estacionarias. fases os ligandos C18 están unidos ás partículas de sílice como cadeas lineais, mentres que nas fases estacionarias de poliestireno fórmase unha capa de polímero relativamente grosa ao seu redor. Nun experimento típico, a porosidade da columna calcúlase como:
As figuras 7A, B mostran a columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) e a columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm de diámetro interior) usando as mesmas condicións de elución (é dicir, 60/40 ACN/H2O e 0,1% de TFA).) da parcela van Deemter.As mesturas peptídicas seleccionadas (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) preparáronse en 20 µL/ O caudal mínimo para ambas columnas é de 800 µL/min. A columna Express RP-Amide era de 2,6 µm e 3,9 µm, respectivamente. Os valores HETP indican que a eficiencia de separación da columna PMP (100 × 1,8 mm id) é moito mellor que a columna Ascentis Express RP-Amide dispoñible comercialmente (100 × 1,8 mm id). estudo.A maior eficiencia de separación da columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) en comparación coa columna Ascentis Express RP-Amide baséase nas melloras na forma, tamaño das partículas e nos complexos procedementos de empaquetado da columna empregados no traballo actual34.
(A) Gráfico de van Deemter (HETP versus velocidade lineal da fase móbil) obtido mediante unha columna PMP (100 × 1,8 mm id) en 60/40 ACN/H2O cun 0,1 % de TFA. cun 0,1% de TFA.
Preparouse e avaliouse unha fase estacionaria de poliestireno incrustado polar para a separación de mesturas de péptidos sintéticos e dixestos de tripsina de albúmina sérica humana (HAS) en cromatografía líquida de alto rendemento. O rendemento cromatográfico das columnas PMP para mesturas de péptidos é excelente na eficiencia e resolución da separación. , síntese controlada da fase estacionaria e complexo embalaxe da columna. Ademais da alta eficiencia de separación, a baixa presión de contrapresión da columna a altos caudais é outra vantaxe desta fase estacionaria. As columnas PMP presentan unha boa reproducibilidade e pódense usar para a análise de mesturas peptídicas e a dixestión de tripsina de varias proteínas. Pretendemos usar esta columna para a separación de produtos naturais, extractos líquidos de plantas medicinais e fungos. tamén se avaliará para a separación de proteínas e anticorpos monoclonais.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Research on Peptide Separation Systems by Reversed Phase Chromatography Part I: Development of a Column Characterization Protocol.J.Cromatografía.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Péptidos activos mellorados deseñados para o tratamento de enfermidades infecciosas.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia e mercado.descubrimento de drogas.15 (1-2) hoxe, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010.009).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Cromatografía.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.A cromatografía líquida avanzada-espectrometría de masas permite a incorporación de metabolómicas e proteómicas amplamente dirixidas.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ O papel da UHPLC no desenvolvemento de fármacos.J.Set. Sci.30 (8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspectos fundamentais e prácticos da cromatografía líquida de ultraalta presión para separacións rápidas.J.Setembro Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplicación da cromatografía líquida de ultra-alto rendemento no desenvolvemento de fármacos.J.Cromatografía.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Hidroxeles macroporosos monolíticos preparados a partir de emulsións de alta fase interna de aceite en auga para a purificación eficiente de enterovirus.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA O papel da cromatografía líquida na proteómica.J.Cromatografía.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Emerging trends in reverse-phase liquid chromatography separations of therapeutic peptides and proteins: theory and applications.J.Farmacia.Ciencia Biomédica.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Separación bidimensional de péptidos mediante un sistema RP-RP-HPLC utilizando diferentes valores de pH na primeira e segunda dimensións de separación.J.Setembro Sci.28 (14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Investigáronse as características de transferencia de masa e o rendemento cinético de columnas cromatográficas de alta eficiencia embaladas con partículas C18 sub-2 μm totalmente e superficialmente porosas.J.Set. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Tendencias recentes e desafíos analíticos no illamento, identificación e validación de péptidos bioactivos vexetais.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-x (02018-x).
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the kingdom of life.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Downstream processing of therapeutic peptides by preparative liquid chromatography.Molecule (Basilea, Suíza) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Cromatografía en modo mixto e a súa aplicación a biopolímeros.J.Cromatografía.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligandos para cromatografía de proteínas en modo mixto: principio, caracterización e deseño.J.Biotecnoloxía.144(1), 3-11 (2009).