Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) é unha planta leguminosa utilizada para a produción de alimentos e a mellora do solo.A expansión global da NLL como cultivo atraeu moitos fungos patóxenos, incluíndo a antracnose do lupino, que causa a devastadora enfermidade da antracnose.Dous alelos, Lanr1 e AnMan, que confiren unha maior resistencia, utilizáronse na reprodución de NLL, pero os mecanismos moleculares subxacentes seguen sendo descoñecidos.Neste estudo, empregáronse os marcadores Lanr1 e AnMan para examinar mostras europeas de NLL.A proba da vacina nun ambiente controlado confirmou a eficacia de ambos doadores resistentes.Realizouse un perfil de expresión xénica diferencial en liñas representativas resistentes e susceptibles.A resistencia á antracnose asociouse coa sobreexpresión dos termos de ontoloxía xenética "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" e "GO:0015979 Photosynthesis".Ademais, a liña Lanr1(83A:476) mostrou unha reprogramación significativa do transcriptoma rapidamente despois da inoculación, mentres que as outras liñas mostraron un atraso nesta resposta dunhas 42 horas.As respostas de defensa están asociadas cos xenes TIR-NBS, CC-NBS-LRR e NBS-LRR, 10 proteínas implicadas na patoxénese, proteínas de transferencia de lípidos, endoglucano-1,3-β-glucosidasa, proteínas da parede celular ricas en glicina e xenes procedentes da vía reactiva do osíxeno.As primeiras respostas a 83A:476, incluída a supresión coidadosa dos xenes asociados á fotosíntese, coincidiron cunha protección exitosa durante a fase de crecemento vexetativo da bioloxía dos fungos, o que suxire que un efector desencadea a inmunidade.A reacción de Mandeloop é máis lento, como o arrastre horizontal xeral.
O altramuz de folla estreita (NLL, Lupinus angustifolius L.) é un cereal rico en proteínas orixinario da rexión do Mediterráneo occidental1,2.Actualmente cultívase como alimento para animais e humanos.Tamén se considera esterco verde nos sistemas de rotación de cultivos debido á fixación de nitróxeno por bacterias fixadoras de nitróxeno simbióticas e á mellora global da estrutura do solo.NLL sufriu un rápido proceso de domesticación no último século e aínda está baixo unha alta presión de reprodución3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Co cultivo xeneralizado de NLL, a sucesión de fungos patóxenos desenvolveu novos nichos agrícolas e provocou novas enfermidades que destruían os cultivos. O máis destacable para os agricultores e criadores de altramuz foi a aparición da antracnose, causada polo fungo patóxeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O máis destacable para os agricultores e criadores de altramuz foi a aparición da antracnose, causada polo fungo patóxeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров e селекционеров люпина было появление антракнозав, паиболее примечательным антракнозого ибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O máis notable para os agricultores e criadores de altramuz foi a aparición da antracnose causada polo fungo patóxeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现，它是由眗埅菌Colletenberg, Lupinin, Lupini iler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现它是现它是现它是现它是由眵hum) d。1 Наиболее поразительным для фермеров e селекционеров люпина является появление антракнозогозонакнозозонеров грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O máis rechamante para os agricultores e criadores de altramuz é a aparición da antracnose causada polo fungo patóxeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Os primeiros informes da enfermidade proviñan de Brasil e Estados Unidos, e os síntomas típicos apareceron en 1912 e 1929 respectivamente.Non obstante, despois duns 30 anos, o patóxeno foi designado como Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .e H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。e H. Schlenk, .A fenotipificación preliminar da enfermidade feita a mediados do século XX mostrou certa resistencia nas accesións de NLL e de altramuz amarelo (L. luteus L.), pero todas as accesións de altramuz branco (L. albus L.) probadas foron altamente susceptibles15,16.Os estudos demostraron que o desenvolvemento da antracnose está asociado a un aumento da precipitación (humidade do aire) e da temperatura (no intervalo de 12-28 °C), o que leva a unha violación da resistencia a temperaturas máis altas17, 18. De feito, o tempo necesario para que xerminan os conidios e comeza a enfermidade foi catro veces máis curto a 24 °C (12 horas) 12 °C en condicións de humidade alta (12 °C) que a 12 °C (12 horas) de humidade alta (19 °C).Así, o quecemento global en curso levou á propagación da antracnose.Porén, a enfermidade foi observada en Francia (1982) e Ucraína (1983) como presaxio dunha ameaza inminente, pero ao parecer foi ignorada pola industria do lupino daquela20,21.Poucos anos despois, esta devastadora enfermidade estendeuse por todo o mundo e tamén afectou aos principais países produtores de lupino como Australia, Polonia ou Alemaña22,23,24.Tras un brote de antracnose a mediados da década de 1990, un amplo cribado deu lugar á identificación de varios doadores resistentes en mostras de NLL19.A resistencia do NLL á antracnose está controlada por dous alelos dominantes separados que se atopan en diferentes fontes de xermoplasma: Lanr1 no cultivar Tanjil e Wonga e AnMan no cultivar.Mandalay 25, 26. Estes alelos complementan os marcadores moleculares que apoian a selección de xermoplasma resistente nos programas de reprodución25,26,27,28,29,30.A liña de reprodución resistente 83A:476 que leva o alelo Lanr1 cruzouse coa liña silvestre susceptible P27255 para obter unha poboación RIL segregada para a resistencia á antracnose, o que permitiu asignar o locus Lanr1 ao cromosoma NLL-1131, 32, 33. a localización dos tres alelos no mesmo cromosoma (NLL-11), pero en posicións diferentes29,34,35.Non obstante, debido ao pequeno número de RIL e á gran distancia xenética entre os marcadores e os alelos correspondentes, non se poden extraer conclusións fiables sobre os seus xenes subxacentes.Por outra banda, o uso da xenética inversa nos altramuces resulta difícil debido ao seu baixo potencial de rexeneración, o que fai complicada a manipulación xenética37.
O desenvolvemento de xermoplasma domesticado que leva o alelo desexado en estado homocigoto, como 83A:476 (Lanr1) e Mandelup (AnMan), abriu a porta ao estudo da resistencia á antracnose ante a presenza de combinacións opostas de alelos en poboacións silvestres.Posibilidades dos mecanismos moleculares.Comparar respostas de defensa xeradas por xenotipos específicos.Este estudo avaliou a resposta transcriptómica precoz da LNN á vacinación contra C. lupini.En primeiro lugar, un panel de xermoplasma europeo NLL que contén 215 liñas foi cribado usando marcadores moleculares que marcan os alelos Lanr1 e AnMan.A continuación realizouse a fenotipificación da antracnose en 50 liñas de NLL, previamente seleccionadas para marcadores moleculares, en condicións controladas.En base a estes experimentos, seleccionáronse catro liñas que difiren na resistencia á antracnose e na composición alélica Lanr1/AnMan para o perfil de expresión xenética de defensa diferencial mediante dous enfoques complementarios: secuenciación de ARN de alto rendemento e cuantificación por PCR en tempo real.
O cribado dun conxunto de xermoplasma NLL (N = 215) con marcadores Lanr1 (Anseq3 e Anseq4) e AnMan (Anseq4) e AnMan (AnManM1) mostrou que só unha liña (95726, preto de Salamanca-b) amplifica o alelo de "resistencia" para todos os marcadores, mentres que "presenza a proporción de 18 alelos sensibles á proporción de 173 alelos". ,5%) liñas.Trece liñas produciron dous alelos "resistentes" do marcador Lanr1 e 8 liñas produciron alelos "resistentes" de Lanr1.marcador.O alelo de "resistencia" do marcador AnMan (Táboa complementaria S1).Dúas liñas eran heterocigotas para o marcador Anseq3 e unha heterocigota para o marcador AnManM1.42 liñas (19,5%) levaban fases opostas dos alelos Anseq3 e Anseq4, o que indica unha alta frecuencia de recombinación entre estes dous loci.Os fenotipos da antracnose en condicións controladas (Táboa complementaria S2) revelaron unha variabilidade na resistencia dos xenotipos probados, que se reflectiu na gravidade da antracnose.As diferenzas nas puntuacións medias foron de 1,8 (moderadamente resistente) a 6,9 (susceptible) e as diferenzas de peso das plantas variaron de 0,62 (susceptible) a 4,45 g (resistente). Houbo unha correlación significativa entre os valores observados en dúas réplicas do experimento (0,51 para as puntuacións de gravidade da enfermidade, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P <0,0001), así como entre estes dous parámetros (-0,59 e -0,77, P <0,0001). Houbo unha correlación significativa entre os valores observados en dúas réplicas do experimento (0,51 para as puntuacións de gravidade da enfermidade, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P <0,0001), así como entre estes dous parámetros (−0,59 e -0,77, P <0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями втяжести болезни, P = 0,00017 e 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими даву, 7ми даву, 7ми пару, 7ми Р < 0,0001) 0,0001). Atopouse unha correlación significativa entre os valores observados en dúas repeticións do experimento (0,51 para as puntuacións de gravidade da enfermidade, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P <0,0001), así como entre estes dous parámetros (-0,59 e -0,77, P <0,00001)).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分度评分度评分木显着相关性（疾病严重程度评分1︺00.物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77） P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 严重 程度 诺 丆 丄 丆 诺 丄1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（（，及 两 个 参数 之间 （（（（（（，及 两 个 参数 之间 （（（（（（，59.和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух потцторя (значениями) аболевания 0,51, P = 0,00017 e масса растения 0,61, P <0,0001), e между этими двумя параметрения 0,61, P <0,0001), e между этими двумя параметрами двумя параметрами параметрами параметрами параметрами (-1,00,509) . Houbo unha correlación significativa entre os valores observados por duplicado (puntuación de gravidade da enfermidade 0,51, P = 0,00017 e peso da planta 0,61, P <0,0001) e entre estes dous parámetros (-0,59 e -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).Os síntomas típicos que se observan nas plantas susceptibles inclúen a torsión e torsión do talo que se asemella a unha estrutura de "arco de pastor", seguido de lesións ovaladas con esporozoitos laranxa/rosa (figura complementaria 1).As accesións australianas que levan os xenes Lanr1 (83A:476 e Tanjil) e AnMan (Mandelup) son moderadamente resistentes, 0,0331 e 0,0036).Algunhas liñas que tamén levan alelos Lanr1 e/ou AnMan "resistentes" mostran síntomas da enfermidade.
Curiosamente, algunhas liñas de NLL sen ningún alelo marcador "resistente" revelaron un alto nivel de resistencia á antracnose (comparable ou superior ao dos xenotipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos parámetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para puntuación e valor de 0,0001 para o peso da planta) e 0,009 p. 001 para puntuación e non significativo para o peso). Curiosamente, algunhas liñas de NLL sen ningún alelo marcador "resistente" revelaron un alto nivel de resistencia á antracnose (comparable ou superior ao dos xenotipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos parámetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para puntuación e valor de 0,0001 para o peso da planta) e 0,009 p. 001 para puntuación e non significativo para o peso). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллони вы золокавы зокого-либо ь устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таки0 Boregine, такни 0 1 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) e по значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) e по-549ние P-549ние ,0001 для оценки и незначимо для массы). Curiosamente, varias liñas de NLL sen ningún alelo marcador "resistente" mostraron un alto nivel de resistencia á antracnose (comparable ou superior ao dos xenotipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos parámetros), Bojar (valor P < 0,0001 para a avaliación e valor B - 0,0001 para a poboación da planta e < 0,0001 para o peso da planta e < 0,04901 para a poboación da planta. 0001 para avaliación e non significativo para peso).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭疽An Lar基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分万0.0.0分万0.0.0. 01）和种群B-549/79b（得分P 值<0,0001，重量不显着）. É interesante que algúns sistemas NLL que non teñen ningún marcador "antixénico" mostren unha alta resistencia horizontal (equivalente aos xenes Lanr1 ou AnMan ou superior), como Boregine (ambos parámetros P < 0,0001), Bojar (valor P < 0,0001, peso da planta 0,001) e cepa B-549/1, peso non significativo (peso B-549/190b). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентносторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности в спокости в сполоста стойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (знирач делипов) 0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) e популяция B-549/79b (оценка P-значение 0,0001) a). Curiosamente, algunhas liñas de NLL que carecían de alelos marcadores de "resistencia" mostraron altos niveis de resistencia á antracnose (comparables ou superiores aos xenotipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P para ambos parámetros <0,0001), Bojar (valor P <0,0001, peso da planta 0,70-549) e valor B0. 01, peso non significativo).Este fenómeno suxire a posibilidade dunha nova fonte xenética de resistencia, o que explica a falta de correlación observada entre os xenotipos marcadores e os fenotipos da enfermidade (valores P de ~0,42 a ~0,98).Así, a proba de Kolmogorov-Smirnov mostrou que os datos sobre a resistencia á antracnose distribuíronse aproximadamente normalmente para as puntuacións (valores P 0,25 e 0,11) e a masa da planta (valores P 0,47 e 0,55), o que suxire que a hipótese de que están implicados máis alelos que Lanr1 e AnMan.
En función dos resultados do cribado da resistencia á antracnose, seleccionáronse 4 liñas para a análise do transcriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup e Population 22660. Estas liñas foron probadas de novo para determinar a resistencia ao ántrax en experimentos de inoculación mediante secuenciación de ARN, sempre que fosen as mesmas que na proba anterior.Os valores de puntuación foron os seguintes: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) e poboación 22660 (6,11 ± 1,29).
O protocolo Illumina NovaSeq 6000 logrou unha media de 40,5 pares Mreads por mostra (29,7 a 54,4 Mreads) (Táboa complementaria S3).As puntuacións de aliñamento na secuencia de referencia oscilaron entre o 75,5% e o 88,6%.A correlación media dos datos de reconto de lecturas entre as variantes experimentais entre as réplicas biolóxicas variou entre 0,812 e 0,997 (media 0,959). Dos 35.170 xenes analizados, 2.917 non revelaron expresión, e os outros 4.785 xenes expresáronse a un nivel insignificante (media base < 5). Dos 35.170 xenes analizados, 2.917 non revelaron expresión, e os outros 4.785 xenes expresáronse a un nivel insignificante (media base < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов слсинов экспрессии начительном уровне (базовое среднее <5). Dos 35.170 xenes analizados, 2.917 non mostraron expresión, e os 4.785 xenes restantes expresáronse nun nivel insignificante (media base <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以帜表达，其他因的表达可以帜表达值< 5).35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имелсунч имелсунч имелись прессию (базовое среднее значение <5). Dos 35.170 xenes analizados, 2.917 non se expresaron e os 4.785 xenes restantes tiñan unha expresión insignificante (media base <5).Así, o número de xenes considerados expresados ​​(media base ≥ 5) durante o experimento foi de 27.468 (78,1%) (Táboa complementaria S4).
Desde o primeiro momento, todas as liñas de NLL responderon á inoculación de C. lupini (cepa Col-08) reprogramando o transcriptoma (táboa 1), con todo, observáronse diferenzas significativas entre as liñas.Así, a liña de resistencia 83A:476 (que leva o xene Lanr1) mostrou unha reprogramación significativa do transcriptoma no primeiro momento (6 hpi) cun aumento de 31-69 veces no número de xenes ascendentes e descendentes illados en comparación con outros puntos de tempo neste momento.Ademais, este pico foi de curta duración, xa que a expresión duns poucos xenes permaneceu significativamente alterada no segundo punto temporal (12 hpi).Curiosamente, Boregine, que tamén mostrou un alto nivel de resistencia na proba de enxerto, non sufriu unha reprogramación transcripcional tan masiva durante o experimento.Non obstante, o número de xenes expresados ​​diferencialmente (DEG) foi o mesmo para Boregine e 83A:476 a 12 HPI.Tanto Mandelup como a poboación 22660 mostraron picos de DEG no último punto temporal (48 l/s), o que indica un atraso relativo nas respostas de defensa.
Debido a que 83A:476 sufriu unha reprogramación masiva do transcriptoma en resposta a C. lupini a 6 HPI en comparación con todas as outras liñas, ~ 91% dos DEG observados neste momento eran específicos da liñaxe (Fig. 1).Non obstante, houbo algunha superposición nas primeiras respostas entre as liñas de estudo, xa que o 68,5%, 50,9% e 52,6% DEG en Boregine, Mandelup e a poboación 22660, respectivamente, superpoñíanse cos atopados en 83A:476 en certos momentos.Non obstante, estes DEG representaron só unha pequena fracción (0,97-1,70%) de todos os DEG detectados actualmente usando 83A:476.Ademais, 11 DEG de todas as liñas eran coherentes neste momento (Táboas complementarias S4-S6), incluíndo compoñentes comúns das respostas de defensa das plantas: proteína de transferencia de lípidos (TanjilG_32225), encima endoglucano-1,3-β-glucósido (TanjilG_23384), dúas proteínas inducibles polo estrés (TanjilG_23384). 531), proteína básica de látex (TanjilG_32352) e dúas proteínas estruturais da parede celular ricas en glicina (TanjilG_19701 e TanjilG_19702).Tamén houbo unha superposición relativamente alta nas respostas do transcriptoma entre 83A:476 e Boregine a 24 HPI (total 16-38% DEG) e entre Mandelup e Poboación 22660 a 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagrama de Venn que mostra o número de xenes expresados ​​de forma diferencial (DEG) en liñas de altramuz de folla estreita (NLL) inoculadas con Colletotrichum lupini (cepa Col-08 obtida en campos de altramuz en Wierzhenice, Polonia, 1999).As liñas NLL analizadas foron: 83A:476 (resistente, portadora do alelo Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo AnMan) e poboación 22660 (moi susceptible).A abreviatura hpi significa horas despois da vacinación.Os valores cero foron eliminados para simplificar o gráfico.
Analizouse o conxunto de xenes sobreexpresados ​​a 6 hpi para determinar a presenza de dominios de xenes R canónicos (Táboa complementaria S7).Este estudo revelou a indución do transcriptoma de xenes clásicos de resistencia á enfermidade con dominios NBS-LRR só en 83A:476.Este conxunto estaba formado por un xene TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinco xenes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 e tanjilg_16162), e catro NBS-LR6 e Catro NBS-LR61 e Catro Tanjilg_22773 jilg_16162), así como Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) e Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Todos estes xenes teñen dominios canónicos dispostos en secuencias conservadas.Ademais dos xenes do dominio NBS-LRR, varias RLL quinases foron activadas a 6 hpi, a saber, unha en Boregine (TanjilG_19877), dúas en Mandelup (TanjilG_07141 e TanjilG_19877) e na poboación 22660 (TanjilG_0314 e TanjilG_09877) 476.
Os xenes cunha expresión significativamente alterada en resposta á inoculación con C. lupini (cepa Col-08) foron sometidos a análise de enriquecemento de Ontoloxía xenética (GO) (Táboa complementaria S8). O termo do proceso biolóxico máis frecuentemente sobrerrepresentado foi "GO:0006952 defense response", que apareceu en 6 de cada 16 (tempo × liña) combinacións con alta significación (valor P < 0,001) (Fig. 2). O termo do proceso biolóxico máis frecuentemente sobrerrepresentado foi "GO:0006952 defense response", que apareceu en 6 de cada 16 (tempo × liña) combinacións con alta significación (valor P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 термином биологического процесса был «GO: 0006952» й появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рисокой значимостью). O termo do proceso biolóxico máis frecuentemente sobrerrepresentado foi "GO:0006952 defense response", que apareceu en 6 de 16 (tempo × liñaxe) combinacións con alta significación (valor P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（縿魗（縶魗（时魗（滶反应”个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. O termo do proceso biolóxico máis representativo é "GO:0006952 resposta de defensa", que aparece en 6 das 16 combinacións (时间×线), con alta significación (valor P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Response», Defense Response процесса в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). O termo de proceso biolóxico máis frecuentemente sobrerrepresentado foi "GO: 0006952 Defense Response", que apareceu en 6 de cada 16 combinacións (tempo × liña) con alta significación (valor P < 0,001) (Fig. 2).Este termo estivo sobrerrepresentado en dous momentos en 83A: 476 e Boregine (6 e 24 hpi) e nun momento en Mandelup e Poboación 22660 (12 e 6 hpi, respectivamente).Este é un resultado esperado, destacando a resposta antifúngica das liñas resistentes.Ademais, 83A:476 respondeu a C. lupini inducindo rapidamente xenes relacionados co estalido oxidativo representado polo termo "proceso redox GO:0055114", indicando unha resposta de defensa específica, mentres que Boregine revelou respostas de defensa específicas, relacionadas co termo "GO".:0006950 Resposta ao estrés”.A poboación 22660 activou a resposta de resistencia horizontal que inclúe metabolitos secundarios, destacando o número excesivo de termos "GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis" e "GO:0006722 Process of triterpene metabolism" (ambos termos pertencen ao mesmo conxunto de xenes), tendo en conta os resultados da análise de enriquecemento e estabilidade de termos entre o enriquecemento e a estabilidade de Mandel. 22660. Ademais, a reacción precoz 83A:476 (6 hpi) e a reacción retardada Mandelup e Poboación 22660 inclúen o termo GO:0015979 "fotosíntese" e outros procesos biolóxicos relacionados.
Os termos de ontoloxía de xenes de bioproceso seleccionados na anotación de xenes expresados ​​de forma diferencial durante as respostas do transcriptoma de lupino de folla estreita (NLL) inoculados con lupino de ántrax (cepa Col-08 obtida en campos de altramuz en Wierzhenice, Polonia, en 1999) son moi esaxerados.As liñas NLL analizadas foron: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homocigoto AnMan) e poboación 22660 (susceptible).
Dado que este estudo tiña como obxectivo identificar xenes que contribúen á resistencia á antracnose, os xenes asignados aos termos GO "GO: 0006952 Defensive responses" e "GO: 0055114 Redox processes" analizáronse con cortes xa que as medias de referencia ≥ 30 con polo menos unha liña.× punto no tempo que combina valores estatisticamente significativos de log2 (cambio de veces).O número de xenes que cumpriron estes criterios foi de 65 para GO:0006952 e 524 para GO:0055114.
83A:476 revelou dous picos DEG anotados co termo GO:0006952, o primeiro a 6 xenes por polgada (64 xenes, regulación ascendente e descendente) e o segundo a 24 xenes por polgada (15 xenes, só regulación ascendente).Boregine tamén mostrou que GO:0006952 alcanzou o seu punto máximo no mesmo momento, pero con menos DEG (11 e 8) e activación preferente.Mandeloop mostrou dous picos de GO:0006952 a 12 e 48 HPI, ambos portadores de 12 xenes (o primeiro con xenes activadores e o segundo só con xenes supresores), mentres que a poboación de 22660 a 6 HPI (13 xenes) tivo un maior predominio do pico de aumento.regulación.Cómpre sinalar que o 96,4% de GO:0006952 DEG nestes picos tiveron o mesmo tipo de resposta (arriba ou abaixo), o que indica unha superposición significativa nas respostas de defensa a pesar das diferenzas no número de xenes implicados.O maior grupo de secuencias relacionadas co termo GO:0006952 codifica a proteína 22 da mensaxe asociada ao estrés de fame (SAM22-like), que pertence ao clado proteico da proteína asociada á patoxénese (PR-10) de clase 10 e ao látex da proteína central.proteína similar (similar a MLP) (fig. 3).Os dous grupos diferían na natureza da expresión e na dirección da resposta.Os xenes que codifican proteínas semellantes a SAM22 mostraron unha indución consistente e significativa nos primeiros momentos (6 ou 12 hpi) e xeralmente non responderon ao final do experimento (48 hpi), mentres que as proteínas tipo MLP mostraron coordinación a 6 hpi.hpi.83A:476 e Mandelup a 48 hp/in, case todos os demais puntos de datos non responderon.Ademais, as diferenzas nos perfís de expresión dos xenes de proteínas similares a SAM22 seguiron a variabilidade observada na resistencia á antracnose, xa que as liñas máis resistentes tiñan máis puntos de tempo que inducían estes xenes de forma significativa que os xenes máis susceptibles.Outro xene PR-10 tipo LlR18A/B mostrou un patrón de expresión moi similar ao xene da proteína tipo SAM22.
Identificáronse os principais compoñentes do termo do proceso biolóxico "GO:0006952 Defense Response" e os patróns de expresión dos xenes candidatos dos alelos Lanr1 e AnMan.A escala Log2 representa valores log2 (cambio de veces) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de altramuz, Wizhenica, Polonia, 1999) e plantas control (inoculadas simuladamente) ao mesmo tempo.Analizáronse as seguintes liñas de lupino de folla estreita: 83A:476 (resistente, que leva o alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos), Mandelup (moderadamente resistente, que porta o alelo homocigoto AnMan) e Poboación 22660 (susceptible).
Ademais, avaliáronse os perfís de expresión dos xenes candidatos de ARN-seq Lanr1 (TanjilG_05042) e AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3).O xene TanjilG_05042 mostrou unha resposta significativa (activación) en 83A:476 só no primeiro momento (6 hpi), mentres que TanjilG_12861 foi significativo en Mandeloop só en dous momentos: 6 hpi (regulación abaixo) e 24 hpi (6 hpi).Con.).axustable) ).
Os xenes máis sobreexpresados ​​no termo GO:0055114 "proceso redox" foron os xenes que codifican as proteínas do citocromo P450 e a peroxidase (Fig. 4).Para mostras illadas de 83A:476 a 6 HPI, os valores máximos ou mínimos de log2 (cambio de veces) (para o 86,6% dos xenes) observáronse en xeral entre plantas inoculadas e control, destacando a alta resposta deste xenotipo ao sexo inoculado.83A:476 mostrou o GO máis significativo: 0055114 DEG a 6 hpi (503 xenes), mentres que o resto das liñas a 48 hpi (Boregine, 31 xenes; Mandelup, 85 xenes; e Poboación 22660, 78 xenes)).Na maioría dos xenes da familia GO:0055114 observáronse dous tipos de respostas á vacinación (activación e inhibición).Curiosamente, ata o 97,6% dos DEG identificados para o termo GO: 0055114 en Mandelupe a 48 hp. Estas observacións suxiren que, a pesar da escala significativamente menor (é dicir, o número de xenes redox mutados, 85 fronte a 503), o patrón de respostas atrasadas do transcriptoma é similar á resposta precoz de mandeloseup 3:87.En Boregine e Poboación 22660, esta converxencia é menor no 51,6% e 75,6%, respectivamente.
Reveláronse os patróns de expresión dos principais compoñentes do termo do proceso biolóxico "GO:0055114 Redox process".A escala Log2 representa valores log2 (cambio de veces) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de altramuz, Wizhenica, Polonia, 1999) e plantas control (inoculadas simuladamente) ao mesmo tempo.Analizáronse as seguintes liñas de lupino de folla estreita: 83A:476 (resistente, que leva o alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos), Mandelup (moderadamente resistente, que porta o alelo homocigoto AnMan) e Poboación 22660 (susceptible).
83A:476 As respostas transcriptómicas á inoculación con C. lupini (cepa Col-08) tamén incluíron o silenciamento coordinado de xenes atribuídos ao termo GO:0015979 "fotosíntese" e outros procesos biolóxicos relacionados (FIG. 5).Este conxunto GO:0015979 DEG contiña 105 xenes que foron significativamente reprimidos a 6 hpi en 83A:476.Neste subconxunto, 37 xenes tamén foron regulados á baixa en Mandelup a 48 HPI e 35 ao mesmo tempo na poboación de 22660, incluíndo 19 DEG comúns a ambos xenotipos.Non se activou significativamente ningún DEG relacionado co termo GO: 0015979 en ningunha combinación (liña x tempo).
Reveláronse os patróns de expresión dos principais compoñentes do termo do proceso biolóxico "GO:0015979 Fotosíntese".A escala Log2 representa valores log2 (cambio de veces) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de altramuz, Wizhenica, Polonia, 1999) e plantas control (inoculadas simuladamente) ao mesmo tempo.Analizáronse as seguintes liñas de lupino de folla estreita: 83A:476 (resistente, que leva o alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos), Mandelup (moderadamente resistente, que porta o alelo homocigoto AnMan) e Poboación 22660 (susceptible).
Con base nos resultados da análise de expresión diferencial e presumiblemente implicado nas respostas de defensa contra fungos patóxenos, seleccionouse este conxunto de sete xenes para a cuantificación dos perfís de expresión mediante PCR en tempo real (Táboa complementaria S9).
O xene da proteína putativo TanjilG_10657 foi inducido significativamente en todas as liñas e puntos de tempo estudados en comparación coas plantas control (mímicas) (Táboas complementarias S10, S11).Ademais, o perfil de expresión de TanjilG_10657 mostrou unha tendencia crecente ao longo do experimento para todas as liñas.A poboación 22660 mostrou a maior sensibilidade de TanjilG_10657 á inoculación cunha activación de 114 veces e o maior nivel de expresión relativa (4,4 ± 0,4) a 24 HPI (Fig. 6a).O xene da proteína PR10 LlR18A TanjilG_27015 tamén mostrou activación en todas as liñas e puntos de tempo, con significación estatística na maioría dos puntos de datos (Fig. 6b).Do mesmo xeito que TanjilG_10657, o nivel de expresión relativo máis alto de TanjilG_27015 observouse na poboación de 22660 inoculadas a 24 HPI (19,5 ± 2,4).O xene da endoquitinase ácida TanjilG_04706 foi significativamente regulado en todas as liñas e en todos os puntos de tempo, excepto para Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Foi fortemente inducido no primeiro punto temporal (6 HPI) en 83A:476 (en 10,5 veces) e aumentou moderadamente noutras liñas (en 6,6-7,5 veces).Durante o experimento, a expresión de TanjilG_04706 mantívose en niveis similares en 83A:476 e Boregine, mentres que en Mandelup e Poboación 22660 aumentou significativamente, alcanzando valores relativamente altos (5,9 ± 1,5 e 6,2 ± 1,5, respectivamente).O xene semellante á endoglucano-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 mostrou unha alta activación nos dous primeiros puntos de tempo (6 e 12 hpi) en todas as liñas excepto na poboación 22660 (Fig. 6d).Os niveis de expresión relativa máis altos de TanjilG_23384 observáronse no segundo punto temporal (12 hpi) en Mandelup (2,7 ± 0,3) e 83A:476 (1,5 ± 0,1).A 24 HPI, a expresión de TanjilG_23384 foi relativamente baixa en todas as liñas estudadas (de 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Perfís de expresión de xenes seleccionados (ag) revelados por PCR cuantitativa.Os números 6, 12 e 24 representan horas despois da vacinación.Os xenes LanDExH7 e LanTUB6 utilizáronse para a normalización e LanTUB6 para a calibración entre series.As barras de erro representan a desviación estándar baseada en tres réplicas biolóxicas, cada unha das cales é a media de tres réplicas técnicas. A significación estatística das diferenzas nos niveis de expresión entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida en 1999 do campo de altramuz en Wierzenica, Polonia) e as plantas control (inoculadas simuladamente) están marcadas por riba dos puntos de datos (*valor P < 0,05, **Valor P ≤ 0.001, *** 0.00. A significación estatística das diferenzas nos niveis de expresión entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida en 1999 do campo de altramuz en Wierzenica, Polonia) e as plantas control (inoculadas simuladamente) están marcadas por riba dos puntos de datos (*valor P < 0,05, **Valor P ≤ 0.001, *** 0.00. Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, му-ш прессии 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) расчд мными расто и данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). As diferenzas estatísticamente significativas nos niveis de expresión entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida en 1999 nun campo de altramuz en Wierzhenice, Polonia) e as plantas de control (inoculadas simuladamente) obsérvanse por riba dos puntos de datos (* valor P < 0,05, ** valor P ≤ 0,01, ≤ 0,0 .接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟照（模拟）槍騡拟掉掉的羽扇豆田获得）水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值 ≤ 0,001)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 簩 波兰 ）平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, пшлированными, пш08тне олей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированы ными расид мы ными тастрольными) ми данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). As diferenzas estatísticamente significativas nos niveis de expresión entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida a partir de campos de lupino en Verzhenice, Polonia, en 1999) e as plantas de control (inoculadas simuladamente) obsérvanse por riba dos puntos de datos (* valor P < 0,05, ** valor P ≤ 0-01, ≤ 0-01, *** 0-0 .As liñas NLL analizadas foron: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homocigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homocigoto AnMan), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos) e poboación 22660 (susceptible).
O xene candidato TanjilG_05042 no locus Lanr1 mostrou un patrón de expresión marcadamente diferente dos perfís obtidos dos estudos de ARN-seq (Fig. 6e).Observouse unha activación significativa deste xene en Mandelup e na poboación 22660 (ata 39,7 e 11,7 veces, respectivamente), dando como resultado niveis de expresión relativamente altos (ata 1,4 ± 0,14 e 7,2 ± 1,3, respectivamente).83A:476 tamén revelou algunha regulación positiva do xene TanjilG_05042 (ata 3,8 veces), porén, os niveis de expresión relativos acadados (0,044 ± 0,002) foron máis de 30 veces inferiores aos observados en Mandelup e na poboación de 22660.analizados por qPCR mostraron diferenzas significativas nos niveis de expresión entre xenotipos en variantes simuladas de vacinación (control), chegando a unha diferenza de 58 veces entre as poboacións 22660 e 83A:476, así como entre as poboacións 22660 e 22660. Conseguiuse unha diferenza dobre entre Boregine e Mandalup.
O xene candidato no locus AnMan, TanjilG_12861, activouse en resposta á vacinación en 83A:476 e Mandelup, era neutral na poboación de 22660 e estaba regulado á baixa en Boregine (Fig. 6f).A expresión relativa do xene TanjilG_12861 foi a máis alta no 83A inoculado: 476 (0,14±0,01).O xene da proteína de choque térmico de clase I de 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 mostrou niveis de expresión relativa máis baixos en todas as cepas e puntos de tempo estudados (Fig. 6g).O valor máis alto observouse a 24 HPI na poboación de 22660 (0,14 ± 0,02, un aumento de oito veces en resposta á vacinación).
A comparación dos perfís de expresión xénica (Fig. 7) revelou unha alta correlación entre TanjilG_10657 e outros catro xenes: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80.80) e TanjilG_05042 (r = 0,80.80) e _070,80.Tales resultados poden indicar a corregulación destes xenes durante as respostas de defensa.Os xenes TanjilG_12861 e TanjilG_23384 mostraron diferentes perfís de expresión con valores de coeficiente de correlación de Pearson máis baixos (de 0,08 a 0,43 e de -0,19 a 0,28, respectivamente) en comparación con outros xenes.
As correlacións entre os perfís de expresión xénica detectáronse mediante PCR cuantitativa.Analizáronse as seguintes liñas de lupino de folla estreita: 83A:476 (resistente, portador do alelo homocigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portador do alelo homocigoto AnMan), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos) e Poboación 22660 (susceptible).Calculáronse tres puntos de tempo (6, 12 e 24 horas despois da inoculación), incluíndo plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida en campos de altramuz en Wierzhenice, Polonia, en 1999) e plantas control (inoculadas simuladamente).A escala mostra o valor do coeficiente de correlación de Pearson.
En base aos datos obtidos a 6 cabalos de potencia por polgada, o WGCNA realizouse en 9981 DEG identificados comparando plantas inoculadas e control para centrarse nas respostas de defensa temperás (Táboa complementaria S12).Atopáronse vinte e dous módulos de xenes (clusters) con perfís de expresión correlacionados (positivos ou negativos) entre xenotipos e variantes experimentais. De media, os niveis de expresión xénica foron descendendo en orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 (en ambas as variantes, con todo, esta tendencia foi máis forte nas plantas control). De media, os niveis de expresión xénica foron descendendo en orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 (en ambas as variantes, con todo, esta tendencia foi máis forte nas plantas control). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 нденция была сильнее у контрольных растений). De media, os niveis de expresión xénica diminuíron na orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 (en ambas as variantes, con todo, esta tendencia foi máis forte nas plantas control).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22.660势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> poboación 22660 的 顺序 下降 （， 在 筌 在 筌 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 ция была сильнее у контрольных растений). De media, os niveis de expresión xénica diminuíron na serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 (sen embargo, en ambas as variantes, esta tendencia foi máis forte nas plantas control).A vacinación deu lugar a unha regulación positiva da expresión xénica, especialmente nos módulos 18, 19, 14, 6 e 1 (por orde decrecente de efecto), regulación negativa (p. ex. módulos 9 e 20) ou con efectos neutros (p. ex. módulos 11, 22, 8 e 13).A análise de enriquecemento de termos GO (Táboa complementaria S13) revelou "GO: 0006952 Respostas protectoras" para o módulo inoculado (18) coa máxima activación, incluíndo xenes analizados por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_10657, así como a maioría das fotos suprimidas). s módulos (9).O concentrador do módulo 18 (Fig. 8) identificouse como o xene TanjilG_26536 que codifica a proteína LlR18B tipo PR-10 e o concentrador do módulo 9 identificouse como o xene TanjilG_28955 que codifica a proteína PsbQ do fotosistema II.No módulo 22 (Fig. 9) atopouse un xene candidato de resistencia á antracnose Lanr1, TanjilG_05042, que está asociado cos termos "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" e "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA Templating" que leva o hub TanjilG_01212.o xene codifica o factor de transcrición do estrés térmico A-4a (HSFA4a).
Análise de rede ponderada da coexpresión xénica de módulos con termos de proceso biolóxico sobrerrepresentados "GO: 0006952 Defense responses".A ligadura simplificouse para destacar os catro xenes analizados mediante qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015).
Análise de rede ponderada da coexpresión xénica dun módulo cun termo de proceso biolóxico sobrerrepresentado "GO: 0006355: Regulación transcripcional, plantilla de ADN" e que leva un xene candidato de resistencia á antracnose Lanr1 TanjilG_05042.A ligadura simplificouse para illar o xene TanjilG_05042 e o xene central TanjilG_01212.
Os exames de resistencia á antracnose recollidos en Australia mostraron que a maioría dos cultivares liberados precozmente eran susceptibles;Kalya, Coromup e Mandelup foron descritos como moderadamente resistentes, mentres que Wonga, Tanjil e 83A:476 foron altamente resistentes26,27,31.tiña o mesmo alelo de resistencia, denominado Lanr1, e Coromup e Mandelup tiñan un alelo diferente, denominado AnMan10, 26, 39, mentres que Kalya transmitiu un alelo diferente., Lanr2.A detección da resistencia á antracnose en Alemaña deu lugar á identificación dunha liña resistente Bo7212 cun alelo candidato distinto de Lanr1, denominado LanrBo36.
O noso estudo revelou unha frecuencia moi baixa (aproximadamente un 6%) do alelo Lanr1 no xermoplasma probado.Esta observación é consistente cos resultados do cribado de xermoplasma de Europa do Leste utilizando os marcadores Anseq3 e Anseq4, que mostraron que o alelo Lanr1 só está presente en dúas liñas bielorrusas.Isto suxire que o alelo Lanr1 aínda non é moi utilizado polos programas de reprodución locais, a diferenza de Australia, onde é un dos alelos clave para a reprodución asistida por marcadores.Isto pode deberse ao menor nivel de resistencia proporcionado polo alelo Lanr1 en condicións de campo europeas en comparación co informe australiano.Ademais, estudos sobre a antracnose en áreas de alta precipitación en Australia demostraron que as respostas de resistencia mediadas polo alelo Lanr1 poden non ser eficaces en condicións meteorolóxicas que favorecen o crecemento e o desenvolvemento rápido do patóxeno19,42.De feito, no presente estudo, tamén se observaron algúns síntomas de antracnose en xenotipos portadores do alelo Lanr1, o que suxire que a resistencia pode desaparecer en condicións óptimas para o desenvolvemento de C. lupini.Ademais, son posibles interpretacións falsas positivas da presenza de marcadores Anseq3 e Anseq4, que están aproximadamente a 1 cM do locus Lanr1 28,30,43.
O noso estudo mostrou que 83A:476, portador do alelo Lanr1, respondeu á inoculación de C. lupini cunha reprogramación do transcriptoma a gran escala no primeiro momento analizado (6 hpi), mentres que en Mandelup, portador do alelo AnMan, as respostas transcriptómicas foron observadas moito máis tarde.(de 24 a 48 CV).Estas variacións temporais nas respostas de defensa están asociadas con diferenzas nos síntomas da enfermidade, o que destaca a importancia do recoñecemento precoz dos patóxenos para unha resposta exitosa á resistencia.Para infectar o tecido vexetal, as esporas de ántrax deben pasar por varias etapas de desenvolvemento na superficie do hóspede, incluíndo a xerminación, a división celular e a formación dun apresario.Un apéndice é unha estrutura infecciosa que se une á superficie do hóspede e facilita a penetración nos tecidos do hóspede.Así, as esporas de C. gloeosporioides no extracto de chícharo mostraron a primeira división do núcleo despois de 75-90 minutos de incubación, a formación dun tubo xerminal despois de 90-120 minutos e a supresión despois de 4 horas 45 .O mango C. gloeosporioides mostrou máis do 40% de xerminación de conidias despois de 3 horas de incubación e aproximadamente un 20% de formación de apresores despois de 4 horas.O xene CAP20 asociado á virulencia de C. gloeosporioides mostrou actividade transcripcional en conidios formadores de epífitas despois de 3,5 h de incubación en cera de superficie de aguacate con altas concentracións de proteína CAP20 despois de 4 h 46 min.Do mesmo xeito, a actividade dos xenes da biosíntese da melanina en C. trifolii foi inducida durante unha incubación de 2 horas seguida da formación dun apresario despois de 1 hora.Estudos de tecidos foliares demostraron que os amorodos inoculados con C. acutatum teñen unha primeira supresión a 8 hpi, mentres que os tomates inoculados con C. coccodes teñen unha primeira supresión a 4 hpi48,49.en gran medida coherente coa escala temporal de Colletotrichum spp.proceso infeccioso.As respostas de defensa rápida a 83A:476 suxiren a implicación de xenes de resistencia vexetal e de inmunidade activada por efectores (ETI) nesta liña, mentres que as respostas atrasadas de Mandelup apoian a hipótese 50 da inmunidade desencadeada por patróns moleculares microasociados (MTI). As primeiras respostas a 83A:476 e Mandelup.A superposición parcial entre xenes regulados á alza ou á baixa na resposta retardada tamén apoia este concepto, xa que a ETI adoita considerarse unha resposta MTI acelerada e mellorada que culmina na morte celular programada no lugar da infección, coñecida como shock anafiláctico 51,52 .
A maioría dos xenes atribuídos ao termo sobrerrepresentado Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" son os 11 homólogos da proteína 22 da mensaxe de xaxún inducida polo estrés (semellante á SAM22) e as sete principais tipos de proteínas do látex (MLP).-como as proteínas 31, 34, 43 e 423 mostraron semellanza de secuencia.Os xenes semellantes a SAM22 mostraron unha activación significativa que durou máis tempo, mostrando un aumento dos niveis de resistencia á antracnose (83A:476 e Boregine).Non obstante, os xenes parecidos a MLP foron regulados só nas liñas que levaban o alelo de resistencia candidato (83A:476/Lanr1 a 6 hpi e Mandelup/AnMan a 24 hpi).Cómpre sinalar que todos os homólogos de tipo SAM22 identificados orixínanse dun grupo de xenes que abarca aproximadamente 105 kb, mentres que os xenes de tipo MLP orixínanse de rexións separadas do xenoma.A activación coordinada destes xenes semellantes a SAM22 tamén se atopou no noso estudo anterior sobre a resistencia de NLL á inoculación de Diaporthetoxica, o que suxire que están implicados nos compoñentes horizontais da resposta de defensa.Esta conclusión tamén se apoia nos informes dunha resposta positiva de xenes semellantes a SAM22 á lesión ou ao tratamento con ácido salicílico, inductores de fungos ou peróxido de hidróxeno.
Demostrouse que os xenes parecidos á MLP responden a varios estrés abióticos e bióticos, incluíndo infeccións bacterianas, virais e fúngicas patóxenas en moitas especies vexetais55.As direccións de resposta a certas interaccións entre plantas e patóxenos variaron desde un forte aumento (é dicir, durante a infestación do algodón con Verticillium dahliae) ata unha diminución significativa (é dicir, despois da infección da maceira con Alternaria spp.)56,57.Observouse unha regulación negativa significativa do xene 423 tipo MLP durante as defensas do aguacate contra a infección por F. niger e durante a infección da maceira Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola e Alternaria alternata son patotipos da mazá58,59.Ademais, os callos da mazá que sobreexpresaban o xene 423 tipo MLP tiñan menor expresión de xenes asociados á resistencia e eran máis susceptibles á infección por fungos59.Despois de Fusarium oxysporum f, o xene 423 tipo MLP tamén foi suprimido no xermoplasma de feixón común resistente.cn.Infección de feixón 60.
Outros membros da familia PR-10 identificados no noso estudo de ARN-seq foron os xenes LlR18A e LlR18B en resposta á regulación positiva, así como o xene regulado ao alza (1 xene) ou á baixa (3 xenes) para a proteína de transferencia de lípidos DIR1..Ademais, WGCNA destaca o xene LlR18B como centro deste módulo, que é moi susceptible á vacinación e porta varios xenes de resposta protectora.Os xenes LlR18A e LlR18B foron inducidos en follas amarelas de altramuz en resposta a bacterias patóxenas, así como en talos de NLL despois da inoculación de D. toxica, mentres que o homólogo de arroz destes xenes, RSOsPR10, foi inducido rapidamente por unha infección fúngica presumiblemente implicada na vía de sinalización do ácido xasmónico, a vía de sinalización non específica da proteína DIR562. s que son necesarias para o inicio da resistencia sistémica adquirida (SAR).Co desenvolvemento de reaccións protectoras, a proteína DIR1 transpórtase desde o foco da infección a través do floema para inducir SAR en órganos distantes.Curiosamente, o xene TanjilG_02313 DIR1 foi inducido significativamente no primeiro momento nas liñas 84A:476 e Poboación 22660, pero a resistencia á antracnose desenvolveuse con éxito só na liña 84A:476.Isto pode indicar algunha subfuncionalización do xene DIR1 en NLL, xa que os tres homólogos restantes responderon á inoculación só na liña 83A:476 a 6 hpi, e esta resposta foi dirixida cara abaixo.
No noso estudo, os compoñentes máis comúns correspondentes ao proceso biolóxico denominado "proceso Redox GO:0055114" foron a proteína do citocromo P450, a peroxidase, a 9S-/13S-lipoxixenase do ácido linoleico e a oxidase do ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico.Ademais, o noso WGCNA define o homólogo de HSFA4a como un concentrador que transporta módulos como o candidato ao xene de resistencia Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a é un compoñente da regulación dependente do redox da transcrición nuclear nas plantas.
As proteínas do citocromo P450 son oxidorreductases que catalizan reaccións de hidroxilación dependentes de NADPH e/ou O2 no metabolismo primario e secundario, incluíndo o metabolismo de xenobióticos, así como hormonas, ácidos graxos, esterois, compoñentes da parede celular, biopolímeros e a biosíntese de proteínas protectoras. d de -10,6 log2 (cambio de veces) a 5,7 debido a un gran número de homólogos alterados (37) e diferenzas nos patróns de resposta entre xenes específicos, o que reflicte unha revisión á alza..Usar só datos de secuencias de ARN para dilucidar a función biolóxica putativa dos xenes NLL nunha superfamilia de proteínas tan grande sería moi especulativo.Non obstante, cómpre sinalar que algúns xenes do citocromo P450 están asociados a unha maior resistencia a fungos ou bacterias patóxenas, incluíndo unha contribución ás reaccións alérxicas69,70,71.
As peroxidasas de clase III son encimas vexetais multifuncionais implicados nunha ampla gama de procesos metabólicos durante o crecemento e desenvolvemento das plantas, así como en resposta a estrés ambientais como a salinidade, a seca, a alta intensidade luminosa e o ataque de patóxenos72.As peroxidasas están implicadas na interacción de varias especies vexetais con Anthracis, incluíndo Stylosanthes humilis e C. gloeosporioides, Lens culinaris e C. truncatum, Phaseolus vulgaris e C. lindemuthianum, Cucumis sativus e C. lagenarium73,74,75,76.A resposta é moi rápida, ás veces mesmo a 4 HPI, antes de que o fungo penetre no tecido vexetal73.O xene da peroxidase tamén respondeu á inoculación de NLL por D. toxica.Ademais das súas funcións típicas para regular a explosión oxidativa ou eliminar o estrés oxidativo, as peroxidasas poden interferir co crecemento dos patóxenos creando barreiras físicas baseadas no reforzo da parede celular durante a lignificación, a subunidade ou a reticulación de compostos específicos.Esta función pódese atribuír in silico ao xene TanjilG_03329 que codifica unha suposta peroxidase anión formadora de lignina que foi significativamente regulada no noso estudo na liña resistente 83A:476 a 6 HPI, pero non noutras cepas e puntos de tempo que non responderon.
A 9S-/13S-lipoxixenase do ácido linoleico é o primeiro paso na vía oxidativa da biosíntese dos lípidos78.Os produtos desta vía teñen múltiples funcións na defensa das plantas, incluíndo o fortalecemento da parede celular mediante a formación de depósitos de calosa e pectina e a regulación do estrés oxidativo mediante a produción de especies reactivas de osíxeno79,80,81,82,83.No presente estudo, a expresión da 9S-/13S-lipoxixenase do ácido linoleico foi alterada en todas as cepas, pero na poboación susceptible 22660 prevaleceu a regulación positiva en diferentes momentos, mentres que nas cepas que portan Lanr1 resistente e o alelo AnMan, fai fincapé na diversificación da capa de oxilipina entre estas reaccións protectoras do xenotipo de antigenero.
O homólogo da 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidase (ACO) foi significativamente regulado ao alza (9 xenes) ou baixo (2 xenes) cando se inoculou con altramuz.Con dúas excepcións, todas estas respostas ocorreron a 6 hp.en 83A:476.A reacción enzimática mediada polas proteínas ACO é o paso que limita a velocidade na produción de etileno e, polo tanto, está moi regulada84.O etileno é unha hormona vexetal que desempeña unha variedade de funcións na regulación do desenvolvemento das plantas e na resposta ás condicións de estrés abiótico e biótico.A indución da transcrición ACO e a activación da vía de sinalización do etileno están implicadas no aumento da resistencia do arroz ao fungo hemibiotrófico oryzae oryzae regulando a produción de especies reactivas de osíxeno e fitoalexinas.Un proceso de infección foliar moi similar atopado entre M. oryzae e C. lupini88,89, no contexto dunha importante regulación positiva dos homólogos de ACO na liña 83A:476 descrita neste estudo, cambia a posibilidade de conferir resistencia á antracnose NLL. O etileno é un paso central de sinalización nas vías moleculares.
No presente estudo, observouse a supresión a gran escala de moitos xenes asociados á fotosíntese a 6 hpi en 83A:476 e a 48 hpi en Mandeloop e a poboación de 22660.A extensión e progresión destes cambios é proporcional ao nivel.Neste experimento observouse resistencia á antracnose.Recentemente, informouse dunha forte e precoz represión de transcricións relacionadas coa fotosíntese en varios modelos de interaccións plantas-patóxenos, incluíndo bacterias e fungos patóxenos.A présa (a partir de 2 HPI nalgunhas interaccións) e a supresión global dos xenes asociados á fotosíntese en resposta á infección poden desencadear a inmunidade das plantas baseándose no despregamento de especies reactivas do osíxeno e a súa interacción coa vía do ácido salicílico para mediar reaccións alérxicas 90,94.
En conclusión, os mecanismos de resposta de defensa propostos para a liñaxe máis resistente (83A:476) inclúen o recoñecemento rápido de patóxenos polo xene R (presumiblemente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) e a sinalización de ácido salicílico e etileno mediada pola resposta alérxica, seguido do establecemento de SAR de longo alcance.A acción é apoiada pola proteína DIR-1.Cómpre sinalar que o período biotrófico para a infección por C. lupini é moi curto (aproximadamente 2 días), seguido de crecemento necrótico95.A transición entre estas etapas pode estar asociada á necrose e á expresión de proteínas inducibles por etileno que actúan como desencadenantes de reaccións de hipersensibilidade nas plantas hóspedes.Polo tanto, a xanela de tempo para a captura exitosa de C. lupini na fase biotrófica é moi estreita.A reprogramación dos xenes asociados coa redox e a fotosíntese observada en 83A:476 a 6 hpi é consistente coa progresión das hifas fúngicas e anuncia o desenvolvemento dunha resposta protectora exitosa na etapa biotrófica.As respostas transcriptómicas de Mandelup e da poboación de 22660 poden ser demasiado atrasadas para capturar o fungo antes de cambiar ao crecemento necrótico, porén, Mandelup pode ser máis eficaz que a poboación de 22660 porque a regulación relativamente rápida da proteína PR-10 promove a resistencia horizontal.
A ETI, impulsada polo xene R canónico, parece ser un mecanismo común para a resistencia dos feixóns á antracnose.Así, na leguminosa modelo Medicago truncatula, a resistencia á antracnose é conferida polo xene RCT1, membro da clase de xenes R da planta TIR-NBS-LRR97.Este xene tamén confire resistencia á antracnose de amplo espectro na alfalfa cando se transfire a plantas susceptibles.Na xudía común (P. vulgaris) identificáronse ata a data máis de dúas ducias de xenes de resistencia á antracnose.Algúns destes xenes atópanse en rexións que carecen de xenes R canónicos, pero moitos outros están situados nos bordos dos cromosomas que portan o grupo de xenes NBS-LRR, incluíndo TIR-NBS-LRRs99.O estudo SSR de todo o xenoma tamén confirmou a asociación do xene NBS-LRR coa resistencia á antracnose no feixón común.O xene R canónico tamén se atopou na rexión xenómica que leva o principal locus de resistencia á antracnose no lupino branco 101.
O noso traballo mostra que unha reacción de resistencia inmediata, activada nunha fase inicial da infección da planta (preferentemente non máis tarde de 12 hpi), protexe eficazmente o lupino de folla estreita da antracnose causada polo fungo patóxeno Collelotrichum lupini.Usando a secuenciación de alto rendemento, demostramos perfís de expresión diferencial de xenes de resistencia á antracnose en plantas NLL mediados polos xenes de resistencia Lanr1 e AnMan.A defensa exitosa implica deseñar coidadosamente os xenes das proteínas implicadas na redox, a fotosíntese e a patoxénese ás poucas horas do primeiro contacto da planta cun patóxeno.Reaccións protectoras similares, pero atrasadas no tempo, son moito menos eficaces para protexer as plantas das enfermidades.A resistencia ao ántrax mediada polo xene Lanr1 aseméllase á resposta rápida típica do xene R (inmunidade desencadeada polo efector), mentres que o xene AnMan probablemente proporciona unha resposta horizontal (inmunidade desencadeada por un patrón molecular asociado a microbios), proporcionando un nivel moderado de sustentabilidade.
As 215 liñas NLL utilizadas para detectar marcadores de antracnose consistían en 74 cultivares, 60 liñas obtidas por cruzamento ou reprodución, 5 mutantes e 76 xermoplasmas silvestres ou orixinais.As liñas proviñan de 17 países, principalmente de Polonia (58), España (47), Alemaña (27), Australia (26), Rusia (19), Bielorrusia (7), Italia (5) e outras liñas.de 10 países.O conxunto tamén inclúe liñas resistentes de referencia: 83A:476, Tanjil, Wonga que leva o alelo Lanr1 e Mandelup que leva o alelo AnMan.As liñas obtivéronse da base de datos europea de recursos xenéticos de lupino mantida por Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (táboa complementaria S1).
As plantas cultiváronse en condicións controladas (fotoperíodo 16 horas, temperatura 25 ° C durante o día e 18 ° C pola noite).Analizáronse dúas réplicas biolóxicas.Illouse o ADN de follas de tres semanas utilizando o DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemaña) segundo o protocolo.A calidade e concentración do ADN illado avaliáronse mediante métodos espectrofotométricos (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).Analizáronse o marcador AnManM1 que marca o xene de resistencia á antracnose AnMan (derivado do cv. Mandelup) e os marcadores Anseq3 e Anseq4 que flanquean ao xene Lanr1 (derivado do cv. Tanjil) 11,26,28.Os homocigotos para o alelo resistente foron puntuados como "1", susceptibles - como "0" e heterocigotos - como 0,5.
En función dos resultados do cribado dos marcadores AnManM1, AnSeq3 e AnSeq4 e da dispoñibilidade de sementes para os experimentos finais de seguimento, seleccionáronse 50 liñas de NLL para o fenotipado de resistencia á antracnose.A análise realizouse por duplicado nun invernadoiro controlado por ordenador cun fotoperíodo de 14 horas cun rango de temperatura de 22 °C durante o día e 19 °C pola noite.As sementes son rascadas (cortando a capa da semente no lado oposto do embrión cunha folla afiada) antes de sementar para evitar a inactividade das sementes debido a que a capa da semente é demasiado dura e para garantir unha xerminación uniforme.As plantas cultiváronse en macetas (11 × 11 × 21 cm) con chan estéril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovia, Polonia).A inoculación realizouse coa cepa Colletotrichum lupini Col-08, cultivada en 1999 a partir de talos de plantas de altramuz de folla estreita cultivadas nun campo en Verzhenitsa, Gran Polonia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Obter unha zona.Os illados cultiváronse en medio SNA a 20 °C baixo luz negra durante 21 días para inducir a esporulación.Catro semanas despois da sementeira, cando as plantas chegaran á fase de 4-6 follas, realizouse a inoculación mediante pulverización cunha suspensión de conidios nunha concentración de 0,5 x 106 conidios por ml.Despois da inoculación, as plantas mantivéronse á escuridade durante 24 horas a unha humidade duns 98% e unha temperatura de 25 °C para facilitar a xerminación dos conidios e o proceso de infección.Despois, as plantas creceron baixo un fotoperíodo de 14 horas a 22 °C día/19 °C noite e 70% de humidade.A puntuación da enfermidade fíxose 22 días despois da inoculación e variou de 0 (inmune) a 9 (moi susceptible) dependendo da presenza ou ausencia de lesións necróticas en talos e follas.Ademais, despois de puntuar, mediuse o peso das plantas.As relacións entre xenotipos marcadores e fenotipos da enfermidade calculáronse como correlacións puntuais de dúas secuencias (ausencia de marcadores heterocigotos no conxunto de liñas para a análise do fenotipo de resistencia á antracnose).