Grazas por visitar Nature.com. Estás a usar unha versión do navegador con compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir a compatibilidade continua, mostramos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositivas á vez. Usa os botóns Anterior e Seguinte para moverte por tres diapositivas á vez ou usa os botóns deslizantes do final para moverte por tres diapositivas á vez.
Preparáronse partículas de sílice porosas mediante o método sol-gel con algunhas modificacións para obter partículas de poros anchos. Estas partículas derivatizáronse con isocianato de N-fenilmaleimida-metilvinilo (PMI) e estireno mediante polimerización por fragmentación de transferencia de cadea inversa (RAFT) para producir poliamidas intercaladas con N-fenilmaleimida. Fase estacionaria de estireno (PMP). As columnas de aceiro inoxidable de diámetro estreito (100 × 1,8 mm de diámetro interior) empaquetaronse cunha suspensión. Avaliouse o rendemento cromatográfico da columna PMP para separar unha mestura de péptidos sintéticos que consistía en cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminoácido encefalina) e hidrolizado tríptico de albumina sérica humana (HAS). En condicións de elución óptimas, o número teórico de placas cunha mestura de péptidos alcanzou as 280.000 placas/m². Comparando o rendemento de separación da columna desenvolvida coa columna comercial Ascentis Express RP-amida, observouse que a eficiencia de separación da columna PMP era superior á columna comercial en termos de eficiencia de separación e resolución.
A industria biofarmacéutica converteuse nun mercado global en expansión cun aumento significativo da cota de mercado nos últimos anos. Co crecemento explosivo da industria biofarmacéutica1,2,3 existe unha gran necesidade de análise de péptidos e proteínas. Ademais do péptido diana, fórmanse varias impurezas durante a síntese de péptidos, polo que se require unha purificación cromatográfica para obter a pureza desexada do péptido. A análise e caracterización de proteínas en fluídos corporais, tecidos e células é unha tarefa extremadamente desafiante debido ao gran número de especies potencialmente detectables presentes nunha soa mostra. Aínda que a espectrometría de masas é unha ferramenta eficaz para secuenciar péptidos e proteínas, se estas mostras se introducen directamente no espectrómetro de masas, a separación non será satisfactoria. Este problema pódese resolver realizando cromatografía líquida (LC) antes da análise de MS, o que reducirá a cantidade de analitos que entran no espectrómetro de masas nun momento determinado4,5,6. Ademais, os analitos poden concentrarse nunha rexión estreita durante a separación da fase líquida, concentrando así estes analitos e aumentando a sensibilidade da detección de MS. A cromatografía líquida (LC) avanzou significativamente na última década e converteuse nun método amplamente utilizado para a análise proteómica7,8,9,10.
A cromatografía líquida de fase inversa (RP-LC) úsase amplamente para purificar e separar mesturas de péptidos empregando sílice modificada con octadecilo (ODS) como fase estacionaria11,12,13. Non obstante, debido á súa estrutura complexa e natureza anfotérica,14,15 as fases estacionarias de RP non poden proporcionar unha separación satisfactoria de péptidos e proteínas. Polo tanto, a análise de péptidos e proteínas con fragmentos polares e non polares require fases estacionarias especialmente deseñadas para interactuar e reter estes analitos16. A cromatografía mixta, que ofrece interaccións multimodais, pode ser unha alternativa á RP-LC para separar péptidos, proteínas e outras mesturas complexas. Preparáronse varias fases estacionarias de tipo mixto e utilizáronse columnas cheas con estas fases estacionarias para separar péptidos e proteínas17,18,19,20,21. Debido á presenza de grupos polares e non polares, as fases estacionarias de modo mixto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalación polar/RPLC) son axeitadas para a separación de péptidos e proteínas22,23,24,25,26,27,28. , as fases estacionarias intercaladas polares con grupos polares unidos covalentemente mostran boas capacidades de separación e unha selectividade única para analitos polares e non polares porque a separación depende da interacción entre o analito e a fase estacionaria. Interaccións multimodais29,30,31,32. Recentemente, Zhang et al.30 obtiveron fases estacionarias terminadas en behenilo de poliaminas e separaron con éxito hidrocarburos, antidepresivos, flavonoides, nucleósidos, estróxenos e algúns outros analitos. O material estacionario incrustado polar ten grupos polares e non polares, polo que se pode usar para separar péptidos e proteínas en partes hidrófobas e hidrófilas. As columnas polares en liña (por exemplo, columnas C18 con amida en liña) están dispoñibles co nome comercial de columnas Ascentis Express RP-Amide, pero estas columnas só se usaron para a análise da amina 33.
No presente estudo, preparouse unha fase estacionaria de incrustación polar (N-fenilmaleimida, poliestireno de incrustación) e avaliouse para a separación de péptidos e a clivaxe da HSA tríptica. Empregouse a seguinte estratexia para preparar a fase estacionaria. As partículas de sílice porosa preparáronse segundo os procedementos descritos nas nosas publicacións anteriores, con algúns cambios nos esquemas de preparación 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Axustáronse as proporcións de urea, polietilenglicol (PEG), TMOS e ácido acético acuoso para obter partículas de sílice con poros de grandes tamaños. En segundo lugar, sintetizouse un novo ligando fenilmaleimida-isocianato de metilvinilo e as súas partículas de sílice derivatizadas utilizáronse para preparar fases estacionarias polares incrustadas. A fase estacionaria obtida empaquetause nunha columna de aceiro inoxidable (diámetro interior 100 × 1,8 mm) segundo un esquema de empaquetamento optimizado. O empaquetamento da columna realízase mediante vibración mecánica para garantir unha capa uniforme dentro da columna. Avaliouse a columna recheada para a separación dunha mestura de péptidos que consistía en cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, péptido de leucina-encefalina) e hidrolizados trípticos de albumina sérica humana (HSA). Observouse que a mestura de péptidos e o dixerido tríptico de HSA se separaban con boa resolución e eficiencia. A eficiencia de separación da columna PMP comparouse coa da columna Ascentis Express RP-Amide. Observouse que os péptidos e as proteínas teñen unha boa resolución e unha alta eficiencia de separación na columna PMP, e a eficiencia de separación da columna PMP é maior que a da columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, ácido acético, trimetoxiortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albumina sérica humana (HSA), cloruro de amonio, urea, hexametilmetacriloildisilazano (HMDS), cloruro de metacriloílo (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoílo (BPO), acetonitrilo (ACN) para HPLC, metanol, 2-propanol e acetona. Sigma-Aldrich Company (San Luís, Missouri, EUA).
Axitouse durante 10 minutos unha mestura de urea (8 g), polietilenglicol (8 g) e 8 ml de ácido acético 0,01 N, e engadíronselle 24 ml de TMOS arrefriando con xeo. A mestura de reacción quentouse a 40 °C durante 6 horas e despois a 120 °C durante 8 horas nun autoclave de aceiro inoxidable. A auga decantouse e o residuo secouse a 70 °C durante 12 horas. Os bloques brandos secos moéronse suavemente e calcináronse nun forno a 550 °C durante 12 horas. Preparáronse e caracterizáronse tres lotes para probar a reproducibilidade dos tamaños de partícula, o tamaño dos poros e a área superficial.
Grupo polar e fase estacionaria para cadeas de poliestireno. O procedemento de preparación descríbese a continuación.
Disolvéronse N-fenilmaleimida (200 mg) e isocianato de metilvinilo (100 mg) en tolueno anhidro e, a continuación, engadíronse 0,1 ml de 2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN) ao matraz de reacción para obter un copolímero de fenilmaleimida e isocianato de metilvinilo (PMCP). A mestura quentouse a 60 °C durante 3 horas, filtrouse e secouse nun forno a 40 °C durante 3 horas.
As partículas de sílice secas (2 g) dispersáronse en tolueno seco (100 ml), axitáronse e sonicaron durante 10 minutos nun matraz de fondo redondo de 500 ml. O PMCP (10 mg) disolveuse en tolueno e engadiuse gota a gota ao matraz de reacción mediante un funil de adición. A mestura someteuse a refluxo a 100 °C durante 8 horas, filtrouse, lavouse con acetona e secouse a 60 °C durante 3 horas. Despois, as partículas de sílice asociadas co PMCP (100 g) disolvéronse en tolueno (200 ml) e engadíuselle 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) en presenza de 100 μl de dilaurato de dibutilestaño como catalizador. A mestura axitouse a 50 °C durante 8 horas, filtrouse e secouse a 50 °C durante 3 horas.
Dispersáronse estireno (1 ml), peróxido de benzoílo BPO (0,5 ml) e partículas de sílice unidas a TEMPO-PMCP (1,5 g) en tolueno e purgáronse con nitróxeno. A polimerización do estireno levouse a cabo a 100 °C durante 12 horas. O produto resultante lavouse con metanol e secouse durante a noite a 60 °C. O esquema xeral da reacción móstrase na figura un.
As mostras foron desgasificadas a 393 K durante 1 h ata que se obtivo unha presión residual inferior a 10–3 Torr. A cantidade de N2 adsorbida á presión relativa P/P0 = 0,99 utilizouse para determinar o volume total dos poros. A morfoloxía das partículas de sílice pura e unidas a ligando examinouse cun microscopio electrónico de varrido (Hitachi High Technologies, Toquio, Xapón). As mostras secas (sílice pura e partículas de sílice unidas a ligando) colocáronse en varillas de aluminio usando cinta de carbono. Depositouse ouro sobre a mostra usando un dispositivo de pulverización catódica Q150T e depositouse unha capa de Au de 5 nm de grosor sobre a mostra. Isto mellora a eficiencia do proceso de baixa tensión e proporciona unha pulverización en frío fina. A análise elemental realizouse cun analizador de composición elemental Flash EA1112 de Thermo Electron (Waltham, MA, EUA). Utilizouse un analizador de tamaño de partícula de Malvern (Worcestershire, Reino Unido) Mastersizer 2000 para obter a distribución do tamaño das partículas. As partículas de sílice sen revestimento e as partículas de sílice unidas a ligandos (5 mg cada unha) dispersáronse en 5 ml de isopropanol, sonicáronse durante 10 minutos, axitáronse durante 5 minutos e colocáronse nun banco óptico Mastersizer. A análise termogravimétrica realízase a unha velocidade de 5 °C por minuto no rango de temperatura de 30 a 800 °C.
Empaquetaronse columnas de aceiro inoxidable de diámetro estreito revestidas de fibra de vidro con dimensións (DI 100 × 1,8 mm) mediante o método de recheo en suspensión seguindo o mesmo procedemento que na referencia 31. Unha columna de aceiro inoxidable (revestida de vidro, DI 100 × 1,8 mm) e unha saída que contiña unha frita de 1 µm conectáronse a unha máquina de empaquetado de suspensión (Alltech Deerfield, IL, EUA). Prepare unha suspensión da fase estacionaria suspendendo 150 mg da fase estacionaria en 1,2 ml de metanol e alimentándoa a unha columna de depósito. Utilizouse metanol como disolvente de suspensión e disolvente de control. Empaquetar a columna aplicando unha secuencia de presión de 100 MP durante 10 min, 80 MP durante 15 min e 60 MP durante 30 min. O proceso de empaquetado utilizou dous vibradores de columna de cromatografía de gases (Alltech, Deerfield, IL, EUA) para a vibración mecánica para garantir un empaquetado uniforme da columna. Peche o empaquetador de suspensión e libere a presión lentamente para evitar danar a cadea. A columna desconectouse da boquilla da suspensión e conectouse outro accesorio á entrada e ao sistema LC para probar o seu funcionamento.
Construíuse un MLC personalizado empregando unha bomba LC (10AD Shimadzu, Xapón), un mostrador cun bucle de inxección de 50 nL (Valco (EUA) C14 W.05), un desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A) e unha xanela capilar UV-VIS. Dispositivo detector (UV-2075) e microcolumna esmaltada. Utilízanse tubos de conexión moi estreitos e curtos para minimizar o efecto da expansión adicional da columna. Despois de encher a columna, instálase un capilar (50 µm de diámetro interior 365) na saída da unión redutora de 1/16″ e instálase un capilar (50 µm) da unión redutora. A recollida de datos e o procesamento do cromatograma realízanse mediante o software Multichro 2000. A 254 nm, a absorbancia UV dos analitos suxeitos monitorizouse a 0. Os datos cromatográficos analizáronse mediante OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmina sérica humana, po liofilizado, ≥ 96 % (electroforese en xel de ágarosa) 3 mg mesturados con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 ml) e bicarbonato de amonio 0,2 M (1 ml). A solución axitouse durante 10 minutos e mantívose nun baño de auga a 37 °C durante 6 horas, e despois inactivouse con 1 ml de TFA ao 0,1 %. Filtrárona a solución e gárdana por debaixo de 4 °C.
A separación dunha mestura de péptidos e HSA dixerida con ácido tríptico nunha columna PMP avaliouse por separado. Comprobouse a hidrólise tríptica dunha mestura de péptidos e HSA separados por unha columna PMP e comparáronse os resultados cunha columna Ascentis Express RP-Amide. O número de pratos teóricos calcúlase mediante a seguinte ecuación:
As imaxes SEM de partículas de sílice pura e partículas de sílice unidas a ligandos móstranse na Figura 2. As imaxes SEM de partículas de sílice pura (A, B) mostran unha forma esférica na que as partículas son alongadas ou teñen simetría irregular en comparación cos nosos estudos previos. A superficie das partículas de sílice unidas polo ligando (C, D) é máis lisa que a das partículas de sílice pura, o que pode deberse ás cadeas de poliestireno que cobren a superficie das partículas de sílice.
Micrografías electrónicas de varrido de partículas de sílice pura (A, B) e partículas de sílice unidas a ligandos (C, D).
A distribución do tamaño das partículas de sílice pura e de partículas de sílice unidas a ligandos móstrase na Fig. 2.3(A). As curvas de distribución do tamaño das partículas volumétricas mostraron que o tamaño das partículas de sílice aumentou despois da modificación química (Fig. 3A). Os datos de distribución do tamaño das partículas de sílice do estudo actual e do estudo anterior compáranse na Táboa 1(A). O tamaño volumétrico das partículas d(0,5) de PMP foi de 3,36 µm, en comparación co valor ad(0,5) de 3,05 µm no noso estudo anterior (partículas de sílice unidas a poliestireno)34. Debido ao cambio na proporción de PEG, urea, TMOS e ácido acético na mestura de reacción, a distribución do tamaño das partículas deste lote foi máis estreita en comparación co noso estudo anterior. O tamaño das partículas da fase PMP é lixeiramente maior que o da fase de partículas de sílice unidas a poliestireno que estudamos anteriormente. Isto significa que a funcionalización superficial das partículas de sílice con estireno depositou só unha capa de poliestireno (0,97 µm) na superficie de sílice, mentres que na fase PMP o grosor da capa foi de 1,38 µm.
Distribución do tamaño das partículas (A) e distribución do tamaño dos poros (B) de partículas de sílice pura e partículas de sílice unidas a ligandos.
O tamaño dos poros, o volume dos poros e a área superficial das partículas de sílice empregadas neste estudo móstranse na Táboa 1 (B). Os perfís de densidade espectroscópica de partículas de sílice puras e partículas de sílice unidas a ligandos móstranse na Fig. 3 (B). Os resultados foron comparables ao noso estudo anterior34. Os tamaños dos poros das partículas de sílice puras e unidas a ligandos foron de 310 Å e 241 Å, respectivamente, o que indica que despois da modificación química, o tamaño dos poros diminuíu en 69 Å, como se mostra na Táboa 1 (B), e a curva de desprazamento móstrase na Fig. A área superficial específica das partículas de sílice no estudo actual é de 116 m2/g, o que é comparable ao noso estudo anterior (124 m2/g). Como se mostra na Táboa 1 (B), a área superficial (m2/g) das partículas de sílice despois da modificación química tamén diminuíu de 116 m2/g a 105 m2/g.
Os resultados da análise elemental da fase estacionaria preséntanse na Táboa 2. O contido de carbono da fase estacionaria actual é do 6,35 %, o cal é inferior ao do noso estudo anterior (partículas de sílice asociadas con poliestireno, 7,93 %35 e 10,21 %, respectivamente) 42. O contido de carbono da fase estacionaria actual móstrase a continuación, xa que algúns ligandos polares como o isocianato de metilvinilo de fenilmaleimida (PCMP) e o 4-hidroxi-TEMPO foron empregados ademais do estireno na preparación de SP. A porcentaxe en peso de nitróxeno na fase estacionaria actual é do 2,21 % en comparación co 0,1735 e o 0,85 % en estudos anteriores 42. Isto significa que a fase estacionaria actual ten unha alta porcentaxe en peso de nitróxeno debido á fenilmaleimida. Do mesmo xeito, os produtos (4) e (5) teñen un contido de carbono do 2,7 % e do 2,9 %, respectivamente, mentres que o produto final (6) ten un contido de carbono do 6,35 %, como se mostra na Táboa 2. Utilizouse unha análise termogravimétrica (TGA) na fase estacionaria do PMP para comprobar a perda de peso, e a curva TGA móstrase na Figura 4. A curva TGA mostra unha perda de peso do 8,6 %, o que concorda ben co contido de carbono (6,35 %), xa que os ligandos conteñen non só C, senón tamén N, O e H.
O ligando fenilmaleimida-metilvinisocianato foi escollido para modificar a superficie das partículas de sílice debido aos seus grupos polares fenilmaleimida e vinilisocianato. Os grupos isocianato de vinilo poden reaccionar ademais co estireno mediante a polimerización radical viva. A segunda razón é inserir un grupo que teña interaccións moderadas co analito e sen fortes interaccións electrostáticas entre o analito e a fase estacionaria, xa que a porción fenilmaleimida non ten carga virtual a pH normal. A polaridade da fase estacionaria pódese controlar mediante a cantidade óptima de estireno e o tempo de reacción da polimerización radical libre. O paso final da reacción (polimerización radical libre) é crítico xa que cambia a polaridade da fase estacionaria. Realizouse unha análise elemental para comprobar o contido de carbono nestas fases estacionarias. Observouse que aumentar a cantidade de estireno e o tempo de reacción aumenta o contido de carbono da fase estacionaria e viceversa. Os SP preparados con diferentes concentracións de estireno teñen diferentes cargas de carbono. Do mesmo xeito, estas fases estacionarias colocáronse en columnas de aceiro inoxidable e comprobáronse as súas características cromatográficas (selectividade, resolución, valor N, etc.). Baseándose nestes experimentos, elixiuse unha composición optimizada para a preparación da fase estacionaria PMP para proporcionar unha polaridade controlada e unha boa retención do analito.
A columna PMP tamén se avaliou para a análise de cinco mesturas de péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina) utilizando a capacidade da fase móbil. 60/40 (v/v) ACN/auga (0,1 % de TFA) a un caudal de 80 µl/min. En condicións óptimas de elución (200 000 placas/m), o número de placas teóricas (N) por columna (100 × 1,8 mm) é de 20 000 ± 100. Os valores de N para as tres columnas PMP móstranse na Táboa 3 e os cromatogramas na Figura 5A. Análise rápida a alta velocidade de fluxo (700 µl/min) nunha columna PMP, cinco péptidos eluídos nun minuto, excelente valor de N de 13.500 ± 330 por columna (100 x 1,8 mm de diámetro), equivalente a 135.000 placas/m (Fig. 5B). Tres columnas do mesmo tamaño (diámetro interior 100 x 1,8 mm) enchíronse con tres lotes diferentes de fase estacionaria PMP para probar a reproducibilidade. Os analitos rexistráronse para cada columna separando a mesma mestura de proba en cada columna utilizando condicións de elución óptimas, número de placas teóricas N e tempo de retención. Os datos de reproducibilidade para as columnas PMP móstranse na Táboa 4. A reproducibilidade da columna PMP correlacionouse ben con valores moi baixos de %RSD, como se mostra na Táboa 3.
Separación de mesturas de péptidos nunha columna PMP (B) e nunha columna Ascentis Express RP-Amide (A), fase móbil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensións da columna PMP (100 x 1,8 mm de diámetro interior), análise. Orde de elución dos compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (encefalina do ácido leucico).
Avaliouse unha columna PMP (diámetro interior 100 x 1,8 mm) para a separación do hidrolizado tríptico da albumina sérica humana mediante HPLC. O cromatograma da Figura 6 mostra que as mostras están ben separadas cunha resolución moi boa. As solucións de HSA analizáronse empregando un caudal de 100 μl/min, unha fase móbil de 70/30 acetonitrilo/auga e 0,1 % de TFA. A clivaxe da HSA dividiuse en 17 picos, como se mostra no cromatograma (Fig. 6), correspondentes a 17 péptidos. Calculáronse as eficiencias de separación dos picos individuais do hidrolizado de HSA e os valores móstranse na Táboa 5.
Os hidrolizados trípticos de HSA separáronse nunha columna PMP (diámetro interior 100 x 1,8 mm), caudal (100 μl/min), fase móbil 60/40 acetonitrilo/auga e 0,1 % de TFA.
onde L é a lonxitude da columna, η é a viscosidade da fase móbil, ΔP é a contrapresión da columna e u é a velocidade lineal da fase móbil. A permeabilidade da columna de PMP foi de 2,5 × 10–14 m2, o caudal foi de 25 µl/min, utilizouse ACN/auga 60/40 v/v. A permeabilidade da columna de PMP (ID 100 × 1,8 mm) foi similar á do noso estudo anterior Ref.34. A permeabilidade dunha columna chea de partículas superficialmente porosas é de 1,7×10,6 µm, 2,5×10-14 m2 para partículas de 5 µm43. Polo tanto, a permeabilidade da fase PMP é similar á permeabilidade das partículas núcleo-casca cun tamaño de 5 μm.
onde Wx é a masa da columna chea de cloroformo, Wy é a masa da columna chea de metanol e ρ é a densidade do solvente. Densidade do metanol (ρ = 0,7866) e do cloroformo (ρ = 1,484). A porosidade total da columna de partículas de sílice-C18 (100 × 1,8 mm de diámetro interior)34 e da nosa columna de C18-urea31 estudada previamente foi de 0,63 e 0,55, respectivamente. Isto significa que a presenza de ligandos de urea reduce a permeabilidade da fase estacionaria. Por outra banda, a porosidade total da columna de PMP (diámetro interior 100 × 1,8 mm) é de 0,60. As columnas de PMP son menos permeables que as columnas recheas de partículas de sílice unidas a C18 porque nas fases estacionarias de tipo C18 os ligandos C18 están unidos ás partículas de sílice en cadeas lineais, mentres que nas fases estacionarias de tipo poliestireno fórmase un polímero relativamente groso arredor das partículas. capa A. Nun experimento típico, a porosidade da columna calcúlase do seguinte xeito:
Na figura 7A e B móstranse os gráficos de Van Deemter para unha columna PMP (diámetro interior 100 x 1,8 mm) e unha columna Ascentis Express RP-Amide (diámetro interior 100 x 1,8 mm) nas mesmas condicións de elución, 60/40 ACN/H2O e 0,1 % de TFA de 20 µl/min a 800 µl/min en ambas as columnas. Os valores mínimos de HETP ao caudal óptimo (80 µl/min) foron de 2,6 µm e 3,9 µm para a columna PMP e a columna Ascentis Express RP-Amide, respectivamente. Os valores de HETP mostran que a eficiencia de separación da columna PMP (100 x 1,8 mm diámetro interior) é moito maior que a da columna Ascentis Express RP-Amide dispoñible comercialmente (100 x 1,8 mm diámetro interior). O gráfico de van Deemter na figura 7(A) mostra que a diminución no valor de N non é significativamente maior ao aumentar o fluxo en comparación co noso estudo anterior. A maior eficiencia de separación da columna PMP (id 100 × 1,8 mm) en comparación coa columna Ascentis Express RP-Amide baséase na mellora da forma e o tamaño das partículas e no sofisticado procedemento de empaquetado da columna empregado no traballo actual34.
(A) Gráfico de Van Deemter (HETP fronte a velocidade lineal da fase móbil) obtido nunha columna PMP (diámetro interior 100 x 1,8 mm) en ACN/H2O 60/40 con TFA ao 0,1 %. (B) Gráfico de Van Deemter (HETP fronte a velocidade lineal da fase móbil) obtido nunha columna Ascentis Express RP-Amide (diámetro interior 100 x 1,8 mm) en ACN/H2O 60/40 con TFA ao 0,1 %.
Preparouse e avaliouse unha fase estacionaria polar de poliestireno intercalado para a separación dunha mestura de péptidos sintéticos e hidrolizado tríptico de albumina sérica humana (HSA) en cromatografía líquida de alta resolución. O rendemento cromatográfico das columnas PMP para mesturas de péptidos é excelente en termos de eficiencia de separación e resolución. A mellora da eficiencia de separación das columnas PMP débese a varias razóns, como o tamaño das partículas de sílice e o tamaño dos poros, a síntese controlada de fases estacionarias e os materiais de recheo complexos da columna. Ademais da alta eficiencia de separación, outra vantaxe desta fase estacionaria é a baixa contrapresión da columna a altas taxas de fluxo. As columnas PMP son altamente reproducibles e pódense usar para analizar mesturas de péptidos e dixestión tríptica de diversas proteínas. Pretendemos usar esta columna para a separación de compostos bioactivos de produtos naturais, extractos de plantas medicinais e cogomelos en cromatografía líquida. No futuro, as columnas PMP tamén se avaliarán para a separación de proteínas e anticorpos monoclonais.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. e Petersson, P. Investigación sobre sistemas de separación de péptidos por cromatografía de fase inversa, parte I: Desenvolvemento dun protocolo para a caracterización de columnas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. e Petersson, P. Investigación sobre sistemas de separación de péptidos por cromatografía de fase inversa, parte I: Desenvolvemento dun protocolo para a caracterización de columnas.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. e Petersson, P. Investigación de sistemas de separación de péptidos mediante cromatografía de fase inversa, parte I: desenvolvemento dun protocolo para a caracterización de columnas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. e Petersson, P. Investigación sobre sistemas de separación de péptidos por cromatografía de fase inversa, parte I: Desenvolvemento dun protocolo para as características das columnas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. e Petersson, P. Investigación sobre sistemas de separación de péptidos por cromatografía de fase inversa, parte I: Desenvolvemento dun protocolo para as características das columnas.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. e Petersson, P. Investigación de sistemas de separación de péptidos mediante cromatografía de fase inversa, parte I: desenvolvemento dun protocolo para a caracterización de columnas.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Métodos para crear péptidos activos mellorados para o tratamento de enfermidades infecciosas. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. e Khrestchatisky, M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia e mercado. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. e Khrestchatisky, M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia e mercado.Vliege P, Lisowski V, Martinez J e Chreschatyski M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia e mercado.Vliege P, Lisowski V, Martinez J e Khreschatsky M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia e mercado. Descubrimento de fármacos. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD e Shen, Y. Cromatografía líquida proteómica avanzada. Xie, F., Smith, RD e Shen, Y. Cromatografía líquida proteómica avanzada.Véxase F., Smith RD e Shen Yu. Cromatografía líquida proteómica avanzada. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced protein composition 液相色谱。Véxase F., Smith RD e Shen Yu. Cromatografía líquida proteómica avanzada.J. Cromatografía. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. A cromatografía líquida-espectrometría de masas avanzada é capaz de combinar metabolómica e proteómica de ampla base. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM e Salisbury, JJ O papel da UHPLC no desenvolvemento farmacéutico. Chesnut, SM e Salisbury, JJ O papel da UHPLC no desenvolvemento farmacéutico.Chesnut, SM e Salisbury, JJ O papel da UHPLC no desenvolvemento farmacéutico.Chesnut, SM e Salisbury, JJ O papel da UHPLC no desenvolvemento de fármacos. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. e Clausen, AM Aspectos fundamentais e prácticos da cromatografía líquida de ultraalta presión para separacións rápidas. Wu, N. e Clausen, AM Aspectos fundamentais e prácticos da cromatografía líquida de ultraalta presión para separacións rápidas.Wu, N. e Clausen, AM Aspectos fundamentais e prácticos da cromatografía líquida de alta presión para a separación rápida. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. e Clausen, AM Aspectos básicos e prácticos da cromatografía líquida a presión ultraalta para a separación rápida.Wu, N. e Clausen, AM Aspectos fundamentais e prácticos da cromatografía líquida de alta presión para a separación rápida.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA e Tchelitcheff, P. Uso da cromatografía líquida de ultrarrendemento no desenvolvemento farmacéutico. Wren, SA e Tchelitcheff, P. Uso da cromatografía líquida de ultrarrendemento no desenvolvemento farmacéutico.Ren, SA e Chelischeff, P. O uso da cromatografía líquida de ultra alta resolución no desenvolvemento farmacéutico. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA e Tchelitcheff, P.Ren, SA e Chelischeff, P. Aplicación da cromatografía líquida de ultrarrendemento no desenvolvemento de fármacos.J. Cromatografía. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Un hidroxel macroporoso monolítico derivado dunha emulsión de aceite en auga cunha fase interna elevada para a purificación eficiente do enterovirus 71. Proxecto Chemical. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. e Wilkins, JA O papel da cromatografía líquida na proteómica. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. e Wilkins, JA O papel da cromatografía líquida na proteómica.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. e Wilkins, JA. O papel da cromatografía líquida na proteómica. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. e Wilkins, JA. O papel da cromatografía líquida na proteómica.J. Cromatografía. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Novas tendencias nas separacións por cromatografía líquida en fase inversa de péptidos e proteínas terapéuticos: teoría e aplicacións. & Guillarme, D. Novas tendencias nas separacións por cromatografía líquida en fase inversa de péptidos e proteínas terapéuticos: teoría e aplicacións. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жомощью жомфифифих тромих с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Novas tendencias na separación de péptidos e proteínas terapéuticos mediante cromatografía líquida de fase inversa: teoría e aplicacións. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 e Guillarme, D.e Guillarmé, D. Novas tendencias na separación de péptidos e proteínas terapéuticos mediante cromatografía líquida de fase inversa: teoría e aplicacións.J. Pharm. Ciencias Biomédicas. ano. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE e Gebler, JC. Separación bidimensional de péptidos usando o sistema RP-RP-HPLC con diferente pH na primeira e segunda dimensión de separación. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE e Gebler, JC. Separación bidimensional de péptidos usando o sistema RP-RP-HPLC con diferente pH na primeira e segunda dimensión de separación.Gilar M., Olivova P., Dali AE e Gebler JK. Separación bidimensional de péptidos empregando o sistema RP-RP-HPLC con diferente pH na primeira e segunda dimensión de separación.Gilar M., Olivova P., Dali AE e Gebler JK Separación bidimensional de péptidos empregando diferentes valores de pH na primeira e segunda dimensión de separación mediante o sistema RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Investigación da transferencia de masa e as características cinéticas de columnas de cromatografía de alta resolución recheas con partículas C18 totalmente porosas e superficialmente porosas menores de 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tendencias recentes e desafíos analíticos no illamento, identificación e validación de péptidos bioactivos vexetais. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Paisaxe proteómica do reino da vida. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Postratamento de péptidos terapéuticos mediante cromatografía líquida preparativa. Molecules (Basel, Suíza) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. e Geng, X. Cromatografía de modo mixto e as súas aplicacións aos biopolímeros. Yang, Y. e Geng, X. Cromatografía de modo mixto e as súas aplicacións aos biopolímeros.Yang, Yu. e Geng, X. Cromatografía de modo mixto e a súa aplicación a biopolímeros. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. e Geng, X. Cromatografía de modo mixto e a súa aplicación en biopolímeros.Yang, Yu. e Gene, X. Cromatografía de modo mixto e a súa aplicación a biopolímeros.J. Cromatografía. A 1218(49), 8813–8825 (2011).